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5.  DISKUSSION

Die autosomal-dominant vererbte Familiäre Hypercholesterinämie (FH) zählt zu den häufigsten monogenetischen Stoffwechselkrankheiten und wird durch eine Defizienz des LDL-Rezeptors (LDL-R) verursacht. Beim Gesunden findet sich dieser zu 70-80% in der Leber. Der Leber kommt somit ursächlich und im Rahmen therapeutischer Bemühungen eine zentrale Rolle zu [103]. Klinisch zeichnet sich die Erkrankung neben einem erhöhten Gesamt- und LDL-Cholesterin sowie einer Xanthomatose der Sehnen und der Haut vor allem durch eine prämature Atherosklerose aus, wobei insbesondere die Koronarsklerose einen frühzeitigen Tod bedingt. Heterozygote FH-Patienten entwickeln die ersten klinischen Symptome in der Regel zwischen dem 20. und 40. Lebensjahr und weisen LDL-Cholesterinserumkonzentrationen zwischen 200-400 mg/dl auf, hier kann der Krankheitsprogress durch intensive medikamentöse Therapie und regelmäßige Lipidapheresen meist deutlich verzögert werden. Homozygot Erkrankte hingegen weisen exzessiv erhöhte LDL-Cholesterinserumkonzentrationen von 400-1.000 mg/dl auf und erkranken bereits im Kindesalter an den Folgeerscheinungen, was zum Tod meist vor dem 20. Lebensjahr führt [10, 12, 13, 16, 27]. Für diese Patienten stellt im Einzelfall die Lebertransplantation das einzige therapeutisch ausreichende Mittel dar [42-44, 104, 105, 118].

Die FH diente uns als Modell zur Etablierung Leber-gezielter Gentransferversuche, als Tiermodell wurden hierbei Watanabe Heritable Hyperlipidemic (WHHL)-Kaninchen eingesetzt. Kaninchen werden bereits seit Jahrzehnten für tierexperimentelle Untersuchungen des Lipidstoffwechsels verwendet, da ihr Lipoproteinmetabolismus trotz der imponierenden HDL-Fraktion dem des Menschen relativ ähnlich ist [53, 106, 107]. Die WHHL-Kaninchen weisen zudem einen LDL-Rezeptordefekt auf, der mit einer deutlichen Elevation der Plasma-LDL-Konzentration bis zu 1.000 mg/dl vergesellschaftet ist und so eine prämature Atherosklerose hervorruft, darüber hinaus kommt es wie bei FH-Patienten zur Ausbildung von Xanthomen [33, 34, 47, 53-57]. Insgesamt bedingen die genannten Veränderungen innerhalb der ersten drei Lebensjahre den Tod des Tieres. Die Ursache des natürlich vorkommenden, charakterisierten Defekts ist eine 12 Nukleotide lange in-frame-Deletion des LDL-Rezeptorgens, welche zu einem Verlust von vier Aminosäuren in der Ligandenbindungsdomäne und damit zu einem funktionsunfähigen Genprodukt führt [50, 54]. Dieses bedingt deutliche phänotypische Parallelen zur FH, so dass WHHL-Kaninchen ein hervorragendes Tiermodell für die Familiäre Hypercholesterinämie darstellen und sich für Leber-gezielte Gentransferversuche anbieten.


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Ein anderes zur Verfügung stehendes Tiermodell stellen die LDL-R knockout Mäuse dar, die durch LDL-R-Gen-Disruption generiert werden können. Durch Fütterung einer cholesterinreichen Diät können diese Tiere zwar ein klinisches Krankheitsbild entwickeln, das dem der FH ähnelt, insgesamt bestehen aber doch noch deutliche Unterschiede gegenüber dem menschlichen Fettstoffwechsel, so dass die WHHL-Kaninchen besser als Tiermodell geeignet scheinen [63, 79-81, 108, 109].

Darüber hinaus sind erste Versuchsreihen in den USA auch an Primaten gestartet worden, die zwar prinzipiell als Vorläufer von Gentherapieversuchen am Menschen Erfolg versprechend sind, aber noch einer ausreichenden klinischen Etablierung bedürfen [110-113, 118].

Zahlreiche präklinische ex vivo- und in vivo-Versuchsreihen mit WHHL-Kaninchen im Rahmen gentherapeutischer Bemühungen der FH wurden in den vergangenen Jahren beschrieben. Während bei der ex vivo-Strategie die Gentherapie mit einer Leberzelltransplantation kombiniert wird, werden bei den in vivo-Ansätzen rekombinante Gene direkt oder mittels eines geeigneten Vektors in den Probandenkörper eingebracht. Das allgemeine Vorgehen bei der ex vivo-Strategie beruht auf der Entnahme von Hepatozyten aus dem Organismus, ihrer Kultivierung und Transfektion mit das LDL-Rezeptorgen tragenden Retroviren sowie der nachfolgenden Retransplantation. Das Paradigma wurde Ende der achtziger Jahre von Wilson et al. geliefert. Hierbei wurden WHHL-Kaninchen Hepatozyten entnommen, kultiviert und mit einem rekombinanten Retrovirus transduziert, welcher das Gen für den humanen LDL-R enthielt. Die so modifizierten allogenen Leberzellen wurden anschließend den Tieren via Portalvene reimplantiert, was zu einem signifikanten Abfall der Serumcholesterinkonzentration von bis zu 70% für einen Zeitraum von sechs Tagen führte [47-50, 118, 119]. Die Annahme, dass die nur vorübergehende Genexpression Ausdruck einer Abstoßungsreaktion gegen die allogenen Leberzellen sein könnte, führte zur Verwendung autologer Hepatozyten. So führten Chowdhury et al. 1991 bei einer Reihe von WHHL-Kaninchen partielle Hepatektomien durch und kultivierten die so gewonnenen Hepatozyten. Nach genetischer Korrektur durch einen das LDL-Rezeptorgen eines Wildtyp-Kaninchens tragenden Retrovirus wurden diese dem jeweiligen Tier gleichfalls transplantiert, was immerhin über einen Zeitraum von vier Monaten zu einer Serumcholesterinsenkung von 25-45% führte. Hinweise für eine serologisch faßbare Abstoßungsreaktion gegen das Genprodukt ergaben sich nicht [47, 51, 118-120].

Auf diesen Ergebnissen aufbauend wurden die ersten in vivo-Gentherapieversuche Anfang der neunziger Jahre gestartet. So beschrieben Wilson et al. die erfolgreiche Durchführung eines leberspezifischen Gentransfers im WHHL-Kaninchen durch Verwendung eines DNA-Protein-[Seite 65↓]Komplexes, der ein humanes LDL-Rezeptorgen enthielt und den Tieren peripher-venös direkt injiziert wurde. Es ließ sich ein Hepatotropismus des Konstruktes nachweisen und die Bildung rekombinanter LDL-R-RNA aufzeigen, deren Menge etwa 2-4% der Norm erreichte. Hinsichtlich des Lipidstoffwechsels äußerte sich dies in einer Senkung des Serumcholesterinspiegels von 25-30%, welche bis sechs Tage nach dem Gentransfer anhielt [59, 118, 120]. Bei anderen Ansätzen von Wilson et al., Li et al. sowie Brown et al. wurde WHHL-Kaninchen ein rekombinanter Adenovirus infundiert, welcher LDL-R-cDNA enthielt. Auch hierbei ließ sich ein deutlicher Hepatotropismus nachweisen, zudem war das Ausmaß der erreichten rekombinanten LDL-Rezeptorgenexpression wesentlich größer als in dem vorgenannten Versuch. Metabolisch konnte eine Reduktion der Gesamt- und LDL-Serumcholesterinkonzentration beobachtet werden, die ihr Maximum nach ca. einer Woche erreichte und für etwa zwei Wochen anhielt. Der Nachweis des Gentransfers erfolgte bei Wilson et al. indirekt über eine Radiomarkierung des Vektors mit anschließender Aufzeichnung der Radioaktivitätsanreicherung in den verschiedenen Organen, wobei eine vermehrte hepatische Anreicherung dokumentiert werden konnte. Zusätzlich wurde die hepatische Expression des humanen LDL-R mittles LDL-Rezeptor-mRNA-Nachweis aufgezeigt. Der Versuch einer Optimierung dieser Ansätze resultierte in Cholesterinsenkungen von bis zu 60% über einen Zeitraum von 100 Tagen [114]. Leider kam es bei der Arbeitsgruppe um Wilson et al. durch die Adenovirusgabe zur Bildung neutralisierender Antikörper, welche den wiederholten Einsatz limitierten [60-62]. Durch den Einsatz von Immunsuppressiva und eine Weiterentwicklung der Vektoren mit zusätzlicher Deletion immunogen wirkender Genabschnitte scheinen jedoch deutlich längere Expressionszeiten möglich [114, 117, 121- 124].

Basierend auf den gewonnenen ex vivo-Daten wurde durch Wilson et al. 1992 als Pilotprojekt ein Protokoll zur Durchführung von Gentransferversuchen bei 5 Patienten mit homozygoter FH beantragt [47, 52]. Trotz der sicher noch unzureichend vorliegenden Daten der Tierversuche wurde die Studie durch die Ethikkomission genehmigt. Die Rekrutierung der Patienten erfolgte lediglich auf Grund des klinischen Phänotyps einer homozygoten FH, eine genetische Charakterisierung erfolgte nicht. Aus heutiger Sicht erscheint dies wenig verständlich, da man annehmen muß, daß es neben dem LDL-R-Defekt weitere Störungen des Lipidstoffwechsels gibt, die den Phänotyp einer homozygoten FH bedingen können [115]. Bei den Patienten wurden partielle Hepatektomien durchgeführt, die so gewonnenen Leberzellen kultiviert und dann mit einem das humane LDL-R-Gen tragenden Retrovirus infiziert. Die positiv selektionierten autologen Zellen wurden anschließend via Portalvene reinjiziert. Die nachfolgenden [Seite 66↓]Stoffwechseluntersuchungen konnten bei drei der Patienten eine Beschleunigung des LDL-Katabolismus bis zu 53% sowie eine Senkung des LDL-Cholesterins bis zu 20% aufzeigen. Zwar wurden die Cholesterinwerte noch für mindestens 18 Monate regelmäßig bestimmt, und es zeigte sich eine persistierende LDL-Senkung, da jedoch postoperativ eine passager pausierte Lipidsenkertherapie wieder aufgenommen wurde, muß der tatsächliche Langzeiteinfluß der Gentherapie auf die Cholesterinserumkonzentration offen bleiben. Zwar bewiesen Wilson et al. mit dieser Studie die prinzipielle Durchführbarkeit einer somatischen Gentherapie am Menschen ohne das Auftreten größerer Komplikationen, dennoch sollte vor der erneuten Durchführung eines humanen Gentherapieprotokolls eine Verfahrensoptimierung erfolgen. Denn mit der chirurgischen Entnahme von Hepatozyten stellte dieses Verfahren eine für den Patienten sehr invasive Prozedur dar, darüber hinaus war die Ausbeute der Zahl erfolgreich transfizierter Zellen mit 11-31% relativ gering [52, 116- 118]. Und obwohl weitere Gentherapieversuche bei Patienten mit genetischen Lebererkrankungen schwerwiegende Komplikationen bis hin zu letalen Ausgängen zeigten, sind langfristig modifizierte Gentherapieverfahren im Menschen zu erwarten [125-127].

Grundlage dieser Arbeit bildete die vorangegangene Entwicklung eines externen szintigraphischen Verfahrens in der Arbeitsgruppe von PD Dr. H. Schmidt, welches die Effizienz eines durch Adenoviren vermittelten LDL-R-Gentransfers beim WHHL-Kaninchen in vivo darstellen kann [6].

Dem schloß sich diese Arbeit mit der Aufgabenstellung an, den Einfluß einer Virusdosiseskalation auf Cholesterinsenkung und Langzeitexpression bei adenoviral vermittelten LDL-Rezeptorgentransferversuchen im in vivo-Kaninchenmodell zu untersuchen. Dabei wurde der LDL-R-Gentransfer mittels Adenoviren des Serotyps 5 durchgeführt. Dieser Vektor wird im Rahmen von Gentransferversuchen relativ häufig eingesetzt, da er zum einen einfach und in großen Mengen hergestellt werden kann und zum anderen auch sich nicht mehr teilende Zellen in hoher Zahl infiziert. Unter natürlichen Bedingungen führt der Virus hauptsächlich zu Infektionen des Respirationstraktes, bei systemischer Applikation jedoch zeigt er einen ausgeprägten Hepatotropismus, weshalb er gerne für Leber-gezielte gentherapeutische Fragestellungen verwendet wird [121, 122]. Limitiert wird der Einsatz dieses Serotyps dadurch, dass die eben beschriebenen häufigen Infektionen der oberen Atmungsorgane eine hohe Durchseuchungsrate der Bevökerung bedingen, so dass eine Vielzahl von Menschen präexistierende Antikörper aufweist. Auch im Tierversuch konnte dieser Effekt bei mehrmaliger Applikation des Vektors beobachtet werden [6-8, 46, 60, 62, 117, 121-124]. Deshalb werden zur [Seite 67↓]Zeit weitere Serotypen des Virus auf existierende Antikörper im Menschen untersucht, um den geeignetsten Vektor für die humane Anwendung zu finden.

Da der LDL-Rezeptor des Kaninchens erst kürzlich kloniert wurde, wurde in unseren Versuchen der zur Verfügung stehende humane LDL-R verwendet.

Neben der Etablierung der bereits in der Literatur beschriebenen Gentherapieversuche, war ein wesentliches Ziel dieser Arbeit eine Dosis-Wirkungs-Beziehung bei Verwendung unterschiedlicher Virusdosierungen zu dokumentieren und deren Effekt auf das Ausmaß der Cholesterinsenkung festzustellen. Auch sollte die Dauer der beobachteten Veränderungen aufgezeichnet werden. Um dies umzusetzen, entschieden wir uns für regelmäßige Bestimmungen der Cholesterinserumkonzentration und mehrfache LDL-Stoffwechselkinetiken mit radioaktiv markierten LDL sowie zu einer Dokumentation des Therapieerfolgs durch szintigraphische Darstellung der radioaktiv markierten LDL-Fraktion nach Injektion in die Kaninchen.

Für die stoffwechselkinetischen Untersuchungen des LDL-Metabolismus wurde der Radiotracer 125I verwendet, da seine diesbezügliche Anwendung als bereits ausreichend etabliert gilt [87, 88, 90, 94].

Als Radionuklid für die LDL-Markierung im Rahmen der Scanuntersuchungen musste ein Tracer gewählt werden, der szintigraphisch auch noch nach Tagen detektierbar ist, da insbesondere bei Patienten mit FH die LDL-Partikel langsam katabolisiert werden, was szintigraphische Untersuchungen auch Tage nach Injektion der radiomarkierten LDL noch sinnvoll macht. Hierbei standen die Radionuklide 125I, 131I, 99mTc sowie 111In zur Auswahl. Unter dem Gesichtspunkt einer eventuellen späteren Anwendung im Menschen erschien 125I hierbei aufgrund seiner langen Halbwertszeit von 60 Tagen ungeeignet, zudem kommt es auf Grund eines zu niedrigen energetischen Niveaus der abgestrahlten Photonen zu einer nur unzureichenden szintigraphischen Darstellung [71, 84]. 123I und 99mTc hingegen erschienen auf Grund ihrer zu geringen Halbwertszeit nicht geeignet [71, 84, 88]. Wir wählten deshalb den Gammastrahler 111In, welcher mit einer Halbwertszeit von 2,83 Tagen in etwa die Halbwertszeit eines LDL-Partikels im Menschen aufweist. Dass sich dieses Radionuklid gut zur LDL-Markierung mit nachfolgender szintigraphischer Detektion und Monitoring des LDL-Metabolismus eignet, war darüber hinaus bereits im Rahmen der Entwicklung des in vivo-Scanverfahrens aufgezeigt worden. [6].

Die bereits ausgeführten Ergebnisse der Arbeitsgruppen um Wilson et al. und Brown et al. konnten durch unsere Durchführung eines adenoviral vermittelten Gentransfers des LDL-R im Kaninchenmodell bestätigt werden, zusätzlich wurden dosisabhängige Auswirkungen [Seite 68↓]beobachtet. Es kam zu einem signifikanten Abfall der Serumcholesterinkonzentrationen, welcher um so stärker ausgeprägt war, je größer die applizierte Vektorendosis war. Während es bei der Applikation von 1/10 der Virusdosis (0,23 x 1012 pfu) lediglich zu einer geringen Senkung der Cholesterinwerte um 13-19% kam, konnte nach Verabreichung der einfachen Dosis (2,35 x 1012 pfu) ein Absinken um 74% und bei Gabe der doppelten Dosis (4,7 x 1012 pfu) sogar eine Reduktion bis auf 1/10 der Ausgangswerte beobachtet werden. Der dabei beobachtete maximale Rückgang war jeweils am 5.-7. Tag nach Gentransfer zu verzeichnen, danach kam es zu einem allmählichen Ansteigen der Cholesterinwerte, so dass innerhalb von 12-18 Tagen nach Vektorgabe bei allen Kaninchen unabhängig von der verabreichten Virusdosis eine Nivellierung des Effekts mit Wiedererreichen der Ausgangswerte eintrat. Der teilweise dramatische Abfall der Cholesterinwerte ist hierbei am ehesten auf die hepatische Expression des LDL-R zurückzuführen. Die FPLC-Analytik der Kaninchenseren ergab, dass die cholesterinreiche LDL-Fraktion auch bis zu vier Wochen nach Gentherapie noch erniedrigt war, begleitend konnte ab dem vierten Tag nach Gentransfer ein Anstieg der triglyzeridreichen VLDL-Fraktion aufgezeigt werden. Hiermit wird erstmalig gezeigt, dass die Leber die erhöhte Cholesterinzufuhr nach dem Gentransfer mit einer erhöhten VLDL-Synthese kompensiert, was wiederum die zwei Wochen post Gentransfer erhobenen Serumcholesterinkonzentrationen erklärt.

Auch bei den vorangehend näher ausgeführten ex und in vivo-Studien waren Cholesterinsenkungen mit einem Maximum wenige Tage nach Gentransfer und einer allmählichen Nivellierung des Effekts in der Folgezeit beschrieben worden, Li et al. hatten zusätzlich eine Erhöhung der HDL-Fraktion aufzeigen können [61]. Im analogen Mausmodell konnte ebenfalls eine Cholesterinsenkung erreicht werden, vergleichbare Effekte bezüglich des HDL-Cholesterins konnten jedoch nicht beobachtet werden [80]. Die Ursache für den Wiederanstieg der Cholesterinwerte wenige Tage nach Gentransfer sowie für den gleichzeitigen HDL-Anstieg konnte von Li et al. nicht geklärt werden. Allgemein liegt der relativ kurzen Wirkung eines adenoviral vermittelten Gentransfers die nicht stabile Transfektion der Hepatozyten zugrunde, da die transfizierte DNA nicht ins Wirtszellgenom integriert wird, sondern episomal verbleibt. Zusätzlich hatten Untersuchungen im Vorfeld dieser Arbeit gezeigt, dass neben anti-adenoviralen Antikörpern auch Antikörper gegen den humanen LDL-R nach Gentransfer limitierend wirken können [6].

Es wurden ergänzend in vivo-Stoffwechseluntersuchungen durchgeführt, um die durch den LDL-R-Gentransfer vermittelte gesteigerte hepatische Aufnahme Indium-markierter LDL und die Cholesterinsenkung durch gesteigerten Katabolismus als Folge einer erhöhten LDL-R-Aktivität [Seite 69↓]zu bestätigen. Stoffwechselkinetische Untersuchungen gelten als geeignetes Instrument, um den Metabolismus einer Substanz aufzuzeichnen. So gilt der verlangsamte Katabolismus der LDL-Fraktion als Zeichen einer gestörten LDL-Aufnahme in die Zelle und somit als Hinweis auf einen LDL-R- oder Apo B-Defekt. In den USA sind solche Untersuchungen mit radiomarkierten LDL auch am Menschen möglich, in Deutschland hingegen sind sie bislang nur im Tiermodell erlaubt.

Vorangehende Untersuchungen hatten bereits einen nahezu identischen Katabolismus von Human-LDL und Kaninchen-LDL aufzeigen können, nach Transfektion von Kaninchen mit dem humanen LDL-R kam es jedoch zu einem beschleunigten Abbau der humanen LDL gegenüber den Kaninchen-LDL. Dies sprach für einen spezifischen Aufnahmeprozeß des humanen LDL-R und belegte Expression und Funktionsfähigkeit des humanen LDL-R nach Gentransfer. Zusätzlich wurde sichergestellt, dass der verwendete Radiotracer keinen Einfluß auf den LDL-Metabolismus nahm [6]. In unseren Experimenten verwendeten wir für die Stoffwechselkinetiken vor und nach Gentherapie humane LDL, welche mit dem Iodisotop 125 markiert worden waren. Vor Gentherapie konnte für alle an der Untersuchung beteiligten Tiere eine nahezu identische Radioaktivitätsabklingkurve nachgewiesen werden, was für einen vergleichbaren LDL-Katabolismus sprach. Nach dem Gentransfer zeigte sich als Zeichen eines funktionell intakten transgen exprimierenden LDL-R bei allen Tieren eine erhöhte katabole Rate der injizierten radiomarkierten LDL. Dieser Effekt war auch nach 113 Tagen, also am Ende unseres Experimentes, noch nachweisbar, allerdings schien er von der gewählten Virusdosis unabhängig zu sein, da sich bei den mit höheren Virusmengen therapierten Tieren nicht zwangsläufig eine höhere katabole Rate der LDL aufzeigen ließ als bei den Kaninchen, welche nur eine vergleichsweise geringe Virusmenge erhielten.

Ähnliche Resultate lieferten die parallel durchgeführten in vivo-Scanuntersuchungen der Kaninchen. Diese basierten auf einem zuvor entwickelten wenig invasiven bildgebenden Verfahren, welches das Vorhandensein des LDL-R in vivo nachweisen kann und semiquantitative Aussagen über seine Aktivität ermöglicht. Prinzip dieses Verfahrens ist die Injektion von mit 111In markierten LDL in den zu untersuchenden Organismus mit anschließender Darstellung der Aktivitätsverteilung via Gammakamera. Die vor Gentransfer angefertigten Aufnahmen der Kaninchen zeigten eine hauptsächliche Aktivitätsanreicherung über den gut durchbluteten Organen Herz, Leber, Lunge sowie in abgeschwächter Form über den großen Gefäßen. Im Zuge der LDL-Metabolisierung und der Freisetzung von freiem Indium stellten sich im weiteren Verlauf verstärkt die Nieren und die Blase dar. Nach Transfektion mit [Seite 70↓]dem LDL-Rezeptorgen konnte bereits eine Stunde nach Injektion der radiomarkierten LDL eine spezifische Anreicherung über der Leber nachgewiesen werden, die auf den prä-Aufnahmen gut sichtbare Herzregion trat hingegen in den Hintergrund. Dieser Effekt ließ sich zu allen Zeitpunkten nach Gentherapie aufzeigen, selbst nach 113 Tagen schienen die LDL noch selektiv in der Leber zu akkumulieren.

Um eine semiquantitative Auswertung zu gewährleisten, wurde anschließend das Leber/Herz-Verhältnis ermittelt. Das Prinzip hierbei besteht darin, die gemessene Radioaktivität über einem bestimmten Organ, in unserem Fall der Leber, zur gemessenen Aktivität über dem Herzen, als dem am stärksten durchbluteten Organ, in Beziehung zu setzen (Organ/Herz-Ratio). Je größer dieser Wert, desto stärker ist das entsprechende Organ mit 111In angereichert. Während in unseren Experimenten vor Gentherapie das Leber/Herz-Verhältnis um einen Wert von ca. 1,5 schwankte, konnte bei mit dem LDL-R gentransfizierten Kaninchen eine Erhöhung um den Faktor 7,5 aufgezeigt werden, wobei das Maximum am 4. Tag nach Gentransfer zu dokumentieren war. Dies sprach für eine vermehrte 111In-Akkumulation in der Leber als Ausdruck einer erfolgreichen LDL-R-Exprimierung. Zwar ließ sich zu den folgenden Zeitpunkten ein allmähliches Absinken des L/H-Quotienten beobachten, trotzdem konnten zum letzten Untersuchungszeitpunkt nach 113 Tagen immer noch deutlich über den Vorgrößen liegende Zahlen nachgewiesen werden. Wie bei den Stoffwechselkinetiken ließ sich auch hierbei keine Korrelation zwischen verwendeter Virusmenge und Höhe der L/H-Ratio aufzeigen.

Zusammenfassend sprechen die Ergebnisse unserer Versuche für einen erfolgreich durchgeführten Gentransfer des LDL-R im WHHL-Kaninchen, wobei festgestellt werden muß, dass die adenoviral vermittelte transgene Expression des LDL-R durch die Bestimmung des Serumcholesterins nicht korrekt wiedergegeben wird. Denn zum einen konnte bei der Bestimmung des Serumcholesterins ein dosisabhängiger Effekt beobachtet werden, d.h. je größer die verwendete Virusmenge im Rahmen des Gentransfers war, desto größer war auch das Ausmaß der passager beobachteten Gesamtcholesterinsenkung, dieser dosisabhängige Effekt zeigte sich bei den Stoffwechselkinetiken mit 125I-LDL und bei den Scanuntersuchungen mit 111In-LDL jedoch nicht. Darüber hinaus kam es innerhalb von 12-18 Tagen nach Gentransfer zu einem Wiedererreichen der Serumcholesterinausgangswerte, wohingegen die in vivo-Stoffwechselkinetiken eine erhöhte Abbaurate radiomarkierter LDL über die gesamte Dauer des Experimentes von 120 Tagen belegten. Auch die szintigraphischen Untersuchungen konnten eine LDL-R-Expression über den untersuchten Zeitraum von 113 Tagen aufzeigen, wenngleich sie auch im Laufe der Zeit nachließ. Die FPLC-Analytik zeigte, dass die zwei Wochen nach [Seite 71↓]Gentransfer erhobenen Serumcholesterinkonzentrationen Folge einer erhöhten hepatischen VLDL-Synthese waren, was somit erstmalig demonstriert, dass die Leber hierdurch die post Gentransfer erhöhte Cholesterinzufuhr kompensiert.

Die allmähliche Nivellierung des Gentherapieeffekts ist bislang noch weitestgehend unklar. Sicher ist, dass beim adenoviral vermittelten Gentransfer durch ausbleibende Integration der rekombinanten DNA ins Wirtszellgenom eine stabile Transfektion unterbleibt. Zudem konnte in mehreren Studien eine Antikörperbildung gegen virale Proteine oder das Genprodukt nachgewiesen werden [6-8, 46, 60, 62, 117, 121- 124]. In den dieser Arbeit vorangegangenen Untersuchungen konnte ebenfalls eine Antikörperbildung gegen den humanen LDL-R aufgezeigt werden [6]. Es wurde gemutmaßt, dass durch die Antikörper der LDL-R möglicherweise blockiert wird, so dass er kein LDL internalisieren kann und damit inaktiv wird. Inwieweit die Antikörperbildung tatsächlich eine Rolle spielt, ist noch unklar. Erste Versuche, welche begleitend zum Gentransfer Immunsuppressiva einsetzten, zeigten hoffnungsvolle Ergebnisse, so dass dieser Gedanke weiter ausgebaut werden sollte [122, 124]. Auch der Einsatz eines Kaninchen-LDL-Rezeptors in vergleichbaren Versuchsaufbauten sollte diskutiert werden, um eine Immunantwort des Kaninchens gegen den humanen LDL-R auszuschließen. Hierdurch könnte möglicherweise eine signifikante Verlängerung des Gentherapieeffekts erzielt werden.

In unserem Versuch wurde auf histologische Untersuchungen von Lebergewebe gentransfizierter Kaninchen verzichtet, da in den vorangegangenen Versuchen zur Entwicklung eines in vivo-Scanverfahrens bereits mittels eines Immunfluoreszenzverfahrens die Expression des LDL-R auf parenchymalen Leberzellen nachgewiesen werden konnte und keine Änderung der Verfahrenstechnik des Gentransfers vorgenommen wurde.

In den westlichen Industriestaaten ist die altersbedingte Gefäßsklerose, insbesondere die Koronarsklerose, die führende Todesursache. Hierbei ist der kausale Zusammenhang zwischen Atherogenese und erhöhten Serumcholesterinwerten belegt, so dass der Behandlung der Hypercholesterinämie ein zentraler Stellenwert zukommt. Häufig liegt dabei ein LDL-R-Defekt ursächlich zugrunde, so dass aus präventivmedizinischer Sicht nicht nur die therapeutische Erhöhung der LDL-R-Aktivität wünschenswert ist, sondern auch die einfache Identifikation eines LDL-R-Defekts. Leider ist letzteres trotz verbesserter molekularbiologischer Methoden noch immer aufwendig und nicht immer erfolgsversprechend. Während die Identifikation homozygoter LDL-R-negativer Patienten meist schon klinisch möglich ist, ist der wesentlich häufiger auftretende heterozygote LDL-R-Defekt (Häufigkeit 1:500) weitaus schwieriger zu diagnostizieren. Da aber eine Hypercholesterinämie sowohl polygenetisch als auch [Seite 72↓]monogenetisch (LDL-R-Defekt, ApoB-Defekt) bedingt sein kann, ist eine präzise Identifizierung sowohl unter therapeutischen als auch prognostischen Gesichtspunkten wünschenswert. Allerdings liefert die Untersuchung an Hautfibroblasten heterozygoter LDL-R-Defekt-Träger oft schwierig zu interpretierende Ergebnisse. FACS-Untersuchungen konnten sich bis heute aus methodischen Gründen nicht in der routinemäßigen LDL-R-Aktivitätsdiagnostik bewähren, so dass ein praktikables Verfahren zur in vivo-LDL-R-Diagnostik etabliert werden musste. Das in den vorangegangenen Versuchen entwickelte in vivo-Scanverfahren zeigte diesbezüglich eine sehr hohe Sensitivität und konnte bereits relativ geringe LDL-R-Aktivitätszunahmen darstellen. Um eine sichere Anwendung am Menschen zu gewährleisten, war Ziel dieser Arbeit, Aussagen über die für eine Gentherapie optimale Virusmenge zu treffen und die Dauer des Therapieeffekts zu verfolgen. Da in den Stoffwechselkinetiken und Scanuntersuchungen keine dosisabhängige Wirkung bezüglich der verabreichten Virusmenge zu beobachten war, wären weitere Versuchsreihen mit weiter absteigenden Virusdosierungen sinnvoll, zumal sich niedrige Virusmengen als weniger immunogen erwiesen haben [124]. Auch wären Langzeitexperimente mit noch längerer Laufdauer interessant, evtl. auch im Vergleich zu den einen normalen LDL-R exprimierenden New Zealand White Kaninchen, um die Dauer des Therapieeffekts noch genauer zu evaluieren.

Langfristig ist damit zu rechnen, dass die somatische Gentherapie Einzug in die routinemäßige Therapie homozygoter LDL-R-negativer Patienten halten wird. Die Tatsache, dass in tierexperimentellen Studien mit der Rekonstitution der LDL-Rezeptoraktivität von 0% auf nur
2-4% eine signifikante Serumcholesterinsenkung zu erreichen war, gibt Hoffnung zu der Annahme, dass auch beim Menschen die Herstellung einer residualen LDL-Rezeptoraktivität bereits zu einer deutlichen Verbesserung des klinischen Verlaufs führen kann. Dies wird zudem durch die klinische Beobachtung untermauert, dass rezeptornegative homozygote FH-Patienten einen wesentlich schwereren Krankheitsverlauf aufweisen als Homozygote mit einer Rezeptordefizienz, aber erhaltener Restfunktion [51, 52, 120]. Aber auch heterozygote FH-Patienten könnten zukünftig von gentherapeutischen Maßnahmen profitieren. Sicherlich ist die medikamentöse Cholesterinsenkung neben der cholesterinarmen Diät und der körperlichen Aktivitätssteigerung unumstritten effektiv und relativ nebenwirkungsarm, doch für Patienten bei denen mit diesen Maßnahmen keine ausreichende Cholesterinsenkung zu erreichen ist, eröffnet die somatische Gentherapie neue Behandlungsalternativen. Bei homozygot Erkrankten könnten damit gar die bislang im Kindesalter durchgeführten Lipidapheresen oder die Lebertransplantation umgangen werden. Prämisse hierfür sind allerdings permanent [Seite 73↓]exprimierende, nebenwirkungsarme Vektoren, was durch die heutzutage verwendeten Vektoren noch nicht gewährleistet werden kann [123].

Dass die 111In-LDL-Szintigraphie geeignet ist, den Erfolg einer LDL-R-Gentherapie im Tiermodell der FH zu verfolgen, konnte bereits dokumentiert werden [6]. Zudem scheinen auf Grund der bereits 4 Stunden post injectionem beobachteten hohen hepatischen LDL-Aufnahme künftig auch 99mTc-Markierungen (Gammakamera) oder F-18-Markierungen (PET, MicroPET) möglich, um die Durchführung am Menschen weiter zu vereinfachen. Die Übertragung unserer Ergebnisse vom Tiermodell auf die Anwendung im Menschen erscheint realisierbar, vorher wäre jedoch eine Optimierung der vorangehend diskutierten Probleme wünschenswert.


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03.08.2005