4 Diskussion

↓76

Das erstmalig 1930 von H. L. Fevold beschriebene Peptidhormon Relaxin galt lange Zeit ausschließlich als zentrales Hormon der Schwangerschaft, verantwortlich für perinatale Effekte wie die Weitung des Geburtskanals. Seit den achtziger Jahren des vergangenen Jahrhunderts wurde das Spektrum der Relaxineffekte stetig um neue Aspekte wie Beeinflussung von Gefäßtonus, Nierenfunktion und Kollagenbilanz erweitert. Erst im Jahre 2002 wurden zwei membranständige Relaxin-Rezeptoren, LGR7 und LGR8, entdeckt.

↓77

In der hier vorliegenden Arbeit konnte nun erstmals gezeigt werde, dass Relaxin

  1. an den humanen Glukokortikoidrezeptor bindet und ihn aktiviert,
  2. die Expression des Glukokortikoidrezeptors erhöht und
  3. die TNFα-Sekretion humaner Makrophagen supprimiert.

Diese bisher unbekannte Interaktion mit dem Glukokortikoidrezeptor stellt dabei einen Ansatzpunkt zur Erklärung der pleiotropen Wirkung des Peptidhormons dar.

4.1  Hemmung der TNFα -Expression

↓78

Angeregt durch Befunde anderer Arbeitsgruppen, die eine antiasthmatische (Bani et al., 1997; Kenyon et al., 2003) und antiallergische (Masini et al., 1994; Piccinni et al., 2000) Wirkung des Relaxins zeigten, wurde in dieser Arbeit ein immummodulatorischer Effekt des Relaxins überprüft. Dabei zeigte eine Vorbehandlung mit Relaxin eine deutlich verringerte TNFα-Sekretion von Makrophagen nach Stimulation mit LPS (siehe u.a. Abbildung 12). Interessanterweise lies sich mit dem Glukokortikoidrezeptor-Antagonisten RU-486 nicht nur die Wirkung des als Positivkontrolle eingesetzten Steroids Dexamethason aufheben, sondern auch die des Relaxins. Dieses Ergebnis lässt sich verschieden interpretieren:

  1. Relaxin verstärkt die Wirkung der im Medium vorhandenen endogenen Steroide am Glukokortikoidrezeptor.
  2. Relaxin selbst aktiviert den Glukokortikoidrezeptor.

Um diese Frage zu klären, wurden die Versuche mit steroidfreiem, sog. „gestripptem“, Medium wiederholt. Die immunmodulatorischen Effekte des Relaxins blieben in voller Stärke bestehen. Da Makrophagen keine endogene Kortisolsynthese aufweisen und das verwendete Medium von Steroiden befreit wurde, lässt sich schließen, dass Relaxin auch ohne die Anwesenheit von Kortisol dazu in der Lage ist, den Rezeptor zu aktivieren.

4.2 Bindung an den Glukokortikoidrezeptor-Proteinkomplex

↓79

Da die obigen Daten eine Aktivierung des GR durch Relaxin nahe legten, wurde mittels Koimmunpräzipitationen untersucht, ob Relaxin an den Glukokortikoidrezeptor bindet. Dabei zeigte sich erwartungsgemäß regelmäßig eine Assoziation des Glukokortikoidrezeptors mit HSP70 und HSP90. Diese Proteine sind bekannte Bestandteile des Protein-Rezeptor-Komplexes des GR. Der hauptsächlich im Zytoplasma der Zelle befindliche, nicht aktivierte Rezeptor benötigt die Bindung von verschiedenen Proteinen, um durch ein Glukokortikoid aktivierbar zu sein (Dao-Phan et al., 1997; Wikstrom et al., 1986; Rajapandi et al., 2000).

Im Glukokortikoidrezeptor-Präzipitat fand sich jedoch neben diesen bekannten, die Struktur und Faltung beeinflussenden Hilfsproteinen („chaperons“) auch regelmäßig Relaxin (Abbildung 18). Dies zeigt, dass Relaxin an den Glukokortikoidrezeptorkomplex binden kann. Ob Relaxin direkt an den Rezeptor bindet oder sich an eines der zum heterooligomeren Rezeptor-Proteinkomplex gehörenden Proteine anlagert, kann anhand dieser Daten nicht beurteilt werden. Ebenfalls kann nicht unterschieden werden, ob Relaxin einen Liganden für den Rezeptor oder ein sog. „chaperon“darstellt. Zusammen mit der auch in steroidfreiem Medium beobachteten TNFα supprimierenden Wirkung scheint die Funktion als agonistischer Ligand jedoch deutlich wahrscheinlicher.

Um am im Zytoplasma lokalisierten Glukokortikoidrezeptor wirken zu können, muss exogen zugeführtes Relaxin zunächst in die Zelle gelangen. Mit einem Molekulargewicht von 6,3 kDa und leicht hydrophilem Charakter ist eine freie Diffusion in die Zelle eher unwahrscheinlich. Eine Aufnahme via Endozytose bzw. über einen aktiven Transportmechanismus ist in der Literatur bisher nicht beschrieben, scheint jedoch wahrscheinlicher.

↓80

Ein interessanter Nebenbefund waren die relativ hohen endogenen Relaxinspiegel der HeLa-Zellen, die sich auch in den Kern-/ Zytoplasmaextrakten (siehe Abbildung 20) zeigten. Dies ist für Zellen des Reproduktionstraktes nicht völlig unerwartet, aber meines Wissens noch nicht beschrieben worden.

4.3 Translokation des Glukokortikoidrezeptors in den Nukleus nach Stimulation mit Relaxin

Da ein aktivierter Glukokortikoidrezeptor zur Vermittlung seiner Effekte in den Kern transloziert werden muss, schlossen sich Untersuchungen zur Verteilung des GR zwischen Kern und Zytoplasma an.

Die Stimulation mit Dexamethason, als potentem Agonisten, führte erwartungsgemäß zu einer starken Zunahme der nukleären Glukokortikoidrezeptorkonzentration nach 30 Minuten (Abbildung 19).

↓81

Nach Inkubation mit Relaxin zeigte sich nach 30 Minuten ebenfalls eine deutlich verstärkte Translokation des Glukokortikoidrezeptors in den Kern. Zeitgleich findet sich dort auch eine erhöhte Relaxin-Konzentration (Abbildung 20). Dies ist ein weiteres Indiz für eine Aktivierung des Glukokortikoidrezeptors durch Bindung von Relaxin mit daraus resultierendem verstärktem Transport von Relaxin und Rezeptor in den Zellkern.

4.4 Bindung an die „glucocorticoid response elements“

Zur Überprüfung der These, dass die Interaktion von Relaxin mit dem Glukokortikoidrezeptor auch zu dessen Aktivierung führt, wurde die Wirkung auf so genannte „glucocorticoid response elements“ (GRE) gemessen. Der aktivierte Glukokortikoidrezeptor vermittelt einen Großteil seiner Effekte über die Bindung an GRE in zahlreichen Promotoren mit konsekutiver Expressionssteigerung der anhängenden Gene.

Experimente nach transienter Transfektion von HeLa- und THP-1-Zellen mit einem GRE-Luziferase-Reportergen-Konstrukt zeigten eine deutliche Zunahme der Luziferase-Aktivität um Faktor 5 bis 7 nach Inkubation mit Relaxin (siehe Abbildung 23 und Abbildung 24). Diese ließ sich durch Behandlung mit RU-486 vollständig aufheben.

↓82

Diese durch einen GR-Antagonisten neutralisierbaren Befunde sind ein weiteres Indiz dafür, dass Relaxin den Glukokortikoidrezeptor aktivieren kann.

Ob ein durch Relaxin aktivierter Glukokortikoidrezeptor auch indirekte genomische Effekte – das sog. „cross-talk mit anderen Transkriptionsfaktoren (z.B. AP-1) – ausübt, kann aus mit diesem Versuchsansatz nicht beurteilt werden.

4.5 Steigerung der GR-mRNA- und GR-Proteinmenge

4.5.1  Einleitung

Wie bereits in der Einleitung beschrieben, werden zwei Glukokortikoidrezeptor-Typen unterschieden: GRα und GRβ. GRβ soll keine typischen Glukokortikoid-Wirkungen vermitteln, sondern im Gegenteil durch Zusammenlagerung mit aktiviertem GRα zu einem Heterodimer dessen Wirkung aufheben (Oakley et al., 1999). Bei den folgenden Ergebnissen ist eine Unterscheidung zwischen GRα und GRβ nur auf mRNA-Ebene möglich, da im Western Blot mit einem nicht α/ β-selektiven Antikörper gearbeitet wurde. Jedoch liegen die GRα-Spiegel in den Zellen physiologischerweise um ein Vielfaches über denen des GRβ (Oakley et al., 1996), sodass die gemessenen GR-Proteinmengen weitgehend GRα darstellen sollten.

4.5.2 Dexamethason

↓83

Die Inkubation mit Dexamethason führte wie erwartet (Cidlowski und Cidlowski, 1981) zu einer recht deutlichen Abnahme der mRNA-Expression des „aktiven“ Glukokortikoidrezeptors α in HeLa- und THP-1-Zellen um 33 bzw. 40% (siehe Abbildung 26 und Abbildung 28).

Auch auf Proteinebene kam es nach Zugabe des hochpotenten Kortikoids in THP-1-Zellen zu einer ausgeprägten Abnahme des GR um 40 bzw. 45% (siehe Abbildung 31 und Abbildung 33). Diese Befunde passen gut zu einer mehrgleisigen negativen Autoregulation des GR nach Aktivierung durch ein Glukokortikoid, die sowohl durch Verminderung der GR-mRNA-Expression, als auch durch einen beschleunigen Abbau des Proteins vermittelt wird (siehe Einleitung).

Alle Effekte des Dexamethasons konnten durch Koinkubation mit dem GR-Antagonisten RU-486 auf ein nicht signifikantes Niveau gesenkt werden.

4.5.3 Relaxin

↓84

Interessanterweise zeigte sich ein inverser Effekt des Relaxins zum Dexamethason. Während das Steroid die Glukokortikoidrezeptor-Expression hemmte, erhöhte Relaxin die GR-Anzahl. Die 24-stündige Inkubation von HeLa- und THP-1-Zellen mit Relaxin führte zu einer Zunahme der GR-Proteinmenge um den Faktor 4 bzw. 2 (siehe Abbildung 31 und Abbildung 33).

Auch auf mRNA-Ebene war zeigte sich ein Zunahme der GR-Expression. Nach zwei Stunden Relaxin-Inkubation waren die GRα-mRNA-Spiegel in HeLa-Zellen und in THP-1-Zellen um ca. den Faktor 2 erhöht (siehe Abbildung 26 und Abbildung 28).

Der GRβ-mRNA-Spiegel in den THP-1-Zellen wurde durch Relaxin nicht signifikant geändert (siehe Abbildung 29). In HeLa-Zellen kam es zwar zu einem signifikanten Anstieg der GRβ-mRNA (siehe Abbildung 27), dieser war jedoch mit 85% nach zwei Stunden im Vergleich zum GRα relativ schwach ausgeprägt.

↓85

Auch die Auswirkungen des Relaxin auf die GR-Expression wurden durch Koinkubation mit RU-486 auf ein nicht signifikantes Niveau gesenkt.

4.5.4 Zusammenfassung

Die Ergebnisse zeigen, dass Relaxin in HeLa- und THP-1-Zellen die Glukokortikoidrezeptor-Expression hochreguliert und dies offensichtlich auch durch Aktivierung des Glukokortikoidrezeptors vermittelt wird, da RU-486 die Effekte unterdrückt.

Da die zelluläre Wirkung von Glukokortikoiden im Regelfall durch die Zahl an Rezeptoren begrenzt wird (Sapolsky et al., 2000), führt diese erhöhte Expression zu einer größeren Suszeptibilität der Zelle für glukokortikoide Stimuli.

↓86

Diese Befunde sind insofern interessant, da hier erstmals die Wirkung des Relaxins von der Wirkung des Steroids Dexamethason abweicht.

4.6 Steigerung der funktionellen Rezeptorzahl in der Zelle

Um nachzuweisen, dass die gefundenen Expressionssteigerungen des Glukokortikoidrezeptors auf mRNA- und Proteinebene auch einen funktionellen Effekt zur Folge haben, wurde die Anzahl bindungsfähiger Rezeptoren in THP-1- und HeLa-Zellen ermittelt. Dazu wurden Sättigungskurven mit radioaktiv markiertem Dexamethason durchgeführt. Die Höhe der maximalen spezifischen Bindung in der Zelle wurde vor und nach 4- bzw. 24-stündiger Inkubation mit Relaxin bestimmt.

Die Zahl der bindungsfähigen Rezeptoren in Hela- bzw. THP-1-Zellen verdoppelte nach 4-stündiger Relaxinstimulation. Eine 24-stündige Stimulation erbrachte eine geringe weitere Steigerung. Diese Daten zeigen, dass die durch Relaxin ausgelösten mRNA- und Protein-Expressionsteigerungen des GR auch tatsächlich zu einer funktionell relevanten Zunahme der bindungsfähigen Glukokortikoidrezeptoren in der Zelle führen.

↓87

Die Dissoziationskonstante des GR für Dexamethason änderte sich durch die Behandlung mit Relaxin hingegen nicht. Dies zeigt, dass Relaxin nicht die Bindungseigenschaften des Rezeptors für Glukokortikoide ändert.

4.7 Konsequenzen und Ausblicke

Diese Befunde zeigen einen interessanten, bisher unbekannten Wirkmechanismus des Relaxins. Das Hormon übt nicht nur eine Wirkung auf die kürzlich entdeckten membranständigen, G-Protein-gekoppelten Rezeptoren LGR7 und LGR8 aus sondern auch auf den zytoplasmatischen Glukokortikoidrezeptor.

Die Ergebnisse zeigen, dass Relaxin an den Glukokortikoidrezeptor-Proteinkomplex bindet und zu seiner Aktivierung und Translokation in den Kern führt. Dort wirkt er als Transkriptionsfaktor und erhöht z.B. die Transkription von Genen mit GRE-Sequenzen im Promotor.

↓88

Die Effekte, die ein mit Relaxin aktivierter Glukokortikoidrezeptor vermittelt, unterscheiden sich jedoch teilweise von denen, die ein mit Dexamethason (stellvertretend für die Gruppe der Glukokortikoide) aktivierter Glukokortikoidrezeptor auslöst. Relaxin als Ligand führte beispielsweise in den Versuchen zu einer Erhöhung der Glukokortikoidrezeptor-Konzentration, Dexamethason hingegen senkte die Menge an Glukokortikoidrezeptoren.

Ein mögliches Erklärungsmodell für diese Liganden-abhängige Wirkung liefert ein anderer Steroidrezeptor, der Östrogen-Rezeptor. Bei diesem wurde kürzlich entdeckt, dass verschiedene Liganden durch Bindung am gleichen Rezeptor unterschiedliche Effekte auslösen (Park und Jordan, 2002). Diese so genannten SERM (selective estrogen receptor modulators), führen vermutlich zu spezifischen Konformationsänderungen (Kraichely et al., 2000), die dann im Zusammenspiel mit anderen Kofaktoren unterschiedliche Effekte bezüglich Gen-Aktivierung oder -Suppression bewirken (Jordan, 2001). Auch für den GR wurden bereits nichtsteroidale selektive Rezeptor-Modulatoren beschrieben (Link et al., 2004; Schulz und Eggert, 2004).

Analog dazu könnte die Bindung des Relaxins eine Konformationsänderung des Glukokortikoidrezeptors mit konsekutiver Modulation seiner Wirkung auslösen. Dadurch wäre eine Änderung der Affinität des Glukokortikoidrezeptors für einzelne (n)GRE ebenso wie die Bindung an neue Promotoren denkbar (Schoneveld et al., 2004). Ferner ist eine Wirkungsänderung an den klassischen Bindungsstellen bis hin zu einer Umkehr der Beeinflussung der Transkription denkbar (Resche-Rigon und Gronemeyer, 1998). Ähnlich wie bei den SERM könnten auch beim Glukokortikoidrezeptor in Abhängigkeit vom Liganden unterschiedliche Koaktivatoren bzw. Korepressoren gebunden werden, die die Wirkung des Rezeptors modulieren (Jenkins et al., 2001). Dies stellt eine mögliche Erklärung für die verstärkte Expression des Glukokortikoidrezptors nach Behandlung mit Relaxin im Gegensatz zur Inkubation mit Glukokortikoiden dar.

↓89

Unterschiedliche Wirkungen von Relaxin und Glukokortikoiden werden sicher auch daher resultieren, dass die Wirkung von Relaxin ein Summationseffekt der Aktivierung der G-Protein-gekoppelten Rezeptoren LGR7/ LGR8 und des zytoplasmatischen Glukokortikoidrezeptors ist. Zwar ist die beobachtete Erhöhung der Glukokortikoidrezeptor-Menge durch RU-486 aufhebbar, so dass sie sehr wahrscheinlich der Aktivierung des Glukokortikoidrezeptors durch Relaxin bedarf, jedoch ist eventuell die parallele Aktivierung der LGR7/ LGR8 ebenfalls eine notwendige Bedingung.

Ferner wird die Wirkung des Relaxins auf verschiedene Zellen von deren spezifischem Verhältnis von LGR7/ LGR8-Rezeptoren und Glukokortikoidrezeptoren zueinander abhängen.

4.7.1  Klinische Bezüge

Natürlich ist es problematisch, aufgrund von In-vitro-Untersuchungen an zwei Zelllinien auf Effekte am lebenden Organismus zu schließen, jedoch möchte ich zumindest einige Gedanken erwähnen.

4.7.1.1 Neue Therapieansätze

↓90

Ein interessantes Anwendungsgebiet eröffnet der hier gezeigte Effekt der Steigerung der Glukokortikoidrezeptorexpression: chronische Behandlung mit Steroiden führt durch Herunterregulation der Glukokortikoidrezeptordichte häufig zur so genannten Steroidresistenz (Silva et al., 1994). Hier könnte Relaxin durch seinen die Glukokortikoidrezeptoranzahl erhöhenden Effekt möglicherweise eine therapeutische Option bieten. Das eine systemische Anwendung prinzipiell möglich ist, zeigte eine Sklerodermie-Studie mit über 60 Patienten, in der Relaxin bei subcutaner Infusion nur eine sehr geringe Nebenwirkungsrate (v. a. Regelblutungsverstärkung und leichte Anämie) zeigte (Seibold et al., 2000).

Darüber hinaus ist eine Steigerung der Suszeptibilität für Glukokortikoide durch lokale Erhöhung der Glukokortikoidrezeptordichte mittels topischer Relaxinapplikation vorstellbar. Dies könnte einen Einsatz bei akuten wie chronischen Hauterkrankungen, bei denen Glukokortikoide eine große Rolle spielen, sinnvoll machen.

Neben diesem die Steroidsensitivität-erhöhenden Effekt, zeigte sich auch ein eigener inflammationshemmender Effekt, der die TNFα-Expression ohne Anwesenheit von Glukokortikoide senkte. Wenn sich dies in vivo bestätigt, könnte Relaxin ein relativ nebenwirkungsarmes Therapeutikum für viele Krankheitsbilder, in denen TNFα ein zentraler Mediator ist, darstellen. Dazu gehören vor allem Erkrankungen aus dem rheumatischen Formenkreis (O'Dell, 2004), aber auch bei der chronischen Herzinsuffizenz wird das kardiodepressive TNFα als wichtiger Mediator gesehen (Wolfe und Michaud, 2004; Sekiguchi et al., 2004).

↓91

Vor kurzem als „Player“ bei der chronischen Herzinsuffizienz bekannt geworden (Dschietzig et al., 2001), ist das gefäßdilatierende und eventuell antiinflammatorische Profil auch für die koronare Herzkrankheit interessant. Bei der Atherogenese spielt die chronische Entzündung eine wichtige Rolle (Shishehbor und Bhatt, 2004), wie auch Untersuchungen an atherosklerotisch veränderten Gefäßen zeigten. Befunde zeigten eine stark verminderte Glukokortikoidrezeptoranzahl in atherosklerotisch veränderten Gefäßwänden, die eine fehlende Proliferationshemmung durch Glukokortikoide zur Folge hat (Bray et al., 1999).

4.7.1.2 Neue Bewertung von bekannten Befunden

Die während der Schwangerschaft auftretenden hohen Relaxinspiegel sind – neben den physiologisch erhöhten endogenen Kortisonspiegeln – auch eine mögliche Erklärung für die bekannte Erhöhung der Immuntoleranz, beispielsweise mit Abschwächung autoimmuner Krankheiten wie des Lupus erythematodes bei Schwangeren.

Die positive Wirkung des Relaxins bei Überexpressionen von Bindegewebe, z. B. bei Sklerodermie (Seibold et al., 2000) und Lungenfibrose (Unemori et al., 1993), wurde bisher immer allein der Expressionssteigerung der MMP und der Inhibition ihrer Hemmer (TIMP) zugeschrieben. Die Aktivierung des Glukokortikoidrezeptors könnte auch einen Betrag dazu leisten; bekanntermaßen wirken Glukokortikoide stark antiproliferativ (Almawi und Melemedjian, 2002).

4.8 Abschließende Bemerkung

↓92

Im Rahmen dieser Dissertation konnte erstmals gezeigt werden, dass Relaxin neben seiner bekannten Wirkung auf die membranständigen Rezeptoren LGR7 und LGR8 mit dem Glukokortikoidrezeptor interagiert. Die Identifizierung dieses neuen Wirkmechanismus des Relaxins kann als Ausgangspunkt weiterer Studien einen Beitrag zur Aufklärung der unterschiedlichen hormonellen Effekte des Peptidhormons leisten.


© Die inhaltliche Zusammenstellung und Aufmachung dieser Publikation sowie die elektronische Verarbeitung sind urheberrechtlich geschützt. Jede Verwertung, die nicht ausdrücklich vom Urheberrechtsgesetz zugelassen ist, bedarf der vorherigen Zustimmung. Das gilt insbesondere für die Vervielfältigung, die Bearbeitung und Einspeicherung und Verarbeitung in elektronische Systeme.
DiML DTD Version 4.0Zertifizierter Dokumentenserver
der Humboldt-Universität zu Berlin
HTML-Version erstellt am:
03.11.2006