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1.  EINLEITUNG

1.1 Gentherapie

Voraussetzung für die ersten gentherapeutischen Ansätze in den sechziger Jahren waren die großen molekularbiologischen Entdeckungen des vorangehenden Jahrzehnts, die entscheidende Aufschlüsse über die Struktur und Funktion von Genen brachten. So zeigten Avery, McLeod und McCarthy 1944 auf, dass die Nukleinsäuren die genetische Information tragen. 1953 präzisierten Watson und Crick diese Aussage im Rahmen ihres „Zentralen Dogmas der Molekularbiologie“, indem sie bewiesen, dass die genetische Information der DNA durch die Basensequenz codiert ist und die Informationsübertragung durch das Prinzip der Basenpaarung möglich ist [1]. Mit der Möglichkeit Gene zu isolieren und zu charakterisieren und den zunehmenden pathophysiologischen Erkenntnissen über viele Erkrankungen, wurde bald der Nachweis von Genmutationen erbracht, die zu bestimmten Krankheiten führen. Für diese bis dahin nur unzureichend oder gar nicht therapierbaren Erkrankungen ergaben sich somit neue therapeutische Perspektiven im Sinne einer kausalen Behandlung auf molekularer Ebene, der Gentherapie. Grundprinzip ist hierbei die Einbringung genetischen Materials in den erkrankten Organismus, das die entsprechende Störung beheben oder zumindest günstig beeinflussen soll [45, 46]. Prämisse für eine erfolgreiche Durchführung ist zunächst die Klärung pathophysiologischer Zusammenhänge einer Krankheit sowie die Aufdeckung des zugrundeliegenden molekularen Defekts. In diesem Kontext unterscheidet man monogenetische Erbkrankheiten, die auf dem Defekt eines einzelnen Gens beruhen (z.B. der defekte „cystic fibrosis transmembrane regulator“ bei der Mukoviszidose) von polygenetischen Erkrankungen (z.B. Krebs) sowie erworbenen genetischen Störungen (z.B. HIV) [5]. Tabelle 1 gibt hierbei einen Überblick über einige Erkrankungen sowie die ihnen zugrundeliegenden Gendefekte (soweit bekannt), welche Angriffspunkt heutiger gentherapeutischer Bemühungen sind.

Ist der molekularbiologische Aspekt einer Erkrankung identifiziert, gibt es verschiedene Möglichkeiten den Defekt auf zellulärer Ebene zu korrigieren. Ziel bei den monogenetischen Erkrankungen ist, durch das Einschleusen von Plasmid-DNA, RNA oder Oligonukleotiden in die Zielzelle das defekte Gen oder seine mRNA zu korrigieren bzw. ein intaktes Gen zusätzlich einzufügen. Die rekombinante mRNA produziert dann im Idealfall das therapeutisch wirkende Genprodukt, welches zelluläre Defekte in der Zielzelle korrigiert oder nach seiner Sekretion den [Seite 2↓]Zellmetabolismus an weiter entfernten Zielzellen beeinflußt. Hierdurch kommt es klinisch zur Ausbildung eines gesunden Phänotyps.

Tabelle 1: Genetische Erkrankungen als mögliche Gentherapiekandidaten

Monogenetische Erkrankungen

Erkrankung

Gendefekt

Zielorgane/-gewebe

Adenosindesaminasemangel

Adenosindesaminase

Lymphatisches Gewebe

α1-Antitrypsinmangel

α1-Antitrypsin

Lunge, Leber

Zitrullinämie

Arginosuccinatsynthetase

 

Zystische Fibrose

Cystic fibrosis transmembrane regulator

Lunge, Pankreas

Hämophilie A/B

Faktor VIII/ IX

Gerinnungsfaktoren

Fukosidose

α-L-Fukosidase

Lysosomen

Morbus Gaucher

Glukozerebrosidase

Makrophagen, Leber, Milz, Lunge

Mukopolysaccharidose Typ I/ VII

α-L-Iduronidase/ β-Glucuronidase

 

Thalassämie

β-Globin

Erythrozyten

Sichelzellanämie

β-Globin

Erythrozyten

Familiäre Hypercholesterinämie

Low Density Lipoprotein-Rezeptor

Leber, Gefäßendothelien

Hyperammonämie

Ornithintranscarbamylase

 

Morbus Niemann-Pick

Sphingomyelinase

Knochenmark, Leber, Milz, Lymphknoten

Phenylketonurie

Phenylalanin-Hydroxylase

 

Polygenetische Erkrankungen

Erkrankung

Gendefekt

Zielorgane

Krebs

 

Variabel

Kardiovaskuläre Erkrankungen

 

Gefäßendothel

Rheumatoide Arthritis

 

Gelenke

Erworbene genetische Erkrankungen

Erkrankung

Gendefekt

Zielorgane

HIV-1

 

Immunsystem

Epstein-Barr

  

Hepatitis

 

Leber


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Schwieriger gestaltet sich die Beeinflussung polygenetischer Erkrankungen, da hier immer noch viele pathophysiologische Mechanismen unbekannt und viele einzelne der Gendefekte nicht hinreichend bestimmt sind. Deshalb muß man sich hierbei oft darauf beschränken, ein therapeutisch wirkendes Protein in die Zelle einzubringen, welches die Symptomatik lindert. Dies geschieht durch das Ausstatten der Zielzelle mit einer neuen Funktion oder durch Verstärkung der positiven Einflüsse gesunder Gene (genetic augmentation), z.B. durch das Hervorrufen einer verstärkten Immunantwort auf Tumorzellen oder Induktion eines geplanten Zelltods von Tumorzellen im Rahmen der Krebstherapie [2, 3].

Prinzipiell muß anhand der Zielzellen eine Einteilung der Gentherapie in zwei Anwendungsgebiete vorgenommen werden. Man unterscheidet hierbei die somatische Gentherapie von der Keimbahntherapie. Erstere beruht auf dem Transfer von genetischem Material in somatische Zellen (Körperzellen), womit die Weitergabe an nachfolgende Generationen ausgeschlossen ist. Dies entspricht den Gesichtspunkten, unter denen momentan gentherapeutische Ansätze verfolgt werden. Die Keimbahntherapie hingegen beschreibt eine permanente Verankerung genetischer Informationen in embryonalen Zielzellen und somit eine Vererbbarkeit. Im Rahmen des Embryonenschutzgesetzes ist diese Form der Gentherapie in der Bundesrepublik Deutschland zum jetzigen Zeitpunkt allerdings nicht erlaubt [4, 32].

Um das therapeutisch wirkende genetische Material in die Zielzelle einzubringen, (Transfektion) sind unter strategischen Gesichtspunkten zwei Verfahren möglich [5, 32, 47, 103]. Das ex vivo-Verfahren beschreibt hierbei die Entnahme der Zielzellen aus dem Körper des Patienten (z.B. Hepatozyten), die nachfolgende Vermehrung in entsprechenden Medien und die Einbringung der DNA in die Zielzellen außerhalb des Körpers. Anschließend werden die behandelten Zellen in den Organismus reimplantiert. Beim in vivo-Gentransfer hingegen werden die rekombinanten Gene direkt oder mittels eines geeigneten Vektors in den Patientenkörper eingebracht. Die genetische Information gelangt also ohne Umwege in die Zielzellen, so dass die Transfektion im Körper stattfindet.


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Abbildung 1: In vivo und ex vivo-Gentherapie

Der idealisierte Vektor sollte eine zellspezifische in vivo-Anwendung erlauben, sicher in das Genom der Zielzelle integriert werden, um so an die Tochterzellen weitergegeben zu werden und hierbei die Exzision des defekten Gens mit nachfolgendem Ersatz durch das gesunde Gen ermöglichen. Dabei sollte weder eine antigene noch onkogene Komponente wirksam und die lediglich einmalige therapeutische Applikation gewährleistet sein. Um das genetische Material in die Wirtszellen einzuschleusen stehen prinzipiell nicht virale und virale Vektoren zur Verfügung, welche spezielle Vor- und Nachteile bergen und die voranstehend erwähnten Kriterien bislang leider nicht erfüllen können. Zu den nicht viralen Gentransfermethoden zählen chemische Vorgänge wie die DNA-Komplexierung mit Calciumphosphat und physikalische Verfahren wie die Mikroinjektion, die Lipofektion, die direkte DNA-Einschleusung und der rezeptorvermittelte Gentransfer (targeting) [5, 10]. Der Hauptvorteil der physikalischen Methoden ist, dass kein Cotransfer von unerwünschtem genetischem Virusmaterial in die Wirtszellen stattfindet und damit das Risiko einer Replikation infektiöser Viruspartikel entfällt. Zudem besteht keine Einschränkung hinsichtlich des Wirtszellspektrums, so dass ein Gentransfer im Prinzip in alle Zellen erfolgen kann. Nachteilig ist, dass keine stabile Integration der transferierten DNA in das [Seite 5↓]Genom der Wirtszelle erfolgt, somit ein lysosomaler Abbauprozeß der DNA in Gang gesetzt wird, was eine Weitergabe an die Tochtergeneration verhindert. Durch zusätzliche Beeinflussung des lysosomalen Abbaus, z.B. durch Komplexierung des DNA-Protein-Moleküls bei der rezeptorvermittelten Endozytose mit einem inaktivierten Adenovirus, konnte zwar eine deutliche Effizienzsteigerung des Gentransfers herbeigeführt werden, trotzdem liegt nach wie vor eine lediglich transiente Genexpression vor. Dies bedeutet wiederum die Notwendigkeit wiederholter Anwendungen des Applikationsprozesses [2, 3].

Bei den viralen Vektoren handelt es sich um modifizierte Viren, die der Fremd-DNA als Transportvehikel dienen und deren Einsatz wiederum durch spezifische Vor- und Nachteile limitiert wird. Die Liste der als Vektor getesteten Viren ist groß und reicht von Papova- und Vacciniaviren über Adeno- und Adeno-assoziierte Viren bis hin zu Herpesviren und Retroviren verschiedener Spezies. Im folgenden soll lediglich auf die wichtigsten viralen Vektoren eingegangen werden, deren Charakteristika in Tabelle 2 zusammenfassend dargestellt sind.

Retroviren stellen das bislang wohl am besten untersuchte virale Vektorsystem dar [5, 47]. Hierbei handelt es sich um einen RNA-Virus, der in seinen infektiösen Eigenschaften durch Modifikation seines Genoms beschnitten wurde und zwar noch in der Lage ist, die Wirtszelle zu infizieren und die rekombinante genetische Information ins Wirtsgenom zu integrieren, aber nicht mehr in der Lage ist, infektiöse Viruspartikel zu bilden. Da es sich bei Retroviren zudem um Onkoviren handelt, wurde zusätzlich die Exzision der Genabschnitte erforderlich, die für onkogene Eigenschaften kodieren. Anstelle dieser Gene können dann die therapeutischen Gene eingebracht werden. Vorteil der Retroviren ist eine stabile Integration in das Genom der Wirtszelle mit einer Weitergabe der veränderten genetischen Information an die Tochtergeneration und eine hierdurch bedingte langfristige Expression der Genprodukte. Darüber hinaus wird durch die Entfernung antigen wirkender Viruskomponenten die Wahrscheinlichkeit einer Immunantwort des Wirtsorganismus deutlich reduziert. Limitierungen in der Anwendung erfährt dieses Vektorsystem jedoch dadurch, dass Retroviren lediglich ins Genom teilungsfähiger Zellen integrieren können, da sie von deren Fähigkeit zur DNA-Synthese abhängig sind. Dies bedeutet eine deutliche Einschränkung hinsichtlich des Wirtszellspektrums, da die meisten Zellen und Gewebe, die es durch Gentransfer zu beeinflussen gilt, Zellen sind, die sich nur noch selten teilen, so z.B. Hepatozyten, Endothelzellen und glatte Muskelzellen der Gefäßwände. Genauso ist die Transfektionsrate postmitotischer Zellen wie Neuronen oder peripherer Zellen nur gering. Eine Möglichkeit die Transfektionsrate zu erhöhen ist, den Gentransfer ex vivo durchzuführen, was wiederum die Gewinnung entsprechender Zielzellen aus [Seite 6↓]dem Patientenkörper erforderlich macht. Nachteilig ist weiterhin, dass die Integration des rekombinanten genetischen Materials semizufällig erfolgt, so dass prinzipiell auch eine Integration in normale Genabschnitte des Wirtsgenoms erfolgen kann, was zu einer gestörten Expression ansonsten gesunder Gene führen könnte. So könnte z.B. die Insertion in der Nähe eines Tumorsuppressorgens dessen Expression verändern und eine Tumorentstehung begünstigen.

Tabelle 2: Charakteristika der wichtigsten momentan erhältlichen Vektoren [5, 117, 121].

Charakteristika

Retrovirus

Adenovirus

Adeno-assoziierter Virus

Wildtypvirus

Einzelsträngige RNA, 9.2 kb

Doppelsträngige DNA, 36 kb

Einzelsträngige DNA, 5 kb

Insertionsgröße

8 kb

7.5 kb

4.5 kb

Titer (colony forming units/ml)

106-107

108-1010

106-108

Zielzellen

Nur teilungsfähige Zellen

Teilungsfähige und nicht teilungsfähige Zellen

Teilungsfähige und nicht teilungsfähige Zellen

Genexpressionsdauer

Langfristig

Transient

Transient bis langfristig

Genexpressionsausmaß

Mäßig

Hoch

Mäßig

Mögliche Hürden

Mutationen nach Insertion

Immunantwort des Wirtes

Toxizität viraler Proteine, Mutationen nach Insertion

Mögliche Wirtsimmunität

Nein

Ja

Ja

Replikationskompetent

Nein

Eventuell

Ja

Virale Proteinexpression

Nein

Ja

Nein

Ein weiteres gut untersuchtes Vektorsystem beruht auf modifizierten Adenoviren [5, 117, 121]. Dieses sind DNA-Viren, die trotz ihrer Größe und ihres relativ komplexen Aufbaus mittlerweile erfolgreich hergestellt werden können. Der adenovirale Lebenszyklus findet in vier Schritten statt. Die virale Infektion erfolgt durch rezeptorvermittelte Aufnahme in die Zielzelle, wo im Zytoplasma der rekombinante DNA-Kern durch virale Proteasen freigelegt wird und die DNA nachfolgend in den Nukleus der Wirtszelle gelangt. Hier finden dann zwei frühe Transkriptionsphasen statt, die der erst sechs bis acht Stunden später beginnenden DNA-Replikation vorausgehen. Die Initiierung der frühen Transkriptionsphasen hängt hierbei im [Seite 7↓]Wesentlichen von dem Frühe-Phase-Gen E1A ab, so dass durch Deletion der E1-Region im adenoviralen Genom ein replikationsdefizienter Vektor hergestellt werden konnte, der anstelle der E1-Region ein therapeutisches Gen tragen kann. Eine Vermehrung dieses Virus ist dann nur noch in Gegenwart von Helferzellen möglich, in welche die E1-Region integriert wurde (siehe Abbildung 2) [5, 121].

Abbildung 2: Vereinfachte Darstellung eines adenoviralen Gentransfersystems

A: Wildtypgenom eines Adenovirus; charakteristisch sind die überlappenden Gensequenzen, welche die Produktion eines nicht antigen wirkenden Vektors erschweren; die frühen Gene (E1- E4) codieren für Enzyme und regulatorische Proteine, die späten Proteine (L1- L5 und IVa2) für Strukturproteine. Die invertierten Regionen (ITR = inverted terminal repeat) enthalten Elemente, die für Replikation und Verpackung des Genoms bedeutsam sind. B: Adenoviraler Vektor, wo nach Deletion der E1-Region Fremd-DNA integriert wurde. C: Durch die Deletion der E1-Region ist der Vektor nicht mehr in der Lage, sich unabhängig zu vermehren; hierzu ist er auf die Präsenz von Helferzellen angewiesen, in welche der E1-Genabschnitt integriert wurde (modifiziert nach [2] und [6]).

Vorteil der adenoviralen Vektoren ist die Fähigkeit zur Infizierung auch ruhender oder sich langsam teilender Zellen, woraus ein großes potentielles Wirtszellspektrum resultiert. Darüber hinaus ist die Transfektionsrate der Wirtszellen außerordentlich hoch, und es können hohe Virustiter erzeugt werden, so dass sich dieser Virus insbesondere für in vivo-Gentransfermethoden eignet. Nachteilig wirkt sich jedoch aus, dass die adenoviralen Gensequenzen nicht ins Genom der Wirtszelle integriert werden, so dass keine Vererbung der veränderten genetischen Information möglich ist und der Effekt mit der Zellteilung verloren [Seite 8↓]geht. Das erklärt, dass die Expressionsprodukte der rekombinanten Gene nur transient nachgewiesen werden können. Dies macht den Einsatz bei chronischen metabolischen Störungen z.B. fragwürdig, ein potentielles Einsatzgebiet dieser Methode wären eher Krankheiten, die eventuell mit einer einmaligen therapeutischen Gabe auskommen, z.B. Krebserkrankungen. Komplizierend kommt hinzu, dass bei der Modifizierung der Viren nicht alle antigen wirkenden viralen Gensequenzen exzidiert werden können, da die virale DNA zum Teil starke Überlappungen ihrer Gensequenzen aufweist. Bedingt hierdurch kommt es zu einer Immunantwort des Wirtsorganismus mit Aktivierung zytotoxischer T-Zellen oder der Bildung neutralisierender Antikörper. Gerade der letzte Punkt spielt beim Einsatz der adenoviralen Vektoren eine limitierende Rolle, da Adenoviren humanpathogene Viren sind und der Mensch im Laufe seines Lebens häufig Infektionen hiermit durchmacht, insbesondere Infektionen der oberen Atemwege, was eine Durchseuchung der Bevölkerung mit präformierten Antikörpern bedeutet. Bislang sind 49 humane Serotypen bekannt, welche nach ihrer Gewebsspezifität und Virulenz in sechs Gruppen eingeteilt werden [121]. Einen Überblick über die wichtigsten humanpathogenen Adenoviren gibt Tabelle 3.

Tabelle 3: Serotypen verschiedener humanpathogener Adenoviren [6-8].

Erkrankung

Adenovirusserotypen

Obere Atemwegsinfekte und atypische Pneumonien

1- 7, 14, 21

Pharyngokonjunktivalfieber

3, 7

Keratokonjunktivitis

8, 11, 19, 37

Meningitis

3, 5, 6, 7, 7a, 12

Gastroenteritis

40, 41

Hepatitis

1, 2, 5

Ein weiteres virales Vektorsystem beruht auf Adeno-assoziierten Viren [5]. Hierbei handelt es sich um kleine, nicht humanpathogene DNA-Viren, die sich in den Wirtszellen nur in Anwesenheit eines Hilfsvirus (Adenoviren oder Herpesviren) replizieren können. Dafür erfolgt eine Integration des Virusgenoms in die Wirtszell-DNA, wobei hier insbesondere eine bestimmte Region auf dem Chromosom 19 bevorzugt wird. Hierdurch wiederum wird das oben beschriebene Mutationsrisiko semizufälliger Insertionen reduziert. Nachteilig in der Anwendung dieser Vektoren ist die Notwendigkeit der Applikation der Helferviren, was erneut eine [Seite 9↓]Immunantwort des Wirtsorganismus zur Folge haben kann. Darüber hinaus ist die Insertionsgröße des therapeutischen genetischen Materials aufgrund der ohnehin geringen Größe des Virus deutlich limitiert und die Transfektionsrate nur mäßig. Zudem können keine überragend hohen Virustiter erreicht werden, und es existieren Restriktionen bezüglich der möglichen Zielzellen, was den Einsatz dieses Vektorsystems bislang auf ex vivo-Gentransfermethoden begrenzt [9]


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1.2  Lipidstoffwechsel

1.2.1 Lipide

Lipide bezeichnen eine heterogene Gruppe natürlicher Substanzen mit unterschiedlicher chemischer Struktur. Sie kommen im menschlichen Körper als Serumlipide, Strukturelemente der Zellmembran, Substrate für die Synthese von Hormonen oder als Depotfett vor und können anhand ihrer Verbindungsklassen in einfache und komplexe Lipide oder nach ihrem Verhalten in wässrigen Medien in hydrophobe und amphiphile Lipide eingeteilt werden (siehe Abbildung 3). Da sie überwiegend lipophile Gruppen enthalten, sind sie gut löslich in organischen Lösungsmitteln wie z.B. Ether, nicht aber in Wasser. Daher müssen im wässrigen Medium Blut spezielle Transportmechanismen existieren. So bilden einige Lipide kolloidale und mizellare Lösungen, für andere hingegen gibt es spezielle Transportproteine. Die polaren Lipide (z.B. freie Fettsäuren) werden hierbei häufig an verhältnismäßig kleine Proteine wie z.B. Albumin oder an spezielle Transportproteine gebunden, so z.B. Retinol [12].


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Abbildung 3: Lipidklassen des Blutplasmas, darunter kursiv die jeweilige Funktion (modifiziert nach [12, 13])


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1.2.2  Lipoproteine

Die nicht polaren Lipide hingegen werden in wesentlich größeren amphiphilen Komplexen, den Lipoproteinen, transportiert. Aufgabe der Lipoproteine ist die Aufnahme, der Transport und die Verstoffwechselung der Nahrungsfette und des Cholesterins. Hierbei handelt es sich um in ihrer Zusammensetzung und Struktur variable Konstrukte aus Cholesterin, Cholesterinestern, Phospholipiden, Triglyzeriden und Apolipoproteinen [11, 15, 22, 101]. Sie bestehen aus einem hydrophoben Kern (Cholesterinester, Triglyzeride) und einer diesen umhüllenden polaren monomolekularen Schicht aus Cholesterin, Phospholipiden und Apolipoproteinen (Abbildung 4).

Abbildung 4: Strukturmodell eines LDL-Lipoproteins

Durchmesser 20-25 nm. Die Oberfläche des kugelförmigen Partikels besteht aus einer Einzelschicht von Phospholipiden und Cholesterin, in die ein einziges Molekül des hydrophoben Apoproteins Apo B eingebettet ist. Der LDL-Kern ist außerordentlich hydrophob und besteht vornehmlich aus Cholesterinestern mit langkettigen Fettsäuren (modifiziert nach [10, 11, 14, 15]).

Zur Klassifizierung der Plasmalipoproteine werden verschiedene Kriterien herangezogen, so die mittels Gelfiltration nachweisbare unterschiedliche Größe, die Oberflächenladung und die damit verbundene elektrophoretische Wanderung, die verschiedene Dichte in der Ultrazentrifugation, die Löslichkeit sowie einige spezielle Oberflächeneigenschaften, die z.B. die Präzipitation beeinflussen. Durch Trennung mittels Ultrazentrifugation können hierbei fünf verschiedene Hauptklassen unterschieden werden: Chylomikronen (CM), Very Low Density- (VLDL), Intermediate Density- (IDL), Low Density- (LDL) und High Density- (HDL) Lipoproteine, die [Seite 13↓]ihrerseits in Subklassen unterteilt werden. Einen Überblick über Einteilung und Eigenschaften geben die Tabellen 4 und 5 [10, 11, 13, 15, 22, 95, 101].

Tabelle 4: Einteilung und Eigenschaften der Serumlipoproteine (modifiziert nach [10, 11, 101]).


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Tabelle 5: Dichteklassen der Lipoproteine [11].

Dichteklasse

Subklasse

Dichte [g/ml]

VLDL

 

<1,006

LDL

 

1,006-1,063

LDL 1

1,006-1,019

 

LDL 2

1,019-1,063

HDL

 

1,063-1,21

HDL 2

1,063-1,125

HDL 2a

1,100-1,125

HDL 2b

1,063-1,100

HDL 3

1,125-1,21

HDL 3L

1,140 (Maximum)

HDL 3D

1,160 (Maximum)

1.2.3 Apolipoproteine

Apolipoproteine sind die Proteinkomponenten der Lipoproteine, die nach immunologischen Eigenschaften, Aminosäurensequenz und Kohlenhydratanteil differenziert werden können. Neben den strukturellen Funktionen innerhalb der Lipoproteinpartikel dienen sie als Liganden für spezifische, innerhalb der Plasmamembran lokalisierte Lipoproteinrezeptoren und fungieren als Effektoren von Enzymen des intravasalen Lipoproteinstoffwechsels [10, 11, 102]. Tabelle 6 gibt hierbei einen Überblick über Eigenschaften, Vorkommen, Funktion und Konzentration der Plasmalipoproteine.

Während die Proteinkomponente des LDL zu 95 % durch Apo B gestellt wird, finden sich in den anderen Dichteklassen komplexe Apolipoproteinmuster. Da ein sehr rascher Austausch der Apolipoproteine A1, A2, C1, C2 und C3 zwischen den Chylomikronen, VLDL, IDL und HDL nachzuweisen ist, sind exakte Angaben über ihre jeweilige Verteilung schwer zu erhalten. Diese natürlichen Austauschprozesse führen dazu, dass die in der Leber und dem Intestinum gebildeten nascenten Formen schnell ihre ursprüngliche Zusammensetzung ändern und in die eigentlichen Plasmalipoproteine übergehen.


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Tabelle 6: Vorkommen und Funktion der Apolipoproteine [13, 95, 102].

Apolipo-protein

Dichteklasse

Masse (kDa)

Funktion

A-I

HDL

28

Strukturprotein, LCAT-Aktivierung, Bindung an HDL-Rezeptoren

A-II

HDL

17

Aktivierung der hepatischen Lipase ?

A-IV

CM, HDL

46

Triglyzeridstoffwechsel, LCAT-Aktivierung

B 100

VLDL, LDL

550

Sekretion von Triglyzeriden und Cholesterin, Strukturprotein, Bindung an B/E-Rezeptoren, Aktivierung der Lysolecithin-Acyltransferase

B 48

CM, VLDL

265

Resorption von Lipiden und lipidlöslichen Vitaminen aus der Nahrung

C-I

CM, VLDL

6,5

Unterdrückung der Bindung nascierender Lipoproteine an den B/E-Rezeptor und an LRP, LCAT-Aktivierung

C-II

CM, VLDL

8,8

Aktivierung der Lipoproteinlipase

C-III

CM, VLDL

8,9

Inhibierung der Lipoproteinlipase und Interferenz mit Lipoproteinen an Leberrezeptoren

D (A-III)

HDL3

29

LCAT-Aktivierung und –Stabilisierung

E

CM, VLDL

34

Ligand für den B/E-Rezeptor sowie E-Rezeptor, Ausschleusung von Cholesterin aus peripheren Zellen

F

HDL

30

Unbekannt

G

VLDL

72

Unbekannt

H

CM, d>1,21 kg/l

55

Unbekannt

(a)

Lp(a)

350-900 (variabel)

Unbekannte Funktion in Blutgerinnung und Fibrinolyse

J

HDL2, HDL3

70

Unbekannt

1.2.4 Stoffwechsel der Lipoproteine

Hauptsyntheseorte der Lipoproteine sind Intestinum und Leber, die in Anbetracht ihrer unterschiedlichen Aufgaben im Lipidstoffwechsel und –transfer jeweils ein eigenes Spektrum an Lipoproteinen synthetisieren [10-12, 15, 22, 96]. Da das Intestinum vorwiegend die mit der Nahrung zugeführten Lipide zu verarbeiten hat und die Leber Lipoproteine aus körpereigenen Lipiden aufbaut, die zum Teil aus der Peripherie (z.B. Fettgewebe) und zum Teil aus dem Katabolismus von Lipoproteinen stammen, unterscheidet man einen exogenen und einen endogenen Weg des Lipoproteinstoffwechsels.


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Hierbei beschreibt der exogene Weg die intestinale Lipoproteinsynthese, wobei es nach Mahlzeiten in der Dünndarmmukosa zur Bildung triglyzeridreicher Chylomikronen kommt. Diese gelangen über die Lymphe ins Blut, wo sie vorzugsweise in den Kapillaren des Fettgewebes sowie des Skelett- und Herzmuskels sehr schnell wieder abgebaut werden. Im Rahmen des bereits beschriebenen ständigen Austauschs von Apolipoproteinen nehmen die Chylomikronen von den HDL auch das Apoprotein C2 auf, welches als Aktivator der Lipoproteinlipase (LPL) wirkt. Dieses Enzym hydrolysiert die Triglyzeride der Chylomikronen zu freien Fettsäuren, welche entweder – nach neuerlicher Veresterung - im Fettgewebe gespeichert werden oder an Albumin gebunden auf dem Blutweg weitertransportiert werden, übrigbleibende Partikel werden von der Leber abgefangen und ganz abgebaut. Durch den Abbau der Chylomikronen entstehen die sogenannten Chylomikronen-Remnants (CM-R), die an Dichte zu- und an Größe abnehmen und nur noch 5% der ursprünglichen Partikelmasse ausmachen. Da während der Umbauprozesse auch das Apoprotein C verloren geht, werden die Remnants nicht mehr weiter durch die LPL abgebaut, sondern werden zur Leber transportiert und hier über spezifische Apo E-Rezeptoren aufgenommen (siehe Abbildung 5) [96, 100].

Der endogene Weg beschreibt die hepatische Lipoproteinproduktion und hierbei im wesentlichen die VLDL-Synthese und –Metabolisierung [100]. In der Leber werden aus körpereigenen Lipiden und Apolipoproteinen die VLDL gebildet, welche mit einem Triglyzeridgehalt von ca. 60% den wesentlichen intravasalen Carrier für endogene Triglyzeride darstellen. Nach der Abgabe in die Blutbahn werden auch diese rasch verstoffwechselt, indem sie durch Aufnahme der Apoproteine E und C die LPL aktivieren und hierdurch die Triglyzeride zu Di- und Monoacylglyzerolen sowie freien Fettsäuren hydrolysiert werden. Dieser intravasale enzymatische Abbau der VLDL geht erneut mit einem regen Austausch seiner Bestandteile einher, der Gehalt der einzelnen Partikel ändert sich ständig, lediglich der Gehalt des Apoprotein B bleibt konstant, da dieses nicht abgegeben wird. Über mehrere Zwischenstufen kommt es so zur Entstehung von VLDL-Remnants, den sogenannten IDL, welche wiederum unter Einfluß der hepatischen Triglyzeridlipase (HTGL) in die cholesterolreichen LDL umgewandelt werden. Diese gelangen per Blutstrom zur Leber und in die Peripherie, wo sie an den hochaffinen LDL-Rezeptor binden, ein integrales Membranprotein der Zielzellen, und zu 80% mittels rezeptorvermittelter Endozytose aufgenommen werden, ein kleinerer Teil wird über rezeptorunabhängige Wege eliminiert. Intrazellulär wird das Cholesterin durch lysosomale Hydroxylasen aus den endozytotischen LDL-Vesikeln freigesetzt und seiner eigentlichen [Seite 17↓]Funktion, z.B. dem Zellmembranaufbau, zugeführt, überschüssiges Cholesterin wird nach erneuter Veresterung durch die Acyl-CoA-Cholesterin-Acyltransferase (ACAT) gespeichert.

Abbildung 5: Stoffwechsel der Plasmalipoproteine. Dargestellt sind exogenes, endogenes und reverses Cholesterintransportsystem (modifiziert nach [13]).

Der Rücktransport des Cholesterins aus den peripheren Geweben zur Leber (reverser Cholesterintransport) wird durch die in Darm und Leber produzierten HDL-Partikel gewährleistet. Die nascenten Formen haben zunächst eine discoidale Form, erst nach der Aufnahme von Phospholipiden, Cholesterol sowie den Apoproteinen C und E aus den Chylomikronen und VLDL nehmen die reifen Partikel eine sphärische Form an. Hierbei sind die HDL auch in der Lage, Cholesterol aus den arteriosklerotischen Plaques der Blutgefäße herauszulösen, weshalb ihnen eine antiarteriosklerotische Wirkung zugeschrieben wird. Das Cholesterol wird unter Einfluß der Lecithin-Cholesterol-Acyl-Transferase (LCAT) verestert und [Seite 18↓]im hydrophoben Kern gespeichert. Nachfolgend werden die HDL-Partikel zur Leber transportiert und aufgenommen, wo das Cholesterol metabolisiert und in Form von Gallensäuren bzw. als freies Cholesterin oder Cholesterinester mit der Galle ausgeschieden wird. Ein anderer Teil des veresterten Cholesterins wird unter Vermittlung von Cholesterinester-Transfer-Proteinen (CETP) auf Apo B enthaltende Lipoproteine übertragen, um via LDL in die Leber oder erneut in periphere Gewebe zu gelangen [1, 10- 13].

1.2.5 Stoffwechsel der Low Density Lipoproteine

Die LDL stellen in ihrer Dichteklasse eine heterogene Partikelpopulation dar, die sich in mindestens fünf Subfraktionen unterteilen läßt, die sich in ihrem Katabolismus unterscheiden. Die Halbwertszeit beim gesunden Probanden beträgt etwa zwei Tage. LDL entstehen intravasal durch den Umbau von VLDL über die weniger dichten IDL und werden anschließend – im Gegensatz zu den VLDL und HDL – ohne entscheidende Umbauvorgänge als Gesamtpartikel eliminiert [11, 12]. Hierbei kommt der Leber eine zentrale Rolle zu, da sie nicht nur die LDL-Produktion via VLDL-Synthese steuert, sondern auch ca. 60-70% des gesamten LDL-Katabolismus auf sie entfallen. Der Rest wird durch die peripheren Gewebe getragen, wo das Cholesterin zum Aufbau von Zellmembranen sowie zur Synthese von Steroidhormonen und Vitamin D benötigt wird. Die Low Density Lipoproteine werden zu etwa zwei Dritteln über den hochaffinen LDL-Rezeptor eliminiert, der Rest wird durch Makrophagen und histiozytäre Zellen des retikuloendothelialen Systems abgebaut. Dieser als „scavenger pathway“ bezeichnete Abbauweg ist im Gegensatz zum LDL-Rezeptor-abhängigen Katabolismus nicht sättigbar [12, 13, 31, 34]. Ihm liegen auf zellulärer Ebene mehrere Mechanismen zugrunde wie die adsorptive Endozytose über niedrig affine Rezeptoren oder die Pinozytose sowie die Aufnahme von LDL über Rezeptoren, die spezifisch modifizierte LDL erkennen, die sogenannten Scavenger-Rezeptoren [97]. Während die Leber den überwiegenden Teil via LDL-Rezeptor aufnimmt, beschreiten die peripheren LDL-verstoffwechselnden Gewebe ca. zur Hälfte diesen LDL-Rezeptor-unabhängigen Weg [11]. Eine Regulation erfährt der LDL-Abbau durch das Expressionsausmaß des LDL-Rezeptors, da dieses unter anderem auch durch Hormone (Östrogene) oder diätetische Maßnahmen beeinflußt werden kann und eine daraus folgende Down- oder Up-Regulation unmittelbare Auswirkungen auf die Höhe des LDL-Spiegels im Blut hat.


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1.2.6  Low Density Lipoprotein-Rezeptor und LDL-Rezeptorzyklus

Der LDL-Rezeptor ist ein integrales Membranglykoprotein, das eine Schlüsselrolle in der Regulation der Cholesterinserumkonzentration spielt und sich in unterschiedlichem Ausmaß auf den meisten Zelltypen nachweisen läßt, besonders hohe Konzentrationen finden sich jedoch auf den Hepatozyten und den Zellen der Nebennierenrinde. Der aus einer einzigen, 839 Aminosäuren langen oligosaccharidhaltigen Peptidkette aufgebaute Rezeptor besteht bei grober Unterteilung aus fünf Domänen, denen jeweils unterschiedliche Funktionen zugeschrieben werden [10, 11, 13, 14] (Abbildung 6).

Abbildung 6: Die fünf Domänen des menschlichen LDL-Rezeptors (modifiziert nach [15] und [14]).

Der größte Teil des Proteins liegt hierbei extrazellulär, nur ein kleiner Anteil wird durch die Transmembran- und die zytoplasmatische Domäne gestellt. Die extrazellulär gelegene aminoterminale Domäne fungiert als Bindungsstelle für Apolipoprotein B 100 und Apolipoprotein E. Sie besitzt eine cysteinreiche Sequenz von 40 Resten, die sich, mit geringfügigen Variationen, siebenmal wiederholt und über zahlreiche Disulfid-Bindungen verknüpft ist. Eine Anhäufung negativ geladener Seitenketten, reich an Clustern aus Glutamat und Aspartat, reagiert mit entprechenden positiv geladenen Regionen des Liganden. Die zweite Domäne zeigt eine 35%-ige Homologie zu einem Teil der Vorstufe des Epidermiswachstumsfaktors und enthält zwei N-gebundene Oligosaccharidketten, ihre Funktion [Seite 20↓]ist allerdings noch nicht bekannt. Die dritte Domäne ist unmittelbar oberhalb der Plasmamembran lokalisiert und enthält Serin- und Threoninreste, die O-glykosidisch gebundene Zuckerreste tragen. Diese Oligosaccharide wirken möglicherweise als Stabilisatoren, die den Rezeptor von der Membran weggestreckt halten, damit die aminoterminale Domäne den Liganden zugänglich ist. Die vierte Domäne durchspannt mit ihren 22 hydrophoben Aminosäuren die Zellmembran und verankert auf diese Weise den Rezeptor. An sie schließt sich die zytosolseitige Domäne an, welche mit Clathrin in Interaktion tritt und via Ansammlung von Rezeptormolekülen auf der Zelloberfläche die Wechselwirkung des Rezeptors mit den coated pits kontrolliert.

Der LDL-Rezeptor spielt in der Homöostase des Cholesterinstoffwechsels eine Schlüsselrolle. Da er sowohl Apo B als auch Apo E binden kann, wird er auch als B/E-Rezeptor bezeichnet, seine Affinität ist für Apo E allerdings ca. 10-mal höher als für Apo B. Weil Apo E-haltige Lipoproteine jedoch mehrere Apo E enthalten, werden durch einen Partikel gleich mehrere Bindungsstellen abgesättigt, während LDL nur jeweils ein Apo B enthalten und somit gleichzeitig mehrere Partikel gebunden werden können. Dies bedingt eine ca. drei-mal höhere Kapazität des B/E-Rezeptors für LDL gegenüber Apo E-haltigen Lipoproteinen [100].

Die Synthese des Rezeptorproteins findet im rauhen endoplasmatischen Retikulum in Form eines Vorläufermoleküls statt, das in Transportvesikeln zum Golgi-Apparat transportiert wird. Hierbei wird durch kontinuierliche Anheftung von Kohlenhydratresten die Modifizierung zum reifen LDL-Rezeptor vollzogen. Dieser wird in sog. coated vesicles zur Zelloberfläche transportiert, wo er ca. 45 Minuten nach Synthesebeginn in die Zellmembran integriert wird. Nach dem Binden spezifischer Apo E- und Apo B-haltiger Liganden sammeln sich die Rezeptoren dann in den sog. coated pits (Stachelsaumgrübchen), welche ihren Namen durch einen käfigartigen Überzug aus multiplen Proteinfilamenten, dem sogenannten Clathrin, erhalten, die an der zytoplasmatischen Zellmembranseite exprimiert werden. Durch Einstülpung und Abschnürung dieser speziellen Zellmembranregion bilden sich coated vesicles aus, die der Internalisierung der LDL-beladenen Rezeptoren dienen, dieser Vorgang wird als rezeptorvermittelte Endozytose bezeichnet. Im Zytoplasma entsteht nach Depolymerisation des Clathrin-Mantels ein Endosom oder uncoated vesicle, das mit einem uncoupling vesicle ( C ompartment of u ncoupling of r eceptor and l igand = CURL) fusioniert. In diesem wird durch eine ATP-getriebene Protonenpumpe ein schwach saurer pH-Wert um 5,0 hergestellt, wodurch es zu einer Dissoziation des LDL-Partikels vom Rezeptor kommt. Letzterer wird nach Abschnürung eines rezeptorreichen Abschnitts recycelt und zur Zelloberfläche zurückgebracht. Die Dauer so eines Regenerationszyklus beträgt gerade [Seite 21↓]mal zehn Minuten, so dass der Rezeptor mehrfach verwendet werden kann, bis er nach ca. 20 Stunden Lebensdauer endgültig abgebaut wird. Das LDL-haltige Vesikel fusioniert schließlich mit einem primären Lysosom, wodurch ein großes sekundäres Lysosom entsteht. Der Proteinanteil der LDL wird dort durch Proteasen in Aminosäuren hydrolysiert, während die Cholesterinester der LDL durch eine saure lysosomale Lipase in freies Cholesterin und freie Fettsäuren hydrolysiert werden. Die Fettsäuren werden für die Synthese neuer Phospholipide verwendet, das freie Cholesterin hingegen durchquert nachfolgend die lysosomale Membran mittels passiver Diffusion, um zur Membransynthese genutzt zu werden. Zusätzlich werden durch den Anstieg freien Cholesterins in der Zelle drei regulatorische Schritte des zellulären Cholesterinmetabolismus ausgelöst. Erstens wird durch einen Feed-back-Mechanismus die zelluläre Cholesterinsynthese gebremst, indem die Aktivität des Schrittmacherenzyms, der 3-Hydroxy-3-Methyl-Glutaryl-CoA-Reduktase (HMG-CoA-Reduktase), supprimiert wird. Zweitens wird die Acyl-CoA-Cholesterin-Acyltransferase (ACAT) aktiviert, welche freies Cholesterin und langkettige Fettsäuren reverestert und damit in die Depotform überführt. Drittens kommt es zu einer Unterdrückung der LDL-Rezeptorneusynthese, wodurch die weitere LDL-Aufnahme aus dem Plasma in die Zelle begrenzt wird [12, 14, 15, 22, 98-100].

Abbildung 7: Der LDL-Rezeptorzyklus (modifiziert nach [13] und [14]).


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1.3  Familiäre Hypercholesterinämie

1.3.1 Geno- und phänotypische Charakteristika der Familiären Hyper-cholesterinämie

Die autosomal-dominant vererbte Familiäre Hypercholesterinämie (FH) zählt zu den häufigsten monogenetischen Stoffwechselkrankheiten. In ihrer heterozygoten Form kommt sie bei Kaukasiern mit einer Häufigkeit von 1:500 in der Bevölkerung relativ oft vor, während sie in der homozygoten Form mit einer Häufigkeit von 1:1.000.000 weitaus seltener ist [10, 13, 16, 27, 119]. Klinisch ist die Erkrankung durch ein erhöhtes Gesamt- und LDL-Cholesterin, eine Xanthomatose der Sehnen und der Haut sowie eine frühzeitig einsetzende Koronarsklerose gekennzeichnet, wobei der Manifestationszeitpunkt bei der homozygoten Form bereits im Kindesalter liegt. Auch kann es zu wiederkehrenden Oligo- oder Polyarthritiden sowie Tendosynovitiden kommen, welche bei Homozygoten sogar zu Gelenkdeformitäten führen können. Laborchemisch lassen sich bei homozygot Erkrankten LDL-Cholesterinserumkonzentrationen von 400-1.000 mg/dl nachweisen, während diese bei Heterozygoten zwischen 200 und 400 mg/dl liegen, hierbei sind die Triglyzeridserumkonzentrationen typischerweise normal oder allenfalls leicht erhöht [12, 22, 100]. Xanthome der Sehnen und der Haut sind typische äußere Zeichen der Familiären Hypercholesterinämie [13], wobei die Häufigkeit ihres Auftretens sowohl mit der Höhe der Cholesterinserumkonzentration als auch mit dem Alter des Patienten korreliert [21]. Dies bedingt, dass heterozygot erkrankte Patienten nach dem 20. Lebensjahr in 46-95% der Fälle Sehnen- und seltener Hautxanthome aufweisen, Homozygote jedoch bis zum vierten Lebensjahr in nahezu 100%. Sehnenxanthome sind palpatorisch derbe, gegenüber der Sehne nicht verschiebbare Erhabenheiten, die typischerweise im Bereich der Fingerstrecksehnen und der Achillessehne zu finden sind [35]. Die Hautxanthome hingegen sind weiche, halbkugelige, gelbliche und gegenüber der Unterlage verschiebliche Knoten, die bevorzugt über den Streckseiten der Ellenbogen, in der Glutealregion und über den Kniescheiben zu finden sind. Während die sogenannten planen Xanthome in den Interdigitalfalten nur bei homozygot Erkrankten zu finden sind, sind Xanthelasmen und der Arcus lipoides corneae zwar durchaus häufige klinische Manifestationen bei der FH, jedoch keinesfalls pathognomonisch, prinzipiell können sie sogar bei Patienten mit einer normalen Cholesterinserumkonzentration auftreten.

Dramatischer sind jedoch die atherosklerotischen Gefäßveränderungen, denen FH-Patienten im Bereich der Koronarien und der thorakalen und abdominellen Aorta bereits frühzeitig unterliegen [Seite 23↓][13, 34]. Zwar kommt es auch zu entsprechenden Veränderungen an den hirnzuführenden Gefäßen und seltener auch an den peripheren Arterien, klinisch manifeste zerebrale oder gar periphere arterielle Durchblutungsstörungen sind jedoch sehr selten. Limitierend wirkt die Erkrankung durch ihre Veränderungen an den Herzkranzgefäßen, was früh zu einer koronaren Herzerkrankung mit entsprechenden klinischen Manifestationen wie pectanginösen Beschwerden und Myokardinfarkten führt. Homozygote erfahren diese Veränderungen bereits in der Kindheit und entwickeln umschriebene proximale Koronarstenosen sowie valvuläre oder supravalvuläre Aortenstenosen durch xanthomatöse Ablagerungen im Bereich der Aortenklappe und Aortenwurzel, gelegentlich finden sich auch xanthomatöse Ablagerungen im Bereich der Mitralklappe. Dies wiederum bedingt das frühzeitige Auftreten von Herzinfarkten schon vor dem 10. Lebensjahr sowie den Tod meist vor Erreichen des Erwachsenenalters. Heterozygote entwickeln entsprechende Veränderungen später und schleichender, meist treten die ersten Anzeichen zwischen dem 25. und 45. Lebensjahr auf, wobei Männer auch bei gleich hohen Cholesterinspiegeln häufiger und früher als Frauen betroffen sind [12, 13], was möglicherweise durch eine stärkere Erniedrigung des HDL-Spiegels bedingt ist [26]. Insgesamt ist bei den nur ein krankes Allel aufweisenden Heterozygoten ein wesentlich variableres klinisches Krankheitsbild zu beobachten als bei homozygot Erkrankten, welche zwei defekte Allele besitzen.

Die genetische Ursache der FH ist in Mutationen im Bereich des LDL-Rezeptorgens begründet, welche zu entsprechenden Funktionsstörungen des LDL-Rezeptors führen [13, 17-20]. Der Grundstein hierfür wurde durch Brown und Goldstein in den 70er Jahren durch Untersuchungen an kultivierten Fibroblasten homozygot Erkrankter gelegt [22]. Das 45 kb lange humane LDL-Rezeptorgen befindet sich auf dem linken Arm des Chromosoms 19 und beinhaltet 18 Exons und 17 Introns. Mittlerweile sind über 200 verschiedene Mutationen bekannt, welche alle zu einer gestörten LDL-Aufnahme aus dem Plasma und damit zu einer Erhöhung der LDL-Konzentration im Serum führen. Abbildung 8 illustriert die Struktur des LDL-R-Gens mit einigen bekannten Mutationen [10, 13, 30].


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Abbildung 8: Struktur des LDL-Rezeptor-Gens mit einigen bekannten Mutationen [13].

Molekularbiologische Untersuchungen an einer großen Zahl homozygoter Patienten führten wiederum zu einer Zuordnung dieser Mutationen zu bislang fünf Klassen, wobei viele LDL-Rezeptorallele mehreren Klassen gleichzeitig angehören [13, 22]: Bei Klasse 1-Mutationen wird von dem defekten Gen kein Rezeptor oder nur eine sehr geringe Menge gebildet. Die am häufigsten vorkommenden Klasse 2-Mutationen führen zur Bildung eines transport-defizienten Rezeptors, dessen intrazelluläre Weiterleitung entweder stark verlangsamt abläuft, so dass nur wenige Rezeptoren verspätet die Zelloberfläche erreichen (Typ 2b) oder dessen Transport auf der Ebene des Vorläufermoleküls zwischen dem endoplasmatischen Retikulum und dem Golgi-Apparat blockiert wird, so dass es gar nicht erst zur Expression des Rezeptors auf der Zelloberfläche kommt (Typ 2a). Zwar laufen die bislang beschriebenen Schritte bei den Klasse 3-Mutationen regelrecht ab, d. h. es kommt zum Erscheinen des Rezeptors auf der Zelloberfläche, dafür kann dieser jedoch keinen Liganden binden. Als auslösend sind hier Mutationen zu sehen, welche die cysteinreiche LDL-Bindungsdomäne oder die Epidermiswachstumsfaktor-Präkursor-homologe Domäne betreffen. Bei den am seltensten vorkommenden Klasse 4-Mutationen kommt es hingegen zu einer komplikationslosen Prozession des Rezeptors an die Zelloberfläche und auch zu einer regelrechten Ligandenbindung, allerdings unterbleibt die für die Internalisierung des Rezeptor-Ligand-Komplexes zwingend notwendige Ansammlung in coated pits, welches die Aufnahme in die [Seite 25↓]Zelle verhindert. Die Klasse 5-Mutationen schließlich beschreiben einen Rezeptor, der bezüglich Transport, Ligandenbindung und Internalisierung ein regelrechtes Verhalten zeigt, jedoch unterbleibt nachfolgend die Ablösung des LDL im Endosom, so dass kein Recycling des LDL-Rezeptors stattfindet.

Die beschriebenen Defekte führen bei Patienten mit FH sowohl zu einem gestörten LDL-Abbau als auch zu einer erhöhten LDL-Synthese, was durch die duale Rolle des LDL-Rezeptors bedingt ist [28, 29, 23-25]. LDL entsteht als Abbauprodukt der von der Leber sezernierten VLDL, wobei als Intermediärprodukt die sog. IDL entstehen. Diese Apo E-haltigen Partikel werden etwa zur Hälfte von den LDL-Rezeptoren abgebaut und auch bei normaler Rezeptorfunktion verbleibt ein Teil im Plasma, wo er zu den LDL hydrolysiert wird, die ebenfalls durch den membranständigen Rezeptor gebunden werden. Der Rezeptor übernimmt beim Stoffwechselgesunden also eine duale Rolle, indem er zum einen die LDL-Produktion durch Eliminierung des LDL-Vorläufers IDL aus der Blutbahn senkt und zum anderen den LDL-Abbau durch rezeptorvermittelte Endozytose anstößt. Die fehlende IDL-Aufnahme und die gestörte LDL-Aufnahme in die Zelle bei der FH bedingen nun eine Erhöhung der LDL-Serumkonzentration zum einen durch eine vermehrte LDL-Produktion aus IDL, zum anderen durch LDL-Retention in der Blutbahn und eine Ankurbelung der zelleigenen Cholesterinbiosynthese. Bezüglich des katabolen Defekts konnten in vivo-Stoffwechselstudien zeigen, dass das LDL bei heterozygoten FH-Patienten etwa 50% langsamer abgebaut wird als bei Stoffwechselgesunden, Homozygote benötigen hierfür sogar ca. drei-mal so lange [23]. Dies bedingt, dass dem LDL-Abbau über die in Kapitel 1.2.5 beschriebenen LDL-Rezeptor-unabhängigen Wege bei FH-Patienten eine vergleichsweise größere Bedeutung zukommt, bei Homozyoten ohne Rezeptoraktivität sind sie sogar komplett für den LDL-Abbau zuständig [31]. Da diese Abbauwege jedoch nicht sättigbar sind und sie auch keine Supprimierung der zellständigen Cholsterinsynthese hervorrufen, führt eine erhöhte Plasma-LDL-Konzentration zu einer Cholesterinretention in den sog. Scavengerzellen. Die auf diese Weise lipidüberladenen Zellen degenerieren zu Schaumzellen, die ihrerseits als wesentliche Bestandteile atherosklerotischer Frühläsionen anzusehen sind.

Allgemein kann man sagen, dass Mutationen, die lediglich zu einer beeinträchtigten Rezeptorfunktion führen, niedrigere Cholesterinwerte und einen milderen klinischen Verlauf mit besserem Ansprechen auf eine medikamentöse Therapie bedingen als Mutationen, die zu einem totalen Funktionsverlust des Rezeptors führen [51, 52, 120]. Eine völlige Korrelation zwischen Mutationstyp und Schweregrad der Erkrankung ist aber nicht immer gegeben. So konnten selbst bei Patienten mit identischen Mutationen innerhalb einer Familie deutlich unterschiedliche [Seite 26↓]klinische Verläufe beobachtet werden; hierfür ist vermutlich der Einfluß anderer auf den Fettstoffwechsel wirkender Gene verantwortlich [24, 25].

1.3.2 Konventionelle Therapie der Familiären Hypercholesterinämie

Grundstein der Therapie bei der FH ist eine generell fettreduzierte Diät, welche insbesondere arm an Cholesterin (<220 mg/die) und gesättigten Fetten (< 10% des Kalorienanteils) sein und bevorzugt mehrfach ungesättigte Fettsäuren (> 10% des Kalorienanteils) enthalten sollte [36, 38]. Leider reichen diätetische Maßnahmen allein meistens nicht aus, um die Serumcholesterinkonzentration ausreichend zu senken, so dass zusätzliche medikamentöse Maßnahmen notwendig werden. Neben Anionenaustauscherharzen, Fibraten, Nikotinsäure und ihren Derivaten, ß-Sitosterin und Probucol werden hier insbesondere in den letzten Jahren zunehmend HMG-CoA-Reduktase-Inhibitoren eingesetzt, auch Kombinationen sind möglich, wobei sich vor allem Kombinationen mit Statinen als besonders effektiv erwiesen haben [22, 37, 39, 119]. Bei heterozygot Erkrankten kann durch diese beiden Maßnahmen oft eine ausreichende Senkung des Gesamt- und LDL-Cholesterins im Serum herbeigeführt werden, bei Homozygoten hingegen reichen diese therapeutischen Möglichkeiten noch nicht aus [13, 44]. In diesen Fällen kann die LDL-Apherese zu einer weiteren Senkung des LDL-Cholesterinspiegels eingesetzt werden. Durch dieses seit den frühen achtziger Jahren in der Regel einmal wöchentlich eingesetzte Verfahren werden selektiv LDL-Partikel, z.B. mittels Immunoadsorption oder dem HELP-Verfahren (heparin-mediated extracorporeal LDL precipitation), aus dem Blut eliminiert. Hierdurch kommt es nachweislich zu einem langsameren Fortschreiten der atherosklerotischen Veränderungen, teilweise konnte sogar eine Regression beobachtet werden [22, 40, 41]. Eine Heilung der Erkrankung ist bislang nur durch eine Lebertransplantation möglich, da hierdurch partiell die fehlenden LDL-Rezeptoren wieder zur Verfügung gestellt werden und die Ansprechbarkeit auf lipidsenkende Medikamente verbessert wird. Eine effektive Cholesterinsenkung über Jahre hinweg ist hierdurch möglich. Da dieses Verfahren jedoch per se mit einer nicht zu vernachlässigenden Morbidität und Mortalität sowie der lebenslangen Einnahme von Immunsuppressiva vergesellschaftet ist, sollte es nur rezeptor-negativen homozygot Erkrankten vorbehalten sein, bei denen eine Ausschöpfung der konservativen Verfahren zu keinem adäquaten Ansprechen geführt hat [22, 34, 42-44, 103, 118, 119]. Die dramatische Cholesterinsenkung durch eine Lebertransplantation unterstreicht den Stellenwert hepatischer LDL-Rezeptoren in vivo und unterstützt gentherapeutische Ansätze, welche den Transfer eines normalen LDL-Rezeptorgens in Hepatozyten zum Ziel haben.


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1.3.3  Gentherapeutische Ansätze der FH im Tiermodell

Watanabe Heritable Hyperlipidemic (WHHL)-Kaninchen stellen ein besonders geeignetes Tiermodell der FH dar, da der Lipoproteinmetabolismus der Kaninchen dem des Menschen relativ ähnlich ist. So leiden auch diese Tiere unter einem LDL-Rezeptordefekt, der mit einer deutlichen Elevation der Serum-LDL-Konzentration vergesellschaftet ist und so eine prämature Atherosklerose hervorruft [33, 34, 47, 53-57]. Die Ursache des Defekts ist eine 12 Nukleotide lange in-frame-Deletion des LDL-Rezeptorgens, welche zu einem Verlust von vier Aminosäuren in der Ligandenbindungsdomäne und damit zu einem funktionsunfähigen Genprodukt führt [50, 54]. Geno- und phänotypisch lassen sich bei diesen Tieren deutliche Parallelen zum Verlauf der FH beim Menschen aufzeigen. Bereits innerhalb des ersten Lebensjahres entwickeln sich beim Kaninchen atheromatöse Veränderungen der Aorta, nachfolgend kommt es zur Bildung subkutaner und tendinöser Xanthome und Linsentrübungen sowie einer progredienten Koronarsklerose [34, 47, 53-57]. Insgesamt führen diese Veränderungen in der Regel in den ersten drei Lebensjahren zum Tod des Tieres.

In den vergangenen Jahren wurden zahlreiche präklinische ex vivo- und in vivo-Versuchsreihen mit WHHL-Kaninchen im Rahmen gentherapeutischer Bemühungen der FH beschrieben. Das Paradigma lieferten Wilson et al. Ende der achtziger Jahre mit einem ex vivo-Ansatz, bei welchem WHHL-Kaninchen Hepatozyten entnommen, kultiviert und mit einem rekombinanten Retrovirus transduziert wurden, welcher das Gen für den humanen LDL-Rezeptor enthielt. Nachfolgend wurden die modifizierten Leberzellen den Tieren via Portalvene reimplantiert, was zu einem signifikanten Abfall der Serumcholesterinkonzentration von bis zu 70% für einen Zeitraum von sechs Tagen führte [47-50]. Die Überlegung, dass die nur transiente Genexpression Ausdruck einer Abstoßungsreaktion gegen die allogenen Hepatozyten sein könnte, führte zur Verwendung autologer Leberzellen. So führten Chowdhury et al. 1991 bei einer Reihe von WHHL-Kaninchen partielle Hepatektomien durch und kultivierten die so isolierten Hepatozyten. Diese wurden nach genetischer Korrektur durch einen das LDL-Rezeptorgen eines Wildtyp-Kaninchens tragenden Retrovirus dem jeweiligen Tier ebenfalls transplantiert, was immerhin über einen Zeitraum von vier Monaten zu einer Serumcholesterinreduktion von 25-45% führte. Hinweise für eine serologisch fassbare Abstoßungsreaktion gegen das Genprodukt ergaben sich nicht [47, 51]. Zum Teil kontroverse Ergebnisse wurden 1991 durch Dichek et al. präsentiert. Hierbei wurden WHHL-Kaninchen Hautfibroblasten entnommen, in Kultur gebracht und anschließend mittels eines Retrovirus transduziert, der humane LDL-Rezeptor-cDNA enthielt. Die positiv selektionierten Zellen [Seite 28↓]wurden auf speziellen Gelatinepads gezüchtet, die den jeweiligen Tieren nachfolgend ins Retroperitoneum implantiert wurden. LDL-Rezeptor exprimierende Zellen konnten bis zu vier Wochen nach Implantation nachgewiesen werden, darüber hinaus konnte erstmals auch die Fähigkeit der genetisch korrigierten Zellen zur Supprimierung der HMG-CoA-Reduktase aufgezeigt werden. Zwar kam es nach Gentransfer zu einem signifikanten Abfall der Serumcholesterinkonzentration, jedoch konnte dieser auch bei den Kontrollgruppen aufgezeigt werden, die gar keine LDL-Rezeptor-cDNA erhalten hatten. Die Ursache hierfür ist letzlich unklar und möglicherweise in der unterschiedlichen Vektorenwahl für die Kontrollgruppen begründet. Zudem ließen sich in vielen der implantierten Pads inflammatorische Infiltrate nachweisen, die auf eine Abstoßungsreaktion hinweisen und damit eventuell für den nur transienten Nachweis rezeptor-positiver Zellen verantwortlich sein könnten [58].

Nach diesen ermutigenden Ergebnissen wurden die ersten in vivo-Gentherapieversuche Anfang der neunziger Jahre gestartet. So beschrieben Wilson et al. die erfolgreiche Durchführung eines leberspezifischen Gentransfers im WHHL-Kaninchen durch Verwendung eines DNA-Protein-Komplexes, der ein humanes LDL-Rezeptorgen enthielt und den Tieren über eine periphere Vene direkt injiziert wurde. Es konnte gezeigt werden, dass sich das Konstrukt hepatotrop verhielt und dass es zur Bildung rekombinanter LDL-Rezeptor-RNA kam, deren Menge etwa 2-4% der Norm erreichte. Metabolisch äußerte sich dies in einer Senkung der Serumcholesterinkonzentration von 25-30%, welche bis sechs Tage nach dem Gentransfer anhielt [59, 119]. Bei anderen Ansätzen infundierten Wilson et al., Li et al. sowie Brown et al. WHHL-Kaninchen einen rekombinanten Adenovirus, welcher LDL-Rezeptor-cDNA enthielt. Auch hierbei konnte ein deutlicher Hepatotropismus aufgezeigt werden, das Ausmaß der hierdurch erreichten rekombinanten LDL-Rezeptorgenexpression war zudem wesentlich größer als in dem vorgenannten Versuch. Hinsichtlich des Lipidstoffwechsels konnte ein Absinken der Gesamt- und LDL-Cholesterinkonzentration beobachtet werden, das sein Maximum nach einer Woche erreichte und für etwa zwei Wochen anhielt. Begleitend konnten Li et al. und Brown et al. einen signifikanten Anstieg der HDL-Cholesterinkonzentration aufzeigen. Leider kam es bei der Arbeitsgruppe um Wilson et al. durch die Adenovirusgabe zur Bildung neutralisierender Antikörper, welche dem wiederholten Einsatz limitierend entgegenstanden [60-62].


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03.08.2005