2 Materialien und Methoden

↓22

Alle Experimente wurden mit immortalen Zervix-Karzinom-Zellen (HeLa) der Firma ATCC sowie mit einer humanen Monozyten-Leukämie-Zelllinie (THP-1), ebenfalls von ATCC, durchgeführt.

2.1  Zellkultur

2.1.1  Materialien

↓23

  • 6 cm-Zellkulturschale

28 cm2 Wachstumsfläche

BD Falcon

  • 10 cm-Zellkulturschale

78 cm2 Wachstumsfläche

BD Falcon

  • Zellkulturflasche 50 ml

25 cm2 Wachstumsfläche

BD Falcon

  • Zellkulturflasche 250 ml

75 cm2 Wachstumsfläche

BD Falcon

  • RPMI 1640 Medium

inkl. 2 mmol/ l L-Glutamin

Gibco

  • FCS

fötales Kälberserum

Biochrom

  • Penicillin/ Streptomycin

10.000 IE/ 10.000 µg/ ml

Biochrom

  • PBS

Phosphat-gepufferte Salzlösung, Dulbeccos Modifikation

Gibco

  • Trypsin-EDTA

in Hanks Balanced Salt Solution (HBSS) ohne Ca2+/ Mg2+

Gibco

  • Zentrifuge

Megafuge 1.0R

Heraeus

  • HeLa-Zell-Medium

RPMI 1640 Medium
plus
10% FCS
1% Penicillin/ Streptomycin

  • ATCC-Medium

RPMI 1640 Medium
plus
1,5 g/ lNatriumbikarbonat (NaHCO3)
4,5 g/ l Glukose
10 mM HEPES
1,0 mM Natriumpyruvat
0,05 mM 2-Mercaptoethanol
10% FCS
1% Penicillin/ Streptomycin

2.1.2 Kulturbedingungen

Grundsätzlich wurden die Zellen in einem Zellkulturschrank bei 37°C und 5% CO2-Begasung kultiviert. Um bakterielle Kontamination zu vermeiden, wurde an einer Werkbank mit gefilterter und laminar strömender Luft gearbeitet.

2.1.3 Zelltypen

2.1.3.1 HeLa

Zur Gruppe der Adhäsionszellen gehörend wurden die HeLa-Zellen liegend in 75 cm2 großen Zellkulturflaschen mit 10 ml HeLa-Zell-Medium kultiviert. Sie wuchsen stets einlagig und wurden kurz vor Erreichen der Konfluenz passagiert.

↓24

Dazu wurde das Medium abgesaugt und zweimal mit PBS gewaschen, um an den Zellen haftende Serumreste zu entfernen. Anschließend wurden die Zellen mit 1,5 ml Trypsin/ EDTA abgelöst. Die Protease war 90 Sekunden im Brutschrank aktiv, danach wurde die Reaktion mit dem FCS-haltigen Hela-Zell-Medium gestoppt. Die Zellen wurden 1:8 verdünnt und erneut in Zellkulturflaschen ausgesät.

2.1.3.2 THP-1

Die Kultivierung der THP-1- Suspensionszellen erfolgte in 5-10 ml ATCC-Medium in stehenden Zellkulturflaschen mit 50 ml Gesamtvolumen. Alle 2-3 Tage wurde das Medium gewechselt. Dazu wurden die Zellen für 10 Minuten mit 1000 U/ min bei Raumtemperatur zentrifugiert. Anschließend wurde vorsichtig das alte ATCC-Medium abgesaugt und neues hinzugefügt. Wenn die mittels Neubauer-Zählkammer bestimmte Zelldichte 2 ∙ 105Zellen/ ml überschritt, erfolgte eine Teilung im Verhältnis 1:1. Daraus resultierte ein wöchentlicher Teilungsrhythmus. Die maximale Kulturdauer betrug 18 Wochen.

2.1.4 Zeitkinetiken

Grundsätzlich wurden Versuche mit verschiedenen Expositionszeiten so konzipiert, dass alle Zellen zum gleichen Zeitpunkt lysiert bzw. vermessen wurden. Das heißt, die Gruppen eines Versuches unterscheiden sich im Behandlungsbeginn, nicht aber im Endpunkt. Durch diesen Aufbau wurde lediglich eine Zeitkontrolle benötigt.

2.2 Protein-Nachweismethoden

2.2.1  Präparation von Kern-/ Zytoplasma-Extrakten

2.2.1.1 Prinzip

↓25

Zur getrennten Analyse von Kern- bzw. Zytoplasma-Bestandteilen wurde mit leichten Modifikationen die von Osborn und Kollegen 1989 beschriebene Methode verwendet, die eine Separation bei der Zelllyse ermöglicht.

Durch Zugabe des hypoosmolaren Puffers A werden die Zellen zum Schwellen gebracht. In diesem Zustand maximaler Spannung der Zellmembran kann sie durch Zugabe einer geringen Menge Detergenz zum Aufreißen gebracht werden. Nach Sedimentation der Kerne kann als Überstand der Zytoplasmaextrakt gewonnen werden. Die als Pellet verbliebenen Zellkerne können nun lysiert und extrahiert werden.

2.2.1.2 Materialien

  • Nonidet P-40 (12,5%)

Octylphenolpoly(ethylenglykolether);
nichtionisches Detergenz zur Solubilisierung von Membranproteinen

Roche

  • PefaBloc SC

4-(2-Aminoethyl)-benzolsulfonyfluorid;
breit wirksamer Serinproteinaseninhibitor

Roche

  • Puffer A

10% Glycerol
10 mM Tris, pH 7,9
10 mM KCl
10 mM NaF
10 mM K2HPO4
1,5 mM MgCl2
1 mM NaVO3 (Natrium(meta)Vanadat)
direkt vor Nutzung:
0,5 mM DTT
0,5 mM PefaBloc SC

  • Puffer C

10% Glycerol
0,42 M NaCl
20 mM Tris, pH 7,9
10 mM NaF
10 mM K2HPO4
1,5 mM MgCl2
1 mM NaVO3 (Natrium(meta)Vanadat)
0,2 mM EDTA
kurz vor Nutzung:
0,5 mM DTT
0,5 mM PefaBloc SC

↓26

Wenn nicht anders angegeben, erfolgten alle Zentrifugationsschritte bei 4°C für 10 Minuten.

Die Zellkulturschälchen (10 cm) mit HeLa-Zellen wurden zweimal mit PBS gewaschen und anschließend mit 500 µl Trypsin/ EDTA abgelöst. Die Zellen wurden in 1,5 ml PBS aufgenommen und in einem 2 ml fassenden Reaktionsgefäß mit 1000 U/ min zentrifugiert. Der Überstand wurde verworfen und das Zell-Pellet mit 1 ml Puffer A gewaschen und erneut mit 1000 U/ min zentrifugiert. Anschließend wurde das Pellet in 150 µl Puffer A resuspendiert. Um die Zytoplasmamembranen zu lysieren, wurde nun 1 µl des Detergens Nonidet P-40 zugegeben. Nach 2 min erfolgte zur Trennung von Zytoplasmabestandteilen und Kernen erneut ein Zentrifugationsschritt bei 1000 U/ min. Der dem Zytoplasmaextrakt entsprechende Überstand wurde in ein Reaktionsgefäß überführt und auf Eis gelagert.

Die als Pellet verbliebenen Kerne wurden mit 40 µl Puffer C lysiert und mit 13.000 U/ min zentrifugiert. Der die Kernextrakte enthaltende Überstand wurde ebenfalls in ein neues Reaktionsgefäß überführt und auf Eis gelagert.

↓27

Im Anschluss wurden die Proteinkonzentrationen nach Bradford bestimmt. Das Messprinzip beruht auf einem von der Proteinkonzentration abhängigen Farbumschlag von dunkelgrün zu blau (Absorptionswechsel von 465 zu 595 nm), der durch Bildung von Coomassie-Protein-Komplexen entsteht.

Die Proben wurden in flüssigem Stickstoff schockgefroren und bei minus 70°C gelagert.

2.2.2 Western Blots

2.2.2.1  Materialien

  • Acrylamid

aus Acrylamid und Bisacrylamid, Rotiphorese Gel 29:1 (40%)

Carl Roth GmbH & Co.

  • Tris

Tris(hydroxymethyl)-aminomethan

Serva Feinbiochemica

  • TEMED

N,N,N‘,N‘-Tetramethylethylendiamin

Sigma

  • APS

Ammoniumperoxydisulfat

Sigma

  • Proteinmarker

6,5 - 175 kDa

New England Biolabs

  • Tischzentrifuge

5415C

Eppendorf

  • Elektrophoresekammer

Dual Mini, 11 X 10 cm

Sigma-Aldrich

  • Stromversorgungsgerät

EPS 600

Pharmacia Biotech

  • Roti-Block

Carl Roth GmbH & Co.

  • Blotkammer

Semi-Dry Transfer Cell Trans-Blot SD

Bio-Rad

  • Thermomixer

5437

Eppendorf

  • ECL

Enhanced Chemiluminescence Lösung

Amersham

  • Film

X-Omat Blue XB-1, 18 x 24 cm

Kodak

  • Entwicklermaschine

Hyperprocessor

Amersham

  • Densitometrie ImageMaster 1D Prime,

Version 2.01, © 1996-97 Nonlinear Dynamics, Ltd.

Hoefer Pharmacia
Biotech

2.2.2.2 Lösungen

↓28

  • TBS:

mit Tris gepufferte Salzlösung;
50 mM Tris(hydroxymethyl)-aminomethan
150 mM NaCl
pH 7,4 HCl

  • 5x SDS-Probenpuffer:

60 mM Tris pH 6,8
25% Glyzerol (Sigma)
5% β-Mercaptoethanol (Serva)
2% SDS
0,1% Bromphenolblau (Serva)

  • SDS-Laufpuffer:

2,5 mM Tris
19,2 mM Glycin
0,01% SDS
pH 8,8

  • Transferpuffer:

20% Methanol
2 mM Tris
15 mM Glycin

  • RIPA-Puffer

20 mM Tris-Cl pH 7,5
420 mM MgCl20,2 mM EDTA
1 mM Na3VO410 mM NaF
1,25% NP40
10% Glycerin

  • Waschpuffer:

0,02% Tween 20 (Aldrich) in TBS

2.2.2.3 Antikörper:

Tabelle 3: Verwendete Antikörper

Antikörper

Eigenschaften

Verdünnung

Hersteller

GR (H-300)

Erstantikörper
Kaninchen, polyklonal, IgG, erkennt α- und β-Isoform,

1:2.500

Santa Cruz

Anti-Kaninchen

Zweitantikörper
Esel, konjugiert mit Meerrettich-Peroxidase

1:5.000

Jackson Immuno-Research Laboratories Inc., via Dianova

2.2.2.4 Prinzip:

Western Blots ermöglichen den quantitativen Nachweis spezifischer Proteine. Dafür werden diese zunächst durch Aufkochen und Zugabe von Natriumdodecylsulfat (SDS) denaturiert. Das negativ geladene SDS, welches sich proportional zum Molekulargewicht der Proteine an diese bindet, verleiht den Proteinen eine negative Außenladung. Dies ermöglicht das Auftrennen der Proteine nach ihrer Größe in einer Gel-Elektrophorese nach Laemmli (Laemmli, 1970), bei welcher die Proteine in einem elektrischen Feld zur Anode wandern. Anschließend werden die Proteine auf eine Polyvinylidenfluorid-Membran (PVDF) übertragen („geblottet“) und mit Hilfe spezifischer Antikörper nachgewiesen. Da die eingesetzte Acrylamidkonzentration den Vernetzungsgrad der Gele und somit die Laufeigenschaften der Proteine beeinflusst, wurde sie mit 10% an die 90 bzw. 95 kDa großen GR-Isoformen angepasst.

↓29

Tabelle 4: Ansatz für 4 SDS-Gele

10% Trenngel

Sammelgel

dd H20

12 ml

14,6 ml

1,5 M Tris pH 8,8

6,25 ml

1 M Tris pH 6,8

2,5 ml

40% Acrylamid

6,25 ml

2,5 ml

SDS

250 µl

200 µl

APS

200 µl

200 µl

TEMED

20 µl

10 µl

2.2.2.5 SDS-Polyacrylamidgelelektrophorese

Eine vom Zelltyp abhängende Lysatmenge wurde ad 20 µl mit RIPA-Puffer vermengt und mit 5 µl 5x SDS-Probenpuffer versetzt. Nach fünfminütigem Erhitzen bei 95°C im Thermocycler wurden die Proben kurz anzentrifugiert, abgekühlt und in die Geltaschen pipettiert. Die Proteinauftrennung durch Elektrophorese dauerte bei 20 mA/ Gel ca. 1 Stunde. Daraufhin wurden die Gele aus den Kammern entnommen, zurechtgeschnitten und mit Blotpuffer inkubiert.

2.2.2.6 Proteintransfer

↓30

Hierbei wurden die im Gel aufgetrennten Proteine mit Hilfe eines elektrischen Feldes auf eine Polyvinylidenfluoridmembran (PVDF) übertragen. Dazu wurden eine PVDF-Membran und sechs Whatman-Papiere auf etwa Gelgröße zurechtgeschnitten. Zur Aktivierung wurde die PVDF-Membran eine Minute in Methanol, zwei Minuten in Aqua bidest. und fünf Minuten in Blotpuffer geschwenkt. Die Whatmanpapiere wurden ebenfalls mit Blotpuffer angefeuchtet.

Nun wurden drei Whatmanpapiere auf den als Anode dienenden Boden der Blotkammer gelegt, darauf die PVDF-Membran, darauf das Gel und abschließend kathodenseitig wieder drei Whatmanpapiere. Durch Ausstreichen wurde sichergestellt, dass keine Luftblasen den Kontakt von Membran und Gel behinderten. Für das elektrische Feld wurde ein konstanter Strom von 350 mA bei maximal 4 Watt über eine bis anderthalb Stunden gewählt.

2.2.2.7 Antikörperbindung

Das Schwenken der PVDF-Membranen über zwei Stunden bei Raumtemperatur in 10 ml Roti-Block minimierte die unspezifische Bindung. Roti-Block enthält eine hohe Konzentration unspezifischer Proteine, die die freien Bindungsstellen auf der PVDF-Membran besetzen. Daraufhin wurden die Membranen über Nacht bei 4°C mit dem in Roti-Block gelösten Erstantikörper unter leichtem Schwenken inkubiert.

↓31

Am Folgetag wurden die Membranen viermal jeweils 10 Minuten mit Western-Blot-Waschpuffer gewaschen und danach zwei Stunden bei Raumtemperatur unter ständigem Schwenken mit dem Zweitantikörper inkubiert. Nach erneutem viermaligen Waschen wurden die Membranen eine Minute in der ECL-Lösung geschwenkt.

Die am zweiten Antikörper gebundene Meerrettich-Peroxidase oxidiert das Luminol des ECL. Das durch die Oxidation angeregte Luminol fällt anschließend unter Lichtemission in den Grundzustand zurück. Das ausgesandte Licht wurde mittels Filmauflage registriert. Die entwickelten Filme wurden gescannt und mit der Software ImageMaster 1D densitometrisch ausgewertet.

2.2.3 Immunpräzipitation

2.2.3.1 Materialien

  • Protein A-Sepharose

in PBS

Pharmacia Biotech

  • GR-Antikörper

siehe Tabelle 3

Santa Cruz

  • Schüttler

Test Tube Rotator

Neolab

  • Zentrifuge

5417 C

Eppendorf

2.2.3.2 Prinzip

↓32

Bei der Immunpräzipitation werden spezifische Antikörper benutzt, um Proteine aus komplexen Gemischen (z.B. Zelllysat) selektiv auszufällen. Dazu wurde der Antikörper an Protein A-Sepharose gekoppelt und mit der Proteinmischung inkubiert.

Nach der Sedimentierung der an Protein A-Sepharose gebundenen Immunkomplexe durch Zentrifugation folgen mehrere Waschschritte, um noch vorhandene ungebundene Proteine zu entfernen. Abschließend wird die Antikörper-Antigen Bindung getrennt und das Proteingemisch extrahiert. Dieses kann z.B. in Western Blots analysiert werden.

2.2.3.3 Kopplung des Antikörpers mit Protein A-Sepharose

Pro Ansatz wurde 50 µl Protein A-Sepharose mit 3 µg spezifischem Antikörper vermengt und für ca. 2 Stunden bei 4°C geschüttelt. Danach wurde kurz anzentrifugiert, der Überstand verworfen und das Pellet in PBS gewaschen. Das gewaschene Pellet wurde in einer den Ansätzen entsprechenden Menge PBS aufgenommen.

2.2.3.4 Herstellung des Zelllysats

↓33

Es wurde mit Zellkulturschalen von 10 cm Durchmesser gearbeitet. Die Konfluenz betrug ca. 80%.

Die Zellen wurden zweimal mit PBS gewaschen und anschließend mit 350 µl RIPA lysiert. Durch zweimaliges Pressen durch Kanülen mit erst 0,6 dann 0,4 mm Durchmesser wurde das Lysat homogenisiert. Danach wurde sieben Minuten mit 14.000 U/ min bei 4°C zentrifugiert. Um unspezifische Bindungen zu verhindern wurde der Überstand mit 50 µl Protein A-Sepharose versetzt und 30 Minuten bei 4°C geschüttelt.

2.2.3.5 „Fischen“ des spezifischen Proteins

Das Zelllysat wurde mit dem Antikörper-Protein A-Sepharose-Komplex versetzt und über Nacht bei 4°C geschüttelt. Danach wurde der Ansatz kurz zentrifugiert und der Überstand verworfen. Das Pellet wurde zehnmal mit 300 µl RIPA gewaschen und anschließend in SDS-Probenpuffer aufgenommen. Um den Antikörper zu denaturieren, wurde 5 Minuten bei 94°C inkubiert. Das Reaktionsgefäß wurde anzentrifugiert, der Überstand in ein neues Reaktionsgefäß überführt und das Pellet mit 10 µl Aqua dest. reextrahiert. Nach erneuter kurzer Zentrifugation wurden die beiden Überstände vereinigt und im Western Blot weiter verarbeitet.

2.3 Gesamt-RNA-Extraktion

2.3.1  Prinzip

↓34

Die Gesamt-RNA wurde mit Trizol isoliert. Trizol von Gibco ist eine monophasisches Lösung aus Phenol und Guanidin-Isothiocyanat, die die Zellen auflöst und gleichzeitig die Ribonukleinsäuren stabilisiert. Zugabe von Chloroform trennt die Lösung in eine organische und eine wässrige, die RNA enthaltende Phase. Um eine Kontamination mit ubiquitär vorkommenden RNasen zu verhindern, wurden alle Schritte mit Handschuhen und RNase-freien Materialien durchgeführt.

2.3.2 Protokoll

Um RNase-freies Wasser zu erhalten, wurde Wasser mit 0,01% DEPC versetzt, über Nacht stehen gelassen und anschließend autoklaviert.

Die Zellschälchen (6 cm) wurden mit 1,7 ml Trizol beschichtet und mehrfach mit einer Pipette abgespült. Das Homogenisat wurde in ein Reaktionsgefäß überführt und 5 Minuten bei 30°C inkubiert, um die vollständige Trennung von Nukleinsäuren und Proteinen zu gewährleisten. Nach Zugabe von 340 µl Chloroform und kräftigem Schütteln wurden die Reaktionsgefäße erneut für 2 Minuten bei 30°C inkubiert. Nach 15-minütiger Zentrifugation mit 10.000 U/ min bei 4°C erhielt man eine untere Phenol- und eine obere wässrige Phase. Die letztere wurde vorsichtig abgenommen und in ein frisches Eppendorf-Reaktionsgefäß überführt. In diesem wurde durch Zugabe von 850 µl Isopropanol die RNA gefällt. Nach Sedimentierung durch 30-minütige Zentrifugation bei 12.000 U/ min und 4°C wurde der Überstand sorgfältig entfernt. Das Pellet wurde zweimal mit 75% Ethanol gewaschen und abschießend kurz bei 30°C luftgetrocknet. Das RNA-Pellet wurde in RNase-freiem Wasser gelöst und im Photometer vermessen. Die Konzentrationsbestimmung erfolgte durch Spektralphotometrie bei einer Wellenlänge von 260 nm, wobei 1 OD260 40 µg RNA/ ml entsprechen (Sambrook et al., 1989).

2.4 PCR

2.4.1  Materialien

↓35

  • Erststrang-Synthese-Kit

1st Strand cDNA Synthesis Kit, Katalog-Nr. 1483188

Roche

  • Cycler

Mastercycler

Eppendorf

  • Amplitaq Gold DNA Polymerase

5 Einheiten/ µl

Applied
Biosystems

2.4.2 Erststrang-Synthese

Da die Polymerase-Kettenreaktion (PCR) nur mit DNA durchgeführt werden kann, wurde die isolierte RNA mittels einer reversen Transkriptase in cDNA umgeschrieben. Durch den Einsatz von Oligo-dT-Primern werden nur polyadenylierte mRNA-Stränge umgeschrieben.

Diese Erststrangsysthese wurde mit einem Kit von Roche durchgeführt. Es wurden 2 µg RNA eingesetzt; das Reaktionsvolumen betrug 20 µl je Ansatz (10 mM Tris, 50 mM KCl, 5 mM MgCl2, 1 mM je dNTP (Desoxynukleosidtriphosphat), 0,04 A260 Einheiten Oligo-p(dT)15, 50 Einheiten/ Ansatz RNasin und mindestens 12 Einheiten/ Ansatz AMV (Avian-Myeloblastosis-Virus)-Reverse-Transkriptase). Die Ansätze wurden zur Primeranlagerung 10 Minuten bei 25°C inkubiert, im Anschluß eine Stunde auf 42°C gehalten, um der RT optimale Bedingungen zu gewährleisten, und danach 5 Minuten bei 94°C denaturiert.

2.4.3 Prinzip der PCR

↓36

Die 1983 von Kary Mullis entwickelte Polymerase-Kettenreaktion erlaubt es spezifische DNA-Sequenzen in kurzer Zeit enorm zu vervielfältigen. Zur Amplifikation eines spezifischen DNS-Fragmentes benötigt man lediglich zwei Primer, die diese Sequenz einschließen, eine hitzeresistente DNA-Polymerase und die vier DNA spezifischen dNTPs. Durch bis zu 40 Zyklen der drei Phasen

entstehen in exponentieller Geschwindigkeit Doppelstränge der DNA-Sequenz zwischen den Primern.

↓37

Der Ansatz kann in einem Agarosegel aufgetrennt werden; die Bandenstärke dient als semiquantitativer Maßstab für die Menge der Ausgangs-DNA.

2.4.4 Protokoll

Die Amplifikation der cDNA mittels PCR erfolgte in einem Gesamtvolumen von 50 µl in folgendem Standardansatz:

↓38

Für GRα und β konnte der gleiche 5‘ Primer verwendet werden. Beide Primerpaare sind exonüberspannend gewählt, so dass bei eventueller Kontamination der RNA-Präparation mit genomischer DNA ein längeres, da intronenthaltendes Amplifikationsprodukt entstehen würde. Daher konnte auf einen Verdau mit DNase verzichtet werden.

Tabelle 5: Primersequenzen

3‘ Primer

5‘ Primer

GRβ: GCT TTC TGG TTT TAA CCA CA

GRα: TTT CCA TTT GAA TAT TTT GG

GRα und β:

GAA TGA CTC TAC CCT GCA TG

Nach einer ersten 10-minütigen Denaturierung der DNA und Aktivierung der Polymerase bei 94°C wurden 40 Zyklen mit folgenden Parametern durchgeführt:

↓39

Zur Komplettierung angefangener DNA-Ketten durch die DNA-Polymerase wurde abschließend die Temperatur für 10 Minuten auf 72°C gehalten.

2.4.5 Analyse von PCR-Fragmenten

Die DNA ist bei neutralem pH durch ihre Phosphatgruppen negativ geladen und wandert deshalb zur Anode. Wenn diese Bewegung durch ein Agarosegel erschwert wird, trennt sich die DNA der Größe nach auf. Ethidiumbromid lagert sich in die doppelsträngige DNA ein (sog. Interkalation), wodurch es eine deutliche Fluoreszenzverstärkung erfährt. Daraus resultieren im UV-Licht Banden, deren Größe und Intensität zur Quantifizierung dienen.

↓40

Jeweils 10 µl der Ansätze wurden in einem 2%-igem Agarosegel in 1 x TAE-Puffer elektrophoretisch aufgetrennt. Das Gel enthielt 0,7 µg Ethidiumbromid/ ml. Die Spannung betrug 150 V, die Elektrophoresezeit ca. 60 min.

2.5 Transiente Transfektion

2.5.1  Prinzip

Als transiente Transfektion wird die vorübergehende Einschleusung von Fremd-DNA in eukaryontische Zellen bezeichnet.

Um die Zellen schonend und effizient zu transfizieren, wurde die Methode der Lipofektion gewählt. Es wurde mit dem „Effectene Transfection Reagent“ von Qiagen gearbeitet. Das Prinzip dieses Reagenz beruht auf der Kondensation der zu transfizierenden DNA mit Hilfe eines Verstärkers (Enhancers) unter definierten Pufferbedingungen (EC-Puffer). Das zugefügte Effectene-Reagenz assoziiert sich mit der kondensierten DNA und formt auf diese Weise spontan Mizellen gleicher Größe und Struktur, was zu einer besonders hohen und reproduzierbaren Transfektionseffizienz führen soll. Die mit DNA beladenen Phospholipidpartikel verschmelzen mit der Zellmembran und setzen die DNA ins Zellinnere frei. Von dort aus gelangt sie in den Zellkern, wo sie transkribiert wird, was schließlich auch zur Proteinexpression führt.

2.5.2 Protokoll

↓41

0,5 bis 1 µg des GRE-luc-Reportergen-Konstrukts wurden in 150 µl EC-Puffer verdünnt, mit 4 µl Enhancer versetzt und 5 Minuten bei Raumtemperatur inkubiert. Zur kondensierten DNA wurden 10 µl Effectene gegeben, dann wurde kurz geschüttelt und für 10 Minuten bei RT zur Mizellenbildung inkubiert. Währenddessen wurden die mit PBS gewaschenen Zellen in 6-cm-Zellkulturschalen mit 4 ml Optimem Medium von Gibco überschichtet. Nach Zugabe von 500 µl Optimem wurden die Ansätze vorsichtig tropfenweise auf die zu ca. 70% konfluenten Zellen pipettiert. Für 6 Stunden wurden die Zellen im Brutschrank bei 37°C inkubiert und danach das Medium durch 3 ml RPMI mit 1% FCS und 1% Penicillin/ Streptomycin ersetzt. Nach weiteren 24 Stunden im Brutschrank wurden die Zellen mit Relaxin stimuliert.

2.6 GRE-Luziferase-Messungen

2.6.1  Prinzip

Der verwendete pGRE-luc Vektor (siehe Abbildung 6) ist ein Konstrukt aus dem „Glucoorticoid Response Element“ und dem Gen des Enzyms Luziferase. Dieses vielverwendete Reportergen entstammt der südamerikanischen Feuerfliege, Photinus pyralis. Es kann eine Reaktion mit einem Luziferin genannten Substrat katalysieren, welche unter Lichtemission erfolgt. Bei Zugabe von Substrat im Überschuss ist die Menge des emittierten Lichtes proportional zur transkriptionellen Aktivität des vorgeschalteten GRE und somit ein Marker für die Aktivierung des GR.

Abbildung 6: Aufbau des pGRE-Luziferase Vektors mit Schnittstellen für Restriktionsendonukleasen (aus BD Biosciences Clontech, 2002).

2.6.2 Protokoll

↓42

Die Messungen wurden mit dem „Luciferase Assay Kit“ von Promega durchgeführt. Um die Luziferaseaktivität zu quantifizieren, wurden die Zellen nach dem Ende der Stimulation mit PBS gewaschen und in 250 µl Reporter-Lysispuffer lysiert. Nach Abschaben und Überführen der Zellreste in ein Reaktionsgefäß wurde das Lysat 15 Sekunden intensiv geschüttelt und zwei Minuten bei 4°C und 12.000 U/ min zentrifugiert.Zwanzig µl des Überstandes wurden mit 100 µl des Luziferase-Substrates in ein Reaktionsgefäß überführt und sofort für 15 Sekunden im Flüssig-Szintillationszähler „Wallac 1409“ (PerkinElmer Wallac) im 32P-Fenster gemessen.

2.7 Radioligandenbindung

  • [1,2,4,6,7-3H]Dexamethason

Gelöst in Ethanol;
70-110 Ci/mmol

Amersham

2.7.1  Prinzip

Zur Quantifizierung der Rezeptormenge wurde eine Sättigungsanalyse angewandt, bei der den endogenen Rezeptoren ein radioaktiv markierter Ligand in aufsteigender Konzentration angeboten wird. Um die Bindungskapazität des Glukokortikoidrezeptors im Zytoplasma zu bestimmen, wurde mit Tritium markiertes Dexamethason (siehe Abbildung 7) verwendet.

↓43

Abbildung 7: Struktur des hochpotenten, synthetischen Glukokortikoids Dexamethason. Das im Rahmen der Radioligandenbindung-Experimente verwendete Glukokortikoid ist an den Positionen 1, 2, 4, 6 und 7 mit Tritium markiert.

Zur Unterscheidung von spezifischer Bindung des markierten Dexamethasons an den Rezeptor und unspezifischer Bindung im Zellinneren wurden in einem Parallelansatz durch die Zugabe der ca. 100-fachen Menge (10 µmol/ l) an nicht markiertem Hormon alle Bindungsstellen vor Inkubation mit 3H-Dexamethason abgesättigt. Die dort gemessene Aktivität entsprach der Größe der unspezifischen Bindung (BNS), mit deren Hilfe sich die spezifische Bindung (BS) an den GR errechnen lässt:

Gesamtbindung (BG) – unspezifische Bindung (BNS) = spezifische Bindung (BS).

↓44

Mit steigender Konzentration des 3H-Dexamethasons nimmt die spezifische Bindung zunächst zu, bis sie einen Sättigungsbereich erreicht, in dem die Rezeptorbindungsstellen belegt sind und es dadurch zu keinem weiteren Anstieg der BS kommt (siehe Abbildung 8). Dieser Punkt ist daher ein Maß für die Rezeptorkonzentration (Bmax) in der Zelle.

Abbildung 8: Spezifische, unspezifische und Gesamtbindung in Abhängigkeit von der Ligandenkonzentration.

2.7.2 Berechnung der Rezeptorkonzentration und der Dissoziationskonstanten

Abbildung 9: Spezifische Bindung in Abhängigkeit von der Ligandenkonzentration. Bmax = maximal an Rezeptor gebundenes Hormon. Kd = Dissoziationskonstante, entspricht der Ligandenkonzentration bei 50%-iger Rezeptorbindung.

↓45

Die Rezeptorkonzentration (Bmax) und die Dissoziationskonstante (Kd) können aus der Kurve der spezifischen Bindung bestimmt werden. Voraussetzung dafür ist, dass die Bindung dem Massenwirkungsgesetz folgt und ein Sättigungsgleichgewicht eingetreten ist.

Es sei:

F = freies Hormon

↓46

B = an Rezeptor gebundenes Hormon

Bmax = maximal an Rezeptor gebundenes Hormon

Dann ist Kd folgendermaßendefiniert (Green und Leake, 1987):

↓47

(1)

Die Kd ist also umgekehrt proportional zur Affinität eines Liganden zu seinem Rezeptor. Je kleiner die Kd, umso höher ist die Affinität.

Wenn nun B = ½ Bmax entspricht, folgt durch einsetzen in (1):

↓48

(2),

d.h. die Dissoziationskonstante entspricht der Konzentration des Hormons, bei der die Hälfte aller Rezeptoren mit dem Hormon besetzt sind (Kd = ½ Bmax).

Da beide Parameter (Bmax und Kd) aus der Sättigungskurve nur recht ungenau abzulesen sind, wurde zu exakten Bestimmung die Methode des Scatchardplots angewendet.

2.7.3 Darstellung nach Scatchardplot

↓49

Abbildung 10: Schema eines Scatchard Plots.

Scatchard (1949) stellte eine Gleichung zur linearen Transformation der Bindungsdaten auf, die eine graphische Ermittlung derselben zulässt. Im so genannten „Scatchard-Plot“, der sehr oft angewendet wird, um Radioligandenbindungsstudien quantitativ auszuwerten, ergibt sich aus der Auftragung des Quotienten aus spezifisch gebundenem und freiem Hormon (Ordinate) gegen spezifisch gebundenes Hormon (Abszisse) im Idealfall eine entsprechende Gerade mit negativer Steigung. Die Steigung entspricht dem negativen Kehrwert von Kdund der Schnittpunkt mit der X-Achse ist Bmax .

Die Voraussetzung für einen linearen Verlauf im Scatchard-Plot ist, dass der Ligand sich an nur einen Rezeptor mit einer konstanten Affinität bindet, so dass keine Kooperativitätsphänomene auftreten (Kd bleibt konstant).

↓50

Allgemein bleibt festzuhalten, dass die bestimmten Bmax und Kd nur apparente Größen sind, da die Zelle eine „black box“ darstellt und man nicht weiß, welche Hormonmenge tatsächlich am Rezeptor wirkt.

2.7.4 Protokoll

HeLa-Zellen wurden in 12-Well-Platten ausplattiert und bei Erreichen der 70%-igen Konfluenz für ca. 16 Stunden auf RPMI-Medium mit 0,5% FCS, 0,02 M NaOH, 0,01 mol/ l HEPES und 0,075% NaHCO3 gesetzt. Von den THP-1-Zellen wurden jeweils ca. 1 ∙ 106 Zellen je 12er Well ausgesät.

Beide Zelllinien wurden 4 bzw. 24 Stunden mit 10 nmol/ l RLX stimuliert, wonach das Medium durch frisches ersetzt wurde. Nun wurden die HeLa-Zellen für zwei Stunden und die THP-1-Zellen für eine Stunde bei 37°C mit dem tritiierten Dexamethason inkubiert.

↓51

Im Anschluss wurden die Zellen fünfmal mit kaltem PBS gewaschen und mit 100-200 µl 100 nmol/ l Natronlauge lysiert. Das Zelllysat wurde nach Zusatz von jeweils 2 ml Szintillations-Cocktail im Scintillationszähler vermessen.

2.8 Zytokin-Messungen

2.8.1  Durchführung

Zur Induktion einer Entzündungsantwort wurden die Makrophagen mit Lipopolysachariden stimuliert. Diese Endotoxine kommen in der äußeren Membran der Zellwände gramnegativer Bakterien vor und sind potente Pyrogene. Eine der wichtigsten Folgereaktionen ist die Produktion von Zytokinen durch Makrophagen. Diese Immunantwort kann durch Inkubation mit anti-inflammatorischen Steroiden (z.B. Dexamethason) gehemmt werden. RU-486 ist ein Progesteron- und Glukokortikoidrezeptor-Antagonist, der so die entzündungshemmende Wirkung von Rezeptor-Liganden aufheben kann.

Als Parameter für die Stärke der Aktivierung der Entzündungskaskade wurden die TNFα-Spiegel im Überstand der Zellen mittels ELISA bestimmt.

2.8.2 Prinzip ELISA

↓52

Enzymimunoassay (EIA) ist die Bezeichnung für eine sowohl enzymatische als auch immunchemische, hochsensitive und spezifische Analysemethode zur Bestimmung von Antigenen, Antikörpern und Haptenen. Meist bedient man sich dabei der Festphasen-Technik des ELISA (enzyme-linked immunosorbent assay), wo das zu quantifizierende Antigen über einen so genannten „capture antibody“ an eine feste Phase gebunden wird (meist die Vertiefungen einer Mikrotiter-Platte). Durch Waschen entfernt man die nicht gebundenen Antigene und gibt einen Antigen-spezifischen Erst-Antikörper hinzu, wäscht erneut und quantifiziert die Menge des Antigens durch Zugabe eines markierten Zweit-Antikörpers. Die untere Nachweisgrenze des verwendeten Systems liegt bei 5 pg/ ml.

Die Versuche wurden mit dem DuoSet-ELISA Development System von R&D Systems durchgeführt. Dieses System bedient sich des Biotin-Strepavidin-Systems. An das mit einem TNFα-spezifischen Antikörper gekoppelte Botin bindet nicht-kovalent das mit einer Meerrettich-Peroxidase (HRP) markierte Streptavidin mit hoher Affinität. Als Substrat für die HRP dient Wasserstoffperoxyd (H2O2) und Tetramethylbenzidin (TMB). Es entsteht ein blauer Farbstoff. Durch Zugabe von Schwefelsäure (H2SO4) wird die Reaktion gestoppt und der Farbstoff von blau in gelb überführt. Die Messung der Adsorption erfolgte bei 450 nm.

2.8.3 Zellstimulation

Je Vertiefung einer 24-Well-Platte wurden ca. 3 ∙ 105 THP-1-Suspensionszellen in 1,5 ml ATCC Medium ausplattiert. Um die Differenzierung zu Makrophagen auszulösen, wurde direkt im Anschluss mit 6 µl Phorbolmyristatacetat (PMA, 20 ng/ ml; Sigma) stimuliert.

↓53

Nach 72 Stunden wurden die nun adhärenten Makrophagen dreimal mit ATCC-Medium gewaschen, mit 1,5 ml frischem ATCC-Medium bedeckt und 24 Stunden ruhen gelassen. Eine Stunde vor Stimulationsbeginn wurden die Zellen auf ATCC-Medium mit nur 1% FCS gesetzt.

Um Einflüsse durch im Medium enthaltene Steroide auszuschließen, wurden die Versuche mit phenolrot- und steroidfreiem Medium wiederholt. Zur Entfernung der Steroide wurde das Medium „gestrippt“, d.h. 24 Stunden bei 4°C mit Aktivkohle inkubiert und anschließend zentrifugiert und filtriert.

Da die Kultur in steroidfreiem Medium einen relativ starken Stressor für die Zelle darstellt, wurde nicht ausschließlich in „gestripptem“ Medium gearbeitet..

2.8.4 Stimulanzien

↓54

  • Lipopolysacharide (LPS)

aus Salmonella abortus equi

Sigma

  • Dexamethason

Sigma

  • Ethanol (Lösungsmittel für Dexa)

Merck

  • Relaxin

Immundiagnostik

  • RU-486 (Mifepristone)

Biomol

2.8.5 Materialien ELISA

  • TNFα Capture Antibody

4 µg/ ml Maus anti-human AK in PBS

R&D Systems

  • TNFα Detection Antibody

300 ng/ ml in 1% ATCC Medium

R&D Systems

  • Wasch-Puffer

0,05% Tween 20 in PBS
pH 7,2-7,4

R&D Systems

  • TNFα Standard

70 ng/ ml

R&D Systems

  • BSA

Rinderalbumin Fraktion V, proteasefrei

Sigma

  • Block-Puffer

1% BSA, 5% Sacharose in PBS mit 0,05% NaN3

  • Substrat-Lösung

1 zu 1 Mischung von Color Reagent A (H2O2) und Color Reagent B (TMB)

R&D Systems

  • Stopp-Lösung

1 M H2SO4

R&D Systems

  • Mikrotiterplatte

Nunc-Immuno-Platte mit 96 Vertiefungen (Wells) und MaxiSorp-Oberfläche

NUNC

  • Software

WinRead 2.10

anthos labtec

  • Photometer

Absorptionsphotometer „ht III“

anthos labtec

2.8.6 Protokoll ELISA

Als erstes wurde eine Zellkulturplatte mit dem Capture-Antikörper beschichtet. Dazu wurden 100 µl der Capture-AB-Lösung je 96-well pipettiert. Die Platte wurde versiegelt und über Nacht bei Raumtemperatur inkubiert. Am nächsten Tag wurden die Wells dreimal mit jeweils 400 µl Waschpuffer gewaschen und im Anschluss mit 300 µl Block-Puffer beschichtet. Nach mindestens einer Stunde bei Raumtemperatur wurde erneut dreimal gewaschen. Die Proben wurden mit 1%-igem ATCC-Medium verdünnt, so dass die Zytokinspiegel im geeichten Messbereich lagen. Jeweils 100 µl wurden in die Vertiefungen pipettiert. Nach 2 Stunden wurde wieder dreimal gewaschen und 100 µl Detektionslösung hinzugegeben. Die versiegelte Zellkulturplatte wurde erneut 2 Stunden bei RT inkubiert und anschließend dreifach gewaschen. Nun wurden 100 µl des Streptavidin-Peroxidase-Komplex hinzugegeben und 20 Minuten lichtgeschützt bei Raumtemperatur inkubiert. Erneut wurde dreimal gewaschen und 100 µl der Substratlösung hinzugegeben. Nach 20 Minuten wurde die Reaktion mit 50 µl Stopplösung beendet und sofort die optische Dichte im Photometer bei 450 nm bestimmt. Um optische Fehler in der Platte zu korrigieren, wurden die Messwerte bei 570 nm abgezogen. Für jede Platte wurde eine eigene Standardkurve erzeugt. Alle Standards und Proben wurden als Doppelwerte bestimmt.

2.9 Statistische Auswertung

↓55

Die ermittelten Daten wurden mit der Software SigmaStat (Version 2.0, Jandel Corporation © 1992-1995) statistisch ausgewertet. Die Diagramme des Ergebnisteils wurden mit der Software SigmaPlot (Version 8.0, SPSS Inc. © 1986-2001) erstellt. Eine Irrtumswahrscheinlichkeit für einen Fehler 1. Art von p < 0,05 wird als signifikant angesehen. Die angegebenen Abweichungen entsprechen dem Standardfehler der Mittelwerte (SEM).

Mit Hilfe einer nichtparametrischen eindimensionalen Kruskal-Wallis-Varianzanalyse (one-way ANOVA) wurden folgende Experimente ausgewertet: Sekretion von TNFα in THP-1-Zellen (4.1.), GRE-Luziferase-Assay (4.4.), K d und B max im 3H-Dexamethason-Assay (4.7.) (Bortz et al., 1990).

Nachfolgende Versuche wurden mit einer nichtparametrischen zweidimensionalen Varianzanalyse (two-way ANOVA) analysiert: Regulation der GR-mRNA (4.5.) und des GR-Proteins (4.6.), 3H-Dexamethason-Sättigungsbindung im Gesamtzellassay (4.7.) (Bortz et al., 1990).

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In jedem Fall wurde nach einem globalen Test ein multipler Vergleich mit Bonferroni-Holm-Adjustierung von P durchgeführt (Holm, 1979).


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03.11.2006