Ergebnisse

Erzeugung Plakophilin 2-defizienter Mäuse

↓11

Zur Deletion des Plakophilin 2-Gens wurde die Technik der homologen Rekombination in embryonalen Stammzellen der Maus (ES-Zellen) angewandt157. Auf der Grundlage der genomischen Sequenz des Plakophilin 2-Gens (Chromosom 16) wurde ein Rekombinationsvektor generiert. Dieser Rekombinationsvektor enthielt den Bereich über das erste und zweite Exon des Plakophilin 2-Gens. Der Rekombinationsvektor wurde so konstruiert, dass ein 7.8 Kb genomisches Fragment, welches von der NotI Schnittstelle in Exon 1 bis zur BamHI Schnittstelle in Intron 1 reichte, durch exogene Sequenzen ersetzt wurde. Die exogene Sequenz bestand aus einem Neomycin-Resistenzmarkergen (neo), welches in entgegengesetzter Leserichtung zum Plakophilin 2-Gen eingefügt wurde (Abb. 9a). Es wurde eine Nullmutation im Plakophilin 2-Gen generiert, da das Vorhandensein der Neomycin-Kassette ein Spleißereignis zwischen Exon 1 und Exon 2 verhindert und es nach 43 Aminosäuren zu einem verfrühten STOP der Plakophilin 2-Translation kommt. Homolog rekombinierte ES-Zellklone mit heterozygoter Plakophilin 2-Mutation wurden in Blastozysten injiziert und in den Uterus scheinschwangerer Ammenmäuse überführt. Verpaarungen von chimären Nachkommen mit C57Bl/6 Tieren ergaben in der F1-Generation heterozygot-mutierte Plakophilin-Mäuse. Mittels Southern-Blot-Analysen und PCR wurden sämtliche Nachkommen auf ihren Genotyp untersucht. Somit konnten Wildtypen von heterozygoten und homozygoten Tieren unterschieden werden (Abb. 9b, c). Für Southern-Blot-Analysen wurde genomische DNA mit XbaI oder HindIII verdaut. Eine genomische Plakophilin 2-DNA-Sonde (ext) erkannte im mutierten Plakophilin 2-Allel ein neues Fragment von 10 Kb, während das entsprechende Wildtyp-Fragment des XbaI-Verdaus eine Länge von 16 Kb aufwies. Die Neomycin (neo) -Sonde erfasste in einem HindIII-Verdau ein neues Fragment von 4.5 Kb im mutierten Allel (Abb. 9b).

Verpaarungen zwischen heterozygoten Tieren ergab keine lebenden Plakophilin 2-defizienten Nachkommen, was vermuten ließ, dass homozygote Pkp2-Embryonen während der Embryonalentwicklung sterben. Um den Zeitpunkt des Todes festzustellen, wurden Embryonen aus verschiedenen Entwicklungsstadien

↓12

Abb. 9 a-e: Strategie der Plakophilin 2-Deletion in der Maus. (a) Schematische Darstellung des Plakophilin 2-Rekombinationsvektors und des wildtypischen sowie mutierten Pkp2-Lokus. Exonsequenzen sind mit grauen Boxen dargestellt, die neo-Kassette wurde in entgegengesetzte Leserichtung an Kodon 43 des ersten Exons eingefügt. Die Sonden für die Southern-Hybridisierung sind mit schwarzen horizontalen Boxen gekennzeichnet (ext, neo). Die Größen der erwarteten Restriktionsfragmente durch den XbaI- und HindIII-Verdau sind angegeben. (b) Southern-Blot des PKP 2-Lokus der E10.75 Wt (+/+), Plakophilin 2-heterozygoten (+/-) und -homozygoten (-/-) Embryonen mit beiden Sonden (ext) und (neo). (c) PCR des Plakophilin 2-Lokus von Wt (+/+), Plakophilin 2-heterozygoten (+/-) und -homozygoten (-/-) Embryonen. (d) Western-Blot der Plakophilin 2-Expression in wildtypischen, heterozygot- und homozygot-mutierten Embryonen (E10.75). Erk diente als Ladekontrolle. (e) Northern-Blot der Plakophilin 2-Expression in wildtypischen, heterozygot- und homozygot-mutierten Embryonen E10.75. Die 28S-rRNA diente als Ladekontrolle.

genotypisiert und inspiziert. Bis Tag 10.75 der Embryogenese wurde die nach Mendelschen Regeln erwartete Anzahl homozygoter Mutanten beobachtet (Tabelle 2). Jedoch wiesen die Mutanten starke Blutungen in die Perikardial- und Peritonealhöhle auf. Ab E11.5 sank die Zahl der lebensfähigen Pkp2-/--Embryonen, was durch fehlenden Herzschlag beurteilt werden konnte. Um die Anwesenheit

Tabelle 2: Lebensfähigkeit der Embryonen aus Pkp2-heterozygoten Verpaarungen

Alter

+/+

+/ -

-/-

E9.75

32% (15)

40% (19)

28% (13)

E10.75

26% (25)

48% (46)

26% (25)

E11.5

29% (21)

49% (35)

22% (16)

   

7%* (5)

E13.75

30% (4)

69% (9)

0%

 

* kennzeichnet die Anzahl der toten homozygot-mutierten Embryonen, die Anzahl der getesteten Embryonen steht in Klammern

↓13

von PKP2 auf Proteinebene zu verifizieren, wurden Western-Blot-Analysen durchgeführt. Dazu wurden Embryonen (E10.75) lysiert und mit einem gegen den C-Terminus von Plakophilin 2 gerichteten Antikörper auf das Vorhandensein von Plakophilin 2 oder verkürzten Plakophilin 2-Formen untersucht. Die Ergebnisse zeigten die Abwesenheit von Plakophilin 2 oder verkürzten Proteinen in homozygoten Embryonen. In heterozygoten Embryonen wurde gegenüber wildtypischen Embryonen eine Reduktion des Plakophilin 2-Proteins deutlich (Abb. 9d). In Northern-Blot-Analysen detektierte eine C-terminale Sonde in Plakophilin 2-defizienten Embryonen (E10.75) keine Plakophilin 2-mRNA. Heterozygote Pkp2-Embryonen zeigten, wie erwartet, eine reduzierte Menge an Plakophilin 2-mRNA im Vergleich zum Wildtyp (Abb. 9e).

Herzdefekte in Plakophilin 2-/--Embryonen

Zur Bestimmung der Lokalisierung von Plakophilin 2 in wildtypischen Embryonen wurden Immunfluoreszenzfärbungen durchgeführt. Plakophilin 2 ist in wildtypischen Embryonen um E10.75 markant in den Kardiomyozyten der Atrien und im Ventrikel des Herzens exprimiert, während homozygote Embryonen kein Plakophilin 2 exprimieren. Um E13.75 ist Plakophilin 2 intensiv in wildtypischen Kardiomyozyten sichtbar, jedoch schwächer im umgebenden Epikard (Abb. 9 f, g).

Abb. 9 f, g: Immunfluoreszenz von Plakophilin 2 an Wt-Herzen, (f) E10.75 und (g) E13.75. Der Antikörper (grüne Fluoreszenz) ist gegen den C-Terminus von Pkp2 gerichtet. Die Zellkerne wurden mit DAPI gefärbt (blau). Die gestrichelte Linie markiert die Grenze zwischen Myokard und Epikard. At, Atrium; V, Ventrikel; Maßstab, 200 µm.

↓14

Um die Ursache der embryonalen Letalität festzustellen, wurden Embryonen von E9.5 und späteren Entwicklungsstadien gründlich untersucht. Im Gesamtbild waren homozygote Embryonen um E10.75 normal entwickelt, jedoch blass im Kopfbereich sowie in der dorsalen Rumpfregion. Ihr Blut war nicht wie bei wildtypischen Embryonen homogen verteilt, sondern sammelte sich in Herzbeutel und Bauchhöhle an, was durch eine deutliche Rotfärbung sichtbar wurde (Abb. 10a, b; 11). Zusätzlich befand sich kein Blut in den Blutgefäßen des Dottersacks von Pkp2-/--Embryonen (Abb. 10c-f). Histologische Färbungen des Dottersacks und die PECAM-Immunantikörperfärbung zeigten jedoch, dass die Vaskulatur der Dottersäcke normal entwickelt und ausgebildet war (Abb. 10g, h). In homozygoten Embryonen war, wie in wiltypischen Embryonen, ein Blutgefäßnetzwerk mit Makro- und Mikrogefäßen vorhanden. Eine essentielle Rolle von Plakophilin 2 in der Angiogenese konnte damit ausgeschlossen werden. Das Erscheinungsbild der Embryonen sowie die Lokalisierung von Plakophilin 2 im Herz ließen

Abb. 10a-h: Phänotypen der Wt- und Plakophilin 2-/--Embryonen E10.75. (a und b) Äußeres Erscheinungsbild von wildtypischen und homozygot-mutierten Embryonen mit Blutansammlung in der Perikardial- und Peritonealhöhle im homozygot-mutierten Embryo. (c-f) Makro- und Mikro-Vaskulatur des Dottersacks. Blutgefäße der wildtypischen, embryonalen Dottersäcke enthielten rote Blutkörperchen, während die Blutgefäße der homozygot-mutierten Pkp2-Dottersäcke keine Blutkörperchen enthielten. (c, d) Fotos von gesamten, frisch präparierten Dottersäcken, (e, f) Hämatoxylin/Eosin-gefärbte Schnitte von Dottersäcken. (g, h) Normal entwickelte Makro- und Mikro-Vaskulatur in einer PECAM-Färbung der Endothelzellen von Wt- und Pkp2-/--Dottersäcken. (a, c, e, g) Wildtyp, (b, d, f, h) Pkp2-/-.1000 µm (a, b, c, d, g und h), 100 µm (e und f).

Abb. 11: Hämatoxylin/Eosin gefärbte Paraffinschnitte durch das Peritoneum von E10.75 Embryonen. Der Pfeil zeigt die Akkumulation von Blutzellen in der Bauchhöhle der Plakophilin 2-/--Embryonen im Gegensatz zu Wildtyp-Embryonen. (links) Wildtyp, (rechts) Pkp2-/-.

↓15

eine Rolle von PKP2 in der kardialen Entwicklung und Stabilität vermuten. Daher konzentrierten sich weitere Untersuchungen besonders auf die Analyse des Herzens. Transversale Eponschnitte durch das sich bildende embryonale Herz von Pkp2-/--Embryonen (E10.75) zeigten eine dünnere Trabekelschicht im zukünftigen linken und rechten Ventrikel des Herzens sowie dünnere Wände der Atrien im Vergleich zum Wildtyp158 (Abb. 10i-l). In einigen Regionen der Atriumwände waren nur zwei Zellschichten im Gegensatz zu drei bis vier Zellschichten in Atriumwänden der Wildtypembryonen sichtbar. In der Proliferation und Apoptose der Kardiomyozyten wurden keine Unterschiede festgestellt, wie mit anti-Phospho-Histon-3-Färbung und TUNEL-Analysen untersucht werden konnte (Daten nicht gezeigt). Ein massiver Riss in der Herzwand, welcher zuvor in Plakoglobin-defizienten Embyonen beschrieben wurde, konnte in Pkp2-/--Embryonen nicht beobachtet werden. Es wurden jedoch feine potentielle Löcher in der Herzwand von Plakophilin 2-defizienten Embryonen detektiert, was vermuten ließ, dass der Blutfluss in das Perikard durch diese feinen Öffnungen in der Herzwand zustande kam. Ein solches potentielles Loch ist mit einer Pfeilspitze in Abb. 10 l versehen.

Es wurden auch Embryonen früherer und späterer Stadien untersucht. Homozygote Embryonen früherer Stadien (E9.5-10) waren normal entwickelt und wiesen keinen Blutfluss in den Herzbeutel oder in die Bauchhöhle auf. Ältere Embryonen um E11.5-12 zeichneten sich zusätzlich zum unkontrollierten Blutfluss durch ein geschwollens Perikard und Peritoneum aus, bevor sie nekrotisch wurden (Daten nicht gezeigt).

Abb. 10i-l: Phänotypen der Wt- (i, k) und Plakophilin 2-/-- (j, l) Embryonen E10.75. Lichtmikroskopie von Toluidinblau-gefärbten transversen Schnitten des embryonalen Herzens. Man beachte die verringerte Wanddicke der Atrien und die reduzierte Trabekelschicht des Ventrikels (Klammern) sowie die Blutakkumulation in der Perikardhöhle in Pkp2-/--Embryonen (Pfeil). ra und la, rechtes und linkes Atrium; bc und cv, bulbus cordis (zukünftiger rechter Ventrikel) und common ventricle (zukünftiger linker Ventrikel). (k, l) Vergrößerte Aufnahme der Atrienwände in wildtypischen und Pkp2-/--mutierten Herzen. (l) Dünnere Atriumwände in mutierten Pkp2-/--Embryonen, die Position eines kleinen Loches in Pkp2-/--Herzen ist gekennzeichnet (Pfeilspitze). ed, Endokardiale Zellen; ep, Epikardiale Zellen; cm, Kardiomyocyten; rb, rote Blutzellen. Maßstäbe: 300 µm (i und j), 50 µm (k und l).

Veränderungen in der Zusammensetzung und Architektur der Zellverbindungen in den Glanzstreifen der Plakophilin 2 -/- -Embryonen

↓16

Desmoplakin ist Hauptbestandteil und eine funktionell essentielle Komponente der Zellverbindungen des Herzens, welche Kardiomyozyten verbinden. Mit Hilfe von Immunfluoreszenzfärbungen und konfokaler Laserscanmikroskopie können die Bestandteile der Zellverbindungen von wildtypischen- und Plakophilin 2-/--embryonalen Herzen markiert werden. Somit konnte die Lokalisierung von Zelladhäsionsproteinen und deren Kolokalisierung mit anderen Proteinen der Zellverbindungen untersucht werden (Abb. 12A, B).In Herzen der Wildtypembryonen (E10.75) kolokalisierte Desmoplakin (DP, grüne Fluoreszenz) mit Zelladhäsionsmolekülen und den Armadillo-Proteinen Plakoglobin, β-Catenin und Plakophilin 2 sowie dem klassischen N-Cadherin und den desmosomalen Cadherinen Dsg 2 und Dsc 2 (rote Fluoreszenz), was durch übereinandergelagerte gelbe Fluoreszenz deutlich wurde (Abb. 12A).

Abb. 12 A: Starke Unterschiede in der Komposition der Zellverbindungen der Glanzstreifen embryonaler E10.75 Pkp2-/--Herzen. Konfokale Immunfluoreszenzmikroskopie von Kryostatschnitten kardialen Gewebes auf Wildtyp (Abb. 12 A) und Plakophilin 2-/--Embryonen des Tages E10.75 (Abb. 12 B). Spezifische Antikörperkombinationen wurden angewandt: Kaninchen Antikörper gegen Desmoplakin (DP, markiert durch grüne Fluoreszenz) und murine monoklonale Antikörper gegen verschiedene andere Proteine kardialer Zellverbindungen (rote Fluoreszenz): (a and a´) Plakoglobin (PG); (b and b´) N-Cadherin (N-Cad); (c and c´) β-Catenin (β-Cat); (d and d´) Plakophilin 2 (PKP2); (e and e) Desmoglein 2 (Dsg2). Die überlagerten Fluoreszenzbilder sind in der rechten Kolumne dargestellt. (A) In Wildtyp-Embryonen zeigen die Zellverbindungen der Glanzstreifen eine weitreichende Kolokalisierung (gelb) von Desmoplakin mit (a) Plakoglobin, (b) N-Cadherin, (c) β-Catenin, (d) Plakophilin 2, und (e) Desmoglein 2. Andere bekannte Plaque-Proteine der kardialen Zellverbindungen zeigen identische Lokalisierungen, zu ihnen gehören p120catenin and α-Catenin (Daten nicht gezeigt). Maßstab, 50 µm.

Abb. 12 B: Starke Unterschiede in der Komposition der Zellverbindungen der Glanzstreifen embryonaler E10.75 Pkp2-/--Herzen. (B) Im Gegensatz zum Wildtyp kolokalisieren keine der Plaque-Proteine (PG, N-Cad, β-Cat, Dsg 2) mit Desmoplakin in Pkp2-/--embryonalen Herzen (a´–e´). In diesen Mutanten ist Desmoplakin im Zytoplasma verteilt, und erscheint oft in einer Art granulärem Aggregat (grüne Punkte). (d´) Vollständiger Verlust der Plakophilin 2-Immunfärbung in homozygot-mutierten Embryonen zeigt, dass tatsächlich eine Nullmutation generiert wurde. (e´) Dsg2 ist nur schwach detektierbar in den Glanzstreifen von Pkp2-/--Herzen. Maßstab, 50 µm.

↓17

In starkem Kontrast dazu kolokalisierte Desmoplakin nicht mehr mit diesen Zelladhäsionsmolekülen in Zellverbindungen der Glanzstreifen Plakophilin 2-defizienter Embryonen (Abb. 12B). Das betraf beispielsweise die Armadillo-Proteine Plakoglobin und β-Catenin sowie das klassische N-Cadherin. Stattdessen war Desmoplakin hauptsächlich im Zytoplasma, abseits von den Zellverbindungen verteilt. Zusätzlich waren die desmosomalen Cadherine, Desmoglein 2 und Desmocollin 2, nur sehr gering in den Herzen der Pkp2-/--Embryonen exprimiert, was durch eine sehr schwache rote Fluoreszenz im Vergleich zu Wildtypherzen deutlich wurde. Wie erwartet zeigte die Immunlokalisierungen außerdem den Verlust der Expression von Plakophilin 2 in homozygoten Herzen (Abb. 12B).

Um den Effekt genauer zu charakterisieren, wurden zusätzlich zu den immunhistologischen Untersuchungen ultrastrukturelle Analysen durchgeführt. Mit Hilfe elektronenmikroskopischer Aufnahmen können die Glanzstreifen der Kardiomyozyten sichtbar gemacht und verschiedene Zellverbindungstypen morphologisch unterschieden werden. Während der gesamten Embryonalentwicklung des Herzens sind die Glanzstreifen reich an Adhärenz-Verbindungen und Desmosomen, was am Beispiel eines E10.75-embryonalen Wildtypherzens deutlich wurde. In wildtypischen Embryonen ist eine kontrastreiche Zellverbindung des desmosomalen Typs sichtbar (Abbildung 13a oben). Die darunterliegende, schwächer kontrastierte Zellverbindung ist eine Adhärenz-Verbindung (Abbildung 13a unten). In den Herzen der Plakophilin 2-/--Embryonen waren diese beiden Morphotypen nicht zu unterscheiden, und kontrastreiche Desmosom-typische Zellverbindungen waren nicht sichtbar (Abb. 13b). Elektronenmikroskopie und Immungoldfärbungen der Wildtyp-Herzen zeigten, dass Desmoplakin an den Plaques dieser beiden Zellverbindungen sitzt, was frühere Beobachtungen in Bezug auf die Zusammensetzung der Zellverbindungen in den Glanzstreifen des Herzens bestätigt, in denen Desmoplakin nicht nur an Desmosomen lokalisiert139 (Abb. 13c, e). Obwohl eine stärkere Markierung in den Desmosom-typischen Zellverbindungen deutlich wurde, waren auch Adhärenz-ähnliche Verbindungen mit Desmoplakin gefärbt (Abb. 13e, man vergleiche die rechte Desmosom-Zellverbindung mit der linken Adhärenz-Verbindung). Zellverbindungen mit kontinuierlicher Markierung für Desmoplakin und Plakophilin 2 wurden ebenfalls häufig gefunden (Abb. 13g, h). Die Zellverbindungen waren auch für das transmembrane Glykoprotein N-Cadherin positiv gefärbt (Abb. 13k). In starkem Kontrast dazu war die Desmoplakin-Färbung in Herzen der Pkp2-/--Embryonen drastisch verändert. Die Immungoldfärbung zeigte den Verlust von Desmoplakin an den Glanzstreifen (Abb. 13d, f, i, j). Desmoplakin war stattdessen im Zytoplasma zu finden, häufig in

Form von dichten Aggregaten mit einer Größe von bis zu 1 µm (Abb. 13i und j). Diese Aggregate waren oft mit Intermediärfilamentbündeln assoziiert. An vielen Stellen waren Intermediärfilamente durch die Desmoplakinaggregate misorientiert, was bei stärkerer Vergrößerung sichtbar wurde (Abb. 14). Intermediärfilamente waren häufig in Form von ungeordneten, locker arrangierten Schlingen

↓18

Abb. 13 a-l: Die Abwesenheit von Plakophilin 2 führt zur Ablösung von Desmoplakin von den Glanzstreifen der Herzen (area composita). Elektronen- (a und b) sowie Immunelektronen- (c-l) Mikroskopie ultradünner Schnitte durch Glanzstreifen embryonaler Herzen von Wildtyp und Pkp2-/--Embryonen (E10.75). Desmosomen, wie im Wildtyp, im oberen Teil von Abbildung (a) sichtbar, waren in Pkp2-/--Herzen (b) nicht vorhanden. Die elektronenmikroskopische Erscheinung von Adhärenz-Verbindungen jedoch war in homozygot-mutierten Herzen ähnlich zu wildtypischen Herzen (unterer Teil von Abbildung a und b). Die Lokalisierung von Desmoplakin war in Pkp2-/--Herzen im Vergleich zu Wildtyp-Herzen drastisch verändert. In wildtypischen Herzen war Desmoplakin stark an den Plaques beider Morphotypen zu finden (c und e), obwohl in der Regel eine stärkere Färbung an Desmosomen deutlich wurde (in Abbildung e, vergleiche die rechte Desmosomen-Zellverbindung mit der linken Adhärenz-Verbindung) waren auch Adhärenz-ähnliche Verbindungen positiv für Desmoplakin (c, e, g). Diese Art von Zellverbindungen waren auch positiv für Plakophilin 2 (h). Im Gegensatz dazu war in Pkp2-/--Herzen keine Desmoplakin-Färbung an den Glanzstreifen detektierbar (d, f). Stattdessen war Desmoplakin teilweise im Zytolasma verteilt und oft in dichten Aggregaten entfernt von den Glanzstreifen zu finden (i, j). Andere Bestandteile der Zellverbindungen des Herzens, wie das klassische Cadherin (N-Cadherin) waren in vergleichbarer Intensität an den Glanzstreifen der Pkp2-/-- wie auch wildtypischen Herzen detektierbar. Maßstäbe, 1 µm (b), 0.5 µm (a, c- g, i, j), 0.2 µm (h, k, l), 0.1 µm (j, Ausschnitt).

um Desmoplakinaggregate zu sehen. Andere Zelladhäsionsproteine, wie das klassische N-Cadherin sowie β-Catenin, beide typisch für Adhärenz-Verbindungen, waren in Plakophilin 2-/--Embryonen im Vergleich zum Wildtyp normal an den Glanzstreifen des Herzmuskels lokalisiert (Abb. 13k, l). In den Abbildungen wird zusätzlich deutlich, dass das Aktin/Myosin-Zytoskelett vom Verlust der Plakophilin 2-Expression nicht sichtbar betroffen war, in wildtypischen wie auch in Pkp2-/--Embryonen führten die Mikrofilamente zu den Zellverbindungen der Glanzstreifen (Abb. 13a und b). Somit ist die Funktion des kontraktilen Apparates durch die Pkp2-Mutation nicht beeinträchtigt, was durch vorhandenen Herzschlag der Pkp2-/--Embryonen unterstrichen wurde. Die in Plakophilin 2-defizienten Embryonen fehlende Verankerung der Intermediärfila-mente mit den Glanzstreifen führte jedoch zu verminderter Zelladhäsion und Stabilität der Kardiomyozyten.

In epithelialen Geweben, wie der Epidermis (Abb. 15a, b) und der Magenschleimhaut (Abb. 15c- e), war die Ultrastruktur der Zellverbindungen in Plakophilin 2-/--Embryonen beachtlicherweise nicht verändert. In Wildtypen sowie in homozygot-mutierten Embryonen waren in entsprechenden Geweben typische Desmosomen und Adhärenz-Verbindungen sichtbar. Gleichfalls konnten keine morphologischen Unterschiede in Zellverbindungen der Aorta sowie in Endothelzellen kleinerer Blutgefäße gefunden werden (Daten nicht gezeigt).

↓19

Abb. 14: Intermediärfilamente (IF) um ein Desmoplakinaggregat in einer Herzmuskelzelle von Plakophilin 2-defizienten E10.75-Embryonen. Die immunelektronische Abbildung eines Ultradünnschnittes zeigt ein typisches dichtes, granuläres Aggregat (Pfeil), in welchem Desmoplakin von extensiven Schlingen aus ungeordneten Intermediärfilamenten umgeben ist. Die Desmoplakin-Immungoldfärbung ist nicht nur im Aggregat, sondern auch über die gesamten IF-Schlingen verteilt zu sehen. Maßstab, 0.5 µm.

Abb. 15: Elektronenmikroskopische Aufnahmen mit normaler Morphologie von Zellverbindungen epithelialer Gewebe um E10.75 in Wildtyp und Plakophilin 2 -defizienten Embryonen. (a und b) In der sich entwickelnden Epidermis von Wt- (a) und Pkp2-/-- (b) Embryonen waren Desmosomen mit ähnlicher Ultrastruktur sichtbar. Sie waren häufig in der Nähe kleiner Adhärenz-Verbindungen zu finden (z.B. links vom Desmosom in Abbildung b). (c, Wt; d und e Pkp2-/-). Ähnlich dazu lagen in anderen Epithelien Desmosomen und Adhärenz-Verbindungen nebeneinander, wie z.B. in der Magenschleimhaut. (e) Die vergrößerte Aufnahme zeigt eine normale Plaquedicke und -dichte sowie eine normale Erscheinung der Desmoglea und dem inneren und äußeren Plaque in Plakphilin 2-defizienten Epithelien. Maßstäbe, 0.1 µm (a, b, e), 0.5 µm (c, d).

Biochemische Unterschiede in Zellverbindungen embryonaler Herzen

In Geweben sowie einschichtigen Zellkulturen epithelialer Zellen und Kardiomyozyten sind Zelladhäsionsproteine, wie beispielsweise die Plakophiline, zu einem Großteil mit dem Zytoskelett assoziiert. Wie in früheren Arbeiten gezeigt wurde, sind diese Strukturproteine durch ihre Verbindung mit dem Zytoskelett und ihre enge Assoziation innerhalb einer Zellverbindung in nichtdenaturierenden Detergenzien wie Triton X-100 und NP-40 zu einem Großteil unlöslich 1,48,103,104. Um die Zusammensetzung der Zelladhäsionskomplexe in wildtypischen und homozygoten Herzen zu untersuchen, wurden diese mit TritonX-100-Lysepuffer behandelt und in lösliche und unlösliche Komplexe getrennt. Wie erwartet wurden in E10.75-Wildtyp-Herzlysaten große Anteile der Zelladhäsionsproteine Desmoplakin, Plakoglobin, β-Catenin und Plakophilin 2 sowie der desmosomalen Cadherine Desmoglein 2 und Desmocollin 2 als auch das klassische Cadherins N-Cadherin in der Triton X-100-unlöslichen Fraktion detektiert (Abb. 16).

↓20

Im Gegensatz dazu waren in Plakophilin 2-defizienten Herzen Desmoplakin und zum Teil auch Plakoglobin viel stärker in der löslichen Fraktion vertreten (d.h. sie sind weniger stark mit dem Zytoskelett und Zellverbindungskomplex assoziiert), während die Löslichkeit von typischen Adhärenz-Verbindungs-Proteinen wie N-Cadherin und β-Catenin unverändert blieb (Abb. 16). Außerdem wurden im Vergleich zum Wildtyp nur sehr geringe Mengen an desmosomalen Cadherinen Dsg2 und Dsc2 in Plakophilin 2-defizienten Herzen detektiert. In Überein-stimmung mit unseren vorherigen Befunden folgern wir aus diesen Ergebnissen, dass die Assoziation von Desmoplakin und Plakoglobin sowie der desmosomalen Cadherine mit dem Zelladhäsionskomplex in Pkp2-/--Kardiomyozyten stark eingeschränkt ist. Dies geht einher mit der reduzierten Stabilität der Glanzstreifen embryonaler Herzen.

Abb. 16: Triton X-100-Extrahierbarkeit der Zellverbindungsproteine in Herzen von Wildtyp und Plakophilin 2-/--Embryonen um E10.75. Triton X-100-unlösliche und -lösliche Fraktionen embryonaler Herzen wurden mittels SDS-PAGE aufgetrennt, die relativen Mengen spezifischer Proteine wurden durch Immundetektion mit Antikörpern im Western-Blot nachgewiesen. In Pkp2-/--Herzen war der Großteil von Desmoplakin und auch ein Teil von Plakoglobin nicht mehr in der Triton X-100-unlöslichen Fraktion detektierbar. Desmosomale Cadherine wie Dsg2 und Dsc2a/b waren in Plakophilin 2-/--Herzen nur in sehr geringen Mengen in der Triton X-100-löslichen Fraktion zu finden, während die Expression und Löslichkeit typischer Proteine aus Adhärenz-Verbindungen, wie N-Cadherin und β-Catenin, unverändert blieben.

Reduzierte Proteinstabilität der desmosomalen Cadherine Dsg2 und Dsc2a/b in Pkp2-/--Herzen

Im zuvor erläuterten Versuch habe ich eine deutliche Reduktion der Proteinmenge von Desmoglein 2 und Desmocollin 2a/2b beschrieben. Um zu untersuchen, ob diese Reduktion auf RNA- oder Proteinebene stattfand, wurde eine semiquantitative Real-Time-PCR für Desmoglein 2, Desmocollin 2a/b und α-Tubulin (als Kontrolle) mit RNA aus embryonalen Herzen durchgeführt (Abb. 17). Für Desmocollin 2 korrespondiert die obere der Doppelbanden mit der längeren Spleißvariante Dsc 2a und die untere Bande mit der kürzeren Spleißvariante Dsc 2b. Es sind keine Unterschiede in der Signalstärke zwischen wildtypischen Herzen und Pkp2-/--Herzen in Desmoglein 2 und Desmocollin 2a/b nach unterschiedlichen Zyklenzahlen zu sehen (Abb. 17). Die Ergebnisse zeigen, dass in Plakophilin 2-defizienten Herzen die verringerte Expression der desmosomalen Cadherine Dsg2 und Dsc2 nicht auf transkriptioneller Ebene reguliert wird. Die niedrige Expression dieser Proteine in Pkp2-/--Herzen wird daher höchstwahrscheinlich auf eine verminderte Proteinstabilität zurückzuführen sein.

↓21

Abb. 17: Semiquantitative RT-PCR von Wildtyp- und Plakophilin 2-/--embryonalen Herzen E10.75. Spezifische Primer für Desmocollin 2a und 2b sowie Desmoglein 2 und α-Tubulin wurden für die semi-quantitative RT-PCR verwendet. In den Kontrollen wurde für die cDNA-Synthese-Reaktion keine RT-Polymerase zugefügt. Kon-troll-PCRs wurden für jedes Primerpaar für Wt und Pkp2-/--Herzen durchgeführt, die jeweils erste Kontrollspur entspricht der

PCR-Reaktion für wildtypsche Herzen, die jeweils zweite Kontrollspur entspricht der Kontroll-Reaktion für Pkp2-/--Herzen. PCR-Reaktionen wurden nach 25, 30 und 35 Zyklen gestoppt und elektrophoretisch aufgetrennt.

Mutationen in Plakophilin 2 sind häufig in Arrhythmogener-Rechts-Ventrikulärer-Kardiomyopathie

Aufgrund der Plakophilin 2-Nullmutation in der Maus, welche zu letalen Veränderungen im Herzen führt, sollte desweiteren untersucht werden, ob Mutationen im Gen für Plakophilin 2 beim Menschen für Arrhythmogene-Rechts-Ventrikuläre-Kardiomyopathie (ARVC) verantwortlich sind. Aus diesem Grund führte die Arbeitsgruppe von L. Thierfelder in einer Zusammenarbeit mit unserer Arbeitsgruppe Sequenzanalysen von allen 14 Exonen und Exon/Intron-Grenzen des humanen Plakophilin 2-Gens von 120 nicht miteinander verwandten ARVC-Patienten (101 Männer, 19 Frauen) durch. Tatsächlich wurden in dieser Sequenzanalyse bei 32 von 120 Patienten (27 Männer, 5 Frauen) 25 verschiedene heterozygote Mutationen im Plakophilin 2-Gen identifiziert. Die Mehrheit der gefundenen Mutationen (18 der 25 Mutationen) führt zu STOP-Kodons (Abb. 18). Die Mutationen beinhalten Basenaustausche, die zu einem direkten STOP-Kodon führen, Leserasterverschiebungen durch Deletionen oder Insertionen von Nukleotiden, Spleißstellenmutationen und Fehl-Sinn-Mutationen (Abb. 18). Obwohl die meisten Mutationen in der C-terminalen Hälfte des Moleküls gefunden wurden, verteilten sich die Mutationen über das ganze offene Leseraster. Sechs unabhängige Ereignisse derselben Nicht-Sinn-Mutation (235C®T), die zu einem direkten STOP-Kodon führen, ließen vermuten, dass Nukleotid 235 einen „Hot-Spot“ für Mutationen im Plakophilin 2-Gen darstellt. Keine der 25 PKP2-Mutationen wurde in 250 untersuchten Kontrollen gefunden. Zwei Familien, A100 und EPF, wurden systematisch analysiert. Die Familie EPF trägt die Insertionsmutation 216insG, die Mitglieder der Familie A100 weisen eine Deletionsmutation (2076_2077delAA) auf (Abb. 19). Diese Deletionsmutation wurde in zwei von ARVC betroffenen Patienten (18 und 161) der Familie A100 detektiert. Vier weitere Familienmitglieder tragen ebenfalls die Mutation, haben jedoch einen unbetroffenen oder bislang ungeklärten Krankheitsstatus (Abb. 19). Zwei Mitglieder (11 und 12) der anderen Familie (EPF) mit ARVC starben plötzlich im Alter von 15 und 16 Jahren. Eine Autopsie zeigte, dass beide Personen an ARVC erkrankt waren, während von fünf weiteren Familienmitgliedern mit derselben Mutation nur einer (17) ARVC-Merkmale aufwies (Abb. 19).

↓22

Abb. 18: Genomische Struktur und die Protein-Struktur von Plakophilin 2 mit ARVC assoziierten Mutationen. Das humane Gen für Plakophilin 2 hat 14 Exone, die Nummerierung der Nukleotide beginnt beim ATG und bezieht sich auf die Genbank-Zugriffsnummer X97675. Gestrichelte Linien begrenzen die Bereiche des Proteins, die von entsprechenden Exonen kodiert werden. Die Positionen der 25 gefundenen Mutationen in ARVC-Patienten sind anhand der genomischen Sequenz dargestellt. Mutationen, die zu einem STOP-Kodon führen sind rot, Leserasterverschiebungen grün, Spleißstellenmutationen dunkelblau und Fehlsinn-Mutationen hellblau unterlegt. Die Häufigkeit der Mutationen (insgesamt 32 von 120) ist durch die Y-Achse gekennzeichnet. aa, Aminosäuren. Modifiziert nach159.

Abb. 19: Stammbäume der Familien A100 und EPF mit Plakophilin 2 Mutationen und ARVC. ARVC Patienten sind schwarz, von ARVC unbetroffene Personen sind weiss dargestellt. Ein ungeklärter Krankheitsstatus ist mit gestrichelt und ein unbekannter Krankheitsstatus mit grau markiert. (+) bedeutet Vorhandensein oder (-) nicht Vorhandensein der PKP2-Mutation, N/V bedeutet, dass Personen nicht für genetische Analysen verfügbar waren. Schrägstrich bedeutet verstorben; Quadrat, männlich; Kreis, weiblich. Abbildung modifiziert nach159.

Um die Auswirkungen der Mutationen auf Proteinebene zu untersuchen und Rückschlüsse auf die Variabilität der Phänotypenausprägung sowie den Krankheitsmechanismus zu ziehen, habe ich Western-Blot-Analysen durchgeführt. Von der Familie A100 mit der 2-bp-Deletionsmutation im Exon 10 des PKP2-Gens konnte eine Rechts-Herzbiopsie eines Patienten A100/161 für eine Western-Blot-Analyse genutzt werden. Die Mutation verursacht eine Leserasterverschiebung und würde nach 693 Aminosäuren zur Translation von 48 Nicht-Sinn-Aminosäuren führen, bis es nach 741 Aminosäuren zu einem STOP-Kodon kommt. Das Ergebnis einer Western-Blot-Analyse eines Patienten der A100-Familie mit dieser Deletionsmutation im Cystein 693 (in der sechsten Arm-Wiederholung), zeigte jedoch kein erwartetes trunkiertes Protein von 83 kDa, sondern eine reduzierte Menge des Wildtypproteins (Abb. 20).

↓23

Wie im untersuchten ARVC-Patienten (2076_2077delAA), sind die PKP2- mRNA- und Proteinmengen aus Pkp2+/--Mäusen ebenfalls reduziert (Abb. 21). Es wäre daher interessant, adulte Mäuse auf einen ARVC-Phänotyp zu untersuchen und ein Mausmodell zum besseren Verständis der Krankheit zu etablieren.

Abb. 20: Western-Blot einer Herzbiopsie eines ARVC-Patienten mit der Mutation 2076_2077delAA. Die Western-Blot-Analyse stammt von einer Herzbiopsie des rechten Ventrikels eines ARVC-Patienten mit einer Leserasterverschiebungs-Mutation, die zu einem vorzeitigen STOP-Kodon nach 741 Aminosäuren führt. Mit verschieden Antikörpern gegen Plakophilin 2 konnte kein verkürztes Protein von 83 kDa detektiert werden (ein anti-Head-Antikörper richted sich gegen die Aminosäuren 131-148 und sollte somit ein verkürztes Protein erkennen). Das Ergebnis zeigt jedoch eine reduzierte Menge des Wildtyp-PKP2-Proteins im Vergleich zum Kontrollysat einer rechten Herzbiopsie eines Patienten ohne ARVC und ohne Plakophilin 2-Mutation. N-Cadherin und α-Tubulin dienten als Ladekontrollen.

Abb. 21: Northern-Blot- und Western-Blot-Analyse von adulten Herzen aus Wildtyp- und Plakophilin 2+/-- Stämmen. (a) Northern-Blot-Analyse von jeweils zwei wildtypischen (+/+) und für Plakophilin 2-heterozygoten (+/-) adulten Herzproben. Eine C-terminale Sonde gegen die mRNA von Plakophilin 2 zeigte reduzierte Signale in heterozygot-mutierten Herzen im Vergleich zu wildtypischen Herzen. Die 28S-rRNA des Ethidiumbromid-gefärbten RNA-Gels diente als Ladekontrolle. (b) Western-Blot-Untersuchungen von Herzproben aus jeweils zwei adulten Wildtyp- und Pkp2+/--Mäusen zeigten ebenfalls reduzierte Plakophilin 2-Proteinmengen in Pkp2+/--Herzen im Gegensatz zu wildtypischen Herzen. Immundetektionen von N-Cadherin und α-Tubulin dienten als Ladekontrollen.


© Die inhaltliche Zusammenstellung und Aufmachung dieser Publikation sowie die elektronische Verarbeitung sind urheberrechtlich geschützt. Jede Verwertung, die nicht ausdrücklich vom Urheberrechtsgesetz zugelassen ist, bedarf der vorherigen Zustimmung. Das gilt insbesondere für die Vervielfältigung, die Bearbeitung und Einspeicherung und Verarbeitung in elektronische Systeme.
DiML DTD Version 4.0Zertifizierter Dokumentenserver
der Humboldt-Universität zu Berlin
HTML-Version erstellt am:
06.02.2006