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4.  ERGEBNISSE

4.1 Selektion eines geeigneten Tiermodells

Zur Etablierung gentherapeutischer in vivo-Strategien für die FH sind in den vergangenen Jahrzehnten verschiedene Tiermodelle benutzt worden.

Ein Beispiel stellen LDL-R knockout Mäuse dar, die durch LDL-Rezeptor-Gen-Disruption generiert werden. Durch Fütterung einer cholesterinreichen Diät können diese Tiere ein klinisches Erscheinungsbild entwickeln, das dem der FH ähnelt. Da jedoch insgesamt deutliche Unterschiede gegenüber dem menschlichen Fettstoffwechsel bestehen, scheinen die WHHL-Kaninchen als Tiermodell besser geeignet [63, 79-81].

Watanabe Heritable Hyperlipidemic (WHHL)-Kaninchen stellen derzeit das geeignetste Tiermodell der FH dar, da der Lipoproteinmetabolismus des Kaninchens trotz der imponierenden HDL-Fraktion dem des Menschen relativ ähnlich ist. So leiden auch diese Tiere unter einem LDL-Rezeptordefekt, der mit einer deutlichen Elevation der Plasma-LDL-Konzentration vergesellschaftet ist und so eine prämature Atherosklerose hervorruft [33, 34, 47, 53-57]. Die Ursache des Defekts ist eine 12 Nukleotide lange in-frame-Deletion des LDL-Rezeptorgens, welche zu einem Verlust von vier Aminosäuren in der Ligandenbindungsdomäne und damit zu einem funktionsunfähigen Genprodukt führt [50, 54]. Das wiederum bewirkt geno- und phänotypisch deutliche Parallelen zum Verlauf der FH beim Menschen und führt in der Regel innerhalb der ersten drei Lebensjahre des Tieres zum Tod.

Die FH zeichnet sich typischerweise durch eine ausgeprägte Elevation der LDL-Cholesterinserumkonzentration im Serum aus. Eine Analyse der Lipoproteindistribution und somit auch der Cholesterinverteilung im Serum wird durch die Lipidelektrophorese gewährleistet, welche die Lipoproteine nach ihrer Migrationsfähigkeit im Agarosegel in die Fraktionen α–Cholesterin (HDL), prä-β-Cholesterin (VLDL) und β–Cholesterin (LDL) unterteilt (siehe auch Tabelle 4).

Nach densitometrischer Auswertung der Lipidelektrophorese wird die quantitative Verteilung der Lipoproteine ermittelt. Beim WHHL-Kaninchen kann hierbei eine Gesamtcholesterinfraktion im Plasma von 600-800 mg/dl aufgezeigt werden, wobei der Hauptanteil durch die LDL-Fraktion ausgemacht wird, andere Lipoproteinfraktionen sind kaum nachweisbar.


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Abbildung 12:
A: Densitometrische Auswertung einer Lipidelektrophorese eines normolipämischen Patienten (NLP) im Vergleich zu einem WHHL-Kaninchen.
B: Densitometrische Auswertung einer Lipidelektrophorese eines FH-Patienten im Vergleich zu einem WHHL-Kaninchen.

Abbildung 12A illustriert die Lipidelektrophorese eines normolipämischen Patienten im Vergleich zum WHHL-Kaninchen. Hierbei ist die gute Übereinstimmung der humanen mit der Kaninchen-LDL-Fraktion deutlich zu erkennen. Abbildung 12B stellt vergleichend Lipidelektrophoresen eines WHHL-Kaninchens und eines Patienten mit Familiärer Hypercholesterinämie gegenüber, wobei jeweils die prominente LDL-Fraktion augenscheinlich ist. Da die WHHL-Kaninchen hinsichtlich ihres Lipidmetabolismus also große Parallelen zu FH-[Seite 46↓]Patienten aufweisen, sind sie ein geeignetes und natürlich vorkommendes Tiermodell zur Etablierung des LDL-R-Gentransfers im Tierversuch.

4.2 Gentransfer

Der Gentransfer wurde mittels des replikationsdefizienten Virus Ad-CMV-hLDL-R (Adenovirus Typ 5 mit dem humanen LDL-Rezeptor-Gen und einkloniertem CMV-Promotor) durchgeführt. Da die Effizienz des Verfahrens im Vorfeld im Vergleich zu einer mit Ad-CMV-β-Gal (Adenovirus mit β-Gal-Gen und einkloniertem CMV-Promotor) therapierten Kontrollgruppe bereits ausgiebig belegt worden war [6], wurde zur Beurteilung des Dosiseskalationseffekts auf eine Kontrollgruppe verzichtet.

Die sterile virushaltige Suspension wurde auf Körpertemperatur erwärmt und den Kaninchen via Ohrvene in unterschiedlichen Dosierungen injiziert. Dabei erhielten je zwei Tiere 0,23 x 1012 pfu (1/10 Dosis), 1,175 x 1012 pfu (1/2 Dosis), 2,35 x 1012 pfu (1fache Dosis) sowie ein Tier 4,7 x 1012 pfu (2fache Dosis). Komplikationen wie Anzeichen einer Lungenembolie oder eine erhöhte Körpertemperatur konnten bei diesen Dosierungen nicht beobachtet werden, jedoch trat bei einem Kaninchen, das mit der ½ Virusdosis behandelt worden war, zwei Tage nach Gentherapie eine passagere Makrohämaturie auf. Insgesamt war in den ersten Tagen nach Gentransfer eine allgemeine Schwäche und Appetitlosigkeit zu beobachten, welche mit der verwendeten Virusmenge positiv korrelierte.

4.3 Cholesterinverläufe nach Gentransfer mit Ad-CMV-hLDL-R

Um die Entwicklung der Cholesterinwerte im Verlauf der hLDL-R-Expression beurteilen zu können, wurde den Tieren vor und nach Gentransfer zur Cholesterinbestimmung regelmäßig Nüchternblut entnommen. Während dieses sechswöchigen Zeitraumes erhielten die Tiere weiterhin ein Kaninchenstandardfutter, welches 12 Stunden vor der jeweiligen Blutentnahme aus dem Käfig entfernt und erst nach Probengewinnung wieder verabreicht wurde. Die Wasseraufnahme war während des gesamten Experiments hingegen ad libitum gewährleistet.

Abbildung 13 stellt den Serumcholesterinverlauf der Kaninchen ab dem ersten Tag nach Gentransfer mit Ad-CMV-hLDL-R in den genannten Dosierungen dar. Hierbei ist der Einfluß der Virusdosis auf die Cholesterinhöhe eindeutig zu erkennen. Während es durch Applikation von 1/10 der Dosis lediglich zu einer geringen Senkung der Cholesterinwerte um 13 bzw. 19% kommt, ist nach Verabreichung der einfachen Dosis eine Reduktion um 74% und nach Gabe der [Seite 47↓]doppelten Dosis sogar ein Absinken um 90% zu beobachten. Der dabei beobachtete maximale Rückgang war jeweils am 5.-7. Tag nach Gentransfer zu verzeichnen, innerhalb von 12-18 Tagen nach Vektorgabe trat bei allen Kaninchen unabhängig von der verabreichten Virusdosis eine Nivellierung des Effekts mit Wiedererreichen der Ausgangswerte ein.

Abbildung 13: Cholesterinverläufe gentherapierter Kaninchen bei Applikation unterschiedlicher Virusdosen (1/10 Dosis, ½ Dosis, 1fache Dosis, 2fache Dosis).

4.4 Selektion eines geeigneten Tracers zur LDL-Radiomarkierung

Prämisse für die Durchführung der in vivo-Scanuntersuchungen war die Verwendung eines Radiotracers, mit dem sich LDL-Partikel markieren lassen und der einer szintigraphischen Detektion zugänglich ist. Da der LDL-Katabolismus bei Patienten mit FH deutlich verlangsamt ist und somit auch Tage nach Injektion der radiomarkierten LDL noch Untersuchungen zur Analyse der hepatischen LDL-Aufnahme sinnvoll sind, mußte zudem ein Radiotracer verwendet werden, der auch noch nach einigen Tagen nachweisbar ist. Hierbei standen die Radionuklide 123I, 125I, 131I, 99mTc sowie 111In zur Auswahl, welche unter Einbeziehung ihrer Halbwertszeit und ihres Emissionsmaximums zusammenfassend in Tabelle 7 dargestellt sind [71, 72, 82-92].


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Tabelle 7: Mögliche Radiotracer zur Markierung von LDL [93].

Tracer

Halbwertszeit

Emissionsmaximum (MeV)

Eβ -Eγ

125I

60 Tage

-

0,035

131I

8,04 Tage

0,61

0,364

123I

13 Stunden

-

0,159

111In

2,83 Tage

-

0,173

99mTc

6 Stunden

-

0,14

125I erwies sich für die in vivo -Scans als weniger geeignet, da die Halbwertszeit des Nuklides (60 Tage) für eine Anwendung im Menschen zu lange ist. Zudem besitzen die abgestrahlten Photonen energetisch ein zu niedriges Niveau und sind damit szintigraphisch nicht ausreichend darstellbar [71, 84]. 123I und 99mTc wiederum erschienen infolge ihrer zu geringen Halbwertszeit nicht geeignet, da sie bereits nach kurzer Zeit nicht mehr nachweisbar sind [71, 84, 88]. Die besten Voraussetzungen schien damit der Gammastrahler 111In mit einer Halbwertszeit von 2,83 Tagen und einem Emissionsmaximum bei 0,173 MeV zu liefern, dessen Halbwertszeit zudem mit der Halbwertszeit der LDL in gesunden Probanden vergleichbar ist. Dass sich dieses Radionuklid gut zur LDL-Markierung mit nachfolgender szintigraphischer Detektion und Monitoring des LDL-Metabolismus eignet, war darüber hinaus im Rahmen der Entwicklung des in vivo-Scanverfahrens hinreichend belegt worden [6].

Für die stoffwechselkinetischen Untersuchungen zum LDL-Metabolismus wurde der Radiotracer 125I verwendet, dessen diesbezügliche Anwendung bereits ausreichend etabliert ist [87, 88, 90, 94].

4.5 Stoffwechselkinetische Untersuchungen

Es wurden in vivo-Stoffwechseluntersuchungen durchgeführt, um die durch den LDL-R-Gentransfer vermittelte gesteigerte hepatische Aufnahme Indium-markierter LDL und die Cholesterinsenkung durch gesteigerten Katabolismus als Folge einer erhöhten LDL-R-Aktivität zu bestätigen. Dafür wurden humane LDL isoliert und mit dem Iodisotop 125 markiert, nachfolgend erfolgte die Injektion in die WHHL-Kaninchen. Aus den sich anschließenden Blutentnahmen wurden Radioaktivitätsabklingkurven berechnet. Diese stoffwechselkinetischen Untersuchungen wurden sowohl vor dem Gentransfer mit Ad-CMV-hLDL-R als auch danach [Seite 49↓]durchgeführt.

4.5.1 Radioiodmarkierung

Aus dem Blut normolipämischer Patienten wurden für stoffwechselkinetische Untersuchungen mittels Ultrazentrifugation humane LDL gewonnen, radioiodiert und in WHHL-Kaninchen injiziert. Hierfür wurde 1 mg frisch isoliertes LDL (in 1M Glycin-Puffer, pH 10) mit Na125I sowie ICl-Lösung versetzt. Die radiochemische Ausbeute der Markierung betrug 22%.

4.5.2 Stoffwechselkinetik vor Gentransfer

Der Radiomarkierung der Proteine schloß sich die Inkubation mit autologem Kaninchenserum an. Die Injektion der markierten Proteine 68 Tage vor Gentransfer erfolgte über die Ohrvene der Kaninchen. Es folgten Blutentnahmen mit Serumisolierung 5 Minuten sowie 1, 3, 6, 12, 24, 36, 48 und 72 Stunden post injectionem. Aus diesen Seren wurden anschließend Aliquots zur quantitativen Bestimmung der Radioaktivität gewonnen.

Abbildung 14 zeigt den Anteil der Radioaktivität im Serum der Kaninchen zu verschiedenen Zeitpunkten nach Injektion der markierten Proteine. 72 Stunden post injectionem konnte ein Absinken der Aktivität im Kaninchenserum auf Werte zwischen 21,1 und 23,0% des Ausgangswertes dokumentiert werden, es zeigte sich für alle Kaninchen eine nahezu identische Radioaktivitätsabklingkurve.

Abbildung 14: Stoffwechselkinetik vor Gentransfer nach Injektion von humanem 125I-LDL.


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4.5.3  FPLC-Analyse der Lipoproteinverteilung im Kaninchenserum vor Gentransfer

Um die Lipoproteindistribution im Serum zu bestimmen, eignet sich die FPLC-Analyse mit einer Superose-6-Säule. Diese trennt nach dem Prinzip der Gelfiltration die Serumbestandteile nach ihrer Größe auf. Da sie einen enorm weiten Trennbereich bietet, ist sie für die Trennung von Lipoproteinen besonders geeignet. In den vorangehenden Untersuchungen waren bereits die Aktivitätsprofile der FPLC-Analyse von Kaninchenserum und Humanserum verglichen worden. Hierbei konnte eine Übereinstimmung des Aktivitätspeaks für Human-LDL und Kaninchen-LDL aufgezeigt werden [6].

Abbildung 15 zeigt die FPLC-Analyse der Lipoproteinverteilung in den Kaninchenseren vor Gentherapie. Die linke Abbildung stellt hierbei die Distribution des Gesamtcholesterins dar. Man kann deutlich zwei Peaks erkennen, wobei der erste, flachere die VLDL-Fraktion und der zweite, höhere die LDL-Fraktion repräsentiert. Die Überhöhung der LDL-Fraktion ist dabei sowohl für das WHHL-Kaninchen als auch für Patienten mit FH typisch, während die VLDL-Fraktion und die in der rechten Abbildung dargestellten Triglyzeride relativ niedrig sind.

Abbildung 15: FPLC-Analyse der Kaninchenseren (1fache Dosis) vor Gentherapie. In der linken Abbildung ist die Verteilung des Gesamtcholesterins dargestellt. Deutlich ist die erhöhte LDL-Fraktion (2. Peak) zu erkennen, die für die WHHL-Kaninchen typisch ist, die VLDL-Fraktion (1. Peak) und die Triglyzeride (rechte Abbildung) sind verhältnismäßig niedrig.


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4.5.4  Stoffwechselkinetik nach Gentransfer mit Ad-CMV-hLDL-R

Nach Gentransfer mit dem humanen LDL-Rezeptor wurden erneut Stoffwechselkinetiken durchgeführt, um die Veränderungen im Metabolismus der humanen LDL zu erfassen. Hierfür erfolgte die neuerliche Markierung humaner LDL mit dem Iodisotop 125I sowie die nachfolgende Injektion in die nun gentherapierten WHHL-Kaninchen. Aus den sich anschließenden Blutentnahmen wurden wieder Aliquots hergestellt und Radioaktivitätsabklingkurven berechnet.


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Abbildung 16: Stoffwechselkinetiken 6, 24 und 120 Tage nach Gentransfer mit Ad-CMV-hLDL-R nach Injektion von humanem 125I-LDL.

Abbildung 16 zeigt den Anteil der Radioaktivität im Serum der Kaninchen zu unterschiedlichen Zeitpunkten nach Injektion der markierten Proteine. Prinzipiell belegen die Radioaktivitätsabklingkurven bei allen Tieren einen funktionell intakten transgen exprimierenden LDL-Rezeptor durch eine erhöhte katabole Rate der injizierten radiomarkierten LDL, d.h. die humanen LDL können von der Leber der Kaninchen nun aufgenommen und metabolisiert werden. Dieser Effekt läßt sich auch 120 Tage nach Gentransfer noch nachweisen, allerdings scheint er von dergewählten Virusdosis unabhängig zu sein, da sich bei den mit höheren Virusmengen therapierten Tieren nicht zwangsläufig eine höhere katabole Rate der LDL aufzeigen läßt als bei den Tieren, die nur eine geringe Virusmenge erhielten.


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4.5.5  FPLC-Analyse der Lipoproteinverteilung im Kaninchenserum nach Gentransfer mit Ad-CMV-hLDL-R

Die Lipoproteindistribution in den Kaninchenseren wurde zu definierten Zeitpunkten nach Gentherapie (4, 10, 17 und 24 Tage danach) abermals mittels FPLC-Analyse untersucht.

Abbildung 17: FPLC-Analyse der Kaninchenseren (1fache Dosis) zu verschiedenen Zeitpunkten nach Gentherapie mit Ad-CMV-hLDL-R. Es wird ein deutlicher Abfall der cholesterinreichen LDL-Fraktion (linke Abb., 2. Peak) bei gleichzeitigem Anstieg der triglyzeridreichen VLDL-Fraktion (linke Abb., 1. Peak und rechte Abb.) deutlich. Dieser Effekt läßt zwar allmählich nach, ist aber vier Wochen nach Gentherapie noch immer zu erkennen.


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Abbildung 17 stellt hierbei in der linken Abbildung wieder die Verteilung der Gesamtcholesterinserumkonzentration dar. Erneut sind hier zwei Peaks zu erkennen, wobei der erste, flachere wieder die VLDL-Fraktion und der zweite, höhere wieder die LDL-Fraktion repräsentiert. Die rechte Abbildung zeigt die Triglyzerid-Fraktion. Im Gegensatz zu den FPLC-Analysen, die vor Gentherapie erhoben wurden (Abb. 15), kann bereits vier Tage nach Gentherapie eine deutliche Reduktion der cholesterinreichen LDL-Fraktion beobachtet werden, welche auch nach vier Wochen noch nachweisbar ist. Begleitend wird ebenfalls ab dem 4. Tag nach Gentransfer ein deutlicher Anstieg der triglyzeridreichen VLDL-Fraktion offenbar, welcher auch mindestens vier Wochen lang anhält. Dies zeigt, dass die Leber die nach dem Gentransfer erhöhte Cholesterinzufuhr mit einer vermehrten VLDL-Synthese kompensiert.

4.6 Scanuntersuchungen

4.6.1 LDL-Radiomarkierungen mit 111Indium

Aus dem Serum normolipämischer Probanden wurden für die Scanuntersuchungen jeweils frisch LDL mittels Ultrazentrifugation isoliert und mit 111In radiomarkiert. Dazu wurde LDL (1 mg in 1 ml PBS) mit DTPA im Verhältnis 1:1 gekoppelt und dann mit 111In versetzt. Die radiochemische Ausbeute der Markierung betrug 10-35%.

4.6.2 Scanuntersuchung vor Gentransfer

Zur Durchführung der Scanuntersuchungen wurden die Kaninchen sediert und jeweils paarweise bäuchlings auf dem Detektor gelagert. Anschließend wurden jedem Tier etwa 3,5-5,0 MBq humane 111In-LDL via Ohrvene peripher-venös injiziert, welche zuvor mit autologem Kaninchenserum inkubiert worden waren. Nachfolgend wurden in der ersten Stunde post injectionem Scanaufnahmen in dynamischer Form als einminütige Bilder aufgenommen. Danach wurden statische 15-minütige Aufnahmen zu den Zeitpunkten 4 und 24 Stunden nach Injektion angefertigt.

Abbildung 18 zeigt die Scanaufnahme eines WHHL-Kaninchens vor Gentransfer, welche in der Blutpool-Phase der ersten Stunde nach Injektion der 111In-LDL angefertigt wurde. Das Tier wurde auf dem Bauch liegend von unten aufgenommen, wobei am oberen Bildrand der Kopf des Tieres dargestellt wird und das Hinterteil des Kaninchens in Richtung des unteren Bildrandes [Seite 55↓]weist. Man erkennt im oberen Bereich die stark durchblutete Herzregion, worunter sich ein etwas weniger anreichernder Bereich demarkiert, der der Leber entspricht. Weiter kaudal gelegen kommen die Nieren als zwei Punkte zur Darstellung, deren Anreicherung wiederum etwas schwächer als die der Leber ist. Im unteren Bereich der Abbildung wird ein stark anreicherndes Areal sichtbar, das der mit freiem 111In gefüllten Blase entspricht. Während der Radiomarkierung verbleibt immer etwas nicht gebundenes, freies Indium in der Probe, welches mit injiziert und sofort über Nieren und Blase wieder ausgeschieden wird, was damit zu einer Anreicherung dieser Organe führt. In der Medianlinie des Kaninchens ausgehend vom Herz-Lungenbereich senkrecht nach unten projizieren sich Aorta und Vena cava als blaue Linie.

Abbildung 18: Definition der „Regions of Interest“ (ROI): Scanabbildung eines WHHL-Kaninchens nach Gabe 111In-markierter LDL vor Gentherapie.

4.6.3 Scanuntersuchungen nach LDL-R-Gentransfer

Die Scanaufnahmen wurden 20 Tage vor sowie 4, 30, 58 und 113 Tage nach Gentransfer erhoben. Dabei wurden die Abstände der Untersuchungen so gewählt, dass mögliche Überlappungen bezüglich der Iod-Kinetiken, welche 68 Tage vor sowie 6, 24 und 120 Tage nach Gentransfer durchgeführt wurden, hinsichtlich gleichartiger Radioaktivitätsspektren minimiert wurden. Die Tiere wurden abermals sediert und zu zweit auf dem Kamerakopf gelagert, es [Seite 56↓]erfolgte dann erneut die Injektion von 3,5-5,0 MBq humanem und mit autologem Kaninchenserum inkubierten 111In-LDL über die Ohrvene. Nachfolgend wurden Scanaufnahmen in der ersten Stunde in dynamischer Form als einminütige Bilder aufgenommen sowie statische Aufnahmen über 15 Minuten zu den Zeitpunkten 4 und 24 Stunden nach Injektion angefertigt.

Abbildung 19: Scanabbildung zweier gentherapierter Kaninchen (1fache Dosis) zu den Zeitpunkten vor Gentherapie (prä) sowie 4, 30, 58 und 113 Tage nach Gentransfer.

Abbildung 19 zeigt die Scanaufnahmen zweier WHHL-Kaninchen, die mit der einfachen Virusdosis behandelt wurden vor Gentherapie sowie 4, 30, 58 und 113 Tage danach. Alle Aufnahmen wurden 4 Stunden nach der Injektion des 111In-LDL vorgenommen, da sich dies als der günstigste Untersuchungszeitpunkt erwies. Die Kaninchen wurden auf dem Bauch liegend von unten aufgenommen, wobei der Kopf zum oberen Bildrand und das Hinterteil zum unteren Bildrand gerichtet ist. Man erkennt auf der Aufnahme vor Gentherapie im oberen Bereich die stark durchblutete Herzregion sowie darunter einen etwas weniger anreichernden Bereich, der der Leber entspricht. Kaudal davon demarkieren sich als zwei seitlich zueinander verlagerte Punkte die Nieren und im untersten Bezirk ein hier nur schemenhaft anreicherndes Areal, welches der mit freiem 111In gefüllten Blase entspricht. Etwa in der Medianlinie finden sich nach kaudal ziehend Aorta und Vena cava als bläulich hervortretendes Band. In allen nach Gentransfer angefertigten Aufnahmen zeigt sich hingegen die stärkste Anreicherung im Bereich der Leber, auch die Nieren und die Blase lassen sich noch relativ gut darstellen, wenngleich sie [Seite 57↓]auch weniger anreichern als die Leber. Dieser Effekt beruht auf der Tatsache, dass es beim Abbau Indium-markierter Proteine zu einem lysosomalen Freisetzen des ungebundenen Indiums kommt. Hierbei wird freies Indium zellulär sezerniert, glomerulär filtriert und tubulär rückresorbiert, was immer auch zu einer Darstellung des Urogenitaltraktes führt. Die auf den prä-Aufnahmen gut sichtbare Herzregion tritt auf den Aufnahmen nach Gentherapie hingegen in den Hintergrund.

Insgesamt läßt sich eine deutliche Aktivitätsanreicherung der 111In-LDL in der Leber zu allen Zeitpunkten nach Gentherapie erkennen, selbst 113 Tage nach dem Gentransfer scheinen die LDL selektiv in der Leber zu akkumulieren. Wie bereits in vorangegangenen Experimenten gezeigt werden konnte, ist die Indium-markierte Aufnahme von LDL in die Leber spezifisch durch den Gentransfer des humanen LDL-R vermittelt [6].

Abbildung 20 zeigt die Scanaufnahmen zweier Tiere, die mit 1/10 bzw. der doppelten Virusdosis therapiert worden waren, ebenfalls zu den Zeitpunkten vor Gentransfer und 4, 30, 58 und 113 Tage nach Therapie.

Abbildung 20: Scanabbildung zweier gentherapierter Kaninchen (1/10 Dosis und 2fache Dosis) zu den Zeitpunkten vor Gentherapie (prä) sowie 4, 30, 58 und 113 Tage nach Gentransfer.

Die Aufnahmen vor Gentransfer entsprechen im wesentlichen denen der Abbildung 19. Auch in den nach Gentherapie angefertigten Bildern lassen sich vergleichbare Ergebnisse wie bei den mit [Seite 58↓]einfacher Dosis behandelten Tieren erkennen. Es kommt zu einer starken Aktivitätsanreicherung in der Leber und geringer auch der Nieren und Blase bei gleichzeitig schwächerer Darstellung der gut durchbluteten Herzregion, was erneut für eine selektive Akkumulation der markierten LDL in der Leber spricht. Abermals ist dieser Effekt auch 113 Tage nach Gentransfer noch nachweisbar, ein früheres Nachlassen des therapeutischen Effektes in dem mit lediglich 1/10 der Virusdosis therapierten Kaninchen läßt sich nicht aufzeigen.


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4.6.4  Quantifizierung des Gentransfers

Die Leber/Herz-Ratio (L/H-Ratio) stellt ein Maß für die spezifische Anreicherung der applizierten Radioaktivität in den einzelnen Organen dar. Die über der Leber gemessene Radioaktivität wird hierbei zu der über dem Herzen gemessenen in Relation gesetzt, wobei sich im zeitlichen Verlauf beurteilen läßt, ob sich ein differierendes Verhalten der 111In-LDL einstellt. Tabelle 8 zeigt die 4 bzw. 24 Stunden nach 111In-LDL-Injektion erhobenen L/H-Ratios für die verschiedenen Untersuchungszeitpunkte, wobei jeweils ein dosisunabhängiger Mittelwert aller zum jeweiligen Zeitpunkt gescannten Tiere verwendet wird.

Tabelle 8: L/H-Quotienten 4 bzw. 24 Stunden nach 111In-LDL-Injektion zu verschiedenen Zeitpunkten vor und nach Gentransfer.

4 h p.i.

 

Mittelwert

Standardabweichung

Anzahl (n)

L/H-Ratio, -20

1,5

0,2

8

L/H-Ratio, 4

11,3

1,7

7

L/H-Ratio, 30

7,0

1,5

6

L/H-Ratio, 58

6,0

1,1

6

L/H-Ratio, 113

7,3

0,9

6

24 h p.i.

 

Mittelwert

Standardabweichung

Anzahl (n)

L/H-Ratio, -20

3,2

0,4

8

L/H-Ratio, 4

14,2

2,0

7

L/H-Ratio, 30

9,2

1,4

6

L/H-Ratio, 58

8,9

0,7

4

L/H-Ratio, 113

8,2

2,5

6

Vergleicht man die vier Tage nach LDL-R-Gentransfer erhobenen Daten mit denen vor Therapie, so läßt sich eine signifikante Erhöhung der L/H-Ratio aufzeigen, was für eine [Seite 60↓]vermehrte 111In-LDL-Akkumulation in der Leber als Ausdruck einer erfolgreichen LDL-R-Exprimierung spricht. Zu den nachfolgenden Zeitpunkten läßt sich zwar ein allmähliches Absinken des L/H-Quotienten dokumentieren, allerdings lassen sich auch zum letzten Untersuchungszeitpunkt nach 113 Tagen noch immer deutlich über den Vorgrößen liegende Zahlen nachweisen. Abbildung 21 stellt diese Ergebnisse graphisch dar.

Abbildung 21: Dosisunabhängige Darstellung der L/H-Ratio 4 bzw 24 Stunden nach Injektion von 111In-LDL zu verschiedenen Zeitpunkten vor und nach Vektorapplikation.

Deutlich ist der Zuwachs der Aktivitätsanreicherung in der Leber nach LDL-R-Gentransfer. Am stärksten ausgeprägt ist dieser Effekt nach 4 Tagen, allerdings ist auch 113 Tage nach Vektorgabe noch ein signifikanter Erfolg der Therapie erkennbar.

Um zu bestimmen, ob eine höhere Vektordosis auch mit einem stärkeren Anstieg des L/H-[Seite 61↓]Quotienten vergesellschaftet ist, wurden die L/H-Quotienten der einzelnen Kaninchen vor und nach Therapie gegenübergestellt. Abbildung 22 illustriert hierbei den individuellen Verlauf der L/H-Ratio der einzelnen Tiere, Abbildung 23 faßt die Ergebnisse etwas allgemeiner für jeweils alle Tiere einer verwendeten Vektordosis zusammen. Hierbei wird abermals ersichtlich, dass der maximale Therapieeffekt am 4. Tag nach Gentransfer aufzuzeigen ist, eine positive Korrelation zwischen Virusdosis und L/H-Quotient ergibt sich jedoch nicht.

Abbildung 22: Individueller Verlauf der L/H-Ratio der einzelnen Kaninchen 4 h (Abbildung A) bzw. 24 h (Abbildung B) nach Injektion radiomarkierter LDL zu definierten Zeitpunkten vor und nach Gentherapie.


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Abbildung 23: Allgemeine dosisabhängige Darstellung des Zellmittelwertes der L/H-Ratio 4 h (Abbildung A) bzw. 24 h (Abbildung B) nach Injektion radiomarkierter LDL zu definierten Zeitpunkten vor und nach Gentransfer.

4.6.5 Bestimmung des günstigsten Untersuchungszeitpunktes

Betrachtet man die Abbildungen 21 bis 23, so fällt auf, dass die L/H-Ratio 24 p.i. der radiomarkierten LDL zwar höher ist als nach 4 h, dass aber 4 h p.i. auch schon ein für Scanuntersuchungen geeigneter hoher Leber-Uptake stattfindet. Da ein zeitnah zur LDL-Applikation durchgeführter Scan organisatorische Vorteile bietet und damit zudem die Möglichkeit offensteht, künftig auch Radioisotope mit kürzerer Halbwertszeit zu verwenden, scheint der Untersuchungszeitpunkt 4 h p.i. der günstigste zu sein.


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03.08.2005