Bedeutung von Plakophilin 2 für die Bildung von Zellverbindungen zwischen Herzmuskelzellen und die Morphogenese des Herzens

Dissertation zur Erlangung des akademischen Grades
doctor rerum naturalis (Dr. rer. nat)
im Promotionsfach Biologie

eingereicht an der Mathematisch-Naturwissenschaftlichen Fakultät I
der Humboldt-Universität zu Berlin

angefertigt von Dipl. Biol. Katja Susann Großmann

geboren am 02.05.1978 in Berlin

Präsident der Humboldt-Universität zu Berlin

Prof. Dr. Christoph Marschkies

Dekan: Dekan der Mathematisch-Naturwissenschaftlichen Fakultät I
Prof. Thomas Buckhout, PhD

Gutachter:
1. Prof. W. Birchmeier
2. Prof. H. Saumweber
3. Prof. L. Thierfelder

Tag der mündlichen Prüfung: 25. Oktober 2005

Die vorliegende Arbeit wurde unter Anleitung von Herrn Prof. Dr. Walter Birchmeier am Max-Delbrück-Centrum für Molekulare Medizin in Berlin-Buch angefertigt.

Zusammenfassung

Plakophiline sind Proteine der Armadillo-Familie, die eine Funktion während der Embryonalentwicklung und im adulten Organismus aufweisen. Mutationen in Genen, die für diese Proteine kodieren, führen häufig zu Krankheiten. In dieser Arbeit wird der Phänotyp von Plakophilin 2-defizienten Mausembryonen unter-sucht, welche Probleme in der Morphogenese des Herzens und dessen Stabilität aufzeigen. Feine Risse in der Herzwand in den Tagen 10.5-11 der Embryogenese führen zu Blutfluss in die Perikardialhöhle und resultieren in embryonalem Tod. In Abwesenheit von Plakophilin 2 löst sich das Zytoskelett-bindende Protein Desmoplakin aus den Zellverbindungen der Kardiomyozyten und bildet Aggregate im Zytoplasma. Im Gegensatz dazu bleiben Zellverbindungen der Epithelien unverändert. Die molekulare Analyse des betroffenen Gewebes lässt eine essentielle Rolle für Plakophilin 2 in der Organisation der Zellverbindungen im Herz ableiten. Besonderen Wert bekamen diese Untersuchungen, als es gelang, die erarbeiteten Zusammenhänge mit einer Krankheit beim Menschen zu koppeln. Beachtlicherweise wurden bei mehr als 25% der an Arrhythmogener-Rechts-Ventikulärer-Kardiomyophathie (ARVC) erkrankten Menschen, Mutationen im Gen für Plakophilin 2 gefunden.

Inhaltsverzeichnis

• Einleitung
  • Die Armadillo-Familie der Adhäsions- und Signalmoleküle
  • Desmosomen und Adhärenz-Verbindungen sind zwei Arten verwandter Zellverbindungen
  • Der molekulare Aufbau der Desmosomen
  • Die Plakophiline sind Bestandteile von Desmosomen
  • Das Zusammenspiel von Desmosomen und Adhärenz-Verbindungen
  • In den Glanzstreifen des Herzens existieren verschiedene Arten von Zellverbindungen
  • Zellverbindungen spielen eine Rolle in der frühen Embryonalentwicklung
  • Desmosomale Proteine in der späteren Embryonalentwicklung und bei Krankheiten
  • Ziel dieser Arbeit
• Ergebnisse
  • Erzeugung Plakophilin 2-defizienter Mäuse
  • Herzdefekte in Plakophilin 2^-/--Embryonen
  • Veränderungen in der Zusammensetzung und Architektur der Zellverbindungen in den Glanzstreifen der Plakophilin 2 ^-/- -Embryonen
  • Biochemische Unterschiede in Zellverbindungen embryonaler Herzen
  • Reduzierte Proteinstabilität der desmosomalen Cadherine Dsg2 und Dsc2a/b in Pkp2^-/--Herzen
  • Mutationen in Plakophilin 2 sind häufig in Arrhythmogener-Rechts-Ventrikulärer-Kardiomyopathie
• Diskussion
  • Plakophilin 2 ist essentiell für die Organisation kardialer Zellverbindungen
  • Veränderungen desmosomaler Komplexe in den Glanzstreifen des Herzens
  • Der Verlust von Plakophilin 2 in Epithelien kann kompensiert werden
  • Die funktionellen Unterschiede von Plakophilin 2 und Plakoglobin
  • Plakophilin 2-Mutationen in ARVC-Patienten
  • Arrhythmogene-Rechts-Ventrikuläre Kardiomyopathie
  • Haploinsuffizienz oder dominant-negative Mechanismen der Plakophilin 2 Mutationen
  • Mögliche heterozygote Maus-Modelle zur Aufklärung eines haploinsuffizienten Plakophilin 2-Krankheitsmechanismus
• Materialien und Methoden
  • Molekularbiologische Standardmethoden, Chemikalien, Kits und Geräte
  • Bakterienstämme und verwendete Plasmide
  • Konstruktion des Rekombinationsvektors, Kultivierung, Elektroporation und Selektion von Zellen
  • Genotypisierungen, Southern-Blot und Northern-Blot
  • Embryoschnitte und -färbungen
  • Immunhistochemie
  • Immunfluoreszenzmikroskopie
  • Elektronen und Immunelektronenmikroskopie
  • Detergenzextraktion, Gelelektrophorese und Western-Blot
  • Semiquantitative Real-Time PCR
  • Sequenzanalysen der ARVC-Patienten
• Abkürzungen
• Literaturverzeichnis
• Erklärung
• Publikationsliste

Tabellen

• Tabelle 1: Expression und Phänotypen desmosomaler Proteine
• Tabelle 2: Lebensfähigkeit der Embryonen aus Pkp2-heterozygoten Verpaarungen
• Tabelle 3: Für Kardiomyopathien verantwortliche Gene beim Menschen

Bilder

• Abb. 1: Die Familie der Armadillo-Proteine sind Adhäsions- und Signalmoleküle. Diese Proteinfamilie besteht aus drei Unterfamilien. Zur Unterfamilie der klassischen Catenine gehören β-Catenin und Plakoglobin. Die Plakophiline 1-3 bilden eine zweite Unterfamilie und besitzen neben neun Arm-Wiederholungen eine konservierte Sequenz im N-Terminus (Head-Domäne). Die p120-verwandten Proteine bilden die dritte Unterfamilie mit p0071, p120catenin und ARVCF, sie haben zusätzlich zu zehn (Arm)adillo-Wiederholungen eine Coiled-coil-Domäne in ihrem N-Terminus.
• Abb. 2: Die beiden klassischen Zellverbindungen der Vertebraten. Desmosomen und Adhärenz-Verbindungen haben ein Protein Abb. 1: gemeinsam, das Plakoglobin (blau). (a) Desmosomen bestehen aus transmembranen Glykoproteinen, den desmosomalen Cadherinen, welche in ihrem zytoplasmatischen Teil an Proteine der Arm-Familie binden (Plakoglobin und Plakophiline 1-3 (rot)). Desmoplakin (grau) wiederum interagiert mit den Armadillo-Proteinen und den Intermediärfilamenten. (b) In Adhärenz-Verbindungen binden klassische Cadherine an Plakoglobin und β-Catenin (grün), welche über α-Catenin (orange) das Aktinzytoskelett verankern. PM, Plasmamembran; IZ, intrazellulär.
• Abb. 3: Desmosomale Proteine in den Zellschichten der Haut. Verschiedene desmosomale Cadherine, Armadillo- und Plakin-Proteine sind in der Haut von Säugetieren in einer differenzierungsabhängigen Weise exprimiert. Wenn Keratinozyten der Basalschicht den Zellzyklus verlassen und in die Stachel- und Körnerzellschicht wandern, erhöht sich die absolute Zahl der Desmosomen (nicht im Bild dargestellt), und es ändert sich deren Zusammensetzung. Keratinozyten der Hornschicht, welche aus zellkernlosen Zellen bestehen enthalten sogenannte Corneodesmosomen. DSC, Desmocollin; DSG, Desmoglein; PG, Plakoglobin; PKP, Plakophilin; DP, Desmoplakin, EVPL, Envoplakin; PPL, Periplakin. Abbildung modifiziert nach⁶⁰.
• Abb. 4a: Schematische Struktur desmosomaler Proteine. Die Hauptbestandteile der Desmosomen sind drei Proteinfamilien, die desmosomalen Cadherine, die Armadillo-Proteinfamilie und die Plakine (siehe Abb. 4b). Desmosomale Cadherine sind Membranmoleküle mit vier extrazellulären Kalziumbindungsstellen. Die vier Mitglieder der Desmoglein-Familie haben hinter der intrazellulären Catenin-Bindungsstelle (ICS) einen verlängerten C-Terminus, welcher weitere Moleküle binden könnte. Alle drei Desmocolline besitzen zwei Spleißvarianten, die `b´ Form besitzt keine Catenin-Bindungsstelle (ICS). IPL, Prolinreiche-Region; RUD, Wiederholungsdomäne; DTD, Desmoglein-Terminaldomäne; EI-EIV, Cadherin-Wiederholungen. Die Armadillo-Familie desmosomaler Proteine besteht aus den Plakophilinen und Plakoglobin. Plakoglobin ist am nächsten verwandt mit β-Catenin, während die Plakophiline näher mit der Unterfamilie der p120catenine verwandt sind. Plakoglobin besitzt dreizehn Arm-Wiederholungen, die Plakophiline haben neun Arm-Wiederholungen zuzüglich einer Head-Domäne (graue Box) in ihrem N-Terminus. Abbildung modifiziert nach⁷¹.
• Abb. 4b: Schematische Struktur desmosomaler Proteine. Die Hauptbestandteile der Desmosomen bilden drei Proteinfamilien, die desmosomalen Cadherine, die Armadillo-Proteinfamilie (siehe Abb. 4a) und die Plakine. Plakine sind hantelförmige Proteine, die drei Domänen enthalten, eine zentrale ROD-Domäne und globuläre C- und N-terminale Domänen. Die N-terminale Domäne von Desmoplakin besitzt eine Reihe von α-helikalen Bündeln (NN, Z, Y, X, W und Z ), welche mit den Armadillo-Proteinen und Cadherinen interagieren, die C-terminale Domäne von Desmoplakin besitzt sogenannte A-,B-,C-Domänen, die mit den Intermediärfilamenten interagieren. Abbildung modifiziert nach⁷¹.
• Abb. 5: Die molekulare Organisation eines Desmosoms. Desmosomale Cadherine binden einander heterophil über ihren N-Terminus. Die Desmoglea ist ein zur Plasmamemban extrazellulärer Bereich, der den interzellulären Raum des Desmosoms darstellt. In diesen Raum ragen die extrazellulären Domänen der Desmogleine und Desmocolline hinein. Zum äußeren Plaque gehören der C-Terminus der desmosomalen Cadherine, die Armadillo-Proteine wie Plakoglobin und die Plakophiline und der N-Terminus von Desmoplakin. Zum inneren Plaque zählt der C-Terminus von Desmoplakin und dessen Verbindung mit den Intermediärfilamenten (schematisch links dargestellt). Eine elektronenmikroskopische Aufnahme eines Desmosoms ist in der Abbildung rechts dargestellt. Maßstab 0.2 µm. Abbildungen modifiziert nach^53,71.
• Abb. 6: Dendogramm der Amino-säuresequenz-Homologien zwischen verschiedenen Armadillo-Proteinen. Aminosäuresequenzen der Arm-Proteine mit Adhäsions- und Signaltransduktionsfunktion wurden mit dem „TREE“-Algorithmus der HUSAR – Sequenzananlyse - Software verglichen. Die Verwandtschaft der verschiedenen Proteine ist im Dendogramm dargestellt. Die verwendeten Sequenzen waren humane Sequenzen für β-Catenin (NP_001895), Plakoglobin (NP_002221), p0071 (NP_003619), Neurojungin (NP_001323), p120catenin (AB002382), ARVCF (U51269), PKP1a (NP_001005337), PKP2a (NP_001005242) und PKP3 (NP_009114). Übernommen aus⁶⁹.
• Abb. 7: Intermediäre Zellver-bindung. In intermediären Zell-verbindungen existieren Proteine aus Desmosomen und Adhärenz-Verbindungen. In der Area composita der Glanzstreifen des Herzens kolokalisieren z.B. β-Catenin, Desmoplakin und N-Cadherin. Auch in Zellverbin-dungen der Kapillaren (Complexus adherens) bilden VE-Cadherin, Plakoglobin und Desmoplakin eine Zellverbindung.
• Abb. 8: Elektronenmikroskopische Aufnahme eines Herzmuskelschnittes. Die Glanzstreifen (schwarze Pfeile) des Herzens sind reich an Adhärenz-Verbindungen und Desmosomen. Myofibrillen sind über Adhärenz-ähnliche Verbindungen in den Glanzstreifen des Herzens verankert und wichtig für die Muskelkontraktion. Intermediärfilamente binden an Desmosomen und sind wichtig für die Stabilität des Herzmuskels.
• Abb. 9 a-e: Strategie der Plakophilin 2-Deletion in der Maus. (a) Schematische Darstellung des Plakophilin 2-Rekombinationsvektors und des wildtypischen sowie mutierten Pkp2-Lokus. Exonsequenzen sind mit grauen Boxen dargestellt, die neo-Kassette wurde in entgegengesetzte Leserichtung an Kodon 43 des ersten Exons eingefügt. Die Sonden für die Southern-Hybridisierung sind mit schwarzen horizontalen Boxen gekennzeichnet (ext, neo). Die Größen der erwarteten Restriktionsfragmente durch den XbaI- und HindIII-Verdau sind angegeben. (b) Southern-Blot des PKP 2-Lokus der E10.75 Wt (+/+), Plakophilin 2-heterozygoten (+/-) und -homozygoten (-/-) Embryonen mit beiden Sonden (ext) und (neo). (c) PCR des Plakophilin 2-Lokus von Wt (+/+), Plakophilin 2-heterozygoten (+/-) und -homozygoten (-/-) Embryonen. (d) Western-Blot der Plakophilin 2-Expression in wildtypischen, heterozygot- und homozygot-mutierten Embryonen (E10.75). Erk diente als Ladekontrolle. (e) Northern-Blot der Plakophilin 2-Expression in wildtypischen, heterozygot- und homozygot-mutierten Embryonen E10.75. Die 28S-rRNA diente als Ladekontrolle.
• Abb. 9 f, g: Immunfluoreszenz von Plakophilin 2 an Wt-Herzen, (f) E10.75 und (g) E13.75. Der Antikörper (grüne Fluoreszenz) ist gegen den C-Terminus von Pkp2 gerichtet. Die Zellkerne wurden mit DAPI gefärbt (blau). Die gestrichelte Linie markiert die Grenze zwischen Myokard und Epikard. At, Atrium; V, Ventrikel; Maßstab, 200 µm.
• Abb. 10a-h: Phänotypen der Wt- und Plakophilin 2^-/--Embryonen E10.75. (a und b) Äußeres Erscheinungsbild von wildtypischen und homozygot-mutierten Embryonen mit Blutansammlung in der Perikardial- und Peritonealhöhle im homozygot-mutierten Embryo. (c-f) Makro- und Mikro-Vaskulatur des Dottersacks. Blutgefäße der wildtypischen, embryonalen Dottersäcke enthielten rote Blutkörperchen, während die Blutgefäße der homozygot-mutierten Pkp2-Dottersäcke keine Blutkörperchen enthielten. (c, d) Fotos von gesamten, frisch präparierten Dottersäcken, (e, f) Hämatoxylin/Eosin-gefärbte Schnitte von Dottersäcken. (g, h) Normal entwickelte Makro- und Mikro-Vaskulatur in einer PECAM-Färbung der Endothelzellen von Wt- und Pkp2^-/--Dottersäcken. (a, c, e, g) Wildtyp, (b, d, f, h) Pkp2^-/-.1000 µm (a, b, c, d, g und h), 100 µm (e und f).
• Abb. 11: Hämatoxylin/Eosin gefärbte Paraffinschnitte durch das Peritoneum von E10.75 Embryonen. Der Pfeil zeigt die Akkumulation von Blutzellen in der Bauchhöhle der Plakophilin 2^-/--Embryonen im Gegensatz zu Wildtyp-Embryonen. (links) Wildtyp, (rechts) Pkp2^-/-.
• Abb. 10i-l: Phänotypen der Wt- (i, k) und Plakophilin 2^-/-- (j, l) Embryonen E10.75. Lichtmikroskopie von Toluidinblau-gefärbten transversen Schnitten des embryonalen Herzens. Man beachte die verringerte Wanddicke der Atrien und die reduzierte Trabekelschicht des Ventrikels (Klammern) sowie die Blutakkumulation in der Perikardhöhle in Pkp2^-/--Embryonen (Pfeil). ra und la, rechtes und linkes Atrium; bc und cv, bulbus cordis (zukünftiger rechter Ventrikel) und common ventricle (zukünftiger linker Ventrikel). (k, l) Vergrößerte Aufnahme der Atrienwände in wildtypischen und Pkp2^-/--mutierten Herzen. (l) Dünnere Atriumwände in mutierten Pkp2^-/--Embryonen, die Position eines kleinen Loches in Pkp2^-/--Herzen ist gekennzeichnet (Pfeilspitze). ed, Endokardiale Zellen; ep, Epikardiale Zellen; cm, Kardiomyocyten; rb, rote Blutzellen. Maßstäbe: 300 µm (i und j), 50 µm (k und l).
• Abb. 12 A: Starke Unterschiede in der Komposition der Zellverbindungen der Glanzstreifen embryonaler E10.75 Pkp2^-/--Herzen. Konfokale Immunfluoreszenzmikroskopie von Kryostatschnitten kardialen Gewebes auf Wildtyp (Abb. 12 A) und Plakophilin 2^-/--Embryonen des Tages E10.75 (Abb. 12 B). Spezifische Antikörperkombinationen wurden angewandt: Kaninchen Antikörper gegen Desmoplakin (DP, markiert durch grüne Fluoreszenz) und murine monoklonale Antikörper gegen verschiedene andere Proteine kardialer Zellverbindungen (rote Fluoreszenz): (a and a´) Plakoglobin (PG); (b and b´) N-Cadherin (N-Cad); (c and c´) β-Catenin (β-Cat); (d and d´) Plakophilin 2 (PKP2); (e and e) Desmoglein 2 (Dsg2). Die überlagerten Fluoreszenzbilder sind in der rechten Kolumne dargestellt. (A) In Wildtyp-Embryonen zeigen die Zellverbindungen der Glanzstreifen eine weitreichende Kolokalisierung (gelb) von Desmoplakin mit (a) Plakoglobin, (b) N-Cadherin, (c) β-Catenin, (d) Plakophilin 2, und (e) Desmoglein 2. Andere bekannte Plaque-Proteine der kardialen Zellverbindungen zeigen identische Lokalisierungen, zu ihnen gehören p120catenin and α-Catenin (Daten nicht gezeigt). Maßstab, 50 µm.
• Abb. 12 B: Starke Unterschiede in der Komposition der Zellverbindungen der Glanzstreifen embryonaler E10.75 Pkp2^-/--Herzen. (B) Im Gegensatz zum Wildtyp kolokalisieren keine der Plaque-Proteine (PG, N-Cad, β-Cat, Dsg 2) mit Desmoplakin in Pkp2^-/--embryonalen Herzen (a´–e´). In diesen Mutanten ist Desmoplakin im Zytoplasma verteilt, und erscheint oft in einer Art granulärem Aggregat (grüne Punkte). (d´) Vollständiger Verlust der Plakophilin 2-Immunfärbung in homozygot-mutierten Embryonen zeigt, dass tatsächlich eine Nullmutation generiert wurde. (e´) Dsg2 ist nur schwach detektierbar in den Glanzstreifen von Pkp2^-/--Herzen. Maßstab, 50 µm. 
• Abb. 13 a-l: Die Abwesenheit von Plakophilin 2 führt zur Ablösung von Desmoplakin von den Glanzstreifen der Herzen (area composita). Elektronen- (a und b) sowie Immunelektronen- (c-l) Mikroskopie ultradünner Schnitte durch Glanzstreifen embryonaler Herzen von Wildtyp und Pkp2^-/--Embryonen (E10.75). Desmosomen, wie im Wildtyp, im oberen Teil von Abbildung (a) sichtbar, waren in Pkp2^-/--Herzen (b) nicht vorhanden. Die elektronenmikroskopische Erscheinung von Adhärenz-Verbindungen jedoch war in homozygot-mutierten Herzen ähnlich zu wildtypischen Herzen (unterer Teil von Abbildung a und b). Die Lokalisierung von Desmoplakin war in Pkp2^-/--Herzen im Vergleich zu Wildtyp-Herzen drastisch verändert. In wildtypischen Herzen war Desmoplakin stark an den Plaques beider Morphotypen zu finden (c und e), obwohl in der Regel eine stärkere Färbung an Desmosomen deutlich wurde (in Abbildung e, vergleiche die rechte Desmosomen-Zellverbindung mit der linken Adhärenz-Verbindung) waren auch Adhärenz-ähnliche Verbindungen positiv für Desmoplakin (c, e, g). Diese Art von Zellverbindungen waren auch positiv für Plakophilin 2 (h). Im Gegensatz dazu war in Pkp2^-/--Herzen keine Desmoplakin-Färbung an den Glanzstreifen detektierbar (d, f). Stattdessen war Desmoplakin teilweise im Zytolasma verteilt und oft in dichten Aggregaten entfernt von den Glanzstreifen zu finden (i, j). Andere Bestandteile der Zellverbindungen des Herzens, wie das klassische Cadherin (N-Cadherin) waren in vergleichbarer Intensität an den Glanzstreifen der Pkp2^-/-- wie auch wildtypischen Herzen detektierbar. Maßstäbe, 1 µm (b), 0.5 µm (a, c- g, i, j), 0.2 µm (h, k, l), 0.1 µm (j, Ausschnitt).
• Abb. 14: Intermediärfilamente (IF) um ein Desmoplakinaggregat in einer Herzmuskelzelle von Plakophilin 2-defizienten E10.75-Embryonen. Die immunelektronische Abbildung eines Ultradünnschnittes zeigt ein typisches dichtes, granuläres Aggregat (Pfeil), in welchem Desmoplakin von extensiven Schlingen aus ungeordneten Intermediärfilamenten umgeben ist. Die Desmoplakin-Immungoldfärbung ist nicht nur im Aggregat, sondern auch über die gesamten IF-Schlingen verteilt zu sehen. Maßstab, 0.5 µm.
• Abb. 15: Elektronenmikroskopische Aufnahmen mit normaler Morphologie von Zellverbindungen epithelialer Gewebe um E10.75 in Wildtyp und Plakophilin 2 -defizienten Embryonen. (a und b) In der sich entwickelnden Epidermis von Wt- (a) und Pkp2^-/-- (b) Embryonen waren Desmosomen mit ähnlicher Ultrastruktur sichtbar. Sie waren häufig in der Nähe kleiner Adhärenz-Verbindungen zu finden (z.B. links vom Desmosom in Abbildung b). (c, Wt; d und e Pkp2^-/-). Ähnlich dazu lagen in anderen Epithelien Desmosomen und Adhärenz-Verbindungen nebeneinander, wie z.B. in der Magenschleimhaut. (e) Die vergrößerte Aufnahme zeigt eine normale Plaquedicke und -dichte sowie eine normale Erscheinung der Desmoglea und dem inneren und äußeren Plaque in Plakphilin 2-defizienten Epithelien. Maßstäbe, 0.1 µm (a, b, e), 0.5 µm (c, d).
• Abb. 16: Triton X-100-Extrahierbarkeit der Zellverbindungsproteine in Herzen von Wildtyp und Plakophilin 2^-/--Embryonen um E10.75. Triton X-100-unlösliche und -lösliche Fraktionen embryonaler Herzen wurden mittels SDS-PAGE aufgetrennt, die relativen Mengen spezifischer Proteine wurden durch Immundetektion mit Antikörpern im Western-Blot nachgewiesen. In Pkp2^-/--Herzen war der Großteil von Desmoplakin und auch ein Teil von Plakoglobin nicht mehr in der Triton X-100-unlöslichen Fraktion detektierbar. Desmosomale Cadherine wie Dsg2 und Dsc2a/b waren in Plakophilin 2^-/--Herzen nur in sehr geringen Mengen in der Triton X-100-löslichen Fraktion zu finden, während die Expression und Löslichkeit typischer Proteine aus Adhärenz-Verbindungen, wie N-Cadherin und β-Catenin, unverändert blieben.
• Abb. 17: Semiquantitative RT-PCR von Wildtyp- und Plakophilin 2^-/--embryonalen Herzen E10.75. Spezifische Primer für Desmocollin 2a und 2b sowie Desmoglein 2 und α-Tubulin wurden für die semi-quantitative RT-PCR verwendet. In den Kontrollen wurde für die cDNA-Synthese-Reaktion keine RT-Polymerase zugefügt. Kon-troll-PCRs wurden für jedes Primerpaar für Wt und Pkp2^-/--Herzen durchgeführt, die jeweils erste Kontrollspur entspricht der
• Abb. 18: Genomische Struktur und die Protein-Struktur von Plakophilin 2 mit ARVC assoziierten Mutationen. Das humane Gen für Plakophilin 2 hat 14 Exone, die Nummerierung der Nukleotide beginnt beim ATG und bezieht sich auf die Genbank-Zugriffsnummer X97675. Gestrichelte Linien begrenzen die Bereiche des Proteins, die von entsprechenden Exonen kodiert werden. Die Positionen der 25 gefundenen Mutationen in ARVC-Patienten sind anhand der genomischen Sequenz dargestellt. Mutationen, die zu einem STOP-Kodon führen sind rot, Leserasterverschiebungen grün, Spleißstellenmutationen dunkelblau und Fehlsinn-Mutationen hellblau unterlegt. Die Häufigkeit der Mutationen (insgesamt 32 von 120) ist durch die Y-Achse gekennzeichnet. aa, Aminosäuren. Modifiziert nach¹⁵⁹.
• Abb. 19: Stammbäume der Familien A100 und EPF mit Plakophilin 2 Mutationen und ARVC. ARVC Patienten sind schwarz, von ARVC unbetroffene Personen sind weiss dargestellt. Ein ungeklärter Krankheitsstatus ist mit gestrichelt und ein unbekannter Krankheitsstatus mit grau markiert. (+) bedeutet Vorhandensein oder (-) nicht Vorhandensein der PKP2-Mutation, N/V bedeutet, dass Personen nicht für genetische Analysen verfügbar waren. Schrägstrich bedeutet verstorben; Quadrat, männlich; Kreis, weiblich. Abbildung modifiziert nach¹⁵⁹.
• Abb. 20: Western-Blot einer Herzbiopsie eines ARVC-Patienten mit der Mutation 2076_2077delAA. Die Western-Blot-Analyse stammt von einer Herzbiopsie des rechten Ventrikels eines ARVC-Patienten mit einer Leserasterverschiebungs-Mutation, die zu einem vorzeitigen STOP-Kodon nach 741 Aminosäuren führt. Mit verschieden Antikörpern gegen Plakophilin 2 konnte kein verkürztes Protein von 83 kDa detektiert werden (ein anti-Head-Antikörper richted sich gegen die Aminosäuren 131-148 und sollte somit ein verkürztes Protein erkennen). Das Ergebnis zeigt jedoch eine reduzierte Menge des Wildtyp-PKP2-Proteins im Vergleich zum Kontrollysat einer rechten Herzbiopsie eines Patienten ohne ARVC und ohne Plakophilin 2-Mutation. N-Cadherin und α-Tubulin dienten als Ladekontrollen.
• Abb. 21: Northern-Blot- und Western-Blot-Analyse von adulten Herzen aus Wildtyp- und Plakophilin 2^+/-- Stämmen. (a) Northern-Blot-Analyse von jeweils zwei wildtypischen (+/+) und für Plakophilin 2-heterozygoten (+/-) adulten Herzproben. Eine C-terminale Sonde gegen die mRNA von Plakophilin 2 zeigte reduzierte Signale in heterozygot-mutierten Herzen im Vergleich zu wildtypischen Herzen. Die 28S-rRNA des Ethidiumbromid-gefärbten RNA-Gels diente als Ladekontrolle. (b) Western-Blot-Untersuchungen von Herzproben aus jeweils zwei adulten Wildtyp- und Pkp2^+/--Mäusen zeigten ebenfalls reduzierte Plakophilin 2-Proteinmengen in Pkp2^+/--Herzen im Gegensatz zu wildtypischen Herzen. Immundetektionen von N-Cadherin und α-Tubulin dienten als Ladekontrollen.
• Abb. 22: Schematische Darstellung von Zellverbindungen der Glanzstreifen des Herzens. In den Glanzstreifen des Herzens befinden sich verschiedene Arten von Zellverbindungen; typische Desmosomen (links in beiden Abbildungen), reine Adhärenz-Verbindungen (nicht dargestellt) und intermediäre Zellverbindungen, die morphologisch ähnlich zu Adhärenz-Verbindungen aussehen, aber positiv für Desmoplakin sind (rechts in den Abbildungen dargestellt). Der Verlust von Plakophilin 2 führt zum Ablösen von Desmoplakin und teilweise Plakoglobin aus den Zellverbindungen. Desmoplakin bildet Aggregate im Zytoplasma, die mit dem Intermediär-filament-Zytoskelett assoziiert sind. Die Expression der desmosomalen Cadherine Dsg2 und Dsc2 ist außerdem reduziert. Typische Proteine aus Adhärenz-Verbindungen wie z.B. N-Cadherin und β-Catenin sind unverändert in den Glanzstreifen der Pkp2^-/--Herzen lokalisiert.
• Abb. 23: ARVC in einem histologischen Schnitt. Trichrome-Färbung von histolo-gischen Schnitten durch den rechten Ventrikel eines gesunden (rechts, 3-fach) und an ARVC erkrankten Boxer-Hundes (links , 3-fach und Vergrößerung (10-fach)). Die weißen Regionen zeigen die massive Einlagerung von Fettgewebe zwischen kardialem Muskelgewebe im dilatierten rechten Ventrikel (nicht sichtbar), die Blaufärbung markiert Bindegewebe¹⁷⁷.