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3.  MATERIAL UND METHODEN

3.1 Gentherapeutische Methoden

3.1.1 Vektor

Als Vektor diente ein Konstrukt aus einem Adenovirus des Serotyps 5, in welchen die cDNA des humanen LDL-Rezeptors sowie ein vorgeschalteter CMV-Promotor einkloniert wurden. Abbildung 9 illustriert hierbei den schematischen Aufbau des verwendeten Adenoviruskonstrukts [63, 64, 120], welches freundlicherweise von der Arbeitsgruppe M. Strauß und G. Cichon (Max-Delbrück-Zentrum, Berlin) zur Verfügung gestellt wurde.

Abbildung 9: Adenoviruskonstrukt mit einkloniertem LDL-Rezeptorgen und CMV-Promotor.

3.1.2 Präparation des Virus

Große Mengen rekombinanter Adenoviren wurden in 293-Zellen produziert, welche in DMEM, 10% FKS, 2 mM L-Glutamin, 100 U/ml Penicillin und 100 μg/ml Streptomycin (Gibco BRL Life Technologies, Berlin, Deutschland) bei 37°C in einer 5% CO2-Atmosphäre kultiviert wurden. Bei 70-80% Konfluenz wurden die Zellen mit Viren einer Dichte von MOI = 5 infiziert und für 48 Stunden inkubiert, danach erfolgte die Sammlung der Zellen sowie Lyse mittels Ultraschall. Der Virus-enthaltende Extrakt wurde für 10 Minuten bei 12.000xg zentrifugiert, [Seite 31↓]anschließend wurden die Viruspartikel durch Zugabe von 0,5 Volumen Polyethylenglycol (PEG) 20%, 2,5 M NaCl und 1 Stunde Inkubation auf Eis gefällt. Das Virus wurde bei 12.000xg für 10 Minuten abzentrifugiert und in 135 mM NaCl, 5 mM KCl, 1 mM MgCl2, 10 mM Tris/HCl, pH 7,4 resuspendiert. Über Nacht wurde gegen denselben Puffer dialysiert. Vor weiteren Verwendungen erfolgte die Sterilfiltration der Viruslösung durch einen 0,22 μm Filter.

3.1.3 Gentherapie und Scantechnik

Vor der Gentherapie wurde zunächst eine 125I-LDL-Kinetik über 72 Stunden durchgeführt. Nach Abklingen der Radioaktivität wurde den WHHL-Kaninchen dann mit 111In markiertes humanes LDL (pro Tier ~3,5-5,0 MBq 111In-LDL) injiziert und seine Distribution mittels In-Szintigraphie unmittelbar post injectionem sowie nach 1, 4 und 24 Stunden dokumentiert, hierfür wurde eine „large field gamma“ Kamera (Siemens Diacam, 172/247 keV, ME-Kollimator) verwendet. Die mit Ketanest sedierten Tiere wurden dazu jeweils zu zweit auf dem Kamerakopf gelagert. Nach neuerlichem Abklingen der Aktivität wurde den Tieren der frisch präparierte Vektor in unterschiedlichen Dosierungen über eine periphere Ohrvene injiziert. Vier Tage nach Durchführung des Gentransfers wurde den Kaninchen erneut 111In-LDL verabreicht und unmittelbar post injectionem sowie nach 1 und 24 Stunden eine In-Szintigraphie durchgeführt. Weitere In-Szintigraphien schlossen sich nach 30, 58 und 113 Tagen an. Das Impulsdichte-Verhältnis wurde aus den ROI´s (region of interest) der Leber und des Herzens ermittelt. Das Leber/Herz-Verhältnis wurde als quantitativer Index für die spezifische Tracer-Akkumulation in der Leber verwendet. Begleitend wurde 6 Tage nach dem Gentransfer eine 125I-LDL-Kinetik über 48 bis 72 Stunden gestartet, zusätzliche Kinetiken erfolgten darüber hinaus nach 24 bzw. 120 Tagen.


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Abbildung 10: Zeitlicher Ablauf des Gentherapieversuchs.

3.2 Lipoproteingewinnung und -aufbereitung

3.2.1 Isolation humaner Lipoproteine aus Serum

Die fraktionierte Ultrazentrifugation ist ein Standardverfahren zur Isolation der Lipoproteine aus Serum. Hierbei werden durch Einstellen des entsprechenden Dichtebereiches mit NaBr bzw. KBr die jeweiligen Lipoproteine in der Ultrazentrifuge zum Flotieren gebracht, d. h. sie schwimmen oben auf der Lösung auf, während sich die schwereren Bestandteile im unteren Teil des Zentrifugationsröhrchens sammeln. Die Trennung der Fraktionen wird durch ein Schneiden der Röhrchen erreicht, anschließend erfolgt durch ein erneutes Einstellen der Dichte eine weitere Auftrennung der Lipoproteine [65].


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Abbildung 11: Schematische Darstellung der Lipoproteinisolation mittels fraktionierter Ultrazentrifugation.

Zur Isolation des humanen LDL wurde normolipämischen Probanden mit einer Monovette (Braun, Melsungen) Blut entnommen und nach Gerinnung bei 3.000 rpm für 10 Minuten abzentrifugiert (Digifuge GL, Heraeus). Danach wurden je 1 ml Serum pro Röhrchen (Polycarbonate centrifugal tube, Beckmann) bei einer angenommenen Dichte d = 1,006 g/ml in der Minifuge (TL-100 Ultrazentrifuge, Beckmann) bei 100.000 rpm für 2,5 Stunden zentrifugiert. Nachfolgend wurden die Röhrchen oberhalb der LDL-Bande geschnitten (ca. Hälfte des Röhrchens), der Überstand wurde verworfen.

Je 0,0828 g KBr wurden in neue Röhrchen eingewogen und jeweils 1 ml der LDL-Fraktion hinzugefügt (angenommene Dichte d = 1,063 g/ml), anschließend erfolgte erneut eine Zentrifugation über 2,5 Stunden bei 100.000 rpm. Danach wurden die Röhrchen unterhalb der LDL-Bande geschnitten (ca. Hälfte des Röhrchens), diesmal wurde der Unterstand verworfen. Abschließend erfolgte die Umpufferung der LDL-Fraktion gegen Phosphatpuffer. Hierfür wurden je 1 ml der LDL-Fraktion in ein Ultrafree 15 Zentrifugations-Filtrations-Röhrchen (Millipore) gegeben und 7 ml Phosphatpuffer zugefügt, anschließend erfolgte eine Zentrifugation für ca. 10 Minuten bei 2.000 g (Restvolumen 1 ml). Mit je 5-8 ml Puffer wurde dieser Filtrationsschritt noch 4-5 Mal wiederholt.


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Phosphatpuffer (für Indium-Markierungen):

 

50mM Na-Phosphat pH 7,4

 
 

100 mM NaCl

 
 

in entionisiertem Wasser !!

 
 

4,879 g Na2HPO4 * 2H2O (Mw 177,99 g/mol)

 
 

+ 3,12 g NaH2PO4 * H2O (Mw 137,99 g/mol)

für 1000 ml

 

+ 5,844 g NaCl (Mw 58,44 g/mol)

 

Glycinpuffer (für Iod-Markierungen):

 

1 M Glycin pH 10

 
 

7,507 g Glycin (Mw 75,07 g/mol)

für 100 ml

 

pH mit NaOH einstellen 10 M bzw. 10 mM

 

3.2.2 Radiomarkierung von LDL

3.2.2.1 Iod-Monochlorid-Methode

Zur Radioiodmarkierung wurde das Isotop 125I (t1/2: 60,14 Tage, γ-Strahler) eingesetzt. Nach Sterilfiltration der isolierten LDL (0,2 μm Millipore Filter, Gelman, Acrodisc, Ann Arbor, Michigan, USA) wurden diese nach der modifizierten Iod-Monochlorid-Methode radiomarkiert [66-68].

Folgender Reaktionsmechanismus wird für die Markierung angenommen:

Im ersten Schritt erfolgt ein schneller Isotopenaustausch zwischen Na125I und ICl. Im zweiten Schritt greift das positiv polarisierte Iod aus dem ICl den Benzolring der Aminosäure Tyrosin des Proteins nach dem Mechanismus einer elektrophilen aromatischen Substitution an. Letztere erfolgt dabei in O-Stellung zur Hydroxylgruppe des Tyrosins [69].

Zur Iodierung des LDL wurde Na125I mit einer Aktivität von 2,7 mCi (100 MBq) eingesetzt.


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1 mg frisch isolierter LDL (in 1M Glycin-Puffer, pH 10) wurden mit der entsprechenden Menge Na125I versetzt. Anschließend wurde zu dieser Mischung Iodmonochlorid gegeben, wobei das molare Verhältnis von Protein:ICl dabei 1:10 betragen sollte. Nach gründlicher Durchmischung wurde der Ansatz dann 10-15 Minuten inkubiert.

Nachfolgend wurde das Reaktionsgemisch zur Trennung von radiomarkiertem LDL und verbliebenem freien Iod über eine Sephadex G-25 Gelfiltrations-Säule (1x15 cm) chromatographiert. Hierbei wurde die Säule zuvor mit Kaninchenserum equilibriert, um die unspezifische Bindung von LDL an das Sephadexmaterial zu minimieren. Als Elutionspuffer diente PBS, die Energie der einzelnen Säulenfraktionen wurde durch einen Monitor erfaßt. Die Effizienz der Markierung wurde dünnschichtchromatographisch überprüft (Gelman ITLC SG, PBS-Puffer, 1 μl Probe, 7,5 cm Laufstrecke).

3.2.2.2 Radiomarkierung mit 111InCl3

Die Radiomarkierung von Proteinen mit Indium (111In t1/2: 2,83 Tage, γ-Strahler) erfolgt mit Hilfe des Komplexbildners DTPA ( D iethylene t riamine p entaacetic a cid) [70-72]. Hierbei wird zunächst DTPA (als Dianhydrid) an das Protein bzw. die Proteinkomponente gebunden. Danach erfolgt die Komplexbildung des Indiums mit dem Protein-gekoppelten DTPA [73-77].

In 10 ml getrocknetem Chloroform (Molekularsieb 4Å) wurden 2 mg DTPA-Dianhydrid für die Kopplungsreaktion suspendiert und für 10 Minuten gerührt. Danach wurde das CHCl3 im N2-Strom verdampft und das LDL (1 mg in 1000 μl PBS) hinzugegeben, anschließend wurde die Mischung abermals 30 Minuten gerührt.

Mit Hilfe von Amicon-Filtern (grün, co: 3,500 kDa) wurde das Kopplungsprodukt in der Eppendorfzentrifuge gegen 0,2 M Citratpuffer ultrafiltriert. Schließlich wurde das Kopplungsprodukt mit Citratpuffer auf ein Volumen von 1 ml gebracht und mit InCl3 (in HCl, Aktivität ca. 160 MBq) versetzt. Der Ansatz wurde geschüttelt und 30 Minuten inkubiert.

Über eine Sephadex G-25 Gelfiltrations-Säule (1x15 cm) wurde das Reaktionsgemisch zur Trennung von radiomarkiertem Protein und verbliebenem freien Indium chromatographiert. Zuvor wurde die Säule mit Kaninchenserum equilibriert, um die unspezifische Bindung von LDL an das Sephadexmaterial zu minimieren. Als Elutionspuffer diente isotonische Kochsalzlösung (0,9% NaCl), ein Monitor erfaßte die Energie der einzelnen Säulenfraktionen. Die Effizienz der einzelnen Säulen wurde dünnschichtchromatographisch überprüft (Gelman [Seite 36↓]ITLC SG, 0,1 M Citratpuffer pH 5, 1-2 μl Probe, 7,5 cm Laufstrecke).

3.3 Stoffwechselkinetische Untersuchungen

3.3.1 Kaninchen

Sechs Monate alte weibliche Watanabe Kaninchen (WHHL) wurden von Herrn Prof. Dimigen (Universitätsklinikum Eppendorf, Hamburg) bezogen. Sie zeichnen sich durch einen kongenitalen LDL-Rezeptordefekt aus, der zu einer starken Elevation der Serumcholesterinkonzentration und damit zu Xanthomen sowie einer prämaturen Atherosklerose und koronaren Herzerkrankung führt. Da die klinischen Symptome mit denen eines FH-Patienten gut korrelieren, stellen die WHHL-Kaninchen ein hervorragendes Tiermodell zur Untersuchung der Familiären Hypercholesterinämie dar.

3.3.2 Kaninchenhaltung

Während der Untersuchungen wurden die Kaninchen in einem 12 Stunden Tag/Nacht-Rhythmus in der Nuklearmedizin der Medizinischen Hochschule Hannover (MHH) in einem S2-Tier-C-Labor in speziellen Stoffwechselkäfigen gehalten, welche die gesonderte Sammlung von Urin und Kot ermöglichten. Die Nahrungszufuhr erfolgte über automatische Futter- und Wasserspender (Kaninchenstandardfutter, Wasser ad libitum).

Außerhalb der Untersuchungen wurden die Tiere im zentralen Tierlabor der MHH gehalten und von den dortigen Tierpflegern versorgt.

3.3.3 Kinetik

Die Proteine wurden mit 125I radiomarkiert und unmittelbar danach den Kaninchen über die Ohrvene injiziert, hierbei wurde jeweils eine Aktivität von 1,1 MBq verwendet. Zu den Zeitpunkten 5 Min., 1, 3, 6, 12, 24, 36, 48 sowie 72 Stunden post injectionem wurde den Tieren über die Ohrarterie ca. 2 ml Blut entnommen, zentrifugiert und das Serum aufbewahrt. Anschließend wurden 500 μl Aliquots dieser Seren im Gamma-Counter (Compu-Gamma, Pharmacia) auf ihre Aktivität hin untersucht. Zusätzlich wurde während der Kinetik der Urin der Kaninchen gesammelt, aliquotiert und die Aktivität bestimmt. Die während der Kinetik gewonnenen Seren wurden darüber hinaus mittels FPLC-Analyse bezüglich ihrer Aktivitätsdistribution untersucht.


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3.3.4  Fast Protein Liquid Chromatographie (FPLC)-Analyse

Die Analyse der Serumproben erfolgte über eine Superose-6-Gelfiltrationssäule (Pharmacia, Uppsala, Sweden). Diese zeichnet sich durch stark quervernetzte Agarose-Beads aus, die einen Durchmesser von 10-13 ± 2 μm aufweisen. Der Trennbereich der Säule liegt für globuläre Proteine zwischen 5.000 und 5.000.000 kDa. Das Material ist in einem pH-Bereich von 1-14 stabil und wird auch durch chaotrope Reagenzien wie SDS, Harnstoff und Guanidinhydrochlorid nicht beeinflußt.

Zur Fraktionierung von Serumproben wurde die Superose-6-Säule in 1 x PBS, 1 mM EDTA, 0,001% (w/v) NaN3 equilibriert. 0,2 ml Kaninchenserum wurden auf die Säule aufgebracht und mit einer Flußrate von 0,3 ml/Min. eluiert. Nach 10 ml Vorlauf wurden 0,5 ml Fraktionen gesammelt und ihre Radioaktivität am Gamma Counter gemessen.

3.4 Quantitative Methoden

3.4.1 Proteinbestimmung nach Lowry

Die Gesamtproteinmenge wurde mit einer modifizierten Methode nach Lowry, mit BSA als Standard, bestimmt [78].


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Lösung 1:

 
 

2 % Na2Co3 in 0,1 M NaOH

 

(500 ml 0,1 M NaOH + 10 g Na2Co3)

Lösung 2:

 
 

0,5 % CuSO4 in 0,1% Na-tatrat

 

(Lösung muß vor Gebrauch frisch hergestellt werden,

 

dazu 1% CuSO4 und 0,2% Na-tatrat 1:1 mischen.)

Lösung 3:

 
 

Lösung 1 + 2 50/1 mischen.

Lösung 4:

 
 

Folin–Ciocalteau–Reagenz (gebrauchsfertig)

 

Reagenz

0,1% NaOH

dH2O

 

50

:

50

:

6

Lösung 5:

 
 

BSA-Standard-Lösung 1 mg/ml

 

Std.1

0 μ g

Std. 2

50 μ g

Std. 3

100 μ g

Std. 4

200 μ g

Std. 5

300 μ g

Std. 6

400 μ g

Proben

BSA

0 μl

50 μl

100 μl

200 μl

300 μl

400 μl

50-200 μl

Triton 1 %

200 μl

200 μl

200 μl

200 μl

200 μl

200 μl

200 μl

SDS 10 %

800 μl

750 μl

700 μl

600 μl

500 μl

400 μl

600-750 μl

Lösung 3

5 ml

5 ml

5 ml

5 ml

5 ml

5 ml

5 ml

 

gut mischen, 10 min inkubieren

Folin-Reagenz

500 μl

500 μl

500 μl

500 μl

500 μl

500 μl

500 μl

 

gut mischen, 30 min inkubieren

Die Messung der Proben erfolgte bei 545 nm am Photometer (U-2000 Spectrophotometer, Hitachi, Düsseldorf, Deutschland). Von allen Proben und Standards wurden Doppelbestimmungen durchgeführt.

3.4.2 Proteinbestimmung nach Bradford

(Protein-Assay der Firma BioRad, München, Deutschland)

Standard Assay (20-140 μ g Protein; 200-1400 μ g/ml)

Standardkurve:

Verdünnungsreihe von 0,2 – 1,4 mg/ml Protein

BSA-Stammlösung: 4 mg/ml


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Verdünnung

BSA-Konzentration in mg/ml

Ansatz

1:20

0,2

50 μl + 950 μl

1:10

0,4

100 μl + 900 μl

1:6,6

0,6

150 μl + 850 μl

1:5

0,8

200 μl + 800 μl

1:4

1

250 μl + 750 μl

1:3,3

1,2

300 μl + 700 μl

Ansatz:

  1. 0,1 ml Standard bzw. Probe
    oder 0,1 ml Puffer als Blindwert
  2. 5 ml Reagenz (1:5 Verd.)
  3. Mischen (vortexten), 5 Min. warten
  4. Messung der Extinktion bei 595 nm

Microassay (1-20 μ g Protein, < 25 μ g/ml)

Standardkurve:

Verdünnungsreihe von 1-25 μg/ml Protein

BSA-Stammlösung: 0,1 mg/ml

Verdünnung

BSA-Konzentration in μ g/ml

Ansatz

1:100

1

10 μl + 990 μl

1:20

5

50 μl + 950 μl

1:10

10

100 μl + 900 μl

1:6,6

15

150 μl + 850 μl

1:5

20

200 μl + 800 μl

1:4

25

250 μl + 750 μl


[Seite 40↓]

Ansatz:

  1. 0,8 ml Standard bzw. Probe
    oder 0,8 ml Puffer als Blindwert
  2. 0,2 ml Reagenz unverdünnt
  3. Mischen (vortexten), 5 Min. bis 1 Std. warten
  4. Messung der Extinktion bei 595 nm

3.4.3 Quantitative Triglyzeridbestimmung

Peridochrom® Triglyzeride GPO-PAP Testkit (Immuno, Heidelberg, Deutschland)

Prinzip:

Reagenzlösung:

 
 

0,5 mM ATP

 

0,35 mM 4-Aminophenazon

3 U/ml Lipase

 

2,5 U/ml Glyzerinphosphatoxidase

 

0,2 U/ml Glyzerokinase

 

0,15 U/ml Peroxidase

 

3,5 mM 4-Chlorphenol


[Seite 41↓]

200 μl Probe werden mit 2 ml Reagenzlösung gemischt und 10 Minuten inkubiert. Die Extinktion der Probe wird bei 470-560 nm am Spektralphotometer (Hitachi U-2000) gegen einen Reagenzleerwert gemessen.

Die Konzentration der Triglyzeride wird nach folgender Formel berechnet:

c (mg/dl) = 1040 x Eprobe (Hg 546 nm) bzw.

c (mmol/l) = 11,9 x Eprobe (Hg 546 nm)

3.4.4 Quantitative Cholesterinbestimmung

(CHOD-PAP-Methode Testkit (Immuno, Heidelberg, Deutschland))

Prinzip:

Reagenzlösung:

 

100 mM Tris pH 7,7

 

50 mM Mg 2+

 

1 mM 4-Aminophenazon

 

10 mM Na-Cholat

 

6 mM Phenol

 

4 mM 3,4-Dichlorphenol

 

0,3% Fettalkoholpolyglykolether

 

0,4 U/ml Cholesterinesterase

 

0,25 U/ml Cholesterinoxidase

 

0,2 U/ml Peroxidase


[Seite 42↓]

200 μl Probe werden mit 2 ml Färbereagenzlösung gemischt und 10 Minuten inkubiert. Die Extinktion der Probe wird bei 470-560 nm am Spektralphotometer (Hitachi U-2000) gegen einen Blindwert gemessen.

Die Konzentration des Cholesterins wird nach folgender Formel berechnet:

c (mg/dl) = 853 x Eprobe (Hg 546 nm) bzw.

c (mmol/l) = 22,1 x Eprobe (Hg 546 nm)

3.4.5 Qualitative und quantitative Plasmalipoproteinbestimmung mit der Lipidelektrophorese

In einem albuminhaltigen Agarmedium werden die Lipoproteine elektrophoretisch getrennt und anschließend durch chemische Präzipitation mit Polyanionen dargestellt. Die Auswertung erfolgt densitometrisch.

Reagenzien (Immuno, Heidelberg, Deutschland):

Agarmediumträger, albuminhaltig

 

Kammerpuffer:

 
 

62,1% Diethylbarbitursäure Na-Salz

 

29,2% Na-Acetat

 

8,7% Zitronensäure

Entwickler 1:

 
 

6,3 mM Phosphorwolframsäure

 

182 mM MgCl 2

 

70 mM NaCl

 

12 mM NaN 3

Entwickler 2:

 
 

6,3 mM Phosphorwolframsäure

 

182 mM MgCl 2

 

1,12 mM NaCl

 

12 mM NaN 3

Das zu untersuchende Serum wird 1:1 mit Agarversiegelungsmedium gemischt und auf die [Seite 43↓]Elektrophoreseplatten aufgetragen. Die Elektrophorese wird in der Radiophor M3 Elektrophorese-Kammer (Immuno, Heidelberg, Deutschland) für 80 Minuten bei konst. 15 mA/ Gelplatte durchgeführt, anschließend werden die Platten jeweils für 30 Minuten in den Entwicklungslösungen 1 und 2 inkubiert. Die quantitative Bestimmung erfolgt densitometrisch (ATH Hirschman Liposkript Al Densitometer). Die Lipoproteine werden dabei nach ihrer Wanderung im elektrischen Feld in die α-Fraktion (HDL), prä-β-Fraktion (VLDL) und die β-Fraktion (LDL) unterschieden.


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03.08.2005