Einleitung

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Für die Entstehung und Aufrechterhaltung mehrzelliger Organismen ist die Organisation von Zellen in strukturell und funktionell unterschiedliche Zellverbände sowie deren Stabilität von essentieller Bedeutung. Es ist somit von grundlegender Voraussetzung, dass Zellen fähig sind, zwischen gleichartigen und andersartigen Zelltypen zu unterscheiden und sich in einem Zellverband zu verankern. Bei diesem Zellverankerungsprozess spielen Zelladhäsionsmoleküle eine entscheidende Rolle. Solche Zelladhäsionsmoleküle bilden filament-verankernde Zellverbindungen, welche die mechanische Stabilität eines Zellverbandes beziehungsweise eines Gewebes entscheidend bestimmen.

Die Armadillo-Familie der Adhäsions- und Signalmoleküle

Plakophilin 2 gehört zur Familie der Armadillo-Proteine1. Die Armadillo-Familie der Adhäsionsmoleküle charakterisiert sich durch aneinandergereihte Armadillo (Arm) -Motive, welche eine Länge von ungefähr 42 Aminosäuren aufweisen. Sie wurden erstmals im Drosophila melanogaster-Segmentpolaritätsgen armadillo nachgewiesen. Ähnliche Motive wurden später in dem Säugerhomolog β-Catenin identifiziert2-6. Zur Familie der Armadillo-Proteine gehören neben den Plakophilinen und β-Catenin weitere Proteine wie Plakoglobin und die p120catenine7,8 (Abb. 1). Auch andere Moleküle enthalten Armadillo-Motive, die hier beschriebene Familie zeichnet sich jedoch durch die duale Lokalisierung ihrer Mitglieder aus. Neben ihrer Anwesenheit an der Zellmembran und der damit verbundenen Funktion als adhäsive und stabilisierende Moleküle, wurden diese Armadillo-Proteine auch in ihrer Lokalisierung im Zellkern beschrieben1,9-12. Für einen Großteil dieser Proteine ist die Funktion im Zellkern, beispielsweise als Signalmolekül, weitgehend unklar. Als gut etabliertes Beispiel gilt jedoch β-Catenin, obwohl besonders in letzter Zeit auch viel über die Funktion von Plakoglobin im Zellkern bekannt wurde13-21. β-Catenin hat eine duale Funktion, zum einen als Adhäsionsmolekül an der Zellmembran und zum anderen als Schaltstelle im kanonischen Wnt-Signalweg9,14,22,23. Die adhäsiven und transkriptionellen Funktionen von β-Catenin werden durch dessen Tyrosin-Phosphorylierungsstatus und durch Konformationsänderungen des C-Terminus bestimmt24-28. Auch für Plakoglobin ist eine Konformationsänderung des C-Terminus beschrieben, die eine regulierende Funktion in der Adhäsion und Transkription ausübt16,20,29.

Abb. 1: Die Familie der Armadillo-Proteine sind Adhäsions- und Signalmoleküle. Diese Proteinfamilie besteht aus drei Unterfamilien. Zur Unterfamilie der klassischen Catenine gehören β-Catenin und Plakoglobin. Die Plakophiline 1-3 bilden eine zweite Unterfamilie und besitzen neben neun Arm-Wiederholungen eine konservierte Sequenz im N-Terminus (Head-Domäne). Die p120-verwandten Proteine bilden die dritte Unterfamilie mit p0071, p120catenin und ARVCF, sie haben zusätzlich zu zehn (Arm)adillo-Wiederholungen eine Coiled-coil-Domäne in ihrem N-Terminus.

Desmosomen und Adhärenz-Verbindungen sind zwei Arten verwandter Zellverbindungen

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In der Zelladhäsion sind Armadillo-Proteine an der Bildung von Strukturen beteiligt, welche wichtig für die Stabilität und Integrität von Geweben sind. In Vertebraten sind das zwei Arten verwandter klassischer Zellverbindungen, die Adhärenz-Verbindungen und die Desmosomen (Übersicht30), (Abb. 2). Trotz ihrer engen funktionellen Verwandtschaft ist ihr Aufbau verschieden, sie haben jedoch ein Adhäsionsprotein gemeinsam, das Plakoglobin31. Beide Zellverbindungen sind in der Lage, Zellverbände zu stabilisieren, indem sie durch einen Verankerungs-mechanismus Zellen miteinander vernetzen und deren Zytoskelett verbinden. Das Zytoskelett der Vertebraten besteht aus verschiedenen Strukturen, wie Mikrofilamenten (z.B. Aktinfilamente) und Mikrotubuli. Zusätzlich zu diesen Filamenten kann dieselbe Zelle auch weitere Zytoskelettfilamente enthalten, wie beispielweise Intermediärfilamente (Übersicht32,33).

Abb. 2: Die beiden klassischen Zellverbindungen der Vertebraten. Desmosomen und Adhärenz-Verbindungen haben ein Protein Abb. 1: gemeinsam, das Plakoglobin (blau). (a) Desmosomen bestehen aus transmembranen Glykoproteinen, den desmosomalen Cadherinen, welche in ihrem zytoplasmatischen Teil an Proteine der Arm-Familie binden (Plakoglobin und Plakophiline 1-3 (rot)). Desmoplakin (grau) wiederum interagiert mit den Armadillo-Proteinen und den Intermediärfilamenten. (b) In Adhärenz-Verbindungen binden klassische Cadherine an Plakoglobin und β-Catenin (grün), welche über α-Catenin (orange) das Aktinzytoskelett verankern. PM, Plasmamembran; IZ, intrazellulär.

Der molekulare Aufbau der Desmosomen

Typische Desmosomen (Maculae adhaerens) sind in Epithelzellen, Kardiomyozyten, Meningothelzellen sowie in dendritischen Retikulumzellen der Lymphknotenfollikel zu finden, wo sie entsprechend Bündel von Intermediär-filamenten der Typen Zytokeratin, Desmin und Vimentin verankern34-38. Da sie besonders in mechanisch beanspruchten Geweben, wie dem Herz und der Haut vorhanden sind, wird ihnen eine primär stabilisierende Funktion zuge-schrieben39-50 (Übersicht51-53). Desmosomen zeichnen sich durch das Plaque-Protein Desmoplakin aus54, welches auch in den Complexus adhaerens, einer Zellverbindung in einigen Endothelzellen, identifiziert wurde55-59. In diesen Zellen ist Desmoplakin essentiell für die vaskuläre Entwicklung, wie mit Gendeletionsstudien in der Maus gezeigt werden konnte47.

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Abb. 3: Desmosomale Proteine in den Zellschichten der Haut. Verschiedene desmosomale Cadherine, Armadillo- und Plakin-Proteine sind in der Haut von Säugetieren in einer differenzierungsabhängigen Weise exprimiert. Wenn Keratinozyten der Basalschicht den Zellzyklus verlassen und in die Stachel- und Körnerzellschicht wandern, erhöht sich die absolute Zahl der Desmosomen (nicht im Bild dargestellt), und es ändert sich deren Zusammensetzung. Keratinozyten der Hornschicht, welche aus zellkernlosen Zellen bestehen enthalten sogenannte Corneodesmosomen. DSC, Desmocollin; DSG, Desmoglein; PG, Plakoglobin; PKP, Plakophilin; DP, Desmoplakin, EVPL, Envoplakin; PPL, Periplakin. Abbildung modifiziert nach60.

Die Zusammensetzung eines Desmosoms unterscheidet sich in verschiedenen Zelltypen und ändert sich auch in einzelnen Schichten des mehrschichtigen Epithels, was bisher am besten am Beispiel der Haut beschrieben wurde (Übersicht60), (Abb. 3). Die Grundbausteine eines Desmosoms sind jedoch immer gleich und werden aus Proteinen dreier Familien gebildet (Abb. 4a, 4b). Zu diesen Familien gehören die desmosomalen Cadherine, Desmoglein 1-450,61-63 und Desmocollin 1-364-66, die Armadillo-Familie mit Plakoglobin7,31 und den Plakophilinen1,67-69 sowie die Plakine mit Desmoplakin, Plectin, Envoplakin und Periplakin (Übersicht70). Desmosomen weisen eine scheibenförmige Gestalt auf

Abb. 4a: Schematische Struktur desmosomaler Proteine. Die Hauptbestandteile der Desmosomen sind drei Proteinfamilien, die desmosomalen Cadherine, die Armadillo-Proteinfamilie und die Plakine (siehe Abb. 4b). Desmosomale Cadherine sind Membranmoleküle mit vier extrazellulären Kalziumbindungsstellen. Die vier Mitglieder der Desmoglein-Familie haben hinter der intrazellulären Catenin-Bindungsstelle (ICS) einen verlängerten C-Terminus, welcher weitere Moleküle binden könnte. Alle drei Desmocolline besitzen zwei Spleißvarianten, die `b´ Form besitzt keine Catenin-Bindungsstelle (ICS). IPL, Prolinreiche-Region; RUD, Wiederholungsdomäne; DTD, Desmoglein-Terminaldomäne; EI-EIV, Cadherin-Wiederholungen. Die Armadillo-Familie desmosomaler Proteine besteht aus den Plakophilinen und Plakoglobin. Plakoglobin ist am nächsten verwandt mit β-Catenin, während die Plakophiline näher mit der Unterfamilie der p120catenine verwandt sind. Plakoglobin besitzt dreizehn Arm-Wiederholungen, die Plakophiline haben neun Arm-Wiederholungen zuzüglich einer Head-Domäne (graue Box) in ihrem N-Terminus. Abbildung modifiziert nach71.

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(Durchmesser: 0.1-0.5 µm), im Bereich eines Desmosoms nähern sich die
Plasmamembranen zweier Zellen auf etwa 30 nm an. In ihrer Ultrastruktur bestehen Desmosomen aus der Desmoglea, einer Art Mittellinie sowie einem inneren und äußeren Plaque72 (Abb. 5). Die Desmoglea ist ein zur Plasmamembran extrazellulärer Bereich, der den interzellulären Raum eines Desmosoms darstellt, in welchen die extrazellulären Domänen der Desmogleine und Desmocolline hineinragen und heterophile (Dsg/Dsc) trans- und cis-Dimere bilden (Übersicht60). Für die Interaktion zwischen desmosomalen Cadherinen ist die Bindung von Ca2+ notwendig. In frühen Stadien der Desmosomenbildung ist der Zusammenhalt von Desmosomen daher kalziumabhängig, irgendwann jedoch bilden sich stabile Desmosomen, die ihre Kalziumabhängigkeit verlieren73,74. Im intrazellulären Bereich eines Desmosoms gibt es auf beiden Seiten der Plasmamembranen symmetrische, dichte Plaques, die in innere und äußere Plaques unterschieden werden. Zum äußeren Plaque gehören der C-Terminus der desmosomalen Cadherine, die Armadillo-Proteine Plakoglobin und die Plakophiline 1-3 und der N-Terminus von Desmoplakin. Zum inneren Plaque zählt der C-Terminus von Desmoplakin und dessen Verbindung mit den Intermediärfilamenten (Übersicht53) und (Abb. 5).

Abb. 4b: Schematische Struktur desmosomaler Proteine. Die Hauptbestandteile der Desmosomen bilden drei Proteinfamilien, die desmosomalen Cadherine, die Armadillo-Proteinfamilie (siehe Abb. 4a) und die Plakine. Plakine sind hantelförmige Proteine, die drei Domänen enthalten, eine zentrale ROD-Domäne und globuläre C- und N-terminale Domänen. Die N-terminale Domäne von Desmoplakin besitzt eine Reihe von α-helikalen Bündeln (NN, Z, Y, X, W und Z ), welche mit den Armadillo-Proteinen und Cadherinen interagieren, die C-terminale Domäne von Desmoplakin besitzt sogenannte A-,B-,C-Domänen, die mit den Intermediärfilamenten interagieren. Abbildung modifiziert nach71.

Die desmosomalen Cadherine Desmoglein und Desmocollin weisen 30% Homologie zueinander und mit den klassischen Cadherinen - typisch für Adhärenz-Verbindungen - auf. Sie alle haben die gleiche extrazelluläre Struktur mit vier charakteristischen Kalziumbindungsstellen, auch Cadherin-Wiederholungen genannt61,64,65,75-82. Die vier Mitglieder der Desmoglein-Familie (MW ~160 kDa) haben einen langen intrazellulären C-Terminus, der hinter der Catenin-Bindungsstelle (ICS) durch eine Prolinreiche-Region (IPL), eine Wiederholungsdomäne (RUD) sowie eine Desmoglein-Terminaldomäne (DTD) verlängert wird (Übersicht53,71) (Abb. 4a). Der intrazelluläre Bereich der Desmocolline (MW ~115 kDa) ist kürzer als bei Desmogleinen,

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Abb. 5: Die molekulare Organisation eines Desmosoms. Desmosomale Cadherine binden einander heterophil über ihren N-Terminus. Die Desmoglea ist ein zur Plasmamemban extrazellulärer Bereich, der den interzellulären Raum des Desmosoms darstellt. In diesen Raum ragen die extrazellulären Domänen der Desmogleine und Desmocolline hinein. Zum äußeren Plaque gehören der C-Terminus der desmosomalen Cadherine, die Armadillo-Proteine wie Plakoglobin und die Plakophiline und der N-Terminus von Desmoplakin. Zum inneren Plaque zählt der C-Terminus von Desmoplakin und dessen Verbindung mit den Intermediärfilamenten (schematisch links dargestellt). Eine elektronenmikroskopische Aufnahme eines Desmosoms ist in der Abbildung rechts dargestellt. Maßstab 0.2 µm. Abbildungen modifiziert nach53,71.

außerdem kommen sie in jeweils zwei Spleißvarianten vor78. Desmocollin `b´ hat im Gegensatz zu Desmocollin `a´ keine Catenin-Bindungsstelle und kann somit nicht an Plakoglobin binden83,84 (Abb. 4a). Während Desmoglein 2 und Desmocollin 2a und 2b in allen Zelltypen mit desmosomalen Zellkontakten exprimiert werden, ist die Synthese der anderen Isoformen weitestgehend auf mehrschichtige Epithelien beschränkt63,85,86. Desmoplakin tritt ebenfalls in zwei Isoformen (Desmoplakin I und II) auf, welche durch differentielles Spleißen entstehen87,88. Desmoplakin I (MW 250 kDa) wird in allen Desmosomen-bildenden Geweben exprimiert. Desmoplakin II (MW 215 kDa) zeigt eine eingeschränkte Verbreitung und wird beispielsweise nicht im Herzmuskel synthetisiert54,89,90. Desmoplakin I liegt als Homodimer vor und besteht aus drei Domänen, einer zentralen α-helikal-gedrehten Spindel und globulären Domänen an dessen N- und C-Termini91 (Abb. 4b). Die globulären Domänen des N-Terminus binden an Cadherine und Armadillo-Proteine, während die C-terminalen globulären Domänen mit den Intermediärfilamenten interagieren92-96. Die Bindung von Plakoglobin (MW 83 kDa) an Desmoplakin sowie an desmosomale Cadherine findet über dessen Armadillo-Wiederholung (13 Armadillo-Motive) statt97-99 (Abb. 4a). Plakoglobin ist eine konstitutive Komponente beider Zellverbindungsarten, der Desmosomen und Adhärenz Verbindungen. Die Plakophiline besitzen neun Armadillo-Motive, die von einem langen N-Terminus und einem kurzen C-Terminus begrenzt werden100 (Abb. 4a). Alle Isoformen weisen eine konservierte Head-Domäne in ihrem N-Terminus auf1,10,69. Im Gegensatz zu Plakoglobin wurden die Interaktionen der Plakophiline mit desmosomalen Cadherinen und Desmoplakin ausschließlich über den N-Terminus der Plakophiline beschrieben, wobei die spezifische Funktion der Head-Domäne unbekannt bleibt96,101. Ob und welche Bindungpartner mit den Plakophilinen über die Armadillo-Wiederholungen interagieren, wurde bisher nicht publiziert. Die dreidimensionale Struktur einer Armadillo-Wiederholung (mehrere Armadillo-Motive) ist von der kristallinen Struktur von Plakophilin 1, in der neun Armadillo-Motive eine Superhelix aus mehreren α-Helices bilden, bekannt. Die dabei entstehende zylindrische Struktur bildet eine positiv geladene Furche, an welche, ähnlich zu β-Catenin, saure Reste der Interaktionspartner andocken können100,102.Desmosomen sind zum einen durch ihre kompakte Natur und zum anderen durch ihre Verbindung mit dem Zytoskelett schwer lösliche Strukturen, deren Protein-Protein-Interaktionen daher nur eingeschränkt zu analysieren sind1,48,103,104. Viele Publikationen basieren auf in-vitro-Experimente und deuten darauf hin, dass zusätzlich zur linearen Cadherin-Armadillo-Plakin-Interaktion eine viel komplexere Natur der Protein-Interaktionen stattfindet (Übersicht71). Es kommt zu einer lateralen Verflechtung desmosomaler Komponenten über mehrere Interaktionspunkte und somit zur Bildung einer dreidimensionalen, stabilen Struktur105-107. Ob es jedoch eine Komponente im Desmosom gibt, die für den stabilen Zusammenhalt der desmosomalen Struktur und der Verankerung mit den Intermediärfilamenten im besonderen verantwortlich ist, bleibt weiterhin unklar.

Die Plakophiline sind Bestandteile von Desmosomen

Zur Unterfamilie der Plakophiline gehören drei Mitglieder, die Plakophiline 1-3 (PKP 1-3), welche ausschließlich in Zellverbindungen des desmosomalen Typus vorkommen1,67-69,108-110. Das Armadillo-Protein p0071, auch Plakophilin 4 genannt111,112, hat jedoch eine nähere Verwandtschaft zu einer anderen Armadillo-Unterfamilie, zu der auch p120catenin, ARVCF und Neurojungin gehören, welche vorwiegend in Adhärenz-Verbindungen zu finden sind8,111-118 (Abb. 6). Die Plakophiline 1-3 sind juxtamembrane Bestandteile der desmosomalen Plaques in welchen sie eng mit anderen Armadillo-Proteinen, wie Plakoglobin sowie den desmosomalen Cadherinen und Desmoplakin, assoziiert sind.

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Abb. 6: Dendogramm der Amino-säuresequenz-Homologien zwischen verschiedenen Armadillo-Proteinen. Aminosäuresequenzen der Arm-Proteine mit Adhäsions- und Signaltransduktionsfunktion wurden mit dem „TREE“-Algorithmus der HUSAR – Sequenzananlyse - Software verglichen. Die Verwandtschaft der verschiedenen Proteine ist im Dendogramm dargestellt. Die verwendeten Sequenzen waren humane Sequenzen für β-Catenin (NP_001895), Plakoglobin (NP_002221), p0071 (NP_003619), Neurojungin (NP_001323), p120catenin (AB002382), ARVCF (U51269), PKP1a (NP_001005337), PKP2a (NP_001005242) und PKP3 (NP_009114). Übernommen aus69.

Die drei Plakophilin-Isoformen sind unterschiedlich exprimiert. Plakophilin 1 ist suprabasal, hauptsächlich in Desmosomen der Stachel- und Körnerzellschicht, aber auch schwach in der Basalzellschicht der mehrschichtigen Epidermis sowie in anderen mehrschichtigen und komplexen Epithelien exprimiert10,68. Plakophilin 2 ist das am weitesten verbreitete Plakophilin. Es ist in Desmosomen aller proliferierenden Epithelien, vorwiegend in der Basalschicht, aber auch in Desmosomen von Tumoren, Kardiomyozyten und Purkinje-Zellen des Herzens sowie in Lymphknotenfollikeln und der Leber zu finden1 ,69 ,119,120. Plakophilin 3 zeigt mit der Anwesenheit in den meisten ein- und mehrschichtigen Epithelien ein intermediäres Expressionsmuster. In Desmosomen der Epidermis ist es in allen Schichten gleich stark vertreten69 (für Expressionsmuster siehe auch Tabelle 1).

Die mRNAs von Plakophilin 1 und Plakophilin 2, nicht jedoch von Plakophilin 3, kommen in zwei Spleißformen vor1,10. Bei Plakophilin 2 unterscheiden sich beide Transkripte durch eine Exoninsertion von 132 bp (44 Aminosäuren) zwischen dem zweiten und dritten Armadillo-Motiv (Abb. 18). Die kürzere, humane Plakophilin 2-Variante (Plakophilin 2a) besteht aus 837 Aminosäuren und hat ein Molekulargewicht von 92 kDa, die längere Form (Plakophilin 2b) hat mit 881 Aminosäuren ein Molekulargewicht von 97 kDa1. Die intrazelluläre Lokalisierung und zelltypspezifische Verteilung von Plakophilin 2b entspricht der kürzeren Spleißvariante Plakophilin 2a, obwohl es gegenüber Plakophilin 2a deutlich schwächer exprimiert wird.

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Wie schon beschrieben, wurden die Plakophiline 1-3 neben ihrer Lokalisierung an der Membran ebenfalls im Zellkern detektiert. Für Plakophilin 1 wurde gezeigt, dass die Spleißform 1a im Zellkern sowie an der Membran lokalisiert, während Plakophilin 1b nur im Zellkern gefunden wurde10. Plakophilin 2a und 2b wurden jedoch beide in Desmosomen und im Zellkern nachgewiesen1. Im Gegensatz zu PKP1 und PKP2, welche auch im Zellkern einiger Zelltypen detektiert wurden, die keine Desmosomen bilden, wie beispielsweise in Fibroblasten, wurde PKP3 nur im Zellkern von Zelltypen detektiert, die Desmosomen besitzen1,69,109. Plakophilin 2 ist zudem in Assoziation mit dem RNA-Polymerase III-Komplex beschrieben worden sowie als Substrat der Tyrosinkinase Tak-1121,122. Die Rolle der Plakophiline in der Signaltransduktion bleibt jedoch weiterhin offen.

Das Zusammenspiel von Desmosomen und Adhärenz-Verbindungen

Desmosomen und Adhärenz-Verbindungen sind funktionell verwandt. In Adhärenz-Verbindungen stellen β-Catenin aber auch Plakoglobin die Verbindung zwischen den klassischen Cadherinen (z.B. N-Cadherin, E-Cadherin) und α-Catenin dar, so dass die Interaktion mit dem Aktinzytoskelett ermöglicht wird123-128 (Abb. 2). Die auf 20 nm angenäherten Plasmamembranen sind im Bereich der Adhärenz-Verbindungen über einen 10-30 nm dicken, submembranen Plaque mit dem Aktinfilamentsystem verbunden (Übersicht128,129). Adhärenz-Verbindungen bilden morphologisch unterschiedliche Formen wie gürtelförmig um die Zelle verlaufende Zonulae adhaerens, streifenförmige Fasciae adhaerens und punktförmige Puncta adhaerens 130. Sie sind in allen Epithelgeweben sowie Gefäßendothelien und, im Unterschied zu Desmosomen, auch in Zellen mesodermalen Ursprungs, wie der Muskulatur aber auch im Nervengewebe zu finden55,56.

Adhärenz-Verbindungen sind jedoch evolutionär älter als Desmosomen und werden in der Regel auch früher in der Entwicklung eines Organismus bzw. Organs detektiert131-134. Zum Beispiel greifen in der frühen Keratinozyten-Adhäsion Filopodien benachbarter Zellen, getrieben durch Aktinpolymerisierung, ineinander und bilden eine Reihe von Puncta adhaerens („Adhärenz-Reißverschluss“, bestehend aus punktförmigen Adhärenz-Verbindungen)135. Desmosomen stabilisieren die Adhäsion, indem sie sich zusätzlich zwischen den Filopodien bilden135. Weitere Zellkulturexperimente weisen ebenfalls auf ein Zusammenspiel von Desmosomen und Adhärenz-Verbindungen hin. Die Verwendung von E-Cadherin-Antikörpern oder dominant-negativem N-Cadherin führt zum Verlust von Adhärenz-Verbindungen und inhibiert zusätzlich die Bildung von Desmosomen. Epithelzellen, die alle desmosomalen Komponenten exprimieren, aber keine E-Cadherin-Plakoglobin-Komplexe bilden können, weisen auch keine Desmosomen auf62,136,137. Auch die gewebsspezifische Desmoplakindeletion in der Epidermis der Maus zeigt, dass Desmosomen und Adhärenz-Verbindungen voneinander abhängen. Der Verlust von Desmoplakin führt nicht nur zur Bildung von Desmosomen, die keine Assoziation mehr mit dem Zytoskelett aufweisen, sondern auch zu einer reduzierten Anzahl von Adhärenz-Verbindungen in der Basalschicht der Epidermis48. In verschiedenen Transfektionsstudien mit stabilen Zellinien konnten auch „intermediäre“ Zellverbindungen detektiert werden, in denen zum Beispiel Desmoplakin unter Anwesenheit der desmosomalen Proteine Plakophilin 2 und Desmoglein 2 an Adhärenz-Verbindungen lokalisiert138.

In den Glanzstreifen des Herzens existieren verschiedene Arten von Zellverbindungen

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Auch in einigen Geweben kommen Arten intermediärer Zellverbindungen vor (Abb. 7), in denen Proteine aus beiden Strukturen koexistieren, zum Beispiel in den Glanzstreifen des Herzens139. Kardiomyozyten werden über Glanzstreifen, dies sind besonders feste Verzahnungen zwischen den Zellen, miteinander verbunden (Abb. 8). Innerhalb dieser Glanzstreifen befinden sich neben Gap Junctions, die wichtig für die Erregungsleitung sind, auch die adhäsiven Zellverbindungen, wie Adhärenz-Verbindungen und Desmosomen und solche intermediärer Natur139. Inzwischen werden die gesamten adhäsiven Zellverbindungen des Herzens auch häufig als Area composita bezeichnet139. In den Glanzstreifen der Kardiomyozyten sind die für Adhärenz-Verbindungen typischen Zelladhäsionsmoleküle wie N-Cadherin, β-Catenin, p120catenin und α-Catenin exprimiert sowie die Desmosom-typischen Moleküle Desmoglein 2, Desmocollin 2a und 2b, Plakophilin 2,

Abb. 7: Intermediäre Zellver-bindung. In intermediären Zell-verbindungen existieren Proteine aus Desmosomen und Adhärenz-Verbindungen. In der Area composita der Glanzstreifen des Herzens kolokalisieren z.B. β-Catenin, Desmoplakin und N-Cadherin. Auch in Zellverbin-dungen der Kapillaren (Complexus adherens) bilden VE-Cadherin, Plakoglobin und Desmoplakin eine Zellverbindung.

Plakoglobin und Desmoplakin I (1,63,86,119 und siehe oben). Adhärenz-ähnliche Verbindungen verankern das Aktin/Myosin-Zytoskelett. Auf diese Weise werden Myofibrillen, die entscheidend für die Muskelkontraktion sind, fest an der Zellmembran verankert. Die Zelladhäsion wird zusätzlich durch die Verankerung der Intermediärfilamente in Desmosom-ähnlichen Verbindungen verstärkt. Auch in Zellverbindungen der Kapillaren, nicht jedoch größerer Blutgefäße, gibt es intermediäre Zellverbindungen, in denen VE-Cadherin mit den Proteinen Plakoglobin und Desmoplakin koexistiert (Complexus adherens)55,56,140.

Zellverbindungen spielen eine Rolle in der frühen Embryonalentwicklung

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Deletionen und Mutationen desmosomaler Proteine in der Maus zeigen wie wichtig Zellverbindungen während der gesamten Embryonalentwicklung sowie im adulten Organismus für die Stabilität von Geweben sind. In der frühen murinen Blastozyste (E3.5) entstehen Desmosomen in polarisierten Trophoektodermzellen im 32-Zellstadium131,132. Ihre Bildung ist eng mit der Blastozoelbildung und der damit verbundenen Expansion des Eizylinders verknüpft, in dem sie eine stabilisierende Rolle spielen. Zu diesem Zeitpunkt haften nur Zytokeratinfilamente an den Desmosomen an131,132. Wie wichtig Desmosomen in der frühen

Abb. 8: Elektronenmikroskopische Aufnahme eines Herzmuskelschnittes. Die Glanzstreifen (schwarze Pfeile) des Herzens sind reich an Adhärenz-Verbindungen und Desmosomen. Myofibrillen sind über Adhärenz-ähnliche Verbindungen in den Glanzstreifen des Herzens verankert und wichtig für die Muskelkontraktion. Intermediärfilamente binden an Desmosomen und sind wichtig für die Stabilität des Herzmuskels.

Embryonalentwicklung sind, zeigt der Verlust von Desmoplakin und Dsg2 in der Maus, welcher bereits zu embryonaler Letalität im Blastozystenstadium führt141,142. Bis zu zwei Tagen nach dem Beginn der Gastrulation (E6.0) ist Zytokeratin das einzige Intermediärfilament in embryonalen Epithelien, erst danach setzt im Mesoderm die Expression von Vimentin-Filamenten ein. In diesen mesodermalen Zellen sind Vimentin-Filamente jedoch spärlich gepackt, im Gegensatz zu den dicht gepackten Zytokeratin-Bündeln des embryonalen Ektoderms und viszeralen Endoderms. Die mesodermalen Zellen besitzen daher keine Desmosomen jedoch Adhärenz-Verbindungen131,132.

Desmosomale Proteine in der späteren Embryonalentwicklung und bei Krankheiten

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In der späteren Embryonalentwicklung scheinen desmosomale Proteine im Herz aber auch der Haut von besonderer Bedeutung zu sein. Identifizierte Mutationen beim Menschen sowie generierte Mutationen in der Maus führen häufig zu Phänotypen, bei welchen die Funktion dieser beiden Organe negativ beeinträchtigt ist (siehe Tabelle 1). In den Autoimmunkrankheiten Pemphigus vulgaris (Epidermis und Schleimhaut betreffend) und Pemphigus foliaceus (ausschließlich Epidermis betreffend) richten sich körpereigene Antikörper gegen die extrazellulären Domänen von Desmoglein 3 und 4 beziehungsweise Desmoglein 1 50,62,143,144. Pemphigus vulgaris-Patienten leiden an Läsionen der Schleimhäute und Haut, die ohne Kortikosteroid-Therapie tödliche Folgen haben. Für Desmoglein 1 sind außerdem beim Mensch heterozygote N-terminale Deletionen (G∨A Transition in der 3´ Spleißakzeptorstelle von Intron 2) beschrieben, die zu Hautverhornung (Keratoderma) führen43. Deletionen desmosomaler Cadherine in der Maus ähneln den Phänotypen menschlicher Krankheiten, sie führen zu Lesionen in Schleimhäuten (Dsg3)39,145,146 bzw. epidermaler Fragilität und Läsionen einhergehend mit Hyperproliferation und Haarverlust (Dsg4, Dsc1)46,50 (siehe Tabelle 1). Plakophilin 1-Mutationen beim Menschen resultieren in Hautfragilität und ein Ektodermales-Dysplasie-Syndrom, was mit der Expression von Plakophilin 1 in bestimmten mehrschichtigen Epithelien und dessen Funktion in der Adhäsion der Keratinozyten konsistent ist10,42,68,147-149. Im beschriebenen Fall (McGrath et al.) trägt der betroffene Patient Mutationen (910C∨T, 1132ins28), die zu verfrühten STOP-Kodons und einem kompletten Verlust der Plakophilin 1-Expression in der Haut führen42. Eine Triade von Phänotypen aus Arrhythmogener-Rechts-Ventrikulärer-Kardiomyopathie (ARVC), krausem Haar und Keratoderma wurde bei Patienten beschrieben, die an Mutationen in Desmoplakin leiden. Die C-terminalen, homozygoten Mutationen (7901delG, 7402G∨C) führen zu einem stabilen, trunkierten Desmoplakin-Protein45,49. Es sind außerdem Mutationen im Gen für Desmoplakin beschrieben, die nur zu einigen der oben genannten Krankheitsbilder führen. Eine heterozygote Mutation (1176C∨G; S299R), in der es zu einem Aminosäurerestaustausch kommt, bedingt ausschließlich dominant vererbte ARVC150, während eine weitere Mutation (1323C∨T; Q331X) zu einem Nullallel und Haploinsuffizienz führend, Keratoderma auslöst151,152. Mäuse, die eine Nullmutation für Desmoplakin besitzen, sind aufgrund von Adhäsionsdefekten in extraembryonalen Geweben und Fehlern in der Expansion/Proliferation des Eizylinders embryonal letal um E6.5141.

Tabelle 1: Expression und Phänotypen desmosomaler Proteine

Protein

Expression

Phänotyp der Maus-Deletionen

Phänotyp der humanen Mutation

Literatur

DSC1

- ubiquitär in epithelialen Geweben

- obere Epidermisschichten
(Stachel- und Körnerzellschicht)

- epidermale Fragilität

- Hyperproliferation

- Haarverlust

unbekannt

46,153,154

DSC2

- ubiquitär in desmosomalen
Geweben (z.B. Zunge, Ösophagus
Herz, Lymphknoten)

- untere Epidermisschichten
(hauptsächlich Basalschicht)

unbekannt

unbekannt

154

DSC3

- in mehrschichtigen Epithelien
(e.g. Epidermis, Trachee)

- untere Epidermisschichten (Basal-
und Stachelzellschicht)

unbekannt

unbekannt

153,154

DSG1

- obereEpidermisschichten

(hauptsächlich Stachel- und
Körnerzellenschicht)

unbekannt

- Keratoderma

43,153,155

DSG2

- ubiquitär in desmosomalen
Geweben (z.B. Herz)

- untere Epidermisschichten
(hauptsächlich Basalschicht)

- sehr früh embryonal letal

(Blastozyste)

unbekannt

63,142

DSG3

- untere Epidermisschichten (Basal-
und Stachelzellschicht)

- Schleimhäute

- epidermale Fragilität

- Lesionen in
Schleimhäuten
(Schnauze und Augen)

- Haarverlust

unbekannt

39,63,144-146,153

DSG4

- obere Epidermisschichten

- Haarfollikel

- epidermale Fragilität

- Hyperproliferation

- Haarverlust

- abnormale Haar-
follikel

- Haarverlust

50

PKP1

- mehrschichtige Epithelien

- obere Epidermisschichten
(hauptsächlich Stachel- und
Körnerzellenschicht)

unbekannt

- epidermale Fragilität
(Ektodermale
Dysplasie)

10,42,68

PKP2

- ubiquitär in desmosomalen
Geweben (z.B. Herz)

- alle Epithelien

- untere Epidermisschichten
(hauptsächlich Basalschicht)

unbekannt

unbekannt

1,120

PKP3

- in vielen einschichtigen und
mehrschichten Epithelien

- untere und obere
Epidermisschichten gleich

unbekannt

unbekannt

69,109

PG

- ubiquitär in desmosomalen
Geweben (z.B. Herz)

- in allen Epithelien

- in allen Epidermisschichten

- Endothelzellen

- embryonal letal (E12)

- Risse in Herzwänden

- epidermale Fragilität

- Keratoderma

- krauses Haar

- ARVC

40,41,44,153

DP

- ubiquitär in desmosomalen
Geweben (z.B. Herz)

- in allen Epithelien, in allen

Epidermisschichten

- Endothelzellen

Tetraploide Fusion:

- embryonal letal (E10)

- Adhäsionsdefekte in
Herzmuskel, Neuroepithel
und Haut

- Keratoderma

- krauses Haar

- ARVC

45,47-49,141,151-153

Es wurde gezeigt, dass Desmoplakin nicht nur für die Anhaftung der Keratinfilamente notwendig ist, sondern auch für die Bildung und Stabilität von Desmosomen in extraembryonalen Geweben während der frühen Embryonalentwicklung. Zur Umgehung eines extraembryonalen Phänotyps wird von der sogenannten tetraploiden-Fusion Gebrauch gemacht. In diesem Verfahren werden diploide Zellen mit entsprechender Nullmutation mit tetraploiden wildtypischen Zellen aggregiert. Während das embryonale Gewebe der Chimären ausschließlich aus diploiden Zellen entsteht, tragen die tetraploiden Wt-Zellen zum extraembryonalen Gewebe bei. Eine solche Desmoplakin-Nullmutation führt zu den typischen späteren Adhäsionsphänotypen (E10) in Desmosomen-enthaltenden Geweben, wie Myokard, Neuroepithel und Epidermis, aber auch der Mikrovaskulatur, welche spezielle Zellverbindungen mit Desmoplakin enthält47,48. Protonotarios et al. beschrieben (1986) die Naxos-Krankheit, ein beeindruckend ähnliches Syndrom aus ARVC, Keratoderma und krausem Haar, vorkommend in einer Population auf der griechischen Insel Naxos156. Die Krankheit wurde später auf eine C-terminale autosomal rezessiv vererbte Mutation (2157_2158delTG) im Gen für Plakoglobin zurückgeführt, die zur Expression eines trunkierten Proteins führt44. Dieser komplexe Phänotyp involviert möglicherweise Adhäsions- und Signaltransduktionsdefekte, da bei der Mutation der C-Terminus betroffen ist, welcher ähnlich wie bei β-Catenin eine regulatorische Funktion ausübt.In Mäusen führt der vollständige Verlust der Plakoglobinexpression zu Fehlfunktionen in der Zelladhäsion von Myokard und Epidermis40,41.Der Hautphänotyp zeichnet sich durch reduzierte Desmosomenzahl aus, was sich im Ablösen der oberen Epidermisschichten äußert40. Auffällige Analogien existieren zwischen Phänotypen des Menschen und der Maus. Bisher wurden weder Gendeletionen für Plakophilin 2 in der Maus, noch Mutationen im Gen für Plakophilin 2 beim Menschen beschrieben.

Ziel dieser Arbeit

↓11

Um eine Funktion für individuelle Mitglieder der Armadillo-Familie zu definieren, macht unsere Arbeitsgruppe von genetischen Mausmodellen Gebrauch. Das Ziel meiner Arbeit war die Analyse der Plakophilin 2-defizienten Maus. Bisher gab es keine Erkenntnisse zur Funktion von Plakophilinen in vivo. Da Plakophilin 2 im Gegensatz zu seinen Familienmitgliedern Plakophilin 1 und 3 auch außerhalb von Epithelien ein breites Expressionsmuster aufweist, war dessen Funktion für uns besonders interessant. Mit Hilfe histologischer, immunologischer, elektronenmikroskopischer und biochemischer Analysen habe ich die Funktion von Plakophilin 2 während der Embryonalentwicklung aufgedeckt. Dabei war es von zentralem Interesse, die besondere Rolle und Aufgabe von Plakophilin 2 in der Zelladhäsion zu beschreiben. Interessanterweise konnten durch unser Mausmodell auch Erkenntnisse zu einer menschlichen Krankheit -ARVC- gewonnen werden.


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06.02.2006