Materialien und Methoden

Molekularbiologische Standardmethoden, Chemikalien, Kits und Geräte

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Die im folgenden nicht näher beschriebenen Standardmethoden wurden aus den Laborhandbüchern von Sambrock et al. (1989)183 und Ausubel et al. (1987)184 übernommen. Diese Methoden waren: Plasmid-DNA-Präparation im analytischen Maßstab, Spaltung von DNA mit Restriktionsendonukleasen, Dephosphorylierung linerisierter DNA, Ligationsreaktionen, Transformation von Bakterien sowie Auftrennung von Nukleinsäuren in Argarosegelen und Kapillartransfer von Nukleinsäuren auf Nitrozellulosemembranen. Nach Angaben der Hersteller wurden durchgeführt: Die Plasmid-DNA-Präparation in quantitativem Maßstab (Qiagen), die Elution von DNA aus Agarosegelen (Qiagen), die radioaktive Markierung von DNA (Megaprime-DNA-labelling-System, Amersham), Chemilumineszenzreaktionen (ECL-Detection-Kit, Amersham) und die DNA-Sequenzierung (Thermo-sequenase-fluorescent-labelled-primer-cycle-sequencing kit, Amersham).

Soweit nicht anders angegeben wurden Chemikalien von Fluka (Neu-Ulm), Merck (Darmstadt), Pharmacia (Freiburg), Serva (Heidelberg) und Sigma (Deisenhofen), radioaktive Nukleotide von Amersham Buchler (Braunschweig), Enzyme von Boehringer Mannheim (Mannheim) und New England Biolabs (Schwalbach/Taunus) und Oligonukleotide von BioTeZ (Berlin) bezogen. Die verwendeten Geräte waren: Bio-Imaging-Analyzer (Fujix BAS 2000, Fuji), DNA Sequenzer 4000L (MWG-Biotech), Minifuge RF (Heraeus Sepatech), Centrifuge 5402 (Eppendorf), Centrifuge J2-21 (Beckman) mit Rotoren JA 10 und Ultracentrifuge TL-100 (Beckman) mit Rotoren TLA 100.3 und TLV 100.

Bakterienstämme und verwendete Plasmide

Es wurden ausschließlich konjugationsdefiziente K12-Sicherheitsstämme von E.coli verwendet:

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-XL-1 Blue [F´, Tn10 (tet r ), proAB + , lacI q Δ (lac)M15, supE44, hsdR17, recA1, endA1, relA1, gyrA96]

-pBluescript II SK + (Stratagene) wurde für DNA-Klonierungsschritte eingesetzt sowie die Klonierung von Northern- und Southern-Sonden.

Konstruktion des Rekombinationsvektors, Kultivierung, Elektroporation und Selektion von Zellen

Der Plakophilin 2-Mausstamm wurde von Martin Behrend und Jörg Hülsken wie folgt generiert und zur Phänotypenanalyse zur Verfügung gestellt. Als Ausgangsvektor für die Konstruktion des Rekombinationsvektors wurde eine weiterentwickelte Form des Vektors pTV0185 eingesetzt. Dieser Vektor enthält ein Neomyzinresistenzgen (neo) und das Thymidinkinasegen des Herpes Simplex Virus. Die zwei Gene liegen unter der Kontrolle des Phosphoglyceratkinase-Promoters. Ein Teil des murinen Plakophilin 2-Gens (Exon 1 und 2 sowie dazugehörige Intronsequenzen) wurde aus einer λ-FIX-II-129/SVJ-Bibliothek (Stratagene) isoliert, mit Restriktionsendonukleasen verdaut und so in den Rekombinations-vektor kloniert, dass die neo-Kassette eine genomischen Sequenz (7.8 Kb) von der Not1-Schnittstelle in Exon 1 bis zu einer BamHI-Schnittstelle in Intron 1 ersetzt. Das Neomycinresistenzgen (neo) wurde in entgegengesetzte Leserichtung zum Plakophilin 2-Gen eingefügt. Es wurde eine Nullmutation im Plakophilin 2-Gen generiert, da die Anwesenheit der Neo-Kassette ein Spleißereignis zwischen Exon 1 und Exon 2 verhindert und es nach 43 Aminosäuren zu einem verfrühten Stop in der Translation von Plakophilin 2 kommt.

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Embryonale Stammzellen (ES-Zellen) der Linie E14.1 (isoliert von Jörg Hülsken) wurden ursprünglich aus der inneren Zellmasse einer männlichen Blastozyste der Mauslinie 129/Ola gewonnen186,187. Die ES-Zellen wurden in DMEM (Gibco, #31966-021, 4500 mg/l Glukose, Glutamax und Pyruvat) supplementiert mit 15% fötalem Kälberserum (Sigma, #F7524), 100 µg/ml Streptomycin und 100 µg/ml Penicillin (Gibco, #), 1% nichtessentiellen Aminosäuren (Gibco, #), 100 µm 2-Mercaptoethanol (Gibco) und 500 U/ml LIF (Esgro, Temecula, CA, USA)kultiviert. Diese Kultur erfolgte als Kokultur mit wachstumsinaktivierten embryonalen Fibroblasten. Neomycin-resistente embryonale Fibroblasten (Feeder-Zellen) wurden aus E16.5 Mausembryonen der Plakoglobin defizienten Mauslinie41 durch Christian Asbrand gewonnen. Feeder-Zellen wurden zunächst in DMEM (Gibco, wie für ES-Zellen angegeben, jedoch ohne LIF) über fünf Passagen kultiviert und anschließend durch Behandlung mit 10 µg/ml Mitomycin C (Sigma) wachstumsinaktiviert, um für die Kokultur mit ES-Zellen eingesetzt zu werden. Alle Zellen wurden bei 37°C, 90% Luftfeuchtigkeit und 7.5% CO2-Gehalt kultiviert. Im Abstand von drei Tagen wurden die ES-Zellen 1:3 verdünnt, wozu sie zunächst mit PBS (137 mM NaCl, 2.7 mM KCl, 8 mM Na2HPO4, 1.5 mM KH2PO4) gewaschen und dann durch Zugabe von Trypsinlösung (0.5 mM EDTA und 2 mg/ml Trypsin in PBS) von der Petrischale abgelöst wurden. Zum Einfrieren wurden die Zellen trypsiniert, sedimentiert (300 x g, 5min), in Einfriermedium (DMEM, 50% FCS, 10% DMSO) resuspendiert und in Styropor verpackt bei -80°C langsam eingefroren. Nach einem Tag wurden die Zellen in Flüssigstickstoff überführt.

ES-Zellen wurden mittels Elektroporation transfiziert: zu 107 Zellen in 800 µl PBS wurde 20 µg linerisierter Rekombinationsvektor zugefügt und in einer 4 mm-Küvette bei 240 V und 500 µF (Genepulser, Biorad) transfiziert. Die Zellen wurden nach der Elektroporation auf vier 10 cm-Zellkulturschalen mit Feeder-Zellen verteilt. Am nächsten Tag wurde dem Zellkulturmedium 400 µg/ml G418 (Gibco) und ab dem fünften Tag 2 µM Gancyclovir (Syntex) zugesetzt. Somit wurden ES-Zellklone, welche die linearisierte DNA des Rekombinationsvektors in ihr Genom aufgenommen haben, positiv auf Neomyzinresistenz selektioniert. Klone, bei denen diese Integration durch homologe Rekombination stattgefunden hat, verlieren die HSV-TK Kassette. Dagegen verbleibt bei zufälliger Integration diese Kassette im Genom. In diesem Fall können die betreffenden Zellen durch Zusatz des Nukleosidanalogs Gancyclovir, welches nach Phosphorylierung durch die HSV-TK in die DNA eingebaut wird und zum Absterben der Zellen führt, negativ selektioniert werden. Nach sieben bis acht Tagen konnten Zellklone mit einer Pipette in 25 µl PBS abgelöst und in 96-Loch-Platten in 25 µl Trypsinlösung vereinzelt werden. Dieser Prozess wurde nach 10 min durch Zugabe von 200 µl ES-Zellmedium abgestoppt und die Zellen anschließend für vier Tage kultiviert. Dann wurden 2/3 der Zellen wie oben beschrieben eingefroren und der Rest auf mit 0,5% Gelatine in PBS vorbehandelten 96-Loch Platten bis zur vollständigen Konfluenz weiterkultiviert. Aus diesen Zellen wurde genomische DNA nach der Methode von Ramirez-Solis et al. (1992) isoliert188. Zwei unabhängige positive ES-Zellklone, bei denen ein Allel mit dem Rekombinationsvektor rekombiniert hat, wurden für die Blastzysteninjektionen genutzt189. Die chimären Blastozysten wurden in den Uterus scheinschwangerer Ammenmäuse injiziert. Da die ES-Zellinie E14.1 aus weißen Mäusen (129/SV) erstellt wurde und C57Bl/6J Mäuse eine schwarze Fellfarbe besitzen, lässt sich der Chimäritätsgrad der Nachkommen anhand der Fellfarbe abschätzen. Chimäre Männchen, die aus den Blastozysteninjektionen hervorgegangen waren, wurden mit C57Bl/6J Weibchen verpaart. F1-Nachkommen mit braunem Fell wurden mittels PCR und Southern-Blot-Analyse genotypisiert.

Genotypisierungen, Southern-Blot und Northern-Blot

Für die Genotypisierung der Tiere wurde die PCR-Methode genutzt. Zunächst wurden Ohrbiopsien in 30 µl Lysepuffer (100 mM Tris pH 7.4, 10 mM EDTA, 0.2% SDS, 200 mM NaCl, 0.2 µg/µl Proteinase K) über Nacht bei 55°C inkubiert. Die verwendeten Oligonukleotide für die PCR waren 438 (GAT CCT GGG TCA CCT GGA CA), 569 (AGG GTC TGC TGC ACC TGC T) und NSN (CTT CTG AGG GGA TCG GCA ATA). Diese Oligonukleotide wurden wie folgt eingesetzt: 1.5 µl 10x Taq-Polymerase-Puffer, 0.6 µl MgCl2 (50 mM), 0.375 µl dNTPs (je 10 mM), 0.2 µl 438 (100 µM), 0.1 µl 569 (100 µM), 0.1 µl NSN (100 µM), 0.2 µl Taq Polymerase, 9.925 µl ddH2O, 2 µl Lysat (1:40). Das PCR-Programm [95°C 1 min, (96°C 6s, 61°C 10s, 72°C 20s), 45 Zyklen, 4°C] ergab ein Wildypfragment von 130 bp und ein Fragment des mutiertes Allels von 230 bp.

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Für Southern-Blot-Analysen wurden Embryonen um E10.75 in 500 µl Lysepuffer inkubiert (siehe oben), Phenol-Chloroform extrahiert und mit 99% Ethanol gefällt sowie mit 70% Ethanol gewaschen. Die genomische DNA wurde in ddH20 aufgenommen und die Konzentration photometrisch gemessen. Für einen Restriktionsendonukleaseverdau wurden 10 µg genomische DNA über Nacht bei 37°C verdaut, am nächsten Morgen wurde der Ansatz bei 60°C auf 20 µl eingedampft und in einem 0.65% Agarosegel elektrophoretisch aufgetrennt. Nach dem Lauf wurde das Gel 30 min in Denaturierungspuffer (1.5 M NaCl, 0.5 M NaOH), 30 min in Neutralisierungspuffer (1 M Tris pH 7.5, 1.5 M NaCl) und 30 min in 20x SSC (100 ml: 175g NaCl, 88g Na-Citrat, pH 7.0) gewaschen, bevor ein Kapillarblot in 20x SSC pH 7.0 aufgebaut wurde (Membran: Hybond N+, #RPN203B, Amersham). Am nächsten Morgen wurde die Membran mit UV-Licht bestrahlt und die Membran in Hybridisierungslösung (100 ml: 50 ml Formamid, 25 ml 20x SSC pH 7.0, 5 ml 100x Denhard´s, 2 ml 50 mM Na-EDTA, 2 ml ssDNA (10 mg/ml), 10 ml 10%SDS, 10 ml 50% Dextransulfat) bei 42°C präinkubiert. Währenddessen wurden die DNA-Sonden (neo-Sonde, gesamte cDNA von Neomyzin; ext-Sonde, Teil der genomischen Sequenz des Pkp2-Lokus außerhalb des Rekombinationsvektors) mit α-32P dCTP markiert (Amersham Biosciences, Megaprime-DNA Labeling System, #RPN1605 nach Protokoll des Herstellers), dann zur Prähybridisierungslösung gegeben und über Nacht bei 42°C inkubiert. Am nächsten Tag wurde die Membran 1x 15 min in Waschlösung 1 (2x SSC, 0.1% SDS), 2x 15 min mit Waschlösung 2 (0.2x SSC, 0.1% SDS) bei 65°C gewaschen und danach Phosphoimagerplatten (Fuji) oder Kodak-Filme aufgelegt.

Für Northern-Blot-Analysen wurden E10.75 Embryonen oder adulte murine Herzen in Trizol (Gibco) mechanisch homogenisiert und RNA isoliert (nach dem Protokoll des Herstellers) sowie dessen Konzentration photometrisch bestimmt. Das gesamte ddH2O, welches über den Versuch genutzt wurde, war zuvor mit Diethylpyrocarbonat (DEPC, 0.1%) behandelt worden. Auf einem denaturierendem RNA-Gel (200 ml: 170 ml ddH2O, 1.6 g Agarose, 20 ml 10x MOPS, 10.5 ml 37% Paraformaldehyde und Ethidiumbromid) wurden jeweils 8 µg RNA geladen und in 1x MOPS (Anleitung siehe Roche) elektrophoretisch aufgetrennt. Nach dem Lauf wurde das Gel 4x 30 min mit ddH2O gewaschen, dann 30 min in Denaturierungspuffer (50 mM NaOH, 10 mM NaCl), 30 min in Neutralisierungspuffer (100 mM Tris pH 7.5) sowie 30 min in 20x SSC geschwenkt, bevor ein Kapillarblot (Membran: Hybond N, #RPN203N, Amersham) mit 20x SSC aufgebaut wurde. Am nächsten Morgen wurde die RNA auf der Membran mit UV-Licht vernetzt und die Membran in Prähybridisierungs-lösung (ExpressHyb, #636813, BD Biosciences) bei 68°C inkubiert, bevor die radioaktive DNA-Sonde (C-Terminus und Teil der 5´UTR von Pkp2; Nukleotide: 1748-2761) zugefügt wurde (siehe Southern-Blot, nach Protokoll des Herstellers). Die Hybridisierung fand bei 68°C über Nacht statt. Am nächsten Morgen wurde die Membran 2x 15 min in Waschlösung 1 (2x SSC, 0,1% SDS), 2x 15 min mit Waschlösung 2 (0,2x SSC, 0,1% SDS) bei 68°C gewaschen und danach Phosphoimagerplatten oder Kodak-Filme aufgelegt.

Embryoschnitte und -färbungen

Für Paraffinschnitte wurden Embryonen und Dottersäcke in PBS präpariert und über Nacht in 4% PFA in PBS fixiert. Danach wurden Embryonen in einer aufsteigenden Ethanol-Reihe (70%, 80%, 90%, 96% Ethanol, 2x reines Ethanol) jeweils 1 Stunde entwässert, 2x 45 min in Toluol inkubiert und über Nacht in flüssiges 60°C warmes Paraffin überführt, bevor sie dann in Paraffin eingebettet wurden. Mit einem Mikrotom (Microm, Heidelberg) wurden in der Regel 7 µm dünne Schnitte angefertigt und für histologische Übersichtsfärbungen, wie HE-Färbungen genutzt. Die auf Objektträgern getrockneten Schnitte wurden zunächst ca. 2 h im 60°C erwärmt, dann 3x je 7 min in Xylol vom Paraffin befreit und in absteigender Ethanol-Reihe (2x reines Ethanol, 96%, 90%, 80%, 70% Ethanol) rehydriert. Die Schnitte wurden als nächstes 1 min in Hämatoxylin gefärbt und sofort für 10 min in warmes, wechselndes Leitungswasser überführt, danach 5 min in 0.1% alkoholischem Eosin gefärbt, wieder dehydriert und anschließend in Entellan (Merck)eingedeckelt.

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Weitere histologische Schnitte (1 µm) wurden von in EPON eingebetteten Embryonen angefertigt. Die Schnitte wurden auf APES-beschichteten Objekträgern gesammelt und bei 60°C getrocknet. Danach 3 min mit Toluidinblau bei 60°C gefärbt, mit ddH20 gewaschen und bei 60°C getrocknet in Entellan eingedeckelt und fotografiert.

Immunhistochemie

Für die Pecam-Färbung wurden Embryonen samt Dottersack in PBS präpariert und über Nacht in Methanol-DMSO (4:1) bei 4°C fixiert. Endogene Peroxidase wurde durch eine Inkubation der Embryonen für 4-5 h in Methanol-DMSO-H2O2 (4:1:1) inhibiert. Danach wurden Embryonen 2x für jeweils 1h in PBS mit 2% Milchpulver und 0.1% TritonX-100 (PBSMT) inkubiert, bevor sie über Nacht bei 4°C mit dem Primärantikörper Pecam-1 aus der Ratte (PharMingen, #557355, 1:250) in PBSMT inkubiert wurden. Danach folgten zwei Waschschritte in PBSMT bei 4°C und drei Waschschritte in PBSMT bei RT. Die Embryonen wurden dann mit dem sekundären Peroxidase-gekoppelten Antikörper (Esel-anti-Ratte-POD, Dianova) über Nacht bei 4°C in PBSMT inkubiert. Am nächsten Morgen wurden die Waschschritte vom Vortag wiederholt und mit einem letzten Waschschritt mit PBST bei 4°C abgeschlossen. Die Embryonen wurden danach mit einer Färbelösung, welche Diaminobenzidin (DAB) enthält (10 ml: 1 ml 1 M Tris pH 7.5, 80 µl 5% NiCl2, 100 µl DAB (30 mg/ml), 2 µl 35% H2O2, 3.25 ml 2% NaN3, 5.57 ml ddH2O) inkubiert. Von der Peroxidase wird DAB in einen Blauton umgewandelt, der Farbumschlag dauert ca. 20 min und kann durch Entfernung des Substrats (waschen mit PBS) abgestoppt werden. Anschließend wurden Fotos gemacht. Danach wurden die Embryonen in Lysepuffer inkubiert und genotypisiert

Immunfluoreszenzmikroskopie

Für Immunfluoreszenzmikroskopie wurden Embryonen in PBS präpariert und direkt in Tissue Tek (Sakura) eingefroren. Der Gefriervorgang wurde entweder in Flüssigstickstoff tiefgekühlten Isopentan oder auf einem in Ethanol-Trockeneis gekühlten Metallblock vollzogen. Kryostatschnitte und Plakophilin 2-Immunfärbungen wurden teilweise in Berlin angefertigt, jedoch zum Großteil auf Trockeneis nach Heidelberg zu Christine Grund versandt und weiterverarbeitet. Wenn nicht anders beschrieben, so wurden 7 µm Kryostatschnitte in -20°C Aceton für 10 min fixiert, luftgetrocknet und dann mit den primären Antikörpern (in PBS, 10% FCS) für 1 h bei RT inkubiert. Die primären Antikörper waren polyklonale Meerschweinchenantikörper oder murine monoklonale Antikörper gegen Plakophilin 2 (Progen Biotechnik GmbH,1,190), murine monoklonale Antikörper (Progen) oder polyklonale Kaninchenantikörper (NaTuTec) gegen Desmoplakin, murine monoklonale Antikörper sowie Meerschweinchen- oder Kaninchenantikörper gegen Desmoglein 2 (Progen,191-194), β-Catenin (monoklonaler Antikörper, Zymed Laboratories), N-Cadherin (monoklonaler Antikörper, Transduction Laboratories) und Plakoglobin (monoklonaler Antikörper, Progen). Nach der Primärantikörperinkubation wurden die fixierten Schnitte 3x 5 min mit PBS gewaschen und mit den Sekundärantikörpern sowie teilweise mit DAPI (1 µg/ml) in PBS/FCS für 30 min bei RT inkubiert. Die sekundären Antikörper waren mit Alexa 568 und Alexa 488 gekoppelt (MoBiTec, Molecular Probes). Nach der Sekundär-Antikörperinkubation wurden die Schnitte in PBS gewaschen und mit Fluoromount (Biozol) oder Immumount (Thermo Shandon) eingedeckelt. Fotos wurden mit Axiophot und LSM 510 Mikroskopen (beide von Carl Zeiss Microimaging, Inc) gemacht.

Elektronen und Immunelektronenmikroskopie

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Für die Elektronenmikroskopie wurden Embryonen in PBS präpariert, ca. 30 min in 3% PFA in PBS anfixiert und dann in 8% PFA, 0.1% Glutaraldehyd in PBS weiterfixiert und bis zu 7 d bei 4°C gelagert und an Bettina Erdmann für die Osmierung und Einbettung in EPON weitergegeben. Von eingebetteten Embryonen wurden mit Glasmessern Semidünnschnitte (1 µm) für Übersichtsfärbungen angefertigt und bis zur entsprechenden Stelle für elektronenmikroskopische Aufnahmen vorgeschnitten. Ultradünnschnitte und elektronenmikroskopische Aufnahmen von Atrium, Ventrikel, Magenepithel und Haut sowie Aorta und Kapillaren wurden von Bettina Erdmann angefertigt.

Die Immunelektronenmikroskopie wurde von Christine Grund angefertigt. Für Immunelektronenmikroskopie wurden 5 µm dünne Kryostatschnitte auf Objektträgern gesammelt, 10 min in 2% PFA in PBS fixiert, für 5 min mit 0.1% Saponin in PBS permeabilisiert und 1 h mit den Primärantikörpern inkubiert. Nach 3 Waschschritten mit PBS wurden die Schnitte mit den sekundären Nanogold-konjugierten Antikörpern (BioTrend) für 2-4 h inkubiert. Die weiteren Arbeitsschritte wurden zuvor beschrieben195. Nach dem Abspülen nicht gebundener Antikörper wurden die Präparate in GA-Lösung (2.5% Glutaraldehyd, 50 mM KCl, 2.5 mM MgCl2, in Cacodylatpuffer) für 15 min bei RT fixiert, 2x 5 min in Cacodylatpuffer (50 mM Na-Cacodylat, pH 7.2) gewaschen und das Signal optional durch 3 min Inkubation in einem Entwickler/Verstärker-Gemisch („HQ Silver TM Enhancement Kit“, Nanoprobes; „R-Gent Silver Enhancement System“, Aurion Gold Reagents, Wageningen, Niederlande) silberverstärkt. Nach dreimaligem Waschen mit ddH2O wurde mit OsO4-Lösung (2% OsO4 (w/v) in ddH2O) für 30 min bei 4°C nachfixiert. Die Dehydrierung und Einbettung erfolgte entsprechend der von Franke et al (1978)196 beschriebenen Methode. Zunächst wurden die Präparate in einer aufsteigenden Ethanolreihe und anschließend in 100% Propylenoxid 2x für je 15 min entwässert und schließlich über Nacht in einem Propylen/Epon-Gemisch belassen. Auf Gewebeschnitte wurde eine mit Epon gefüllte Gelatinekapsel (Serva, Heidelberg) gestülpt, die Polymerisierung erfolgte für 48 h bei 60°C. Ultradünnschnitte wurden in UA-Lösung (2% Uranylacetat (w/v) in Methanol) für 15 min und Bleicitrat (50 ml H2O: 1.33g PbNO3, 1.76g Na-Citrat x 2H2O, 30 ml heißes H2O, 8 ml 1 N NaOH) für 5 min kontrastiert und mit dem Elektronenmikroskop (Modell EM910, Carl Zeiss Microimaging, Inc) ausgewertet.

Detergenzextraktion, Gelelektrophorese und Western-Blot

Für Löslichkeitsstudien wurden acht embryonale Herzen nach der Genotypisierung in 200 µl Triton-X-100-Lysepuffer (100 ml: 2 ml 1 M HEPES pH 7.4, 1 ml 100% Triton X-100, 3 ml 5 M NaCl, 50 µl 1 MCaCl2, Proteaseinhibitoren(Mini EDTA-frei, Roche (#1836170)) aufgenommen, sonifiziert und gevortext. Lysate wurden bei 4°C, 20000xg für 15 min zentrifugiert. Lösliche und unlösliche Fraktionen wurden getrennt und deren Proteinkonzentration nach Bradford bestimmt. Gleiche Mengen der Triton X-100 löslichen und unlöslichen Fraktionen wurden mit Hilfe eines SDS-PAGE aufgetrennt (Sammelgel: 4% Acrylamid/Bisacrylamid 29:1, 125 mM Tris-HCL, pH 6.8, 0.1% SDS, 0.1% Ammoniumpersulfat, 0.1% TEMED; 6% Trenngel: 6% Acrylamid/Bisacrylamid 29:1, 300 mM Tris-HCL, pH 8.8, 0.1% SDS, 0.1% Ammoniumpersulfat, 0.1% TEMED) und in 1x Laemmli-Elektorphoresepuffer (2.5 mM Tris-HCl pH 8.3, 19.2 mM Glyzin, 0.2% SDS) aufgetrennt197. Die Proteine wurden mit einem Nass-Transfer über Nacht (200 mA, 4°C) auf eine Membran (PVDF, Immobilon-P, 45 µm, Millipore) mit Hilfe einer Elektro-Transfer Apparatur (Biorad) in Transferpuffer transferriert. Dazu wurden die Membranen kurz in Methanol gewaschen, Gele, Membranen und Whatmanpapier in Transferpuffer (1 l: 14.42 g Glyzin, 3.03 g Tris-Base, 0.1 g SDS) equilibriert, luftblasenfrei übereinander gelegt und zwischen die Elektroden gebracht. Die Membran wurde am nächsten Tag 1 h in 5% Milchpulver in PBS/0.2% Tween20 blockiert und in PBSMT mit den verschiedenen Primärantikörpern 3 h inkubiert. Zu den Primärantikörpern gehörten: monoklonale Plakophilin 2-Antikörper-Mix (Progen, 1:10 verdünnt,1), Plakophilin 2 Meerschweinchenantikörper (HP-1, verdünnt 1:2000; Head, verdünnt 1:1000, von W.W. Franke aus Heidelberg), Plakoglobin monoklonaler Antikörper (mAK) (11E4 von W.W. Franke, Heidelberg, 1:10 verdünnt), β-Catenin mAK (Sigma, 1:1000 verdünnt), N-Cadherin mAK (Transduktion Labs, 1:2500 verdünnt), α-Tubulin mAK (Sigma, 1:3000 verdünnt), Dsc2a/b Kaninchenantikörper (rb36 von W.W. Franke, Heidelberg und Progen, 1:500 verdünnt), Dsg 2 mAK (Dsg3.10 von W.W. Franke aus Heidelberg, 1:10 verdünnt), Desmoplakin I mAK-Mix (2.17, 2.15, 2.20 von W.W. Franke aus Heidelberg, 1:10 verdünnt). Nach der Primär-antikörperinkubation wurden die Membranen 2x 10 min mit PBST gewaschen und dann 1 h mit den Sekundärantikörpern in PBST inkubiert. Die Sekundärantikörper (Dianova) waren Peroxidase-gekoppelt und wurden in einer Verdünnung von 1:5000 bis 1:15000 eingesetzt. Nach der Sekundärantikörperinkubation wurden die Membranen 3x 10 min mit PBST gewaschen und danach mit ECL-Chemilumineszenzreagenz für 1 min inkubiert bevor Filme (Kodak) in der Dunkelkammer belichtet und entwickelt wurden. Die Belichtungszeit variierte je nach Stärke des Signals zwischen 1 sec und 5 min. Nach Bedarf wurde die Membran 30 min in einem 50°C warmen Wasserbad gestrippt (100 mM 2-Mercaptoethanol, 2% SDS, 62.5 mM Tris-HCl pH 6.8), mit PBST gewaschen und mit einem neuen Antikörper inkubiert. Für die Lyse von adulten Herzen, humanen Herzbiopsien oder gesamten Embryonen wurde RIPA-Lysepuffer (100 ml: 5 ml 1 M Tris pH 7.4, 3 ml 5 M NaCl, 1 ml 10% SDS, 1 ml 100% NP40, 500 mg Dioxycholinsäure DOC, Fluka) verwendet und die Proben wie zuvor beschrieben, weiterverarbeitet. Ladekontrollen waren α-Tubulin, Erk sowie N-Cadherin.

Semiquantitative Real-Time PCR

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Herzen von E10.75-Embryonen wurden zunächst in PBS präpariert und in Flüssigstickstoff tiefgefroren, bis die Embryonen mittels PCR genotypisiert wurden. Dann wurden jeweils vier Herzen von homozygoten Plakophilin 2-Embryonen und Herzen von Wildtyp-Embryonen in 450 µl Trizol (siehe Northern-Blot) gepoolt und kräftig (20 min) gevortext, bis das Gewebe völlständig aufgelöst war. Die RNA-Isolierung erfolgte nach dem Protokoll des Herstellers. Für die Fällung wurde lineares Acrylamid als Fällungshilfe genutzt. Die gefällte RNA wurde in 12 µl ddH2O (mit 1% DEPC versetzt) aufgenommen. Für die cDNA Synthese wurden jeweils 6 µl eingesetzt, wobei jeweils ein weiterer Ansatz mit den restlichen 6 µl als Kontrolle ohne Zugabe von RT-Polymerase mitgeführt wurde. Für die cDNA-Synthese wurden zunächst zu je 6 µl RNA in ddH20 0.5 µl (1 µg/µl) Poly(T)-Primer pipettiert, 5 min bei 70°C, 2 min auf Eis und 2 min bei RT (21°C) inkubiert. Danach wurde folgender Prä-Mix (13.3 µl mit und ohne RT-Polymerase) hinzugefügt und 1 h bei 42°C inkubiert sowie danach 5 min auf Eis abgekühlt: 4.5 µl ddH20, 2 µl 100 µM DTT, 1 µl RNAse Inhibitor (40 U/µl), 0.8 µl 25 mM dNTPs, 4 µl 5x Puffer, 1 µl Superscript II-RT-Polymerase (Gibco). Für die semiquantitative RT-PCR für α-Tubulin (als interne Kontrolle), Desmoglein 2 und Desmocollin 2a/b wurden folgende Oligonukleotide so gewählt, dass Vorwärts- und Rückwärts-Primer in unterschiedlichen Exonen lagen und somit die Amplifikation von genomischer DNA durch dazwischenliegende Intronsequenzen verhindert wurde. Desmocollin 2a/b: mDsc2a/b FW: 5´-AGG GCA AAG AGA CCA TTG AGA-3´, mDsc2a/b RV: 5´-GGT CAC TAC AGC AAC CCA CA-3´, Produktgröße von Dsc2a, 290 bp, Dsc2b, 336 bp; mDsg2 FW: 5´-CGA AGC CGT AAG GAC AAG AG-3´, mDsg2 RV: 5´-CGA CCT AGG CAA ACT TCA GC-3´, Produktgröße von Dsg2, 297 bp; mTub FW: 5´-AAG GAG GAT GCT GCC AAT AA-3´, mTub RV: 5´-TGG AAT TGT AGG GCT CAA CC-3´, Produktgröße von α-Tubulin, 277 bp. Die PCR-Reaktionen wurden jeweils für cDNAs aus Wt- und Plakophilin 2-/--Herzen sowie den jeweiligen Kontrollen ohne RT-Polymerase angesetzt. Eine PCR-Reaktion setzte sich wie folgt zusammen: 1.5 µl 10x Taq-Puffer, 0.6 µl 50 mM MgCl2, je 0.5 µl Primer, 0.2 µl 25 mM dNTPs, 0.2 µl Taq-Polymerase, 10.5 µl ddH20, 1 µl Template (unverdünnt, direkt aus den Ansätzen mit und ohne RT-Polymerase). Programm: 95°C 2 min, (96°C 10 s, 60°C 30 s, 72°C 30 s), 4°C. Pro Primerpaar wurden zusätzlich drei Ansätze vorbereitet, die nach unterschiedlichen Zyklenzahlen (25, 30, 35 Zyklen) abgestoppt wurden und auf einem 2% Agarosegel elektrophoretisch aufgetrennt wurden.

Sequenzanalysen der ARVC-Patienten

Für klinische und genetische Studien wurden ARVC-Patienten aus den Universitätskliniken Berlin-Buch, Münster, Boston und NYC aquiriert. Rechts-ventrikuläre Herzbiopsien wurden während einer diagnostischen Herzkatheter-Untersuchung entnommen159. Sequenzanalysen und systematische Analysen der zwei ARVC-Familien und Biopsieentnahmen wurden von der Arbeitsgruppe L. Thierfelder vollzogen159. Für Sequenzanalysen wurde genomische DNA von venösen Blutproben isoliert und die Exone des PKP2-Gens nach Standardprotokollen amplifiziert (Taq PCR Core Kit, QIAGEN, Hilden). Die Oligonukleotide umfassten die Exone und flankierende 60-100 bp der Intronsequenzen. PCR-Produkte wurden aufgereinigt und beide Stränge direkt mit dem BigDye-Terminator-DNA-Sequenzier-Kit mit Hilfe des 3100 Avant Genetic Analyzers (Applied Biosystems, Foster City, CA, USA) sequenziert. Für Mutationsanalysen wurde die Sequencher 4.1 Software genutzt. Bei PKP2-Deletions/Insertions-Mutationen wurden beide Allele der 12 ARVC-Patienten in Vektoren subkloniert und direkt sequenziert.


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06.02.2006