3 Ergebnisse

↓56

3.1  TNFα-Expression

Zunächst erfolgte die funktionelle Prüfung der Hypothese, dass Relaxin einen immunmodulatorischen Effekt, hat am Beispiel der Zytokinproduktion in THP-1-Zellen. Die Zellen wurden mit LPS zur Auslösung einer Inflammationsantwort behandelt. Als Parameter für deren Stärke wurde der TNFα-Spiegel mittels ELISA bestimmt.

In Konzentrationsreihen über 8 h und 48 h konnte die Konzentration von 100 ng/ ml LPS als optimal zur Stimulierung der Ausschüttung von TNFα bestimmt werden (siehe Abbildung 11).

↓57

Abbildung 11: Sekretion von TNFα durch THP-1-Zellen in Abhängigkeit von der LPS-Konzentration. Die Stimulation erfolgte über 8 h bzw. 48 h (n = 3). Die TNFα-Spiegel wurden mittels ELISA bestimmt (p < 0,05, #: vs. Kontrolle, *: vs. 1 ng/ ml LPS).

Durch weitere Vorversuche mit Relaxin-Konzentrationen von 0,1, 1, 10 und 100 nmol/ l,konnte ein Maximaleffekt des Relaxins in THP-1-Zellen ab 10 nmol/ l festgestellt werden (Daten nicht gezeigt). Um die Menge des benötigten Relaxins zu reduzieren, wurde für die nachfolgenden Versuche eine Konzentration von 1 nmol/ l verwendet, welche einen mittleren Dosis-Wirkungs-Bereich repräsentiert. Dexamethason und RU-486 waren in Ethanol gelöst. Die resultierenden Lösungsmittelkonzentrationen allein hatten keinen Einfluss auf die Zellen (Daten nicht gezeigt).

Der TNFα-Anstieg nach Stimulation mit LPS konnte durch Koinkubation mit 100 nmol/ l Dexamethason um 70% (8 h), 74% (24 h) und 67% (48 h) verringert werden. Die Anwesenheit von 10 nmol/ l Relaxin verringerte die Spiegel um 55% (8 h), 60% (24 h) und 51% (48 h). Dieser Effekt wurde durch den GR-Antagonisten RU-486 sowohl bei Dexamethason als auch bei Relaxin nahezu vollständig aufgehoben (siehe Abbildung 12, Abbildung 13 und Abbildung 14).

↓58

Abbildung 12: Sekretion von TNFα durch THP-1-Zellen nach 8-stündiger LPS-Stimulation. Einfluss von Relaxin, Dexamethason und RU-486 (n = 10; K: Kontrolle; LPS: 10 nmol/ l Lipopolysacharide; RLX: 1 nmol/ l Relaxin; DX: 100 nmol/ l Dexamethason; RU: 0,5 µmol/ l RU-486, p < 0,05, #: vs. Kontrolle, *: vs. LPS).

Abbildung 13: Sekretion von TNFα durch THP-1-Zellen nach 24-stündiger LPS-Stimulation. Einfluss von Relaxin, Dexamethason und RU-486 (n = 10; K: Kontrolle; LPS: 10 nmol/ l Lipopolysacharide; RLX: 1 nmol/ l Relaxin; DX: 100 nmol/ l Dexamethason; RU: 0,5 µmol/ l RU-486, p < 0,05, #: vs. Kontrolle, *: vs. LPS).

Abbildung 14: Sekretion von TNFα durch THP-1-Zellen nach 48-stündiger LPS-Stimulation. Einfluss von Relaxin, Dexamethason und RU-486 (n = 10; K: Kontrolle; LPS: 10 nmol/ l Lipopolysacharide; RLX: 1 nmol/ l Relaxin; DX: 100 nmol/ l Dexamethason; RU: 0,5 µmol/ l RU-486, p < 0,05, #: vs. Kontrolle, *: vs. LPS).

↓59

Um Wechselwirkungen mit im Medium vorhandenen endogenen Steroidhormonen auszuschließen, wurden die Versuche in steroidfreiem („gestripptem“) Medium wiederholt. Dort zeigten sich gleiche Ergebnisse: eine deutliche Erniedrigung des TNFα-Spiegels durch Dexamethason und Relaxin und eine Neutralisierung dieses Effektes durch den GR-Antagonisten (siehe Abbildung 15, Abbildung 16 und Abbildung 17). Da die Kultivierung in steroidfreiem Medium keine optimalen Bedingungen für die Zellen darstellt, und sich morphologische Veränderungen der Zellen wie Vakuolenbildung und zum Teil auch Ablösung zeigen, war es sinnvoll, die Versuche nicht bereits primär in steroidfreiem Medium durchzuführen.

Abbildung 15: Sekretion von TNFα durch THP-1-Zellen nach 8-stündiger LPS-Stimulation in steroidfreiem Medium. Einfluss von Relaxin, Dexamethason und RU-486 (n = 10; K: Kontrolle; LPS: 10 nmol/ l Lipopolysacharide; RLX: 1 nmol/ l Relaxin; DX: 100 nmol/ l Dexamethason; RU: 0,5 µmol/ l RU-486, p < 0,05, #: vs. Kontrolle, *: vs. LPS).

Abbildung 16: Sekretion von TNFα durch THP-1-Zellen nach 24-stündiger LPS-Stimulation in steroidfreiem Medium. Einfluss von Relaxin, Dexamethason und RU-486 (n = 10; K: Kontrolle; LPS: 10 nmol/ l Lipopolysacharide; RLX: 1 nmol/ l Relaxin; DX: 100 nmol/ l Dexamethason; RU: 0,5 µmol/ l RU-486, p < 0,05, #: vs. Kontrolle, *: vs. LPS).

↓60

Abbildung 17: Sekretion von TNFα durch THP-1-Zellen nach 48-stündiger LPS-Stimulation in steroidfeiem Medium. Einfluss von Relaxin, Dexamethason und RU-486 (n = 10; K: Kontrolle; LPS: 10 nmol/ l Lipopolysacharide; RLX: 1 nmol/ l Relaxin; DX: 100 nmol/ l Dexamethason; RU: 0,5 µmol/ l RU-486, p < 0,05, #: vs. Kontrolle, *: vs. LPS).

Diese Befunde zeigten deutlich einen die Ausschüttung von TNFα-hemmenden Effekt des Relaxins, der analog zum Effekt von Dexamethason durch einen GR-Antagonisten aufgehoben werden konnte. Diese Experimente deuteten daher auf eine Wirkung des Relaxins über den Glukokortikoidrezeptor hin. Deshalb schlossen sich Untersuchungen zur Wechselwirkung von Relaxin mit Glukokortikoidrezeptor an.

3.2 Koimmunpräzipitation

Bei der Präzipitierung mit Glukokortikoidrezeptor-Antikörpern und folgender Auftrennung des Präzipitates mit der SDS-Polyacrylamid-Gelelektrophorese (SDS-PAGE) konnten regelmäßig Relaxin-Banden detektiert werden. Für die mit dem Glukokortikoidrezeptor assoziierten Hitzeschockproteine HSP70 und HSP90 wurden ebenfalls durchgängig deutliche Banden festgestellt (siehe Abbildung 18a). Das Verfahren der Koimmunpräzipitation ist quantitativ nur sehr eingeschränkt zu beurteilen, jedoch scheint eine Inkubation mit Relaxin für 30 Minuten die Menge des mit dem Glukokortikoidrezeptor kopräzipitierten Relaxins zu erhöhen.

↓61

Die Koimmunpräzipitation mit Relaxin-Antikörpern zeigte (siehe Abbildung 18b) eine Bande für den Glukokortikoidrezeptor, die nach Relaxin-Behandlung stärker ausgeprägt war.

Abbildung 18: Immunpräzipitation aus HeLa-Zelllysat (Relaxin: 10 nmol/ l Relaxin über 30 Minuten) mit AK gegen a) den GR und b) Relaxin sowie nachfolgende Auftrennung der Präzipitate und Analyse der Kopräzipitation im Western Blot (repräsentatives Beispiel von n = 3 Versuchen).

Diese Befunde zeigen, dass Relaxin an den Glukokortikoidrezeptor selbst oder an mit dem Rezeptor assoziierte Proteine bindet.

3.3 Verteilung von Glukokortikoidrezeptoren und Relaxin in Zytoplasma und Zellkern

↓62

Um differenziertere Befunde zur Verteilung des Glukokortikoidrezeptors und des Relaxins im Zytoplasma und im Zellkern zu erhalten, wurde eine Zeitkinetik mit HeLa-Zellen durchgeführt. Die Zellen wurden bei der Lyse in Kern- und Zytoplasmaextrakte aufgetrennt. Die Extrakte wurden in Western Blots mit einem GR- bzw. Relaxin-Antikörper verarbeitet.

3.3.1  Verteilung des Glukokortikoidrezeptors

Dexamethason führte nach 30 Minuten zu einem massiven Glukokortikoidrezeptor-Anstieg im Kern, die Rezeptormenge im Zytoplasma hingegen änderte sich kaum.

Nach Relaxin-Stimulation stieg die Glukokortikoidrezeptor-Menge im Kern ebenfalls nach 30 Minuten an und sank dann unter den Ausgangswert. Im Zytoplasma bewirkte Relaxin bereits nach 30 Minuten einen Anstieg der Rezeptor-Proteinmenge, der sich nach einer und vier Stunden noch verstärkte (siehe Abbildung 19).

↓63

Abbildung 19: Zeitkinetik der Glukokortikoidrezeptorprotein-Menge in Kern-/ Zytoplasmaextrakten nach Stimulation mit 10 nmol/ l Relaxin und 100 nmol/ l Dexamethason (repräsentatives Beispiel von n = 3 Versuchen).

3.3.2 Verteilung des Relaxins

Zeitgleich mit dem Ansteigen des Glukokortikoidrezeptors im Kern 30 Minuten nach Stimulation mit Relaxin, findet man dort auch eine Erhöhung des Relaxinspiegels. Danach fällt die Relaxinmenge im Kern wieder auf ihr Ausgangsniveau zurück. Im Zytoplasma bleibt der Relaxinspiegel in etwa gleich (siehe Abbildung 20).

Abbildung 20: Zeitkinetik der Relaxinprotein-Menge in Kern-/ Zytoplasmaextrakten nach Stimulation mit 10 nmol/ l Relaxin (repräsentatives Beispiel von n = 3 Versuchen).

3.4 Bestimmung der Luziferaseaktivität als Marker für die Aktivierung des Glukokortikoidrezeptors

↓64

Zur Untersuchung der Fragestellung, ob die Bindung des Relaxins an den Glukokortikoidrezeptor-Komplex auch zu seiner Aktivierung führt, wurden HeLa- und THP-1-Zellen transient mit einem GRE-luc Vektor transfiziert. Dadurch führte jede Stimulation der „glucocorticoid response elements“ der DNA durch den aktivierten Glukokortikoidrezeptor zu einer verstärkten Expression der Luziferase.

Aufgrund der Zeit- und Konzentrationskinetiken (siehe Abbildung 21 und Abbildung 22) wurden für die folgenden Untersuchungen eine Expositionsdauer von 4 Stunden und eine Relaxinkonzentration von 10 nmol/ l gewählt.

Abbildung 21: Zeitkinetik der Luziferaseaktivität in mit GRE-luc transient transfizierten HeLa-Zellen (n = 3; Relaxinkonzentration 10 nmol/ l; 100% = ohne Relaxinexposition, p < 0,05, #: vs. Kontrolle, *: vs. 3 h).

↓65

Abbildung 22: Einfluss der Relaxinkonzentration auf die Luziferase-Aktivität in mit GRE-luc transient transfizierten HeLa-Zellen (n = 3; Expositionsdauer 4 Stunden, p < 0,05, #: vs. Kontrolle).

Die Luziferase-Aktivität in HeLa-Zellen erhöhte sich nach vierstündiger Inkubation mit 100 nmol/ l Dexamethason um den Faktor 11, 10 nmol/ l Relaxin bewirkte eine Steigerung um den Faktor 7. Die Koinkubation mit 0,5 µmol/ l RU-486 verringerte die Aktivitätszunahme um 61% bei Dexamethason und 29% bei Relaxin. Bei 2,5 µmol/ l RU-486 wurde konnte kein signifikanter Aktivitätsanstieg durch Dexamethason oder Relaxin mehr nachgewiesen werden (siehe Abbildung 23).

Abbildung 23: Aktivität der Luziferase in mit GRE-luc transient transfizierten HeLa-Zellen nach vierstündiger Behandlung mit Dexamethason, Relaxin und RU-486 (n = 3; K: Kontrolle; RU 5: 0,5 µmol/ l RU-486; RU 25: 2,5 µmol/ l RU-486; DX: 100 nmol/ l Dexamethason, p < 0,05, #: vs. Kontrolle, *: vs. DX bzw. RLX).

↓66

Wie aus Abbildung 24 ersichtlich ergaben die Versuche mit THP-1- Zellen ähnliche Befunde. Die Aktivitätszunahme der Luziferase nach vierstündiger Inkubation mit Dexamethason bzw. Relaxin war 8- bzw. 5-fach. Durch 0,5 µmol/ l RU-486 wurde der Anstieg um 64% bei Dexamethason und 57% bei RU-486 verringert. In der höheren Konzentration von 2,5 µmol/ l RU-486 kam es zu keiner signifikanten Aktivitätszunahme durch Dexamethason oder Relaxin.

Abbildung 24: Aktivität der Luziferase in mit GRE-luc transient transfizierten THP-1-Zellen nach vierstündiger Behandlung mit Dexamethason, Relaxin und RU-486 (n = 3; K: Kontrolle; RU 5: 0,5 µmol/ l RU-486; RU 25: 2,5 µmol/ l RU-486; DX: 100 nmol/ l Dexamethason, p < 0,05, #: vs. Kontrolle, *: vs. DX bzw. RLX).

3.5 Regulation des Glukokortikoid-Rezeptors durch Relaxin auf mRNA-Ebene

Nach diesen Hinweisen auf Aktivierung des Glukokortikoidrezeptors durch Relaxin folgten Versuche, in denen die Beeinflussung der Rezeptor-Expression durch Relaxin untersucht wurde.

↓67

Dazu wurden HeLa- bzw. THP-1-Zellen für 0,5, 1, 2 und 4 Stunden mit 10 nmol/ l Relaxin bzw. für 6 Stunden mit 100 nmol/ l Dexamethason stimuliert und anschließend die RNA extrahiert. Um festzustellen, ob die Effekte durch Bindung an den Glukokortikoidrezeptor vermittelt sind, wurden die Untersuchungen mit 0,5 µmol/ l RU-486 wiederholt.

Repräsentative Ergebnisse (aus n = 4 Versuchen) der PCR zeigt Abbildung 25.

Abbildung 25: GAPDH-, GRα- und GRβ-mRNA-Expression in HeLa- und THP-1-Zellen. Inkubation mit 10 nmol/ l Relaxin für 0,5, 1, 2 und 4 Stunden bzw. mit 100 nmol/ l Dexamethason für 6 Stunden. Rechts zusätzlich mit 0,5 µmol/ l RU-486 inkubiert.

↓68

Zur Quantifizierung wurden die Banden densitometrisch ausgewertet und auf das Gen GAPDH abgeglichen.

Die sechsstündige Inkubation mit Dexamethason in HeLa-Zellen hatte eine 33%-ige Abnahme der Expression zur Folge. Die Stimulation mit Relaxin führte zur signifikanten mRNA-Expressionssteigerung des GRα in HeLa-Zellen um 95, 145, 200 bzw. 165% nach 0,5, 1, 2 bzw. 4 Stunden (siehe Abbildung 26). Die Ko-Inkubation mit RU-486 verhinderte signifikante Expressionsänderungen.

Abbildung 26: Expression der GRα-mRNA in HeLa-Zellen nach Stimulation mit Relaxin und RU-486 (n = 4, normiert auf GAPDH, 10 nmol/ l Relaxin, 0,5 µmol/ l RU-486, DX: 100 nmol/ l Dexamethason für 6 Stunden, p < 0,05, #: vs. Kontrolle).

↓69

Wie Abbildung 27 zeigt, veränderte sich die mRNA des GRβ nach Stimulierung mit Dexamethason nicht. Relaxin führte zu signifikanten Erhöhungen von 85 und 110% nach 2 und 4 Stunden. Der GR-Antagonist RU-486 senkte die Effekte auf ein nichtsignifikantes Niveau.

Abbildung 27: Expression der GRβ-mRNA in HeLa-Zellen nach Stimulation mit Relaxin und RU-486 (n = 4, normiert auf GAPDH, 10 nmol/ l Relaxin, 0,5 µmol/ l RU-486, DX: 100 nmol/ l Dexamethason für 6 Stunden, p < 0,05, #: vs. Kontrolle).

In THP-1-Zellen kam es durch die Inkubation mit Dexamethason zu einer signifikanten Verringerung der GRα-mRNA-Expression um 50%. Relaxin hingegen erhöhte die GRα-mRNA-Expression. Nach 30 Minuten war der Anstieg noch nicht signifikant, nach 1, 2 und 4 Stunden jedoch waren deutliche Steigerungen um 175, 215 und 230% festzustellen (siehe Abbildung 28). Auch hier unterdrückte RU-486 eine Änderung der Rezeptor-mRNA-Expression.

↓70

Abbildung 28: Expression der GRα-mRNA in THP-1-Zellen nach Stimulation mit Relaxin und RU-486 (n = 4, normiert auf GAPDH, 10 nmol/ l Relaxin, 0,5 µmol/ l RU-486, DX: 100 nmol/ l Dexamethason für 6 Stunden, p < 0,05, #: vs. Kontrolle).

Die mRNA-Expression von GRβ in THP-1-Zellen wurde weder von Dexamethason noch Relaxin mit oder ohne RU-486 signifikant beeinflusst (siehe Abbildung 29).

Abbildung 29: Expression der GRβ-mRNA in THP-1-Zellen nach Stimulation mit Relaxin und RU-486 (n = 4, normiert auf GAPDH, 10 nmol/ l Relaxin, 0,5 µmol/ l RU-486, DX: 100 nmol/ l Dexamethason für 6 Stunden).

3.6 Regulation des Glukokortikoidrezeptors durch Relaxin auf Proteinebene

↓71

Um zu überprüfen, ob die erhöhte Transkription des Glukokortikoidrezeptors auch eine erhöhte Proteinsynthese zur Folge hat, wurde das Verfahren des Western Blots gewählt.

Die detektierten Banden wurden densitometrisch ausgewertet und auf α-Actin abgeglichen.

In HeLa-Zellen resultierte die 24-stündige Inkubation mit Dexamethason in einer Abnahme der GR-Proteinmenge um 40%. Relaxin hingegen führte zu einer Erhöhung der relativen Proteinmenge des Glukokortikoidrezeptors in HeLa-Zellen um ca. 450% nach 4 Stunden und um 390% nach 24 Stunden (siehe Abbildung 30 und Abbildung 31). Auch auf Proteinebene wurden die Effekte von Dexamethason und Relaxin auf die GR-Expression durch RU-486 aufgehoben.

↓72

Abbildung 30: Western Blot nach 4- bzw. 24-stündiger Stimulation von HeLa-Zellen mit 10 nmol/ l Relaxin, 0,5 µmol/ l RU-486 bzw. 100 nmol/ l Dexamethason (repräsentatives Beispiel aus n = 3 Versuchen).

Abbildung 31: Veränderung der Glukokortikoidrezeptor-Proteinmenge in HeLa-Zellen nach 4- bzw. 24-stündiger Stimulation mit 10 nmol/ l Relaxin und 0,5 µmol/ l RU-486 bzw. 24-stündiger Inkubation mit 100 nmol/ l Dexamethason (DX), normiert auf α-Actin (n = 3, p < 0,05, #: vs. Kontrolle).

In THP-1-Zellen zeigte sich folgendes Bild: Dexamethason führte zu einer signifikanten Abnahme des GR-Protein-Gehaltes um 45%. Relaxin hingegen hatte einen 155%igen bzw. 205%igen Anstieg nach 4 bzw. 24 Stunden zur Folge (siehe Abbildung 32 und Abbildung 33). Die Ko-Inkubation mit RU-486 unterdrückte auch hier die Effekte von Dexamethason bzw. Relaxin auf die Rezeptorexpression.

↓73

Abbildung 32: Western Blot nach 4- bzw. 24-stündiger Stimulation von THP-1-Zellen mit 10 nmol/ l Relaxin, 0,5 µmol/ l RU-486 bzw. 100 nmol/ l Dexamethason (Repräsentatives Beispiel aus n = 3 Versuchen).

Abbildung 33: Veränderung der Glukokortikoidrezeptor-Proteinmenge in THP-1-Zellen nach 4- bzw. 24-stündiger Stimulation mit 10 nmol/ l Relaxin und 0,5 µmol/ l RU-486 bzw. 24-stündiger Inkubation mit 100 nmol/ l Dexamethason (DX), normiert auf α-Actin (n = 3, p < 0,05, #: vs. Kontrolle).

3.6.1  Steroidfreies Medium

Sowohl für die mRNA- als auch die Protein-Messungen waren die Ergebnisse (je n = 3) für „gestripptes“, steroidfreies Medium analog (Daten nicht gezeigt).

3.7 Sättigungskurven von 3H-Dexamethason

↓74

Als funktioneller Nachweis für eine relaxininduzierte Erhöhung der Anzahl bindungsfähiger Glukokortikoidrezeptoren in der Zelle wurde die spezifische Bindungskapazität (BS) für mit Tritium markiertes Dexamethason bestimmt.

In HeLa-Zellen stieg die spezifische Bindungals Maß für die Glukokortikoidrezeptor-Konzentration durch 4- bzw. 24-stündige Vorinkubation mit 10 nmol/ l Relaxin von 51 auf 110 bzw. von 61 auf 135 pmol/ Ansatz an. Durch RU-486 wurde die spezifische Bindung auf 20 pmol/ Ansatz erniedrigt (siehe Abbildung 34).

Abbildung 34: Sättigungskurve der spezifischen Bindung von 3H-Dexamethason in HeLa-Zellen und Veränderung durch Relaxin bzw. RU-486 (n = 3, Kontrolle: 2 Stunden mit entsprechender Menge an 3H-Dexamethason inkubiert, RLX 4 h: wie Kontrolle + vierstündige Vorbehandlung mit 10 nmol/ l Relaxin, RU-486: wie Kontrolle + 1 µmol/ l RU-486 während der Inkubation, p < 0,05, #: vs. Kontrolle).

↓75

Bei den THP-1-Zellen kam es ebenfalls zu einer deutlichen Erhöhung der Rezeptoranzahl. Die Bmaxstieg nach vierstündiger Vorbehandlung mit Relaxin von 161 auf 301 pmol/ Ansatz und nach 24-stündiger Relaxin-Inkubation von 144 auf 311 pmol/ Ansatz. Durch RU-486 wurde die spezifische Bindung auf 25 pmol/ Ansatz erniedrigt (siehe Abbildung 35).

Abbildung 35: Sättigungskurve der spezifischen Bindung von 3H-Dexamethason in THP-1-Zellen und Veränderung durch Relaxin bzw. RU-486 (n = 3, Kontrolle: 1 Stunde mit entsprechender Menge an 3H-Dexamethason inkubiert, RLX 24 h: wie Kontrolle + 24-stündige Vorbehandlung mit 10 nmol/ l Relaxin, RU-486: wie Kontrolle + 1 µmol/ l RU-486 während der Inkubation, p < 0,05, #: vs. Kontrolle).

Die Dissoziationskonstante Kd wurde durch die Stimulation mit Relaxin nicht beeinflusst (siehe Tabelle 6).

↓76

Tabelle 6: Kd und Bmax wurden durch Scatchard-Plots aus den Daten der Sättigungsbindungskurven berechnet. Beides sind lediglich apparente Größen, da die 3H-Dexamethason Konzentration in der Zelle nicht bestimmt werden kann (jeweils n = 3).

K d [nmol/ l]

B max [pmol/ Ansatz]

Zunahme B max

HeLa-Zellen, 4 h Vorinkubation mit 10 nmol/ l Relaxin

Kontrolle

20 ± 7

51 ± 6

Relaxin

19 ± 5

110 ± 13

216%

HeLa-Zellen, 24 h Vorinkubation mit 10 nmol/ l Relaxin

Kontrolle

19 ± 8

61 ± 8

Relaxin

21 ± 4

135 ± 15

221%

THP-1-Zellen, 4 h Vorinkubation mit 10 nmol/ l Relaxin

Kontrolle

27 ± 5

161 ± 18

Relaxin

26 ± 7

301 ± 32

187%

THP-1-Zellen, 24 h Vorinkubation mit 10 nmol/ l Relaxin

Kontrolle

23 ± 6

144 ± 16

Relaxin

24 ± 5

311 ± 33

216%


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03.11.2006