Aus der Medizinischen Klinik m. S.
Kardiologie, Pulmologie und Angiologie
der Medizinischen Fakultät der Charité –
Universitätsmedizin Berlin

Dissertation

Interaktionen zwischen dem Peptidhormon Relaxin und dem humanen
Glukokortikoidrezeptor

Zur Erlangung des akademischen Grades
Doctor medicinae (Dr. med.)

vorgelegt der Medizinischen Fakultät der Charité –
Universitätsmedizin Berlin

von
Michael Peter Greinwald
aus Toronto/ Kanada

Gutachter:
1. Priv.-Doz. Dr. med. Th. Dschietzig
2. Prof. Dr. F. Brunner
3. Prof. Dr. med. S. Felix

Datum der Disputation: 15.05.2006

Zusammenfassung

Seit Beginn des 20. Jahrhunderts ist Relaxin bekannt als Schwangerschaftshormon, das unter anderem zur pränatalen Weitung des Geburtskanals beiträgt. Erst in den letzten Jahren wurden weitere Wirkungen des Peptidhormons beschrieben. So beeinflusst Relaxin den Gefäßtonus, die Nierenfunktion sowie die Kollagenbilanz des Bindegewebes. Als Angriffsstelle des Peptidhormons wurden im Jahre 2002 zwei membranständige Rezeptoren, LGR7 und LGR8, identifiziert.

Im Rahmen dieser Arbeit an HeLa- und THP-1-Zellen konnte nun erstmals gezeigt werden, dass Relaxin als Agonist mit dem Glukokortikoidrezeptor interagiert.

Zunächst konnte mit Hilfe von Koimmunpräzipitationen eine Bindung von Relaxin an den Rezeptor nachgewiesen werden. 30 Minuten nach Behandlung mit Relaxin kam es zu einer Translokation von Relaxin und Glukokortikoidrezeptoren in den Zellkern. Eine transiente Transfektion mit einem GRE-Luziferase-Konstrukt zeigte eine Aktivierung von glucocorticoid response elements (GRE) nach Inkubation mit Relaxin. Funktionell führte Relaxin zu einer verminderten TNFα-Sekretion von Makrophagen nach Stimulation mit bakteriellem Endotoxin. Mittels PCR, Western Blots sowie ³H-Dexamethason-Inkorporation konnte eine Zunahme funktionell aktiver Glukokortikoidrezeptoren nach Behandlung mit Relaxin gezeigt werden. Alle beschriebenen Effekte des Relaxins ließen sich durch Koinkubation mit dem Glukokortikoidrezeptor-Antagonisten RU-486 aufheben.

Eigene Schlagworte: Glukokortikoide, Rezeptor, Relaxin, Makrophagen

Abstract

Relaxin has been known as a central hormone of pregnancy responsible for the dilatation of the birth canal since the beginning of the 20^th century. Recent studies elucidated several new effects of relaxin such as regulation of vasotonus, renal function, and collagen turnover. In 2002, two G-protein-coupled receptors, LGR7 and LGR8, were identified as relaxin receptors.

The present study shows for the first time that relaxin interacts as an agonist with glucocorticoid receptors (GR) in HeLa- and THP-1-cells.

Initially, co-immunoprecipitation experiments revealed binding of relaxin to glucocorticoid receptors. Treatment with relaxin led to translocation of relaxin and glucocorticoid receptors into the nucleus within 30 minutes. After stimulation with relaxin, cells transiently transfected with GRE-luciferase constructs demonstrated activation of glucocorticoid receptors. At the functional level, relaxin reduced – in GR-dependent manner - TNFα-secretion of macrophages after stimulation with bacterial endotoxin. An increase of functionally active glucocorticoid receptors after incubation with relaxin was shown by PCR, western blots, and incorporation of ³H-labeled dexamethasone. All investigated effects of relaxin were abolished by co-treatment with the glucocorticoid receptor antagonist RU-486.

Keywords: Glucocorticoids, Receptor, Relaxin, macrophages

Inhaltsverzeichnis

• 1 Einleitung
  • 1.1  Relaxin
    • 1.1.1  Die Entdeckung des Hormons Relaxin
    • 1.1.2 Struktur
    • 1.1.3 Synthese
    • 1.1.4 Zirkulierende Relaxin-Spiegel
    • 1.1.5 Gen-Isoformen
    • 1.1.6 Signaltransduktion
    • 1.1.7 Biologische Effekte
      • 1.1.7.1  Prä- und Perinatale Effekte
      • 1.1.7.2 Bindegewebe:
      • 1.1.7.3 Gehirn
      • 1.1.7.4 Renale und vaskuläre Effekte
      • 1.1.7.5 Myokardiale Effekte
      • 1.1.7.6 Hämostasis
      • 1.1.7.7 Immunologische Effekte
      • 1.1.7.8 Zusammenfassung
  • 1.2 Glukokortikoid-Rezeptor
    • 1.2.1  Sekretion der Glukokortikoide
    • 1.2.2 Biologische Effekte von Glukokortikoiden
    • 1.2.3 Wirkungsvermittlung über den Glukokortikoidrezeptor
    • 1.2.4 Struktur des Glukokortikoidrezeptors
    • 1.2.5 Regulation der zellulären Konzentration von Glukokortikoidrezeptoren
    • 1.2.6 Glukokortikoidrezeptorantagonist RU-486
  • 1.3 Zielsetzung der Arbeit
• 2 Materialien und Methoden
  • 2.1  Zellkultur
    • 2.1.1  Materialien
    • 2.1.2 Kulturbedingungen
    • 2.1.3 Zelltypen
      • 2.1.3.1 HeLa
      • 2.1.3.2 THP-1
    • 2.1.4 Zeitkinetiken
  • 2.2 Protein-Nachweismethoden
    • 2.2.1  Präparation von Kern-/ Zytoplasma-Extrakten
      • 2.2.1.1 Prinzip
      • 2.2.1.2 Materialien
    • 2.2.2 Western Blots
      • 2.2.2.1  Materialien
      • 2.2.2.2 Lösungen
      • 2.2.2.3 Antikörper:
      • 2.2.2.4 Prinzip:
      • 2.2.2.5 SDS-Polyacrylamidgelelektrophorese
      • 2.2.2.6 Proteintransfer
      • 2.2.2.7 Antikörperbindung
    • 2.2.3 Immunpräzipitation
      • 2.2.3.1 Materialien
      • 2.2.3.2 Prinzip
      • 2.2.3.3 Kopplung des Antikörpers mit Protein A-Sepharose
      • 2.2.3.4 Herstellung des Zelllysats
      • 2.2.3.5 „Fischen“ des spezifischen Proteins
  • 2.3 Gesamt-RNA-Extraktion
    • 2.3.1  Prinzip
    • 2.3.2 Protokoll
  • 2.4 PCR
    • 2.4.1  Materialien
    • 2.4.2 Erststrang-Synthese
    • 2.4.3 Prinzip der PCR
    • 2.4.4 Protokoll
    • 2.4.5 Analyse von PCR-Fragmenten
  • 2.5 Transiente Transfektion
    • 2.5.1  Prinzip
    • 2.5.2 Protokoll
  • 2.6 GRE-Luziferase-Messungen
    • 2.6.1  Prinzip
    • 2.6.2 Protokoll
  • 2.7 Radioligandenbindung
    • 2.7.1  Prinzip
    • 2.7.2 Berechnung der Rezeptorkonzentration und der Dissoziationskonstanten
    • 2.7.3 Darstellung nach Scatchardplot
    • 2.7.4 Protokoll
  • 2.8 Zytokin-Messungen
    • 2.8.1  Durchführung
    • 2.8.2 Prinzip ELISA
    • 2.8.3 Zellstimulation
    • 2.8.4 Stimulanzien
    • 2.8.5 Materialien ELISA
    • 2.8.6 Protokoll ELISA
  • 2.9 Statistische Auswertung
• 3 Ergebnisse
  • 3.1  TNFα-Expression
  • 3.2 Koimmunpräzipitation
  • 3.3 Verteilung von Glukokortikoidrezeptoren und Relaxin in Zytoplasma und Zellkern
    • 3.3.1  Verteilung des Glukokortikoidrezeptors
    • 3.3.2 Verteilung des Relaxins
  • 3.4 Bestimmung der Luziferaseaktivität als Marker für die Aktivierung des Glukokortikoidrezeptors
  • 3.5 Regulation des Glukokortikoid-Rezeptors durch Relaxin auf mRNA-Ebene
  • 3.6 Regulation des Glukokortikoidrezeptors durch Relaxin auf Proteinebene
    • 3.6.1  Steroidfreies Medium
  • 3.7 Sättigungskurven von ³H-Dexamethason
• 4 Diskussion
  • 4.1  Hemmung der TNFα -Expression
  • 4.2 Bindung an den Glukokortikoidrezeptor-Proteinkomplex
  • 4.3 Translokation des Glukokortikoidrezeptors in den Nukleus nach Stimulation mit Relaxin
  • 4.4 Bindung an die „glucocorticoid response elements“
  • 4.5 Steigerung der GR-mRNA- und GR-Proteinmenge
    • 4.5.1  Einleitung
    • 4.5.2 Dexamethason
    • 4.5.3 Relaxin
    • 4.5.4 Zusammenfassung
  • 4.6 Steigerung der funktionellen Rezeptorzahl in der Zelle
  • 4.7 Konsequenzen und Ausblicke
    • 4.7.1  Klinische Bezüge
      • 4.7.1.1 Neue Therapieansätze
      • 4.7.1.2 Neue Bewertung von bekannten Befunden
  • 4.8 Abschließende Bemerkung
• 5 Zusammenfassung
• Abkürzungsverzeichnis
• Literaturverzeichnis
• Danksagung
• Lebenslauf
• Eidesstattliche Erklärung

Tabellen

• Tabelle 1: Die Wirkungen des Relaxins.
• Tabelle 2: Übersicht über die Wirkung der Glukokortikoide (Übersicht in Sapolsky et al., 2000; Umland et al., 2002).
• Tabelle 3: Verwendete Antikörper
• Tabelle 4: Ansatz für 4 SDS-Gele
• Tabelle 5: Primersequenzen
• Tabelle 6: K_d und B_max wurden durch Scatchard-Plots aus den Daten der Sättigungsbindungskurven berechnet. Beides sind lediglich apparente Größen, da die ³H-Dexamethason Konzentration in der Zelle nicht bestimmt werden kann (jeweils n = 3).

Bilder

• Abbildung 1: Kristallstruktur des porcinen Relaxin-A-B-Heterodimers mit Darstellung der Disulfidbrücken (modifiziert nach Ivell R und Einspanier, 2002).
• Abbildung 2: Schematische Darstellung des Präpro-Relaxins mit Disulfidbrücken inklusive der Positionen der A- und B- Domäne, des Verbindungspeptides (C-Domäne) und des Signalpeptides (modifiziert nach Ivell R und Einspanier, 2002).
• Abbildung 3: Schema der Hypothalamus-Hypophysen-Nebennierenrinde-Achse
• Abbildung 4: Schema der Wirkung des Glukokortikoidrezeptors als Transkriptionsfaktors. Glukokortikoide binden nach Überwindung der Zellmembran an den Rezeptor. Daraufhin lösen sich die HSP, und der GR wird in den Kern transloziert, wo er als Dimer an (n)GRE bindet und so Einfluss auf die Transkription nimmt (modifiziert nach Umland et al., 2002).
• Abbildung 5: Strukturformel von Mifepriston (RU-486) (aus Cadepond et al., 1997).
• Abbildung 6: Aufbau des pGRE-Luziferase Vektors mit Schnittstellen für Restriktionsendonukleasen (aus BD Biosciences Clontech, 2002).
• Abbildung 7: Struktur des hochpotenten, synthetischen Glukokortikoids Dexamethason. Das im Rahmen der Radioligandenbindung-Experimente verwendete Glukokortikoid ist an den Positionen 1, 2, 4, 6 und 7 mit Tritium markiert.
• Abbildung 8: Spezifische, unspezifische und Gesamtbindung in Abhängigkeit von der Ligandenkonzentration.
• Abbildung 9: Spezifische Bindung in Abhängigkeit von der Ligandenkonzentration. B_max = maximal an Rezeptor gebundenes Hormon. K_d = Dissoziationskonstante, entspricht der Ligandenkonzentration bei 50%-iger Rezeptorbindung.
• Abbildung 10: Schema eines Scatchard Plots.
• Abbildung 11: Sekretion von TNFα durch THP-1-Zellen in Abhängigkeit von der LPS-Konzentration. Die Stimulation erfolgte über 8 h bzw. 48 h (n = 3). Die TNFα-Spiegel wurden mittels ELISA bestimmt (p < 0,05, #: vs. Kontrolle, *: vs. 1 ng/ ml LPS).
• Abbildung 12: Sekretion von TNFα durch THP-1-Zellen nach 8-stündiger LPS-Stimulation. Einfluss von Relaxin, Dexamethason und RU-486 (n = 10; K: Kontrolle; LPS: 10 nmol/ l Lipopolysacharide; RLX: 1 nmol/ l Relaxin; DX: 100 nmol/ l Dexamethason; RU: 0,5 µmol/ l RU-486, p < 0,05, #: vs. Kontrolle, *: vs. LPS).
• Abbildung 13: Sekretion von TNFα durch THP-1-Zellen nach 24-stündiger LPS-Stimulation. Einfluss von Relaxin, Dexamethason und RU-486 (n = 10; K: Kontrolle; LPS: 10 nmol/ l Lipopolysacharide; RLX: 1 nmol/ l Relaxin; DX: 100 nmol/ l Dexamethason; RU: 0,5 µmol/ l RU-486, p < 0,05, #: vs. Kontrolle, *: vs. LPS).
• Abbildung 14: Sekretion von TNFα durch THP-1-Zellen nach 48-stündiger LPS-Stimulation. Einfluss von Relaxin, Dexamethason und RU-486 (n = 10; K: Kontrolle; LPS: 10 nmol/ l Lipopolysacharide; RLX: 1 nmol/ l Relaxin; DX: 100 nmol/ l Dexamethason; RU: 0,5 µmol/ l RU-486, p < 0,05, #: vs. Kontrolle, *: vs. LPS).
• Abbildung 15: Sekretion von TNFα durch THP-1-Zellen nach 8-stündiger LPS-Stimulation in steroidfreiem Medium. Einfluss von Relaxin, Dexamethason und RU-486 (n = 10; K: Kontrolle; LPS: 10 nmol/ l Lipopolysacharide; RLX: 1 nmol/ l Relaxin; DX: 100 nmol/ l Dexamethason; RU: 0,5 µmol/ l RU-486, p < 0,05, #: vs. Kontrolle, *: vs. LPS).
• Abbildung 16: Sekretion von TNFα durch THP-1-Zellen nach 24-stündiger LPS-Stimulation in steroidfreiem Medium. Einfluss von Relaxin, Dexamethason und RU-486 (n = 10; K: Kontrolle; LPS: 10 nmol/ l Lipopolysacharide; RLX: 1 nmol/ l Relaxin; DX: 100 nmol/ l Dexamethason; RU: 0,5 µmol/ l RU-486, p < 0,05, #: vs. Kontrolle, *: vs. LPS).
• Abbildung 17: Sekretion von TNFα durch THP-1-Zellen nach 48-stündiger LPS-Stimulation in steroidfeiem Medium. Einfluss von Relaxin, Dexamethason und RU-486 (n = 10; K: Kontrolle; LPS: 10 nmol/ l Lipopolysacharide; RLX: 1 nmol/ l Relaxin; DX: 100 nmol/ l Dexamethason; RU: 0,5 µmol/ l RU-486, p < 0,05, #: vs. Kontrolle, *: vs. LPS).
• Abbildung 18: Immunpräzipitation aus HeLa-Zelllysat (Relaxin: 10 nmol/ l Relaxin über 30 Minuten) mit AK gegen a) den GR und b) Relaxin sowie nachfolgende Auftrennung der Präzipitate und Analyse der Kopräzipitation im Western Blot (repräsentatives Beispiel von n = 3 Versuchen).
• Abbildung 19: Zeitkinetik der Glukokortikoidrezeptorprotein-Menge in Kern-/ Zytoplasmaextrakten nach Stimulation mit 10 nmol/ l Relaxin und 100 nmol/ l Dexamethason (repräsentatives Beispiel von n = 3 Versuchen).
• Abbildung 20: Zeitkinetik der Relaxinprotein-Menge in Kern-/ Zytoplasmaextrakten nach Stimulation mit 10 nmol/ l Relaxin (repräsentatives Beispiel von n = 3 Versuchen).
• Abbildung 21: Zeitkinetik der Luziferaseaktivität in mit GRE-luc transient transfizierten HeLa-Zellen (n = 3; Relaxinkonzentration 10 nmol/ l; 100% = ohne Relaxinexposition, p < 0,05, #: vs. Kontrolle, *: vs. 3 h).
• Abbildung 22: Einfluss der Relaxinkonzentration auf die Luziferase-Aktivität in mit GRE-luc transient transfizierten HeLa-Zellen (n = 3; Expositionsdauer 4 Stunden, p < 0,05, #: vs. Kontrolle).
• Abbildung 23: Aktivität der Luziferase in mit GRE-luc transient transfizierten HeLa-Zellen nach vierstündiger Behandlung mit Dexamethason, Relaxin und RU-486 (n = 3; K: Kontrolle; RU 5: 0,5 µmol/ l RU-486; RU 25: 2,5 µmol/ l RU-486; DX: 100 nmol/ l Dexamethason, p < 0,05, #: vs. Kontrolle, *: vs. DX bzw. RLX).
• Abbildung 24: Aktivität der Luziferase in mit GRE-luc transient transfizierten THP-1-Zellen nach vierstündiger Behandlung mit Dexamethason, Relaxin und RU-486 (n = 3; K: Kontrolle; RU 5: 0,5 µmol/ l RU-486; RU 25: 2,5 µmol/ l RU-486; DX: 100 nmol/ l Dexamethason, p < 0,05, #: vs. Kontrolle, *: vs. DX bzw. RLX).
• Abbildung 25: GAPDH-, GRα- und GRβ-mRNA-Expression in HeLa- und THP-1-Zellen. Inkubation mit 10 nmol/ l Relaxin für 0,5, 1, 2 und 4 Stunden bzw. mit 100 nmol/ l Dexamethason für 6 Stunden. Rechts zusätzlich mit 0,5 µmol/ l RU-486 inkubiert.
• Abbildung 26: Expression der GRα-mRNA in HeLa-Zellen nach Stimulation mit Relaxin und RU-486 (n = 4, normiert auf GAPDH, 10 nmol/ l Relaxin, 0,5 µmol/ l RU-486, DX: 100 nmol/ l Dexamethason für 6 Stunden, p < 0,05, #: vs. Kontrolle).
• Abbildung 27: Expression der GRβ-mRNA in HeLa-Zellen nach Stimulation mit Relaxin und RU-486 (n = 4, normiert auf GAPDH, 10 nmol/ l Relaxin, 0,5 µmol/ l RU-486, DX: 100 nmol/ l Dexamethason für 6 Stunden, p < 0,05, #: vs. Kontrolle).
• Abbildung 28: Expression der GRα-mRNA in THP-1-Zellen nach Stimulation mit Relaxin und RU-486 (n = 4, normiert auf GAPDH, 10 nmol/ l Relaxin, 0,5 µmol/ l RU-486, DX: 100 nmol/ l Dexamethason für 6 Stunden, p < 0,05, #: vs. Kontrolle).
• Abbildung 29: Expression der GRβ-mRNA in THP-1-Zellen nach Stimulation mit Relaxin und RU-486 (n = 4, normiert auf GAPDH, 10 nmol/ l Relaxin, 0,5 µmol/ l RU-486, DX: 100 nmol/ l Dexamethason für 6 Stunden).
• Abbildung 30: Western Blot nach 4- bzw. 24-stündiger Stimulation von HeLa-Zellen mit 10 nmol/ l Relaxin, 0,5 µmol/ l RU-486 bzw. 100 nmol/ l Dexamethason (repräsentatives Beispiel aus n = 3 Versuchen).
• Abbildung 31: Veränderung der Glukokortikoidrezeptor-Proteinmenge in HeLa-Zellen nach 4- bzw. 24-stündiger Stimulation mit 10 nmol/ l Relaxin und 0,5 µmol/ l RU-486 bzw. 24-stündiger Inkubation mit 100 nmol/ l Dexamethason (DX), normiert auf α-Actin (n = 3, p < 0,05, #: vs. Kontrolle).
• Abbildung 32: Western Blot nach 4- bzw. 24-stündiger Stimulation von THP-1-Zellen mit 10 nmol/ l Relaxin, 0,5 µmol/ l RU-486 bzw. 100 nmol/ l Dexamethason (Repräsentatives Beispiel aus n = 3 Versuchen).
• Abbildung 33: Veränderung der Glukokortikoidrezeptor-Proteinmenge in THP-1-Zellen nach 4- bzw. 24-stündiger Stimulation mit 10 nmol/ l Relaxin und 0,5 µmol/ l RU-486 bzw. 24-stündiger Inkubation mit 100 nmol/ l Dexamethason (DX), normiert auf α-Actin (n = 3, p < 0,05, #: vs. Kontrolle).
• Abbildung 34: Sättigungskurve der spezifischen Bindung von ³H-Dexamethason in HeLa-Zellen und Veränderung durch Relaxin bzw. RU-486 (n = 3, Kontrolle: 2 Stunden mit entsprechender Menge an ³H-Dexamethason inkubiert, RLX 4 h: wie Kontrolle + vierstündige Vorbehandlung mit 10 nmol/ l Relaxin, RU-486: wie Kontrolle + 1 µmol/ l RU-486 während der Inkubation, p < 0,05, #: vs. Kontrolle).
• Abbildung 35: Sättigungskurve der spezifischen Bindung von ³H-Dexamethason in THP-1-Zellen und Veränderung durch Relaxin bzw. RU-486 (n = 3, Kontrolle: 1 Stunde mit entsprechender Menge an ³H-Dexamethason inkubiert, RLX 24 h: wie Kontrolle + 24-stündige Vorbehandlung mit 10 nmol/ l Relaxin, RU-486: wie Kontrolle + 1 µmol/ l RU-486 während der Inkubation, p < 0,05, #: vs. Kontrolle).