Grampp, Anne: Proliferation von Mikrogliazellen und Astrozyten im Gyrus dentatus der Ratte nach experimenteller Läsion des entorhinalen Kortex

Aus dem Institut für Anatomie
der Medizinischen Fakultät Charité
der Humboldt-Universität zu Berlin


DISSERTATION
Proliferation von Mikrogliazellen und Astrozyten im Gyrus dentatus der Ratte nach experimenteller Läsion des entorhinalen Kortex

Zur Erlangung des akademischen Grades
Doctor medicinae (Dr. med.)

vorgelegt der Medizinischen Fakultät Charité
der Humboldt-Universität zu Berlin

von Anne Grampp
aus Kulmbach

Dekan: Prof. Dr. med. Dr. h.c. R. Felix

Gutachter:
Prof. Dr. med. R. Nitsch
PD Dr. med. G. Raivich
Prof. Dr. med. A. Fontana

Datum der Promotion:

ABSTRACT

Entorhinal cortex lesion of adult rats induces glial activation and proliferation in the deafferented dentate molecular layer. Double-labelling immunocytochemistry for the astrocyte-specific antigen glial fibrillary acidic protein or the microglial cell marker Griffonia simplicifolia isolectin B4 with bromodexyuridine detection revealed that microglia counts and the proliferation rate in the ipsilateral dentate gyrus reached a maximum in the molecular layer at 3 days post-lesion (dpl) and returned to control levels by 30 dpl. Astrocyte counts in the ipsilateral dentate gyrus peaked at 30 dpl, with maximum proliferation at 7 dpl. At 100 dpl the astrocyte count had reverted to control levels. Glial proliferation was not restricted to the ipsilateral molecular layer but also occurred to some degree in the granule cell layer and the contralateral dentate gyrus. Thus entorhinal cortex lesion induces a rapid microglial reaction and long-lasting astrocyte activation in the deafferented termination zone of the perforant path. To conclude, glial proliferation after entorhinal cortex lesion follows a complex temporal and spatial pattern that coincides with processes of neuronal and axonal reorganization.

Keywords:
Hippocampus, entorhinal cortex lesion, glial proliferation, astrocytes, microglia, bromodeoxyuridine

ABSTRACT

Die Läsion des entorhinalen Kortex bei adulten Ratten induziert in der deafferenzierten Molekularschicht des Gyrus dentatus eine Gliaaktivierung und -proliferation. Histochemische Doppelfärbungen auf das astrozytenspezifische Antigen Glial fibrillary acidic protein oder den Mikrogliamarker Griffonia simplicifolia isolectin B4 und Bromodeoxyuridin haben gezeigt, daß die Mikrogliazellzahlen in der Molekularschicht des Gyrus dentatus 3 Tage nach Läsion (dpl) ein Maximum erreichten und 30 dpl auf Kontrollwerte zurückgingen. Die Astrozytenzahlen im ipsilateralen Gyrus dentatus erreichten 30 dpl ein Maximum, ihre größte Proliferationsaktivität war 7 dpl zu beobachten. 100 dpl waren die Astrozytenzahlen auf Kontrollwerte zurückgegangen. Die Gliaproliferation war nicht auf die ipsilaterale Molekularschicht beschränkt, sondern trat auch zu einem bestimmten Grad in der Körnerzellschicht und im kontralateralen Gyrus dentatus auf. Somit ruft eine entorhinale Kortexläsion eine rasche Mikrogliareaktion und eine langanhaltende Astrozytenaktivierung in der deafferenzierten Terminationszone des Tractus perforans hervor. Schließlich ist zu erwähnen, daß Gliaproliferation nach entorhinaler Läsion einem komplexen zeitlichen und räumlichen Muster folgt, das bei Prozessen der neuronalen und axonalen Reorganisation auftritt.

Schlagwörter:
Hippokampus, entorhinale Kortexläsion, Gliaproliferation, Astrozyten, Mikroglia, Bromodeoxyuridin


80


Seiten: [8] [9] [10] [11] [12] [13] [14] [15] [16] [17] [18] [19] [20] [21] [22] [23] [24] [25] [26] [27] [28] [29] [30] [31] [32] [33] [34] [35] [36] [37] [38] [39] [40] [41] [42] [43] [44] [45] [46] [47] [48] [49] [50] [51] [52] [53] [54] [55] [56] [57] [58] [59] [60] [61] [62] [63] [64] [65] [66] [67] [68] [69] [70] [71] [72] [73] [74] [75] [76] [77] [78] [79] [80]

Inhaltsverzeichnis

TitelseiteProliferation von Mikrogliazellen und Astrozyten im Gyrus dentatus der Ratte nach experimenteller Läsion des entorhinalen Kortex
Einleitung
Abkürzungsverzeichnis Abkürzungsverzeichnis
1 EINLEITUNG
1.1Anatomische und physiologische Grundlagen
1.1.1Hippokampus-Formation
1.1.2Tractus perforans
1.2Einführung in die Pathophysiologie der entorhinalen Läsion
1.2.1Entorhinale Kortexläsion
1.2.2Transneuronale Veränderungen
1.2.3Reaktives Sprouting und Synaptogenese
1.3Gliareaktionen auf entorhinale Läsion
1.3.1Mikroglia-Aktivierung
1.3.2Astrozytäre Reaktionen
1.3.3Phagozytose
1.3.4Expression von immunologischen Zellmarkern
1.3.5Produktion von humoralen Faktoren
1.3.6Zunahme der Zellzahl: Migration oder Proliferation?
1.4Zielstellung
2 THEORETISCHE GRUNDLAGEN
2.1Proliferationskinetische Untersuchungen
2.2Grundlagen der Immunhistochemie
2.2.1.1Histochemische Darstellung von Mikrogliazellen
2.2.1.2Immunhistochemische Darstellung von Astrozyten
2.2.1.3Immunhistochemische Darstellung BrdU-positiver Zellen
2.2.1.4Die nach Hsu et al. modifizierte ABC-Methode
3 MATERIAL UND METHODEN
3.1Versuchstiere und Versuchstierhaltung
3.2Zusammensetzung des Anästhetikums
3.3Zusammensetzung der Fixativflüssigkeit
3.4Zusammensetzung des verwendeten Puffers
3.4.1PBS
3.4.2Spülpuffer
3.5Chemikalien für die morphologische Untersuchung
3.5.1Darstellung von Mikroglia
3.5.2Darstellung von Astrozyten
3.6Chemikalien für die proliferationskinetische Untersuchung
3.7Einteilung der Versuchstiergruppen
3.8Versuchsablauf
3.8.1Entorhinale Läsion
3.8.2Applikation von 5‘-Bromo-2‘-deoxyuridin und transkardiale Perfusion
3.8.3Immunhistochemie
3.8.3.1Darstellung von Mikroglia durch Griffonia simplicifolia Isolektin B4
3.8.3.2Immunhistochemische Darstellung von GFAP
3.8.3.3Immunhistochemische Darstellung von BrdU
3.8.3.4Negativkontrolle ohne Primärantikörper gegen BrdU
3.9Morphologische und proliferationskinetische Auswertung
3.9.1Gesichtsfelder
3.9.2Auswertungskriterien und Auszählung der Gesichtsfelder
3.10Statistische Auswertung
4 ERGEBNISSE
4.1Untersuchungen an Mikrogliazellen
4.1.1Beschreibung der histologischen Präparate
4.1.1.1Kontrollstadium (Versuchstiergruppe 1)
4.1.1.2Tag 3 nach Läsion (Versuchstiergruppe 2)
4.1.1.3Tag 10 nach Läsion (Versuchstiergruppe 4)
4.1.1.4Tag 30 nach Läsion (Versuchstiergruppe 5)
4.1.2Zellzählung und proliferationskinetische Auswertung bei der Mikroglia
4.1.2.1Mikrogliazellzahlen nach entorhinaler Läsion
4.1.2.2Zahl proliferierender Mikrogliazellen nach entorhinaler Läsion
4.1.2.3Der Labeling Index als Marker der Proliferationsquote von Mikrogliazellen
4.1.2.4Vergleich der Mikrogliaproliferationsaktivität ipsi- und kontralateral zur entorhinalen Läsion
4.2Untersuchungen an Astrozyten
4.2.1Beschreibung der histologische Präparate
4.2.1.1Kontrollstadium (Versuchstiergruppe 1)
4.2.1.2Tag 3 nach Läsion (Versuchstiergruppe 2)
4.2.1.3Tag 7 nach Läsion (Versuchstiergruppe 3)
4.2.1.4Tag 10 nach Läsion (Versuchstiergruppe 4)
4.2.1.5Tag 30 nach Läsion (Versuchstiergruppe 5)
4.2.1.6Tag 100 nach Läsion (Versuchstiergruppe 6)
4.2.2Zellzählung und proliferationskinetische Auswertung bei den Astrozyten
4.2.2.1Astrozytenzahlen nach entorhinaler Läsion
4.2.2.2Zahlen proliferierender Astrozyten nach entorhinaler Läsion
4.2.2.3Der Labeling Index als Marker der Proliferationsquote von Astrozyten
4.2.2.4Vergleich der Astrozytenproliferationsaktivität ipsi- und kontralateral zur entorhinalen Läsion
4.3Zusammenfassung der Ergebnisse
4.3.1Mikroglia
4.3.2Astrozyten
5 DISKUSSION
5.1Fragestellung und Ziel
5.2Interpretation der eigenen Ergebnisse
5.2.1Rolle von Proliferation und Migration
5.2.2Astrozyten-Zellzahlenanstieg und GFAP-Reaktivität
5.2.3Abnahme der Astrozytenzahlen in den frühen Stadien
5.2.4Beteiligung humoraler Faktoren an der Gliareaktion
5.2.5Unerwartet starke Reaktionen in der Körnerzellschicht
5.2.6Kontralaterale Aktivierung
5.3Beurteilung der BrdU-Methode für proliferationskinetische Untersuchungen
5.4Ausblick
6 ZUSAMMENFASSUNG
Bibliographie LITERATURVERZEICHNIS
Lebenslauf
Danksagung
Selbständigkeitserklärung

Abbildungsverzeichnis

Abb. 1: Anatomie der Hippokampusformation bei höheren Säugern. DG=Gyrus dentatus (1=äußere Molekularschicht, 2=innere Molekularschicht, 3=Körnerzellschicht, 4=Fissura hippocampi, 5=Hilus), CA1/2/3=Abschnitte des Hippocampus proper, Fi=Fimbria, S=Subikulum, aB=anguläres Bündel, EC=entorhinaler Kortex (I/II/III/IV/V/VI=Schichten des entorhinalen Kortex), ECL=entorhinale Kortexläsion. Die Abbildung zeigt den Verlauf des Tractus perforans.
Abb. 2: Zellzyklus (nach Leonhardt, 1990, Histologie, Zytologie und Mikroanatomie des Menschen, S.54, Abb. 35). Phasen des Zellzyklus: Mitose, G1-Phase, S=Synthesephase, G2-Phase; G0-Phase. PMZ=postmitotische Zelle.
Abb. 3: Strukturformeln von BrdU und Thymidin. Die analogen Moleküle bestehen beide aus einer Desoxyribose und unterscheiden sich lediglich in ihrem Basenrest. Thymidin setzt sich aus einer Desoxyribose und einem Thyminbasenrest zusammen. BrdU besteht aus Desoxyribose mit einem Uridinrest, der an Stelle 5 im Ring einen Bromrest besitzt.
Abb. 4: Schematische Darstellung von Desoxyribonukleinsäure (DNS) ohne und mit Einbau von BrdU. BrdU nimmt kompetitiv den Platz von Thymidin in der DNS ein.
Abb. 5: Modell der Immunhistochemie. Der Primärantikörper (z.B. Rabbit-anti-GFAP) bindet mit seinem Fab- Anteil spezifisch an ein Gewebsantigen (z.B. GFAP). Der biotinylierte Zweitantikörper (z.B. goat-anti-rabbit-biot.) bindet an das Fc-Fragment des aus dem Kaninchen (rabbit) stammenden Erstantikörpers. Zusammen mit dem Biotinrest am Fc-Fragment des Sekundärantikörpers kann sich nun ein Avidin-Biotin-Peroxidase-Komplex (ABC) ausbilden, der mit Diaminobenzidin zu einem farbigen Produkt reagieren kann. Auf diese Weise kann man Gewebsantigene (z.B. GFAP) farbig sichtbar machen.
Abb. 6: Operationssitus. Kopf der Ratte mit eröffneter Schädelkalotte bei den ab Lambda gemessenen Koordinaten für den entorhinalen Kortex. lambda=Lambda.
Abb. 7: Methode der Zellzählung. Unterteilung des Gyrus dentatus (DG), hier auf der lädierten Seite, in sechs Gesichtsfelder. Separate Auszählung der gesamten Gliazellen und der BrdU-positiven Gliazellen in der äußeren (OML) und inneren (IML) Molekularschicht sowie der Körnerzellschicht (GCL). ECL=entorhinale Kortexläsion. In der Vergrößerung sind BrdU-positive und BrdU-negative Gliazellen am Zellkern zu erkennen.
Abb. 8: Beispiel für doppelt positiv angefärbte Gliazellen. a: IB4- und BrdU-positive Mikrogliazellen in der äußeren Molekularschicht des ipsilateralen Gyrus dentatus drei Tage nach Läsion, b: GFAP- und BrdU-positive Astrozyten in der äußeren Molekularschicht des ipsilateralen Gyrus dentatus sieben Tage nach Läsion. Lange Pfeile: Zelleib; kurze Pfeile: Zellkern. Vergrößerung: x 100.
Abb. 9: Mikroglia-Kontrollstadium ohne entorhinale Läsion, linker-rechter Hippokampus. Überwiegend schwächer angefärbte, ramifizierte Mikrogliazellen. Das Gewebe weist kaum Zeichen der Proliferation auf. Vergrößerung: x 40.
Abb. 10: Mikroglia 3 dpl, ipsilateral-kontralateral. Ipsilateral deutlich gefärbte Mikrogliazellen besonders in der äußeren Molekularschicht, zahlreiche BrdU-positive Zellkerne. Kontralateral wenige, schwach angefärbte Mikrogliazellen. Vergrößerung: x 40.
Abb. 11: Mikroglia 10 dpl, ipsilateral-kontralateral. Ipsilateral zahlreiche stark gefärbte Mikrogliazellen. Vergrößerung: x 40.
Abb. 12: Mikroglia 30 dpl, ipsilateral-kontralateral. Ipsilateral in der Molekularschicht deutlich angefärbte Mikrogliazellen. Vergrößerung: x 40.
Abb. 13: Statistische Auswertung der Zellzahlen und Proliferationsraten von Mikrogliazellen in den Molekularschichten (ML) und Körnerzellschichten (GCL) beider Hirnhemisphären. a: Mikrogliazellzahlen. b: Anzahlen BrdU-positiver, also doppelgefärbter Mikrogliazellen. c: Labeling indices, ermittelt durch die Anzahlen BrdU-positiver Mikrogliazellen dividiert durch die Gesamtzellzahlen von Mikrogliazellen. Sternchen auf den Säulen repräsentieren die Signifikanz der Daten, im Vergleich mit den Kontrollwerten (* = p < 0,05; ** = p < 0,005).
Abb. 14: Astrozyten-Kontrollstadium ohne entorhinale Läsion, linker-rechter Hippokampus. Gleichmäßig verteilte, braun gefärbte Astrozyten mit zarten Fortsätzen in beiden Hirnhälften. Vergrößerung: x 40.
Abb. 15: Astrozyten 3 dpl, ipsilateral-kontralateral. Braun gefärbte Astrozyten mit schlanken Fortsätzen in beiden Hirnhemispheren. Vergrößerung: x 40.
Abb. 16: Astrozyten 7 dpl, ipsilateral-kontralateral. Ipsilateral stärker angefärbte, verdickt erscheinende Astrozyten mit teilweise BrdU-Inkorporation, besonders in der äußeren Molekularschicht. Vergrößerung: x 40.
Abb. 17: Astrozyten 10 dpl, ipsilateral-kontralateral. Stark angefärbte, verdickte Astrozyten mit BrdU-positiven Zellkernen besonders in der ipsilateralen äußeren Molekularschicht. Vergrößerung: x 40.
Abb. 18: Astrozyten 30 dpl, ipsilateral-kontralateral. Ipsilateral stark gefärbte neben schwächer angefärbten Astrozyten. Vergrößerung: x 40.
Abb. 19: Astrozyten100 dpl, ipsilateral-kontralateral. Auf beiden Seiten Astrozyten mit zarten Fortsätzen. Vergrößerung: x 40.
Abb. 20: Statistische Auswertung der Zellzahlen und Proliferationsraten von Astrozyten in den Molekularschichten (ML) und Körnerzellschichten (GCL) beider Hirnhemisphären. a: Astrozytenzellzahlen. b: Anzahlen BrdU-positiver, also doppelgefärbter Astrozyten. c: Labeling indices, ermittelt durch die Anzahlen BrdU-positiver Astrozyten dividiert durch die Gesamtzellzahlen von Astrozyten. Sternchen auf den Säulen repräsentieren die Signifikanz der Daten, im Vergleich mit den Kontrollwerten (* = p < 0,05; ** = p < 0,005).

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