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1.  Einleitung

1.1. Zellkulturmodelle

Das kultivieren von primären Zellen außerhalb ihrer physiologischen Umgebung, dem Organ und dem lebenden Organismus als Ganzes, erfordert die Bereitstellung von einer nachempfundenen künstlichen Lebensumgebung, die der Situation in vivo so nahe wie möglich kommt. Basale Bedürfnisse der Zellen, beispielsweise die Deckung des Energiebedarf, der Aufrechterhaltung des Membranpotentials und der Temperatur sind- zumindest für einen bestimmten Zeitraum bereits für viele Zellarten mit dem relativ einfachen Mittel der Kulturschale zu erreichen. Die Kulturschale als statische Zellkultur unterliegt aber vielen Beschränkungen, deshalb wurden verschiedene andere Kulturmodelle entwickelt. Die dynamische Zellkultur hat den Vorteil der kontinuierlichen, steuerbaren Zufuhr von Kulturmedium und Gas. Eine dynamische Zellkultur hat das meiste Potential für die Entwicklung eines hybriden Leberunterstützungssystem (LUS), das dieser Arbeit zugrunde liegt. Die Möglichkeit, der Perfusion der Zellkultur mit humanem, durch eine vorgeschaltete Plasmaseperation gewonnenen Plasma, statt mit Kulturmedium macht einen klinischen Einsatz als Leberunterstützungstherapie möglich.

1.1.1. Statische Zellkulturen

Zellkulturen von primären Leberzellen wurden als Technik zur einfacheren Analyse der Leberfunktion entwickelt. Die ersten Hepatozytenkultursysteme bestanden nur aus isolierten Leberzellen, die in Kulturschalen mit Serum oder wegen der besseren Reproduzierbarkeit und Ausgangssituation für viele Experimente, bald darauf mit definiertem Medium überschichtet wurden. In Suspensionskulturen, wo die Hepatozyten keine Möglichkeit zur Reorganisation oder Adhäsion haben, kommt es bereits nach wenigen Stunden zum Verlust der Zellfunktion. Der Nutzen dieser einfachen Kultursysteme ist auf kurze Zeit begrenzt, morphologische und funktionelle Änderungen der Zellen treten bereits während der ersten Tage in Kultur auf12. Der Verlust der spezifischen Funktion der Hepatozyten in einer so einfachen Kulturumgebung deutet auf das Fehlen von Faktoren hin, die in vivo vorhanden sind und die hepatozelluläre Funktion unterstützen. Zahlreiche Wissenschaftler haben sich dieser Fragestellung angenommen und versucht, die Kulturverhältnisse der in vivo Situation näher zu bringen.

Dazu gehörte zuerst die Verbesserung des Mediums durch Zugabe von einer Vielzahl von Substraten3, und der Zugabe von Hormonen wie Insulin45 oder Glukokortikoide678. Durch diese Mediumzusätze konnte die Funktion der Zellen auf 1 bis 2 Wochen verlängert werden und bestimmte Effekte wie die Steigerung der Albumin Synthese erreicht werden.

Um die Zellkultur noch länger in Funktion und Differenzierung zu halten wurde die Methode der Anheftung der Zellen an eine Oberfläche ähnlich dem Bindegewebe entwickelt. Geeigneter als Kunststoff erwiesen sich Adhäsionsflächen organischer Herkunft, wie Typ I Kollagen9. Kollagen verbessert die initiale Adhäsionsfähigkeit und verlängert die Funktion der Zellen in den Bereich von Wochen. Dadurch wurde es zum ersten Mal möglich, Cytochrom P450 durch Phenobarbital in kultivierten Zellen zu induzieren10. Durch die Verbesserung der organischen Adhäsionsfläche in eine komplexe Biomatrix, bestehend aus aufbereiteten Kollagen Fasern und sauren Proteinen wie Fibronektin und kleine Mengen an Glycosaminoglykanen gelang es Hepatozyten von Ratten über 5 Monate zu kultivieren11. Der Nutzen von einer komplexen extrazellulären Matrix für die parenchymalen Zellen zeigte sich sehr deutlich.

Für die interzellulare Kommunikation via Gap- Junctions ist das Vorhandensein der Extrazellularen Matrixkomponenten Glycosaminoglykane und Proteoglykane vor allem entscheidend. Die Korrelation der Menge an mRNA die für Gap- Junction Protein kodiert (bestimmt mit Northern Blots) und der Menge an 27-kD Gap Junction Polypeptid (bestimmt mit Western Blots) mit dem Grad der Elektrischen- und intracellularer Farbstoff Kopplung zeigt, dass aktive Glykosaminoglykane und Proteoglykane die Expression und Synthese von Gap- Junctions induziert12.

Ein weiterer Schritt in Richtung physiologische Umgebung war das Bereitstellen von Zellen des Bindegewebes als Co- Kultur13141516, die Zell- Zell- Kontakte ermöglichten. In herkömmlicher Kultur verlieren die Hepatozyten rasch die für sie typischen Gap- Junctions12, mit Co- Kultur halten die Gap- Junctions unbegrenzt. Ein weiteres wichtiges Funktionsmerkmal, die für parenchymale Zellen übliche kubischen Form wird durch die Co- Kultur erhalten17. Gap- Junctions können auch [Seite 11↓]durch verschiedene Medienzusätze wie Hyaluronate länger erhalten werden 18, jedoch nur im Bereich von Tagen, die Effizienz der Co- Kultur wird dabei bei weitem nicht erreicht.

Durch Co- Kultur lassen sich wichtige Mechanismen der zellulären Kommunikation erhalten. Zu diesen Mechanismen gehört

  1. direkter Kontakt durch Tight- Junctions und Desmosomen
  2. elektrische und mechanische Kopplung
  3. extrazelluläre Matrix wie z.B. Basalmembran und Grundsubstanz
  4. sekretorische Signale; Autokrin, Parakrin und Endokrin.

Die einzelnen Leistungen der Zellen sind zum Teil einzigartig für eine Zellreihe wie viele metabolische Funktionen von Hepatozyten, andere Leistungen wie die Kollagensynthese und Sekretion finden in parenchymalen und nicht- parenchymalen Zellen statt wie Hepatozyten und Sinusendothelzellen19.

Mittels Zeitraffer- Mikroskopie ist es möglich, die Migration, Mitose- und Abstoßungs- Verhalten einer Zellart oder einer Co- Kultur über ein bestimmtes Zeitintervall zu messen 20.

Die räumlichen Ordnung der Zelle hat einen großen Einfluß auf ihre Funktion212223. Der beste Weg, nach A. Guillouzo24 diese Funktion zu erhalten scheint die Benutzung von Matrigel25 in der Sandwich Technik zu sein. Die Sandwich Technik, bei der die Leberzellen auf eine Schicht Kollagen aufgebracht werden und dann mit einer weiteren Schicht bedeckt werden hat gegenüber der einfachen Kollagen Schicht mehrere Vorteile, wie die Vermeidung von physikalischen Scherkräften beim Mediumwechsel und wesentlich längere Beibehaltung differenzierter Funktionen 2627. Objektiviert ausgedrückt mittels des Anteils der Albumin Transkriptions-Aktivität: für frisch isolierte Zellen war die Transkriptions- Aktivität verglichen mit intakten Leberzellen bei 40%, im einfachen Kollagen Schicht System bei 5% an Tag 7, im Sandwich Schicht System bei 40% zwischen Tag 7 und Tag 21 28.

Andere erfolgreiche Modelle der Kultivierung von Hepatozyten beruhen auf Enzyminduktion. Dimethylsulfoxid (DMSO) scheint den Effekt von beidem durch pharmakologische Induktion von Differenzierung zu simulieren29. Die Albumin Sekretion ist bei diesem Modell bei 35% und bleibt stabil, Gen Expression für Hepatozyten spezifische Funktionen ist auf hohem Niveau erhalten30.

Der Zusatz von Hepatocyte Growth Factor (HGF) reguliert die Expression von Cytochrom P450 Isoenzymen in der Zellkultur herunter31, Cytochrom als Phase I Enzyme werden beeinflusst, jedoch nicht Phase II Enzyme wie UDP- Glucuronyltransferase oder Glutathione-S-Transferase (GST). Die Suppression verringert auch stark die Effekte der Enzyminduktion durch Substrate an den Cytochrom P450 Isoenzymen 32. Auf der anderen Seite bewirkt HGF die Stimulation der Zellen in die Mitose einzutreten. Nach 96 Stunden Inkubation mit HGF steigt die Anzahl der Hepatozyten die den G0/G1 Status verlassen und in die S und G2 sowie M Phasen eintreten 33.

Der Einfluss von Kohlendioxid und Sauerstoffgehalt in der Begasung der Zellkulturen auf den Energiestoffwechsel ist ebenfalls bedeutsam34 und sollte den physiologischen Bedingungen so nahe wie möglich kommen..

Landry et al35 beschreibt Techniken, Leberzellkulturen zu räumlichen, gewebeähnlichen Aggregaten zu reorganisieren. Dabei ist die Oberfläche poly-HEMA (poly-2-hydroxyethyl methacrylate) beschichtet, so dass die verwendeten postnatalen Rattenleberzellen abgewiesen werden und statt an der Oberfläche zu aggregieren sich in Sphäroide organisieren. In derselben Studie wird auch semiquantitativ auf den Einfluss von Glucocorticoiden und Glucagon bezug genommen, da der Anteil der Parenchymalen zu Nicht- Parenchymalen Zellen sich bei Mangel an diesen Hormonen zugunsten der Nicht- Parenchymalen Zellen verschiebt.

Seit wenigen Jahren ist auch die gezielte Erforschung der räumlichen Konfiguration von Co-Kulturen durch Mikrofabrikations- Techniken36, beruhend auf photolithographische Verfahren, möglich.

Die statische Zellkultur hat ihre Anwendung vor allem bei wissenschaftlichen Fragestellungen wie Pharmakologischen Untersuchungen oder bei der Aufklärung von Stoffwechselwegen sowie zunehmend zur Synthese von Proteinen und Antikörpern. Das Verfahren der Wahl zur Zellkultur ist [Seite 12↓]von der Fragestellung der geplanten Studie abhängig, Vor- und Nachteile der einzelnen Verfahren sind- soweit bekannt- abzuwägen37, pathologische und physiologische Effekte in vitro sind zu differenzieren.

Die definierten Bedingungen der Kulturmethoden für viele Zelltypen beinhalten eine Reihe von löslichen Regulatoren und Substrate von definierten Matrixkomponenten die durch den Zelltyp und den zu regulierenden physiologischen Prozess bestimmt werden38 und der Anpassung bedürfen.

Ein Nachteil der statischen Schalenkultur ist die geringe Substratmenge, die von der kleinen Zellmenge bewältigt werden kann.

1.1.2. Dynamische Zellkulturen

Die Technik der isoliert perfundierten Leber ist schon seit langem in Gebrauch. Dabei wird die Leber, vor allem Rattenleber, kanüliert und in einer Perfusionapparatur verbracht, wo sie dann mit Vollblut durchströmt wird. Die wohl ausgereifteste und komplexeste Perfusionsapparatur, die viele Aspekte der in vivo Situation der Leber berücksichtigt, ist die von Neuhaus394041, die Schweinelebern verwendet und zur temporären Therapie des Leberversagens gedacht ist. Die hauptsächlichen Vorteile der isoliert perfundierten Leber sind die erhaltene Organstruktur und die Möglichkeit den Gallenfluss separat zu sammeln und zu analysieren41. Die Dauer der Nutzung ist aber wegen Hämodynamik und Immunokompatibilität auf kurze Zeit begrenzt. Die klinische Anwendung als Leberunterstützung war jedoch bei den meisten Autoren wenig erfolg versprechend42 oder eher zum kurzfristigen Bridging vor Transplantationen geeignet.

Um die Vorteile der Organperfusion und die Vorteile der statischen Kulturen zu verbinden beziehungsweise zumindest zu einem großen Teil zu vereinen wurden hybride Zellkultursysteme entwickelt, die sowohl aus künstlichen Materialien wie auch aus biologischen Komponenten bestehen. Die hybriden dynamischen Leberzellkulturen wurden vor allem mit dem Ziel der Leberunterstützung bei Patienten konzipiert. Laut Arkadopoulus43 wurden schon seit den Fünfziger Jahren des letzten Jahrhunderts Leberunterstützungssyteme konstruiert, welche isolierte oder gezüchtete Leberzellen und Leberscheiben in verschiedenen Bioreaktoren perfundierten. Der wohl erste Versuch auf diesem Gebiet war von Nose et al44 in den 60er Jahren. Sie füllten eine kryokonservierte Hasen-Leberzellsuspension in einen Dialysator, der mit Cellulose Membranen ausgestattet war, die für Moleküle mittlerer Größe durchlässig waren. Das System eines modifizierten Dialysators haben viele Arbeitsgruppen beibehalten, darunter Mikami und Matsumura. Der Ansatz von Brunner et al45 bestand aus zellulären Komponenten und immobilisierten Leberenzymen, dieser Ansatz leistete aber nur Detoxifikation, komplexe Regulationsmechanismen und Syntheseleistung stehen dabei außen vor. Ein auf Leberscheiben basierendes Gerät entwarf Soyer et al46, Eiseman et al47 experimentierte mit isolierten Hepatocyten in verschiedenen Geräten, darunter eine Zentrifuge, einem Dialysator und einer Perfusionskammer. Basierend auf vielen parallel geschalteten Monolayerkulturen entwickelte Uchino et al48 ein Gerät, welches aber nie seinen Weg in die klinische Erprobung fand.

Als Zellquelle dienten den meisten Wissenschaftlern primäre xenogene Hepatocyten oder Hepatom-Zelllinien. Primäre Humanhepatozyten, die bei Split-Liver-Transplantationen oder nicht zur Transplantation geeigneten Organen anfallen stehen nur gelegentlich und begrenzt zur Verfügung. Hepatomzelllinien bereiten Schwierigkeiten im Hinblick auf die Biologische Sicherheit, insbesondere bei immunsupprimierten Patienten nach der Lebertransplantation. Außerdem scheint die hepatocytenspezifischen Funktionen nur teilweise erhalten zu sein. Sussman et al49 konstruierte als erster ein hybrides Leberunterstützungssystem mit C3A Zellen, Abkömmlinge einer Hepatoblastomzelllinie. In einer randomisierten klinischen Studie50 des King’s College Hospital, London, UK, wurde bei der Überlebensrate in der Therapie des akuten Leberversagens fast kein Unterschied zwischen intensivierter konventioneller Intensivtherapie und Leberunterstützungstherapie mit dem Gerät von Sussman festgestellt. Versuche mit Hepatoma Zellen der HepG2 Zelllinie ergaben außerdem eine verkürzte Lebensdauer der Zellen unter Toxinbelastung, ein erhöhten Glukose Verbrauch verbunden mit gesteigerter Laktat Bildung, geringere Urea Synthese, geringere Protein Synthese sowie ein nicht induzierbares Cytochrom P450 System51. In der gleichen Studie von Stange et al wurden neben HepG2 Zellen auch Immortalisierte Hepatozyten von Transgenen Mäusen und primäre Hepatozyten von Ratten verglichen. Die Immortalisierten Zellen hatten ebenfalls einen erhöhten Verbrauch von Glucose und eine gesteigerte Produktion von Laktat, sowie eine mittelmäßige Harnstoffsynthese und die P450 Induktion war bei weitem nicht so effektiv wie in primären Zellen, die in allen gemessenen [Seite 13↓]Bereichen die besten Ergebnisse zeigten.

Die Isolation von großen Mengen Leberzellen wurde kontinuierlich verbessert. Es ist auch möglich, einzelne Zellarten für bestimmte Fragestellungen zu gewinnen 52.

Xenogene primäre Zellquellen, vor allem von Schweinen sind von den meisten Arbeitsgruppen bevorzugt. Sie sind wegen ihren bemerkenswerten morphologischen und funktionellen Homologenität mit humanen Leberzellen beliebt. Die Biokompatibilität ist allerdings noch nicht völlig geklärt.

Obwohl die Zellen in dem von Gerlach konstruierten Bioreaktor53 -der dieser Arbeit zugrunde liegt- in separaten, durch Membranen abgeschirmten Kompartimenten residieren und von besonderen SPF- Tieren stammen ist die im Zusammenhang mit der Xenotransplantation geführte Diskussion über Xenoinfektionen54555657, insbesondere die Entwicklungen über den Porcinen Endogenen Retrovirus (PERV)5859 zu beachten. Der von Gerlach konstruierte Bioreaktor 60 erlaubt durch seine Bauweise dezentralisierten Stoffaustausch, separate Gasversorgung über spezielle Oxygenierungsmembranen sowie verschiedene Betriebsmodi. Eine Tierexperimentelle Erprobung als hybrides Leberunterstützungssystem fand bereits erfolgreich statt61. Auch eine klinische Erprobung mit 8 Patienten erfolgte bereits, eine xenogene PERV Infektion konnte nicht nachgewiesen werden62. Für die weitere Entwicklung und Nutzung von xenogenen Zellen ist ein Modell zur Testung der Immunbarriere mittels präparierten Lymphozyten mit Hepatozyten in Alginate Beads beschrieben 63.

Dynamische Zellkulturen in Bioreaktoren mit drei Dimensionaler Co- Kultur eignen sich auch- in Labor Skalierung- zu Pharmazeutischen Untersuchungen in vitro. Durch Methylcholanthren Induktion konnte die Aktivität der 7-Ethoxyresofurin O-deethylase um das 20 fache gesteigert werden, sowie weitere Funktionen auf hohem Niveau nachgewiesen werden64.

1.2. Möglichkeiten der Bewertung der Zellfunktion

Die Kriterien zur Bewertung der Viabilität von Zellen in Kultur lassen sich in drei systematische Kategorien einteilen65: (1) Morphologisches Erscheinungsbild, (2) Integrität der Plasmamembran und (3) funktionelle Kapazität. Einheitliche Standards haben sich für die Evaluation von Leberzellkulturen noch nicht herausgebildet. Um eine möglichst umfassende Aussage treffen zu können ist der Einsatz von mehreren Tests, die unterschiedliche Bereiche der Zellviabilität abdecken, wünschenswert. Viele Techniken aus dem Bereich der Gewebe- und Organ Viabilitätstests sind mit Zellkulturen nicht brauchbar66, andere wie z.B. Mikroskopie sind geeignet.

1.2.1. Morphologisches Erscheinungsbild

Eine einfache und effektive Methode ist die Lichtmikroskopie, mit oder auch ohne Färbung. Mit der Durchstrahlelektronenmikroskopie (TEM) und der Rasterelektronenmikrioskopie (SEM) kann die interne Struktur der Zelle und die räumliche Zellorganisation dargestellt werden. Während die Lichtmikroskopie schnell und einfach durchzuführen ist kommt die Elektronenmikroskopie für die Routine der Zellevaluation wegen des Aufwands nicht in Frage. Ergebnisse einer Studie liegen für den von Gerlach entwickelten Bioreaktor bereits vor676869, weitere systematische Arbeit ist im Gange.

Die morphologische Bewertung ist jedoch bei Zellkulturen in Bioreaktoren nur vor der Zelleinfüllung und nach Versuchsende, wenn der Bioreaktor geöffnet werden kann, möglich. Biopsien, die eine representative Gewebe- Probe liefern sind aus Gründen der besonderen Konstruktion und wegen der Notwendigkeit der Erhaltung der keimfreien Umgebung während der Kulturphase gegenwärtig fast nicht realisierbar. Deshalb eignet sich die Mikroskopie nicht als Routine Parameter in der täglichen Qualitätssicherung der Leberzellkultur für den klinischen Einsatz.

1.2.1.1. Lichtmikroskopie

Mit dem Lichtmikroskop sieht man wie viele Zellen einzeln, manche als Doublet oder in Aggregaten vorliegen. Die Phasenkontrastmikroskopie ist wesentlich besser geeignet um die Zellen zu bewerten. Unzerstörte Hepatozyten sind oval oder kugelförmig, haben einen Helligkeitskontrast zwischen Zellkern und Zytoplasma und einen Refraktionsbedingten Ring um die Zellmembran. Bei geschädigten Hepatocyten muss man zwischen irreversiblen und reversiblen Schäden [Seite 14↓]unterscheiden. Herman et al 70 unterscheidet drei Stufen der Schädigung. Die erste Stufe ist charakterisiert durch zahlreiche schmale Blasen, in der zweiten Stufe konfluieren die schmalen Blasen und bilden eine oder mehrere größere Blasen, die sich aus der Zellmembran stülpen. In der dritten Stufe verschwinden die Blasen, die Plasmamembran wird diskontinuierlich und ein genereller Einstrom in die Zelle findet statt. Im Phasenkontrast zeigen sich Zellen der Schädigungsstufe drei hochgranulär, der Kontrast zwischen Medium und Zellen sowie zwischen Zellkern und Zellplasma geht verloren. Während Stufe eins und zwei noch reversibel sind ist Stufe drei irreversibel. Bei gekühlten Hepatozyten findet sich oft eine generelle leichte Schwellung an Stelle der Blasenbildung.

Das morphologische Erscheinungsbild der Zellen vor der Einfüllung in den Bioreaktor ist ein wichtiges Kriterium. Nur eine Zellsuspension mit geringem Grad an Schädigung sollte ihren Weg in den Bioreaktor finden.

1.2.1.2. Trypan Blau

Der Standard zur Identifizierung defekter Zellen und seit langem gebräuchlich ist der organische Farbstoff Trypan Blau. In vielen Publikationen über primäre Zellkulturen wird er für die Angabe der initialen Viabilität nach der Isolierung der Zellen verwendet.

Der Test ermöglicht eine Aussage über die Aufrechterhaltung des negativen inneren Plasmamembranpotentials7172. Durch die negative Ladung von Trypan Blau kann der Farbstoff nur in die Zellen penetrieren wenn das aktiv aufrechterhaltene innere Membranpotential zusammengebrochen ist. Eine weiterführende Aussage über andere metabolischen Funktionen und die zu erwartende Qualität der Zellen lässt der Test nicht zu. Manche Autoren verknüpfen mit dem Trypan Blau Test auch die Integrität der Plasmamembran. Elektronenmikroskopische Aufnahmen beweisen aber, dass auch Zellen mit morphologisch intakter Plasmamembran Trypan Blau aufnehmen können, ein Indiz, dass das Membranpotential das wesentliche Kriterium ist. Man kann aber dennoch davon ausgehen, dass Zellen die Trypan Blau aufnehmen irreversibel geschädigt sind. Eine Schädigung von mehr als 10% der Zellen bei der initialen Prüfung mit Trypan Blau gibt Berry73 als bedenkenswerte Grenze bei Hepatozyten von Ratten für die weitere Verwendung der Zellsuspension an. Dieses Kriterium sollte als Freigabekriterium für eine Zellsuspension gelten. Es wurde in dieser Form auch in die Routineprotokolle als In Prozess Kontrolle vor der Zelleinfüllung in den Bioreaktor integriert.

1.3. Biochemische Untersuchungen - Integrität der Plasmamembran

Enzymliberation

Im klinischen Alltag hat die Bestimmung der Enzyme im Serum einen wichtigen Stellenwert. Auch in der Zellkultur ist die Bestimmung der freigesetzten Enzyme wegen der etablierten und einfachen Tests ein sehr hilfreiches Werkzeug um Zellschäden und ihre Ausmaße zu beurteilen. Enzyme verlassen über physiologische Exportmechanismen die Zellen oder werden bei einem Zellschaden freigesetzt74. Bei einem Zellschaden werden zuerst die Enzyme des Zytoplasma freigesetzt, dann die Mitochondrialen und als letztes die membrangebundenen Enzyme, damit kann man aus dem Enzymmuster auf die schwere des Schadens schließen.

In der klinischen Diagnostik verwendet man verschiedene Quotienten für eine enzymologische Differentialdiagnose von Lebererkrankungen durchzuführen. Der de Ritis- Quotient (AST/ALT) ist bei akuten Virushepatitiden typischerweise kleiner als 0,7. Für andere Erkrankungen sind typische Bereiche beschrieben.

Der Quotient dient klinisch der Abschätzung des Schweregrads der Einzelzellschädigung. Hohe Werte zeigen eine relativ geringe, kleine Werte dagegen eine tief greifende Zerstörung des Parenchyms der Leber an.

Der Quotient ist bei den meisten Erkrankungen zwischen 1 und 6, bei Metastasenlebern typischerweise über 20.

Die Verwendung der einzelnen Parameter der Enzymliberation in der täglichen Routine der Zellkultur wird in einer eigenständigen Arbeit dargestellt und ist eine wichtiger Beitrag zur laufenden Qualitätskontrolle und ein einfaches Mittel zur täglichen In-Prozess Kontrolle. Die Bedeutung der einzelnen Enzyme wird nachfolgend kurz skizziert:


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AST

Die Messung der Aktivität der Aspartat- Aminotransferase erfolgt im zusammengesetzten optischen Test, bei dem L- Aspartat und α- Ketoglutarat durch die AST zu Oxalacetat und L-Glutamat umgesetzt werden. Im nächsten Schritt, einer Malat- Dehydrogenase katalysierten Indikatorreaktion reagieren Oxalacetat und NADH + H+ zu Malat und NAD+.

Die AST ist eine Zellständiges Enzym, das nur bei Zellschädigung freigesetzt wird, und bei fast allen Erkrankungen der Leber und der Gallenwege erhöht ist.

ALT

Die Bestimmung der Alanin- Aminotransferase erfolgt im zusammengesetzten optischen Test, bei dem L- Alanin und α- Ketoglutarat zu Pyruvat und L-Glutamat umgesetzt werden. In einer LDH Katalysierten Indikatorreaktion reagieren Pyruvat und NADH + H+ zu Laktat und NAD+.

Erhöhung der ALT- Aktivität sind klinisch ein Indiz für Schäden des Parenchyms der Leber mit Membranpermeabilitätsstörung.

GLDH

Die Glutamat- Dehydrogenase ist in den Hepatozyten ausschließlich in den Mitochondrien lokalisiert. Die GLDH Aktivität wird optisch gemessen, unter der katalytischen Wirkung der GLDH werden 2-Ketoglutarat und NADH + NH4+ zu L-Glutamat und NAD+ umgesetzt.

GLDH wird bei schwerwiegenden Schäden des Parenchyms der Leber verstärkt freigesetzt.

LDH

Die Lactat- Dehydrogenase wird nach der Reaktion

Pyruvat + NADH + H+ → Laktat + NAD+

Photometrisch über die Abnahme der Extinktion des NADH quantitativ bestimmt.

Wegen des ubiquitären Vorkommens der LDH spielt dieses Enzym in der klinischen Leberdiagnostik keine besondere Rolle. Da die Enzyme in der Ko- Kultur der Zellen jedoch vorwiegend aus den Hepatozyten stammen ist die Lactat- Dehydrogenase zur Bestimmung von Zellschaden prinzipiell interessant.

γ-GT

Die γ- Glutamyl- Transpeptidase ist in den Epithelien der intrahepatischen Gallenwege in hoher Aktivität nachweisbar. Es katalysiert die Reaktion

γ-Glutamyl-3-carboxy-4-nitroanilid + Glycylglycin → γ-Glutamyl-glycinglycid + 3-Carboxy-4-nitroanilin

Die Enzymatische Reaktion wird durch kontinuierliche Messung der Extinktionszunahme bei 405 nm verfolgt. In der Klinik ist die γ-GT das Leitenzym für pathologische cholestatische Prozesse oder durch Enzyminduktion für Alkoholabusus.

1.4. Metabolische Untersuchungen

Die Testung der metabolischen Funktionen der Zellkultur hat einen wichtigen Stellenwert, da auf die klinisch etablierten Punkte Scores, die auf vor allem auf Anamnese und Befund basieren, nicht zurückgegriffen werden kann. Auch erfassen die quantitativen Leberfunktionstests physiologische Funktionen direkt, was die Chance für ein besseres Verständnis der pathophysiologischen Prozesse gibt75.

Das Profil für Tests für Dynamische Zellkulturen weicht durch die komplexe Massenverteilung in großem Maße von statischen Kulturen ab. Deshalb ist eine Orientierung an klinischen Leberfunktionstest (LFT) sinnvoll, die bei vielen Autoren bereits für die in vitro Leberperfusion herangezogen wurden. Die Eliminationskinetik der Testsubstanzen muss bekannt sein und um unabhängig von der Konzentration zu messen muss sie einer Kinetik erster Ordnung folgen. Außerdem gelten in Bezug auf die Sicherheit die gleichen Anforderungen wie in der klinischen [Seite 16↓]Verwendung, da die getesteten Reaktoren für die Therapie von Patienten im akuten Leberversagen genutzt werden sollten und somit der Sicherheit die höchste Priorität eingeräumt werden muss.

1.4.1.  Grundlagen der Leberfunktionsteste (LFT) in vivo

Metabolische Leberfunktionsteste funktionieren auf der Basis der Bestimmung der Clearance. Dabei wird die eliminierte Stoffmenge pro Zeiteinheit durch die Blutkonzentration geteilt, man erhält so eine von der Konzentration unabhängige Aussage über die Aktivität eines Enzyms oder eines physiologischen Transport- Vorgangs.

Winkler et al 76 haben die LFTs nach ihren Perfusions- Eliminations- Beziehung und der damit verbundenen diagnostischen Aussage kategorisiert. Sie teilen die Testsubstanzen nach ihren kinetischen Eliminations Konstanten (Vmax, Km) und des hepatischen Blutflusses in drei Kategorien ein, das (1) Flussbegrenzte Schema, das (2) Generelle Schema und das (3) Enzymbegrenzte Schema. Die Grundlage der Schematisierung bildet die Voraussetzung des Zutreffens der Michaelis- Menten Gleichung bei den getesteten Enzymsystemen. Die Michaelis- Menten Gleichung beschreibt im Fließgleichgewicht den Zusammenhang der Reaktionsgeschwindigkeit und der Substratkonzentration mit zwei Parametern, der Enzymatischen Aktivität (Vmax) und der Affinitätskonstanten (Km).

Die direkte Messung von Vmax durch hohe Konzentrationen der Testsubstanz, welche das Enzymsystem absättigt, ist wegen der durch die erforderliche hohe Konzentration zu Befürchtenden unerwünschter Effekte toxischer, osmotischer oder hämodynamischer Art nur mit den wenigsten Substanzen möglich. Die Clearance Bestimmung mit geringeren Konzentrationen kann aus der Michaelis- Menten Gleichung abgeleitet werden:

[1]

v = Eliminationsgeschwindigkeit, c = Konzentration, Vmax und Km kinetische Konstanten des Enzyms.

Wenn die Konzentration sehr gering ist (c << Km) kann Formel [1] in

[2]

oder durch umstellen in

[2a]

umgewandelt werden. Der Ausdruck auf der linken Seite ist per Definition die Clearance, mit der Dimension Volumen / Zeit. Unter der Voraussetzung, Km ist ein konstanter Parameter, der von den physiochemischen Eigenschaften des Enzyms bestimmt wird, zeigt die Formel [2a], dass die Clearance proportional zu Vmax ist. Wird in vivo eine Substanz als Bolus Injektion in einer Konzentration verabreicht, die so niedrig ist, das der Abbau proportional zur Konzentration ist, so folgt nach einer initialen Verteilungsphase der Substanzabbau einer einfachen Exponentialfunktion (Funktion 1. Ordnung), von welcher die Clearance dann berechnet werden kann. Die Konzentration kann in vivo nicht unmittelbar homogen an den metabolisch aktiven Orten gemessen werden, was der komplexe Aufbau der Leber mit sich bringt. Praktisch messbar sind die Konzentrationen die in die Leber einfließen und die wieder aus der Leber herausfließen. Die Auflösung einer Differentialgleichung, die den Konzentrationsgradienten in der Leber beschreibt ergibt folgende Formel:

[3]

Cout= Konzentration nach der Leberpassage, Cin= Konzentration vor der Leberpassage, v= [Seite 17↓]Eliminationsgeschwindigkeit, F= hepatischer Blutfluss.

Die posthepatische Konzentration Cout ist bei einem Patienten nur mit größerem apparativem Aufwand (Katheterisierung der V. Hepatica) bestimmbar und bei kleinen Konzentrationen meist schwierig zu analysieren, aber nach dem Fickschen Prinzip

[4a]

kann man Cout aus der Formel [3] herauslösen:

[4b]

Die Formel [4b] ist gültig für Cin von Null bis Unendlich. Sie bietet damit eine generelle Lösung, welche aber die Eliminationsrate in einer komplizierten Weise in Relation zur Konzentration der Testsubstanz setzt.

Von dieser generellen Lösung lässt sich mit bestimmten Beschränkungen ein generelles Clearance Schema ableiten. Wenn die Eliminationsrate v klein ist (v/(F * Km) << 1, oder v/Vmax << 1) lässt sich die Clearance einfacher ausdrücken:

[5] generelles Clearance Schema

Diese Formel weicht von der Michaelis- Menten- Gleichung für kleine Konzentrationen, der Formel [2] durch die Implementierung des hepatischen Blutflusses ab. Die Abhängigkeit der Clearance vom hepatischen Fluss ist- wie bereits erwähnt- durch die Organarchitektur der Leber bedingt. Mit Substanzen des generellen Clearance Schemas kann man zwischen Leberperfusion und Leberfunktion nicht unterscheiden, um die Perfusion von der Funktion zu Differenzieren bedarf es speziellen Clearance Schemen, für Flussbegrenzte Clearance und für Enzymbegrenzte Clearance, die sich vom generellen Clearance Schema durch die kinetischen Eigenschaften der Testsubstanzen ableiten.

Bei niedriger first- pass Elimination einer Substanz, wenn Vmax einer gegebenen Substanz klein im Verhältnis zum Produkt von F * Km ist, dann kann die generelle Clearance Formel [5] zum Enzymbegrenzten Clearance Schema näherungsweise umgewandelt werden:

[6] Enzymbegrenztes Clearance Schema

Diese Formel ist identisch mit der Gleichung [2a]. Die Enzymbegrenzte Clearance variiert nicht mit dem hepatischen Blutfluss, sie ist somit ein Test der metabolischen Funktion unabhängig von der Kinetik.

Wenn bei der ersten Leberpassage fast das gesamte Substrat metabolisiert wird, wenn also Vmax/(F * Km) >>1, dann kann das generelle Clearance Schema [5] zu

[7] Flussbegrenztes Clearance Schema

reduziert werden. Das Flussbegrenzte Schema kann für die Bestimmung des hepatischen Blutflusses herangezogen werden, nicht jedoch für die Funktion, da Km und Vmax komplett aus der Gleichung verschwinden. Die Klassifizierung der Testsubstanzen hängt somit von der Kenntnis Ihrer Kinetik ab.

Im Bioreaktor ist die Kinetik unterschiedlich zur Leber in vivo. Statt Arterie, Portalvene und lobuläre Ultrastruktur und Vena Hepatica als ableitendes Gefäß gibt es einen rezirkulierenden Kreislauf, der kontinuierlich mit frischem Medium versorgt wird und in gleichem Maße altes Medium abfließt. Der Bioreaktor befindet sich im rezirkulierenden Kreislauf, innerhalb des Bioreaktors verteilt sich das Medium über verschiedene Kompartimente für Flüssigkeit, das Intrakapilläre- und das Zellkompartiment. Das Diffusionsverhalten ist abhängig von der Substanz, dem Molekulargewicht und der spezifischen Dichte. Die Kinetik einer Bolusgabe einer Substanz in eine dynamische Zellkultur kann weitgehend in zwei Phasen unterteilt werden, der initialen Distributions- Phase und [Seite 18↓]der darauf folgenden Eliminations- Phase77.

1.4.2. Lidocain und MEGX

Lidocain wird als Medikament in der Therapie von Herzrhythmusstörungen und als Lokalanästhetikum weit verbreitet eingesetzt. Die Kinetik von Lidocain in vivo ist gut beschrieben 78, die therapeutische Breite ist gering, Nebenwirkungen, insbesondere unerwünschte Effekte auf das zentrale Nervensystem sind häufig. Die terminale Halbwertszeit in gesunden Personen liegt bei ca. 90 min, abhängig von Autor und Studienkollektiv.

Der hepatische Metabolismus von Medikamenten und Umweltgiften wird von zwei Klassen von Enzymen katalysiert: den Oxidoreduktasen und Hydrolasen sowie den Transaminasen. Die Reaktionen katalysiert von den Oxydoreduktasen und Hydrolasen wird als Phase I bezeichnet, die Synthesereaktionen katalysiert von den Transaminasen wird als Phase II Metabolismus bezeichnet. Die meisten Reaktionen finden an mehr als einem Typ dieser Phasen statt, ein Synergistischer Effekt ist die Regel. Phase I Reaktionen erhöhen die Polarität eines Moleküls, somit die Wasserlöslichkeit und damit die Fähigkeit des Organismus die Substanz auszuscheiden. Gelegentlich entstehen dabei auch toxische Metaboliten. Die Produkte der Phase II Reaktionen sind generell weniger toxisch oder biologisch aktiv, verglichen mit der Ausgangssubstanz. In den meisten Fällen wird durch die Phase II Reaktion die Wasserlöslichkeit eines Substrats weiter erhöht, sogar jenseits von dem durch die Phase I Reaktion erreichten Metaboliten. Das wichtigste Enzym zum Metabolismus von Medikamenten ist das Cytochrom P450 System. Mehr als die Hälfte aller in der Leber metabolisierten Medikamente werden vom Cytochrom P450 System verstoffwechselt. Eine Menge offensichtlich unterschiedlicher Reaktionen werden vom Cytochrom P450 System katalysiert. Grundsätzlich handelt es sich dabei um eine Monooxygenierung des Substrats. Deshalb werden diese Enzyme auch Monooxygenasen oder „mixed-function oxydases“ genannt.

Im Stoffwechsel von Lidocain sind verschiedene Metaboliten bekannt. Je nach Spezies werden die einzelnen Metaboliten unterschiedlich stark erzeugt. Nach Kennaghan et al79 erscheint im 24 Stunden Sammel- Urin von Schweinen MEGX zu 14,9% der Ausgangsdosis, im Mensch nur 3,9%. Daten für die Intravenösen Konzentrationen im Schwein sind nicht verfügbar. Da MEGX als intermediärer Metabolit weiterverstoffwechselt wird eignet sich diese Substanz nicht für Bilanzierungen.


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Abbildung 1: Lidocain Stoffwechselwege nach Keenaghan

Der Metabolismus von Lidocain hat sich als guter Marker für die Cytochrom P450 Isoenzym Funktion erwiesen. Im Mensch ist vor allem C4P3A4 das verantwortliche P450 Enzym für die Umwandlung von Lidocain zu Monoethylglycinxylidid (MEGX)80, dem wichtigsten Phase I Metaboliten. Die gleiche Studie berichtet auch von beachtlichen interindividuellen Unterschieden.

Die Lidocain Elimination und die Synthese von Megx ist von der Konzentration von Insulin abhängig 81, die in der dynamischen Zellkultur aber konstant ist.

Im porcinen Tiermodell, dem Vergleich von in vivo Leberfunktion mit ex vivo perfundierten Leber ergab sich eine große Ähnlichkeit im Metabolismus, so dass Mets et al die perfundierte Schweineleber als Modell für Metabolische Untersuchungen suggerieren 82.

1.4.3. Galaktose

Galaktose ist im klinischen Gebrauch eine sichere Substanz, mit physiologischem Vorkommen. Nur bei Menschen die an der seltenen Galaktosämie leiden ist Unverträglichkeit zu erwarten. Beim Säugling und Kleinkind fällt Galaktose in größeren Mengen als Produkt der im Dünndarm stattfindenden Hydrolyse von Lactose an. Beim Erwachsenen muss für die Biosynthese von Glycoproteinen sowie- während der Lactationsphase- von Lactose benötigte Galaktose aus Glucose synthetisiert werden.

In vivo findet der Abbau von Galaktose vor allem in der Leber statt83. Galaktose und ein ATP wird dabei von der Galaktokinase zu Galaktose-1-Phosphat phosphoryliert. Dieses reagiert mit Uridindiphosphatglucose (UDPG) unter Bildung von Uridindiphosphatgalaktose (UDPGal) und Glucose-1-Phosphat. Diese durch das Enzym Galaktose-1-Phosphat-uridyltranspherase vermittelte Reaktion besteht also in einem Austausch von Galaktose und Glucose am Uridindiphosphat. Die [Seite 20↓]Folgereaktion ist eine Epimerisierung der aktivierten Galaktose. Durch die UDP-Galaktose-4-epimerase entsteht UDP-Glucose84.

Beim Abbau von Galaktose ist die Galaktokinase das geschwindigkeitsbestimmende Enzym8586. Die kinetischen Konstanten für diesen Stoffwechselweg im Schwein sind bekannt: Vmax= 585 µmol/min, Km= 0,24 mmol/l (Mittelwerte n=20), daraus resultiert der Quotient der Clearance Vmax/Km= 2,44 l/min 83. Daraus erfolgt eine Einordnung nach Winkler et al in das generelle Clearance Schema76. Dieses Schema gilt aber nur für kleine Testdosen ohne Absättigung des Enzymsystems.

Im allgemeinen klinischen Gebrauch wird die Galaktose- Eliminationskapazität(GEK) bestimmt. Die Standard Prozedur für die Bestimmung beginnt mit der intravenösen Injektion von 0,5 g/KG Körpergewicht. Nach der initialen Verteilungsphase von 20 Minuten liegt eine abgesättigte Michaelis-Menten-Kinetik vor, also eine Abbau-Kinetik nullter Ordnung, die durch eine lineare Beziehung zwischen Konzentration und Zeit gekennzeichnet ist. Zwischen der zwanzigsten und der sechzigsten Minute nach der Injektion wird mehrmals die Plasmakonzentration bestimmt. Diese Werte werden extrapoliert und die Eliminationszeit auf der Absissenachse abgelesen. Die GEK wird dann berechnet87:

Galaktose Eliminationskapazität (GEK)

D= initiale Dosis i.v., Er= renale Eliminatin, te= extrapolierte Eliminationszeit, k= Korrekturfaktor für Fehler durch Verteilung (5 min). Die GEK bei Lebergesunden liegt im Bereich von 59 min87.

Die Aussage der GEK wird vor allem für die Prognosestellung nach wiederholter intraindividueller Durchführung geschätzt. In der Akutdiagnostik und der klinischen Entscheidungsfindung ist der Test meist den klinischen Scores unterlegen. Auch korreliert er nicht zwingend mit einem Leberschaden oder mit anderen Parametern wie der Albuminsynthese und der Synthese von Gerinnungsparametern 88.

Im klinischen Gebrauch gibt es auch die Möglichkeit die Leberfunktion mit Galaktose als Atemtest zu prüfen89.

1.4.4. Sorbitol

Sorbit ist ein physiologisch Vorkommender Zucker, der vor allem als Zuckeraustauschstoff Verwendung gefunden hat. Die Insulinunabhängige Verwendung prädestiniert Sorbitol für die diabetisgerechte Ernährung.

Der hauptsächliche biochemische Stoffwechselweg ist die Umwandlung von Sorbitol zu Fructose, die von der Sorbitoldehydrogenase unter Umwandlung von NAD+ zu NADH und H+ katalysiert wird. Sorbitol kann durch die Aldosereduktase auch in Glucose umgewandelt werden, dabei wird NADPH und H+ zu NADP+ umgewandelt84.

Sorbitol ist eine sehr sichere Testsubstanz, nur bei der sehr seltenen angeborenen Fructoseintoleranz kann es zu unerwünschten Wirkungen, vor allem Hypoglykämie, kommen.

Die Elimination von Sorbitol findet in vivo vor allem in der Leber statt, aber ungefähr ein sechstel wird über die Niere ausgeschieden. Die Elimination ist dabei von der Diät und der körperlichen Belastung während des Testvorgangs abhängig90. Sorbitol folgt einer Kinetik erster Ordnung über einen weiten Bereich sicherer Dosen91. Nach Winkler et al erfolgt eine Einordnung in das flusslimitierte Clearance Schema76, da die Extraktionsrate bei der Erstpassage durch die Leber bei gesunden Probanden bei 93% liegt90.

Die Formel für die Berechnung der Clearance ist deshalb Formel [7] aus Abschnitt 1.3.1:

Flussbegrenztes Clearance Schema

Der Test kann im klinischen Gebrauch kann als Bolus- Injektion wie von Molino et al92 angewandt oder als Dauerinfusion mit Bestimmung des Fließgleichgewichtes wie von Zeeh et al90 durchgeführt werden.


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1.4.5.  Antipyrin

Antipyrin wurde erstmals Mitte der 70er Jahre als Leberfunktionstest eingesetzt93, es wird heute gelegentlich in der Evaluation der Leberfunktion für Transplantationen verwendet. Durch orale Gabe der Testsubstanz und durch Bestimmung der Konzentration im Speichel, die der Plasmakonzentration gleicht, ist der Test non- invasiv durchführbar. Die Clearance lässt sich einfach errechnen94.

Antipyrin wird durch Cytochrom (beteiligt sind folgende Cytochrom P450 Enzyme: CYP1A2, CYP2B6, CYP2C8, CYP2C9, CYP2C18 und CYP3A4) in den Microsomen in die Hauptmetaboliten 4-Hydroxyantipyrin, 3-Hydroxymethylantipyrin und Norantipyrin verstoffwechselt95. Ein Vorteil des Antipyrin Tests ist die Unabhängigkeit der Clearance von der Leberdurchblutung, da diese Substanz keinem nennenswerten First-Pass-Effekt unterliegt.

Ein Nachteil von Antipyrin ist die vergleichsweise Aufwendige Analytik mittels HPLC, die in der täglichen Routine der Qualitätssicherung der Bioreaktoren bei angestrebten Stand- By Betrieb des Leberunterstützungssystems nur schwer zu realisieren sind. In Voruntersuchungen dieser Arbeit zeigte sich Antipyrin auch als schwerfällig in der Handhabung, da es von der Testzeit mit den anderen Substanzen im Cocktail- Bolus- Ansatz im Rezirkulationsmodus des Bioreaktors abweicht.

Im Tiermodell von Gross et al 96 ergab der Vergleich des Aminopyrin Atemtests mit dem Galaktose Atemtest eine höhere Spezifität des Galaktose Tests. Der Galaktose Test korrelierte auch besser mit dem Umfang der intakten Leberzellmasse. Bei den Atemtest wird Di-14C-Methylaminoantipyrin bzw. 1-14C-Galaktose intravenös oder intraperitoneal verabreicht und 14CO2 im Atem gemessen.

Das Hauptargument gegen die Verwendung von Antipyrin war die Abdeckung der Cytochrom P450 Enzymfamilie durch das verwendete Lidocain und seinem Metaboliten MEGX. Kompetitive hemmende Effekte sind zu vermeiden.

1.5. Syntheseparameter

1.5.1. Ammoniak und Harnstoffsynthese

Der qualitative Nachweis der Harnstoffsynthese ist in einer Leberzellkultur ein wichtiger Funktionsparameter, der auf die Erhaltung metabolischer Kompetenz hinweist.

Ammoniak entsteht physiologisch vorwiegend durch den Abbau von Aminosäuren im Rahmen des Proteinstoffwechsels. Beim Abbauprozess der Aminosäuren wird der Aminostickstoff als Ammoniak unter Bildung von Ketosäuren abgespalten 97. Ammoniak hat einen pK’- Wert von 9,1, es liegt bei einem pH Wert von 7,40 zu etwa 99% als Ammoniumion (NH4+) vor. Die Ausscheidung von Ammoniak erfolgt zu ca. 70% als Harnstoff durch die Harnstoffbiosynthese im periportalen Bereich der Leber97. Die restlichen 30% werden durch die Glutaminsynthethasereaktion in der perivenösen Leberzellpopulation.

Die Enzyme des Harnstoffzyklus sind auf zwei Kompartimente der Zellen, den Mitochondrien und dem Cytosol verteilt. Der erste Schritt des Harnstoffzyklus findet in den Mitochondrien statt. Dabei reagiert Ammonium mit Hydrogencarbonat und ATP zu Carbamoylphosphat. Das katalysierende Enzym ist die Carbamoylphosphat-Synthetase. Das Carbamoylphosphat reagiert mit Ornithin weiter zu Citrullin mit Hilfe der Ornithintranscarbamoylase. Ornithin ist eine nicht- proteinogene Aminosäure. Citrullin wird nun aus den Mitochondrien in das Cytosol transportiert, wo der Zyklus seinen Fortgang findet. Im Cytosol reagiert Citrullin mit Aspartat zu Arginosuccinat. Katalysiert wird dieser Schritt durch die Arginosuccinat-Synthetase. Aus Arginosuccinat spaltet sich Fumarat ab. Übrig bleibt die Aminosäure Arginin. Das katalysierende Enzym ist die Arginosuccinase. Fumarat wird im Zitronensäurecyclus zu Oxalacetat weiterverarbeitet. Oxalacetat wird durch Transaminierung zu Aspartat umgewandelt und steht wieder für den Harnstoffzyklus zur Verfügung. Im nächsten Schritt hydrolysiert Arginase Arginin zu Harnstoff und Ornithin. Das Ornithin steht für einen neuen Zyklus zur Verfügung, der Harnstoff wird abgegeben ins Blut und über die Nieren und den Harn ausgeschieden.


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Abbildung 2: Harnstoffzyklus, aus Lehninger: Principles of Biochemistry98

Im menschlichen Organismus erfolgt die Regulation und Verstoffwechselung von Ammoniak und Aminosäuren hauptsächlich durch die Leber. Die normale Konzentration von Ammoniak im Blut beträgt 10-50 µmol/l. Die tägliche Bildung von Harnstoff einer 70 kg schweren Normalperson liegt bei etwa 0,5 mol (30 g). Bei Störungen des Ammoniak Stoffwechsels, insbesondere großer Überschuss im extrazellulären Kompartement sind schwere cerebrale Schäden zu befürchten. Bei der hepatischen Enzephalopathie, ein komplexes multifaktorielles Krankheitsbild, spielt Ammoniak eine wichtige Rolle.

In der klinischen Diagnostik wird der Ammoniak Toleranz Test angewendet um den Grad des Portal- Systemischen- Kolateralkreislaufs bei Patienten mit Leberzirrhose abzuschätzen. Dabei wird dem Patienten eine orale Dosis Ammoniumacetat verabreicht und nach 30 und 60 Minuten die Konzentration im peripheren Blutkreislauf gemessen. Der Test korreliert nicht nur mit dem Ausprägungs- Grad des Kolateralkreislaufs, sondern auch mit der portalen Hypertension99. Der Ammoniak Toleranz Test ist in modifizierter Variante auch geeignet um die Ursache von Aszitis, zirrhotische versus maligne Genese, zu Differenzieren 100.

Die Abhängigkeit des Harnstoffzyklus von der Aminosäurenzufuhr ist zu beachten. Schnellste Umsatzraten werden bei der Zufuhr von Supraphysiologischen AS- Konzentrationen erreicht101. Dies kann man sich für einen Stimulationstest zu Nutze machen.

1.5.2. Aminosäurenstoffwechsel

Der gesamte Aminosäuren- und Ketosäurenstoffwechsel und Proteinbiosynthese ist ein interessanter Ansatz die Funktion von Leberzellen zu Prüfen. Aufgrund der aufwendigen umfassenden Analytik liegen Ergebnisse bis jetzt jedoch nur zu einem Teil vor. Die bisherigen Ergebnisse102103 zeigten, dass die Harnstoffzyklus Aminosäuren Argenin und Ornithin aufgenommen und freigesetzt werden gemäß ihrer normalen Funktion im Zyklus. Putrescin wird synthetisiert und folgt Ornithin im Polyamin- Metabolismus. Die Synthese und Freisetzung von α-Ketosäuren von verzweigtkettigen Aminosäuren reflektiert die Transaminierungs- Kapazität des Kultursystems. Die α-Keto- und Aminosäure Pyruvat und Alanin werden abgegeben als folge der Degradierung von Zucker zu Pyruvat im Rahmen der Glykolyse.

1.5.3. Albumin

Albumin ist das wichtigste Protein im Blut. Es wird in der Leber synthetisiert und ins Blut [Seite 23↓]freigesetzt. Die Funktionen von Albumin sind vor allem erhalt des osmotischen Druckgradienten zwischen intravasalem und extravasalem Kompartiment. Außerdem ist es ein bedeutsames Transportprotein.

Die Albumin- Liberation summiert sich aus der Syntheseleistung gesunder Zellen und Freisetzung durch apoptotische Zellen zusammen.

In statischen Monolayer- Leberzellkulturen ist die Liberation von Albumin im gewechselten Medium alle z.B. 24 Stunden einfach zu bestimmen. Der Verlauf, der unter sophistikierten Kulturbedingungen, d.h. modifiziertes Williams E Medium mit zusätzlichen Aminosäuren und verschiedenen Hormonen, erzielt wird ist ein geringer Wert initial an Tag 0 und ein Anstieg im Verlauf der Kulturdauer über eine Woche2. Andere Arbeitsgruppen104 mit weniger anspruchsvollen Kulturbedingungen berichten von einer „stabilen“ Produktion von Albumin über den Kulturzeitraum. Die Synthese von Albumin ist von Insulin und Glukokortikoiden sowie anderen Hormonen beeinflusst 105.

In der Zellkultur spielt Albumin vor allem eine Rolle als Parameter für die Synthese Leistung der Zellen. Von porcinen Zellen wird Pig- Albumin freigesetzt, das in Leberunterstützungssystemen lediglich zur Charakterisierung der Leistung und zur Qualitätssicherung nützlich ist, aber im therapeutischen Einsatz wegen seiner potentiell antigenen Eigenschaften eher unerwünscht ist.

1.5.4. Lactat

Lactat entsteht im Stoffwechsel der Glucose. Der wichtigste Stoffwechselweg ist der glykolytische Abbau, eine weitere Abbaumöglichkeit für Glucose besteht im Abbau über den Pentosephosphatweg. Die glykolytische Zerlegung von Glucosemolekülen, die auch unter aeroben Stoffwechselbedingungen stattfindet, ist entwicklungsgeschichtlich wahrscheinlich eines der ältesten Stoffwechselwege. Die Reaktionsfolge der Glykolyse ist bei allen eukaryonten Lebewesen identisch, das Prinzip ist die Umwandlung von Glucose in 9 Schritten zu Pyruvat, dabei werden netto zwei Adenosintriphosphat (ATP) gewonnen 84.

Pyruvat wird dann im Mitochondrium komplett zu CO2 und H2O oxydiert oder- unter anabolen Bedingungen durch die Lactatdehydrogenase zu Lactat reduziert und aus der Zelle freigesetzt.

1.5.5. Gluconeogenese

Die Bestimmung der Gluconeogenese in Zellkulturen beruht auf einem einfachen Prinzip: die Zellen werden in glucosefreien Medium kultiviert und die Rate der Gluconeogenese über die gemessene Glucosekonzentration bestimmt. Da eine Ausgewogene Versorgung der Zellkultur als wichtiger angesehen werden muss kommt diese Bestimmung bei einer Zellkultur die auf Funktion optimiert ist nicht zur Anwendung.

1.6. Ziele der eigenen Arbeit

Diese Arbeit wird im Rahmen der Entwicklung eines hybriden Leberunterstützungssystems durchgeführt, dessen Kernstück die Entwicklung eines Bioreaktors ist, der für Leberzellen in klinisch relevanten Mengen ausgelegt ist und für die Leberzellen möglichst nahe an die in vivo Bedingungen herankommen soll. Um das Projekt über tierexperimentelle Erprobung zu klinischen Phase I Studien zu führen ist die Untersuchung der Zellleistung wesentlich.

Das Ziel dieser Arbeit ist die Charakterisierung der Funktion des verwendeten dynamischen Zellkulturmodells und die Etablierung von Funktionstests. Dabei sind folgende Fragen zu beantworten:

  1. Evaluierung und Diskussion von Methoden zur Bewertung der Leberzell- Funktion, welche eine Routine Diagnostik der Funktion der Zellen im verwendeten 3D- Kulturmodell zulassen,
  2. Empfehlungen für Untersuchungsschemata, welche Veränderungen rechtzeitig aufzeichnen und gleichzeitig aufwendige oder überflüssige Diagnostik vermeiden.
  3. Nutzbarkeit von Funktionstests hinsichtlich Qualitätssicherung in der Routine Bereitstellung von Leberunterstützungssystemen.[Seite 24↓]
  4. Beitrag zum Wirksamkeitsnachweis des Bioreaktors, Hypothese: „der Bioreaktor ermöglicht Lebertypische Leistung“ oder zum Zurückweisen der Nullhypothese „der Bioreaktor ermöglicht keine Lebertypische Leistung“.
  5. Beurteilung einer für den therapeutischen Bereich nutzbaren Kulturdauer des aktuellen Systems.
  6. Aussagekraft der einzelnen untersuchten Parameter und deren Nutzbarkeit im Hinblick auf eine Standardisierung des Systems für klinische Studien.


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08.03.2005