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2.  Material und Methoden

2.1. Das dynamische Kulturmodell

Das Kulturmodell ist als hybrides Leberuntersützungssystem (LSS) entwickelt worden. Es besteht an zentraler Stelle aus einem Bioreaktor, der die Leberzellen beherbergt und Stoffaustausch über synthetische Membranen ermöglicht. Zur mechanischen Unterbringung des Bioreaktors, Steuerung des Stoffwechsels und der Reaktortemperatur wurde ein Bioreaktormonitor entwickelt, der alle zur Versorgung des Bioreaktors benötigten Aggregate in einem mobilen Gehäuse bietet.

2.1.1. Bioreaktor

Der Bioreaktor besteht aus einem Gehäuse aus Polyurethan (PU-R 725 A/B, Rohm & Haas GmbH, Bremen). Das Innere des Bioreaktors besteht aus einem Geflecht von Kapillarhohlfaser­membranen, die den Reaktor in intra- und extrakapilläre Kompartimente aufteilen. Die kultivierten Leberzellen sind im extrakapillären Kompartiment angesiedelt und adhärieren auf der äußeren Oberfläche der Kapillaren. Durch Wahl der Membraneigenschaften und durch jeweils unabhängige externe Ansteuerung eines Kapillarbündels können den Membranen unterschiedliche Funktionen zugewiesen werden. Hydrophile Membranen können über den Anschluss zum Bioreaktorkreislauf für die Zufuhr oder Ausfuhr von Flüssigkeiten genutzt werden. Verwendet wurden Membranen aus Polyethersulfon (Micro PES TF 10® Capillary Membranes, Membrana GmbH, Wuppertal). Hydrophobe, gaspermeable Membranen werden zur Oxygenierung und zur Ver- und Entsorgung von Kohlendioxid verwendet. Eingesetzt wurden Kapillaren aus Doppelschichtmembranen bestehend aus Polypropylen und Polyamid (MHF 200TL Hollow Fiber, Mitsubishi Corporation, Tokyo, Japan). Als weitere Membran zur Oxygenierung wurden alternativ Oxy Plus Membranen (Oxy Plus®, Membrana GmbH, Wuppertal) erprobt. Diese Membranen wurden direkt mit Gas beschickt. Die folgende Tabelle gibt die Eigenschaften der unterschiedlichen Kapillarbündel wieder.

Tabelle 1: Eigenschaften Kapillarbündel

Membran

Verwendung

Cut-off

Kapillarzahl

Austausch­oberfläche

Micro PES TF 10®

Stoffaustausch Zelladhäsion

200 * 103 MW

6000

1,5 m2

MHF 200TL Hollow Fiber®

Gasaustausch

impermeabel

640

0,075 m2

Oxy Plus®

Gasaustausch

impermeabel

600

1,07 m2

Ein Bioreaktor kann nur einmal benutzt werden.

Abbildung 3: Kapillarhohlfaserbioreaktor


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2.1.2.  Bioreaktormonitor

Der Bioreaktor als „Herzstück“ des dynamischen Zellkultursystems wird von in einem beheizten Gehäuse während des Betriebs gehalten. Die Regulation der Mediumzirkulation und der Frischmedium- und Gasversorgung übernimmt das speziell angefertigte Steuergerät, der Bioreaktormonitor.

Abbildung 4: a) Bioreaktormonitor und b) Bioreaktormonitor in Betrieb

Zur Aufrechterhaltung der Zellfunktion und pH- Regulation im Kulturmedium wird das Zell­kompartiment im Bioreaktor mit trockenen Gasen (Sauerstoff, Kohlendioxid und Druckluft) begast. Die Entnahme der Gase erfolgt über Hausanschlüsse, wobei in Abhängigkeit zum aktuellen pH-Wert die Gasmischung über geeichte Klein- Durchflussmesser DK 800 R (Krohne Messtechnik, Duisburg) anteilig reguliert wird.

Die Basismischung der Gase beträgt durchschnittlich 95 % Druckluft (Hausanlage) mit 21 % Sauerstoff und 5 % Kohlendioxid (AGA 5.0, AGA Gas GmbH Hamburg).

Um der Zellkultur physiologische Temperaturen zu gewährleisten, ist der Bioreaktor von einem Gehäuse aus 8 mm Acrylglas umgeben, das mittels eines Tangentialheizgebläses (230 V / 50 Hz), mit ca. 80 m3 * h-1 Luft nach dem Umwälzprinzip beheizt wird. Die Heizleistung von max. 1000 W ist über ein Leistungsmodul (Kemo, Berlin) regelbar.

Die Messung der Ist-/Soll-Temperatur erfolgt über eine im Gehäuse montierte Messsonde (Typ PT 100, RS Components, Mörfelden-Walldorf), deren Werte über einen im Lüftergehäuse eingebauten, digitalen, selbstoptimierenden Regler (CAL 9900, RS Components, Mörfelden-Walldorf) angezeigt und reguliert werden.

Die Basis der Perfusionseinrichtung bilden zwei miteinander gekoppelte Dialysemonitorrohlinge (HD-Secura, B .Braun Melsungen AG, Melsungen), die aufgabenspezifisch modifiziert sind und als Apparateträger für Pumpen, Klemmventile, Druckanzeigen, Steuerelektronik sowie alle weiteren Systemkomponenten dienen. Die Gesamtapparatur kann auf Rollen bewegt werden und unterteilt sich in einen Patienten- und Bioreaktormonitor (siehe Abbildung).

Um das System stabil und sicher, auch für den klinischen Betrieb zu haben wurden verschiedene Sicherheitsfunktionen in das System integriert. Um physiologisch angepasste Drücke und Volumenströme zu erreichen, finden Schlauchpumpen mit Zahnriemengetriebe (Typ 49 V 437, 348 und 260 B, B. Braun Melsungen AG, Melsungen) Verwendung. Unter Berücksichtigung der in den einzelnen Zirkulationskreisläufen maximal notwendigen Volumenströme sind für Blutzuführung und Reaktorkreislauf die Pumpen mit einer Förderleistung von maximal 600 ml/min, beziehungsweise [Seite 27↓]für die Mediumzufuhr bzw. den Mediumablauf, Pumpen mit einer Maximalleistung von jeweils 200 ml/min dimensioniert. Der Förderfluss aller Pumpen ist von Null bis zum jeweiligen Maximalfluss stufenlos manuell regulierbar und über einzelne LCD-Displays ablesbar.

Zur Vermeidung von Druckspitzen und unphysiologischen Strömungsverhältnissen, die unter Umständen zu Schädigung der Zellen und zur Berstung des Bioreaktors und der Perfusionsleitungen führen könnten, sind in den einzelnen Kreisläufen Druckaufnehmer (Typ BV 49 B 90, B. Braun Melsungen AG, Melsungen) vorhanden. Mit ihnen ist es möglich, durch die Sensoren gemessene Werte die einzelnen Arbeitszustände der Pumpen rück- gekoppelt aufeinander abzustimmen, und bei Überschreitung definierbarer Grenzwerte gegebenenfalls sofort zu stoppen. Ablesung des Ist-Wertes und Einstellung der Schaltgrenzwerte erfolgt über separate Druckanzeiger (Typ 49 V 189, B. Braun Melsungen AG, Melsungen), die in den jeweiligen Monitoren installiert sind. Als druckstabile Leitungen werden Combidynschläuche (B. Braun Melsungen AG, Melsungen) verwendet, die ausgehend von Expansionskammern (B. Braun Melsungen AG, Melsungen) in den Schlauchleitungssystemen mit den einzelnen Sterilfilter (Minisart, Sartorius AG, Göttingen) geschützten, und in den jeweiligen Monitorplatten montierten Druckaufnehmern verbunden sind.

Um eine Berstung der Leitungssysteme und Bioreaktoren zu vermeiden, ist der Grenzwert für den Prä- Reaktordruck bei 250 mmHg, für den inneren Reaktordruck mit 120 mmHg definiert. Bei Überschreitung dieser Grenzwerte stoppt die Reaktorkreislaufpumpe.

Einem Volumenrückstau und einem retrograden Fluss von Medium entgegenwirkend, findet bei Überschreitung des Post- Reaktordruckes von 15 mmHg eine Aktivierung der Ableitungspumpe statt. In Abhängigkeit zu den Betriebsverläufen können die Grenzwerte für einen optimalen Systemabgleich korrigiert werden.

Der Flüssigkeitstransport am LSS erfolgte durch medical- grade PVC-Leitungen (Sonderanfertigungen von Braun-Carex S.p.A., Mirandola, Italien). Der Leitungsdurchmesser betrug 2,5 mm bis 4,8 mm. Zuzüglich der Expansionskammern und der Einlagen für die Rollerpumpen betrug das Flüssigkeitsvolumen der Leitungen am Bioreaktormonitor 70 ml und am Patientenmonitor 160 ml. Das Gasgemisch für die Gasversorgung wurde durch Perfusor Leitungen aus PVC, (B. Braun Melsungen, Melsungen) geleitet. Ein hydrophober Sterilfilter (B. Braun Melsungen, Melsungen) im Gaskreislauf sorgt für zusätzliche Sicherheit.

2.1.3. Systemaufbau

Die einzelnen Bestandteile des Reaktorkreislaufs (Bioreaktor, Schlauchsysteme, Blasenfallen, Druckmessleitungen, Bakterienfilter, 3-Wege-Hähne, Verbindungen, Adapter) werden als sterilisierte, folienverpackte Einmalartikel geliefert.

Der Zusammenbau erfolgt unter sterilen Arbeitsbedingungen nach Herstellervorschrift in einer Laminar- Air- Flow- Werkbank (Kendro Laboratory Products GmbH, Langenselbold, BRD).

Das geschlossene System wird in den Bioreaktormonitor integriert: der Bioreaktor wird in Halterungen im Plexiglasgehäuse festgeschraubt, der Silastikabschnitt des Kreislaufs in die Rollerpumpe der Kreislaufzirkulation bzw. der des Mediumzulaufs in die Fingerprint- Pumpe der Mediumzufuhr eingelegt, die Gaszuleitung an den Anschluss der Gasmischeinheit und die Druckübertragungsschläuche an die Drucksensoren angeschlossen.

Anschließend wird der Kreislauf mit 0,9% NaCl- Lösung befüllt und entlüftet. Es erfolgt eine Umwälzung des Volumens über die Kreislaufpumpe bis zum Austausch der Kochsalzlösung durch Kulturmedium vor der Zelleinfüllung.

Nach Einstellen des pH-Wertes über die Gasmischung auf pH 7,38 – 7,42 ist der Bioreaktor für das Einbringen der Zellen vorbereitet.

2.1.4. Betriebsmodi des Bioreaktor- Systems

Es sind folgende Betriebsarten vorgesehen: Rezirkulation, Mediumsubstitution, Mediumwechsel sowie für den klinischen Einsatz Therapiebetrieb.

Rezirkulation (Geschlossener Kreislauf):


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In der Rezirkulation erfolgt kein Flüssigkeitsaustausch zwischen dem Bioreaktorkreislauf und der Umwelt. In dieser Situation ist sowohl die kontinuierliche Nährstoffeinspeisung, als auch das Auswaschen von Metaboliten und Substraten unterbrochen. Diese für die Zellkultur auf Dauer belastende Betriebsart findet im Rahmen von Metabolismusuntersuchungen und während der Druckmessungen am LSS statt. Die Reaktorpumpe hält die lebensnotwendige Konvektion im Bioreaktor aufrecht. Durch Abklemmen der Mediumeinleitung und Mediumableitung zirkuliert die Flüssigkeit im Reaktorkreislauf in einem geschlossenen System.

Mediumsubstitution (Offener Kreislauf mit langsamer Austauschgeschwindigkeit):

Die Ernährung der Zellen während der Stand- By- Phase und der therapiefreien Intervalle durch Kulturmedium erfolgt in der Betriebsart „Mediumsubstitution“. In den stetigen Bioreaktorkreislauf (Zirkulationsgeschwindigkeit 50-300 mL/min) wird langsam und kontinuierlich durch die Mediumpumpe frisches Medium eingespeist (Geschwindigkeit 50-200 mL/h). Durch die Druckerhöhung im Kreislauf wird gleichzeitig gebrauchtes Medium passiv aus der Zirkulation verdrängt. Über die Position der Druckausgleichskammer im Verhältnis zum Bioreaktor kann das Druckniveau bei dem es zum Ableiten von gebrauchtem Medium kommt beeinflusst werden. Wird die Druckausgleichskammer höher gehängt steigt der Druck im Kreislauf an, wird die Kammer tiefer gehängt kommt es zu einer Erniedrigung des Druckniveaus.

Mediumwechsel (Offenes System mit schnellem Stoffaustausch im „single-pass“ Modus):

Soll ein rascher Austausch der im Reaktorkreislauf zirkulierenden Flüssigkeiten erreicht werden (Entlüften des Bioreaktors, Austausch von Spüllösung gegen Kulturmedium, Vorbereitung des Bioreaktorkreislaufs mit isoonkotischer Lösung vor Therapiestart), kann über den alleinigen Betrieb der Reaktorpumpe und Freigabe des entsprechenden Flüssigkeitsweges ein schneller Wechsel der Flüssigkeit im Bioreaktor und im Reaktorkreislauf durchgeführt werden. Auch im Mediumwechsel- Modus findet eine Durchmischung und Verdünnung statt.

2.1.5. Stand-By Protokoll

Ziele: Gewährleistung der Vitalfunktionen der Zellkultur

  1. Aufrechterhaltung der Perfusion der Zellkultur.
  2. Angepasstes Nährstoffangebot und Austausch von Stoffwechselprodukten.
  3. Aufrechterhaltung einer angemessenen Umgebungstemperatur.
  4. Bedarfsgerechtes Sauerstoffangebot, Abtransport von Kohlendioxid, Regulation des Säure-Basen-Haushalts.
  5. Schutz der Zellkultur vor mikrobieller Kontamination.
  6. Überwachung und Wartung von Teilkomponenten des BELS.
  7. Funktions- und Qualitätsabschätzung der Zellkultur.
  8. Protokollierung des BELS-Status und der getroffenen Maßnahmen.

Aufrechterhaltung der Perfusion der Zellkultur:

Die Reaktorpumpe sorgt über die Bewegung der extrazellulären Flüssigkeiten für die Umverteilung von Nährstoffen und Metaboliten im Reaktorkreislauf. Die Art und Weise, in der der erzeugte Flüssigkeitsstrom die Zellkultur umspült, wird durch den Perfusionsmodus bestimmt. Der Konvektionsmodus unter Ausnutzung der beiden unabhängigen Kapillarbündel des Bioreaktors ist als optimaler Perfusionsmodus im Stand-By Betrieb anzusehen. Der Perfusionsmodus und die Geschwindigkeit der Reaktorpumpe legen somit Ausmaß und Geschwindigkeit der Stoffverteilung in der Umgebung der Zellkultur fest. Nur ein kontinuierlicher Betrieb der Reaktorpumpe hält den lebenserhaltenden Kreislauf für die Hepatozytenkultur aufrecht.

Abhängig vom Flüssigkeitsvolumen und dem Gesamtwiderstand des Reaktorkreislaufs beeinflußt die Reaktorpumpe die Druckverhältnisse vor, im und hinter dem Bioreaktor. Für die Sicherheit der Leitungen und des Bioreaktors ist es unerlässlich, folgende Druckwerte beim Betrieb der Pumpe nicht zu überschreiten: Maximalwert „Prä“-Druck: 250 mmHg; Maximalwert „Intra“-Druck: 120 mmHg. Die Druckabschaltung der Reaktorpumpe stellt bei intakter Druckmessung einen Schutz [Seite 29↓]vor der Drucküberlastung im Reaktorkreislauf dar.

Neben der perfusionstechnischen Sicherheit gilt es im Innern des Bioreaktors physiologische hydrostatische Druckverhältnisse anzustreben: „Intra“-Druck im Bereich von 0 bis + 60 mmHg .Für die Geschwindigkeit der Reaktorpumpe gelten unter Einhaltung der Sicherheitsdruckwerte folgende Richtlinien:

Mindestfluß zur Aufrechterhaltung einer adäquaten Perfusion der Hepatozytenkultur: 50 mL/min
Maximalfluß (unter Einhaltung der Druckgrenzen der Materialsicherheit: „Prä“-Reaktor 250 mmHg, „Intra“-Reaktor 120 mmHg): 300 mL/min

Das Perfusionsverhalten des Bioreaktors ändert sich im zeitlichen Verlauf des BELS-Betriebs. In aller Regel steigen die Druckwerte „Prä“ und „Intra“-Druck. Die Flowrate der Reaktorpumpe muß entsprechend heruntergeregelt werden. Ein Unterschreiten der Flußgeschwindigkeit unter 50 mL/min sollte dabei nicht unterschritten werden und hätte die Beendigung des Stand-By dieses Reaktors zur Folge.

Angepasstes Nährstoffangebot und Austausch von Stoffwechselprodukten:

Ab Tag 4 der Zellkultur nach Zelleinfüllung erfolgt eine Mediumsubstitution mit einem Zu- und Abfluss von 50 mL/h frisches Kulturmedium (modifiziertes Williams E Medium). In dieser Einstellung wird gewährleistet, dass frisches Kulturmedium dem Reaktorflow zugeführt wird, das zirkulierende Medium also kontinuierlich angefrischt wird. Am Reaktor ist ein Perfusionsbetrieb einzustellen.

Aufrechterhaltung einer angemessenen Umgebungstemperatur:

  1. Die einwandfreie Funktion der Erwärmungsvorrichtungen des BELS ist regelmäßig zu überwachen (Zieltemperatur: 39°C). Steuerung der Zieltemperatur erfolgt über die Solltemperatur der Thermostaten der Erwärmungseinrichtungen.
  2. Das Bioreaktorschutzgehäuse muss bis auf Veränderungen des Perfusionsmodus verschlossen bleiben.
  3. Die schnelle Einspeisung großer Flüssigkeitsvolumina in den Bioreaktorkreislauf (z. B. Plasma./ Mediumaustausch) erfolgt, um ein Auskühlen des Systems zu verhindern, bei Erwärmung der Austauschflüssigkeit

Bedarfsgerechtes Sauerstoffangebot, Abtransport von Kohlendioxid, Regulation des Säure-Basen-Haushalts:

Der Gasaustausch findet an den Oberflächen der Oxygenierungsmembranen im Innern des Bioreaktors statt. Das Sauerstoffangebot lässt sich über die Zusammensetzung und die Durchflussgeschwindigkeit des Gasgemisches steuern. Die Einstellungen werden an der Gasmischbox des Bioreaktors vorgenommen. Die Flussgeschwindigkeit des Reaktorkreislaufs beeinflusst über die Bewegung der Flüssigkeit zwischen Zelloberflächen und Oberflächen der Oxygenierungsmembranen ebenfalls den Gassautausch.

Als basale Einstellung der Gasversorgung ist ein Druckluftfluss von 200 mL/min, ein Sauerstofffluss von 20 mL/min und ein Kohlendioxidfluss von 2 mL/min anzusehen. Diese Einstellung erzielt im leeren Reaktor eine physiologische BGA:

pH 7,35-7,45

pCO2≥ 30mmHg und ≤45mmHg

pO2 ≥200mmHg und ≤260mmHg

Base Excess (ABE) zwischen - 10 bis +2.

Bikarbonat: 15 bis 25 mmol/l.


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Kalium: 3,5 bis 4,8 mmol/l

Natrium: 135 bis 145 mmol/l

Calcium: 0,9 bis 1,2 mmol/l.

Interventionen:

Azidose (pH<7,35):

sorgfältige Analyse der BGA und gezieltes Eingreifen:

  1. Reduktion des Kohlendioxidflusses im Gasgemischs bei pCO2>45 mmHg.
  2. Substitution von Bicarbonat bei HCO3<15 mmol/l.

Die Menge des zu injezierenden Bicarbonats erfolgt in Abstimmung mit dem ABE. Es wird jeweils 1/3 des negativen BE in mL Bicarbonat in einem Bolus gespritzt. Es muss im Verlauf soviel Bicarbonat gespritzt werden, dass der pCO2 auf den angestrebten Wert geregelt werden kann.

Alkalose (pH>7,45):

  1. Erhöhung des Kohlendioxidflusses im Gasgemischs bei pCO2<35 mmHg.
  2. Keine zusätzliche Bicarbonatgabe.

Sauerstoffmangel:

1. Erhöhung des Sauerstoffanteils im Gasgemisch bei pO2<200 mmHg

Sauerstoffüberfluss:

1. Erniedrigung des Sauerstoffanteils im Gasgemisch bei pO2>260 mmHg

In beiden Fällen muss vor allem die korrekte Drucklufteinstellung überprüft und ggf. auf 200 mL/min korrigiert werden. Die Druckluft dient als Trägergas für die anderen Gase. Die Höhe des Druckluftflusses bestimmt die Verweilzeit der anderen Gase im Reaktor.

Jede Veränderung an der Gaseinstellung oder Zuspritzen von Bicarbonat macht regelmäßige BGA Kontrollen notwendig.

2.2. Zellisolierung

Die Gewinnung primärer Schweinehepatozyten für das hybride Leberunterstützungssystem stand am Anfang der Kulturphase. Dabei wurde nach der Hepatektomie eines Schweins die Leber durch Kollagenaseperfusion in zelluläre Bestandteile gebracht, diese wurden gereinigt und in den Bioreaktor eingebracht. Verwendet wurde die von Berry et al106 entwickelt Methode der high- yield Präparation, die von Gerlach et al107108 für die Bedürfnisse adaptiert und weiterentwickelt wurde.

Die Tierversuche wurden durch die Berliner Senatsverwaltung für Gesundheit genehmigt,
Reg.-Nr. O 0057/92.

2.2.1. Tieroperation

Als Spendertiere für die Zellisolierung wurden Hausschweine der deutschen Landrasse beiderlei Geschlechts verwendet. Um eine günstige Bindegewebskonfiguration der Leber vorzufinden wurden Jungtiere mit einem Körpergewicht zwischen 12 und 20 kg verwendet.

Für die Leberzellisolierung werden Schweine von der Firma Schaumann Besitz-Hülsenberg GmbH & Co. KG (Schaumann Forschungszentrum Hülsenberg Wiesenweg 32, 23812 Wahlstedt) verwendet, die unter pathogenfreien (SPF = specific pathogen free) Bedingungen gefüttert, [Seite 31↓]gehalten und transportiert werden. Vor der Organentnahme werden die Tiere individuell auf bakterielle und virale Erreger von Zoonosen untersucht (siehe folgende Tabelle).

Tabelle 2: Untersuchungen zum Ausschluss von Zoonosen

Bakteriell

Viral

Leptospira

Influenza A

Brucella

Influenza B

Salmonella paratyphi OH, H, O

Rotavirus

Salmonella typhi H, O

Pseudorabies

Salmonella typhimurium

 

Yersinia enterocolitica

 

Yersinia pseudotubercularis

 

Das Gewicht der entnommenen Lebern lag zwischen 300 und 680g, was einer Ausbeute von 2,2 bis 4,0 x 109 Zellen entspricht.

Eine PERV Analytik wurde in Zusammenarbeit mit dem Robert Koch Institut in Berlin seit 1997 durchgeführt.

Der Operationsablauf erfolgte nach einem festen Procedere, basierend auf einer Hepatektomie OP. Nach 6-stündiger Nahrungskarenz wurden die Tiere mit Azaperon (Stresnil-Janssen®, Janssen-Cilag GmbH, Neuss) 3-4 mg/kg KG und 0,05 mg/kg KG Atropin (Atropinsulfat Braun®, Braun Melsungen, Melsungen) prämediziert. Anschließend erfolgte die Intubation, kontrollierte Beatmung und eine TIVA, die aus der Kombination von Etomidat (Metomidate-Jansen®, Janssen-Cilag GmbH, Neuss) 0,2-0,25 mg/kg KG /h und Fentanyl (Fentanyl-Janssen®, Janssen-Cilag GmbH, Neuss) 1-2 ml/h bestand.

Die Tiere wurden nach klinischen Standards für die OP vorbereitet und in einen OP-Saal der tierexperimentellen Einrichtung der Charité, Campus Virchow-Klinikum eingeschleust.

Die Tiere wurden Laparotomiert und der Leberhilus freipräpariert. Danach folgte die Kanülierung der zuleitenden Gefäße, zuerst der A. Hepatica mit einer der Gefäßwandstärke angepassten Knopfkanüle, und dann der V. Portae mit einer Kanüle aus Silastik. Nach der Kanülierung wurde die Kanüle der V. Portae mit der Zuleitung von Isolierungslösung A verbunden, dann die V. Hepatica durchtrennt. Noch in situ wurde mit der Perfusion der Leber begonnen. Die Tiere wurden nach erfolgter Organentnahme durch Blutentzug getötet.

2.2.2. Zellisolierungs- Prozess

Die Organperfusion und Präparation der Zellsuspension erfolgte dann in einer speziellen laboreigenen Perfusionsapparatur. Für diese Apparatur wurde ein Dialysemonitorrohling der Braun Melsungen, Melsungen) modifiziert. In dem Gehäuse wurde eine Arbeitsfläche geschaffen, auf der sich durch sterile OP Tücher geschützt ein auf 40°C elektrisch beheizbares Stahlrundgefäß befand, in dem die Leber schwimmend gelagert wurde.

In der Perfusionsapparatur waren auch drei stufenlos regulierbare Rollerpumpen für die Zirkulation (Pumpe 1 für die A. Hepatica, Pumpe 2 für die V. Portae) und den Ablauf (Pumpe 3) der Isolierungslösungen integriert. Eine ebenfalls integrierte Druckmessung diente der Feed- Back- Regulation der Pumpe für die A. Hepatica.

Zur Zellgewinnung wurde die entnommene Leber durch Perfusion mit Kollagenase in zelluläre Bestandteile gebracht. Mit fünf Arbeitsschritten löst man den Zellverband Stufenweise auf. Während Lösung A noch in situ nur durch Schwerkraft perfundiert wird, werden die anderen Lösungen in der Perfusionsapparatur fluss- bzw. druckgesteuert perfundiert. Über die V. Portae wird mit einem Fluss von 2 ml * (min * g Lebergewebe)-1, also einem Gesamtfluss von 500 bis 800 [Seite 32↓]ml/min perfundiert. Die A. Hepatica wird druckgesteuert mit im Durchschnitt 80 mmHg perfundiert. In Abhängigkeit des Lebergewichtes wird die Leber insgesamt mit bis zu 1000 ml/min Isolierungslösung durchströmt. Während der gesamten Zeit ist auf die Vermeidung von Druckstellen zu achten.

Lösung A dient zum Freispülen von Blut, zum entfernen von Calcium und zum Herabsetzen der Lebertemperatur auf Raumtemperatur zur Vermeidung eines warmen hypoxischen Schadens. Lösung B dient der Calciumfreien Perfusion zur Auflockerung der desmosomalen Verbindung unterhalb der Hepatozyten. Lösung C ergänzt Calcium wieder, da die Kollagenase von Ca++ Ionen Abhängig ist. Außerdem erwärmt Lösung C die Leber wieder auf 37°C, das Reaktionsmaximum der Kollagenase. Lösung D ist der wichtigste Schritt, da diese Lösung die Kollagenase enthält, die zur Auflösung des Bindegewebes der Leber erforderlich ist. Wenn die Leber ausreichend aufgelöst ist, spätestens nach 15 min wird Lösung D abgepumpt und mit Lösung E die Wirkung der Kollagenase beendigt. Nach initialen Freispülen mit Lösung E wird in diesem Schritt wird die Leberkapsel perforiert, die Leberzellen werden in Lösung gebracht und gleichzeitig gekühlt. Die Zellsuspension wird in einen sterilen Zellwaschbeutel verbracht und zur weiteren Zellreinigung in den Kühlraum gebracht.

Tabelle 3: Zellisolierungslösungen
Alle Lösungen wurden von der Firma Biochrom, Berlin bezogen.

Lösung

Menge

T

Durchführung

Zusammensetzung

A

2 l

20°C±2

Single Pass

2000 mL PBS ohne Ca2+/Mg2+

+ 1% Penicillin/Streptomycin (5 mL/500 mL)

+ 1% Amphotericin B (5 mL/500 mL)

+ 0,2% EDTA-Lösung (1 mL/500 mL)

B

2 l

20°C±2

Rezirkulation 20 min

2000 mL PBS ohne Ca2+/Mg2+

+ 1% Penicillin/Streptomycin (5 mL/500 mL)

+ 1% Amphotericin B (5 mL/500 mL)

+ 1% NaHCO3-Lösung (5 mL/500 mL)

+ 1% Glucose 10% (5 mL/500 mL)

C

1 l

37°C

Single Pass

500 mL Medium 199 mit HEPES

+ 1% Penicillin/Streptomycin (5 mL/500 mL)

+ 1% Amphotericin B (5 mL/500 mL)

D

1 l

37°C

Rezirkulation bis zu 15 min

1000 mL Medium 199 mit NaHCO3 oder Williams Medium E mit NaHCO3

+ 1% Penicillin/Streptomycin (5 mL/500 mL)

+ 1% Amphotericin B (5 mL/500 mL)

+ 0,04% Kollagenase (0,4 g /1000 mL)

unmittelbar vor Gebrauch sterilfiltriert der Lösung zusetzen!!!

E

1 l

4°C

Single Pass

2000 mL Medium 199 mit HEPES

+ 1% Penicillin/Streptomycin (5 mL/500 mL)

+ 1% Amphotericin B (5 mL/500 mL)

2.2.3. Zellaufbereitung und -einfüllung

Die Zellen sedimentierten im Kühlraum bei 5°C zehn Minuten im Zellisolierungsbeutel. Dann wurde der Überstand der Isolierungslösung in den über ein Ventil verbundenen Ablaufbeutel abgeleitet und frisches Medium wurde aus dem ebenfalls mit einer Schlauchklemme verbundenen Reservoir der Lösung E wieder zugeleitet, der Zellkulturbeutel wurde geschüttelt und wieder zum Sedimentieren aufgehängt. Dieser Vorgang wurde zweimal wiederholt. Die Methode der Zellwäsche in einem in sich geschlossenen System hat gegenüber der herkömmlichen Zellreinigung in Zentrifugen ein geringeres Verkeimungsrisiko.


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Vor der Besiedlung des Bioreaktors mit Hepatozyten wird das Gesamtvolumen der Zellsuspension und die initiale Viabilität bestimmt. Durch einbringen einer Probe der Suspension in einer Neubauer Zählkammer ermittelt man lichtmikroskopisch die Zellzahl pro Mikroliter.

Der Zellisolierungsbeutel mit den gereinigten Zellen wurde über einen Dreiwegehahn mit großem Lumen (B. Braun Melsungen, Melsungen) an die Zelleinfüllung des Bioreaktors angeschlossen. Am dritten Ende des Dreiwegehahns war eine Perfusorspritze (B. Braun Melsungen, Melsungen) angeschlossen, mit der die Zellen langsam aus dem Beutel und in den Bioreaktor gepumpt wurden. Um die Zellen möglichst gleichmäßig zu Verteilen wurde am Bioreaktor jeden Spritzenhub die Zelleinfüllkappe mittels Dreiwegehahn umgeschaltet.

2.2.4. Adhäsionsphase

Als Zelladhäsionsphase werden die ersten 24 h der Hepatozytenkultur nach der Zellefüllung in den Bioreaktor bezeichnet. In dieser Zeit erfolgen die Adhäsion, das Auswachsen aus den Aggregaten und die Wiederherstellung der Stoffwechselhomoöstase der Hepatozyten. Das Herauslösen der Hepatozyten aus dem Leberzellverbund und die Aufhebung der Interaktion mit den anderen Organen des lebenden Organismus stellen bedeutende Veränderungen der Lebensbedingungen der Zellen dar. Durch eine Reihe von Komponenten wie der Verlust der Zellausrichtung und Zellkontaktes und der Aussetzung an der hypothermen Hypoxie und der Enzymwirkung der membranschädigenden Kollagenase stellt der Vorgang der Zellisolierung und der Aufbereitung bis zur Zelleinfüllung eine bedeutende Belastung für die Integrität der einzelnen Zellen dar. Dementsprechend sind die Wiedererwärmung, die Reoxygenierung, die Nährstoffversorgung, die Wachstumsfaktorenwirkung durch Tierplasmasubstitution und die Rotation des Bioreaktors zur gleichmäßigen Verteilung der Zellen im Zellkompartiment entscheidend für einen erfolgreichen Adhäsionsprozess. Ziel des letzten ist die Zellhaftung und –ausbreitung auf den Kapillaren und die Wiederherstellung der Homoöstase durch Ausgleich der Nährstoff- und Sauerstoffschuld und durch Rekonstruktion des Zytoskeletts und der Zellpolarität.


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2.3.  Viabilitätsuntersuchungen und Analytik

2.3.1.  Bolus Leberfunktionstests

Bei den Bolus Leberfunktionstesten wird der zeitabhängige Umsatz von Substraten im geschlossenen Reaktorkreislauf beurteilt. Folgende Substanzen werden in der angegebenen Dosis in den Bioreaktorkreislauf eingebracht:

Tabelle 4: LFT Substanzen für Bolustests

Substanz

Dosis

Lidocain/MEGX

(Lidocain 1%,Apotheke desVirchow-Klinikums, Humboldt-Universität ,Berlin)

3mg

Sorbitol

(Sorbitol 40%, SerumWerk Bernburg AG, Bernburg)

1,8g

Galactose

(Galaktose25%, Apotheke des Virchow-Klinikums, Humboldt-Universität, Berlin)

1,5g

Ammoniak

(0,05 molar NH4Cl, Apotheke des Virchow-Klinikums, Humboldt-Universität, Berlin)

750 µmol

Die Durchführung des Leberfunktionstests umfasst folgende Schritte:

  1. Betriebsart Rezirkulation wählen
  2. Leerwerte für alle Parameter gewinnen (Zeitpunkt 0)
  3. Unmittelbar im Anschluss alle Testsubstanzen injizieren
  4. Nach 90 Minuten Verlaufswerte erheben (Zeitpunkt 90)
  5. Betriebsart Mediumsubstitution wählen

Auf die exakte Dosierung und Handhabung ist zu achten um Fehler gering zu halten.

Die Leerversuche, mit Bioreaktoren ohne Zellen, erfolgen mit dem gleichen Procedere.

Die metabolischen Leberfunktionstests wurden am Tag 0 im zellfreien Bioreaktor durchgeführt. Dann als Standard mit Zellen am Kulturtag 1, 2, 3, 6, 9, 12, 15, 18, 21 und alle folgenden 3 Tage. Aus verschiedenen Gründen wurden manchmal die Tests auch an anderen Tagen durchgeführt, so dass für die Auswertung Kategorien der Kulturtage geschaffen wurden.

Für die Auswertung wurde die Differenz der gemessenen Konzentration der jeweiligen Substanz zum Zeitpunkt 90 min (C90min)minus der Ausgangskonzentration zum Zeitpunkt 0 min (C0min) als delta- Wert (Δ-Substrat) berechnet. Der delta- Wert gleicht die ungleichen Zeitintervalle zwischen aufeinander folgenden metabolischen Bolustests aus.

Abbildung 5: Berechnung zur Normalisierung der Bolus LFT Werte


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2.3.2.  Kontinuierliche Leberfunktionstests

Mit Hilfe von Leberfunktionstests (LFT’s) erfolgte die Beurteilung der Stoffwechselleistungen der Hepatozyten. Dazu wurden unterschiedliche Testsubstanzen kontinuierlich zusammen mit dem Nährmedium in den Reaktorkreislauf eingebracht. Kontrolliert wurde die gleichmäßige Zugabe von den LFT-Testsubstanzen durch Abnahme von Mediumleerwerten aus den Mediumbeuteln.

Der Bioreaktor wurde entsprechend dem Protokoll für die Stand-By Kulturphase betreut. Die Entnahme der Proben für die Analytik erfolgte einmal täglich zur gleichen Uhrzeit. Am Tag 0, dem tag der Zelleinfüllung wurde nach 1 und 6 Stunden eine Probe entnommen. In den folgenden 3 Tagen dann jeweils einmalig, danach im 3 Tages Rhythmus.

Die Testsubstanzen wurden vor dem Anschluss eines neuen Mediumbeutels unter sterilen Bedingungen mit folgenden Zielkonzentrationen in diesen eingespritzt:

Tabelle 5: LFT Substanzen für kontinuierliche Tests

Substanz

Konzentration

Lidocain

(Lidocain 1%,Apotheke desVirchow-Klinikums, Humboldt-Universität ,Berlin)

6 mg/l

Sorbitol

(Sorbitol 40%, SerumWerk Bernburg AG, Bernburg)

1 g/l

Galaktose

(Galaktose25%, Apotheke des Virchow-Klinikums, Humboldt-Universität, Berlin)

1 g/l

Die Testmethode basiert auf der Messung des Fliesgleichgewichts der Elimination der entsprechenden Testsubstanz.

Um den systematischen Fehler durch die manuelle Zugabe der Testsubstanzen in die Medienbeutel zu minimieren wurde die Konzentration der Testsubstanzen im Mediumreservoir (CMedium) bestimmt und die gemessene Konzentration der Substanzen im Bioreaktorkreislauf (CProbe) davon subtrahiert. Der daraus resultierende Wert wurde nach dem Substrat bezeichnet.

Abbildung 6: Berechnung zur Elimination systemischer Fehler Ausgangskonzentration Substrat im Medium

2.3.3. Lidocain

Lidocain wurde mit dem TDx/TDxFLx Lidocain Assay Testkit in einem TDx System (beides Abbott Laboraties, IL, USA) analysiert. Der Lidocain Assay beruht auf dem Prinzip des Fluoreszenzpolarisations- Immunoassys (FPIA).

Am Anfang jeder Messungen erfolgte die Überprüfung der Kalibrierung des TDx System, weiter Qualitätssicherung erfolgte durch die Messung einer Lidocain Kontrollkonzentration während jedem Durchlauf des Probenkarussells.

Das Testkit wurde gemäß Bedienungsanleitung verwendet.


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2.3.4.  MEGX

Monoethylglycinexylidide wurde mit dem TDx/TDxFLx MEGX Assay Testkit in einem TDx System (beides Abbott Laboraties, IL, USA) analysiert. Der MEGX Assay beruht wie der Lidocain Testkit auf dem Prinzip des Fluoreszenzpolarisations- Immunoassys (FPIA).

Am Anfang jeder Messungen erfolgte die Überprüfung der Kalibrierung des TDx System, weiter Qualitätssicherung erfolgte durch die Messung einer MEGX Kontrollkonzentration während jedem Durchlauf des Probenkarussells.

Das Testkit wurde gemäß Bedienungsanleitung verwendet.

2.3.5. Galaktose

Die Bestimmung von Galaktose erfolgt indirekt photometrisch durch Messung von NADH bei 365 nm mit einem Corbas Fara II Analyzer, Hoffman La Roche, Grenzach. Als Enzym wurde β-Galactose Dehydrogenase (GalDH) aus Pseudomonas Fluorescens von Boehringer Mannheim Laboratories, Mannheim verwendet109.

Reaktions- Gleichung:

Das Prinzip der Testreaktion ist die Oxydation von Galaktose zu Galaktonolacton verbunden mit der Umwandlung von NAD+ zu NADH. Als Umgebungsbedingungen der Reaktion wurde 25°C, pH 9 und Tris-HCL Puffer gewählt.

2.3.6. Sorbitol

Die Bestimmung von Sorbitol erfolgt indirekt photometrisch durch Messung von NADH bei 365 nm mit einem Corbas Fara II Analyzer, Hoffman La Roche, Grenzach. Als Enzym wurde Sorbitol Dehydrogenase (SDH) aus der Schafs Leber von Boehringer Mannheim Laboratories, Mannheim verwendet110.

Reaktions- Gleichung:

Das Prinzip der Testreaktion ist die Oxydation von Galaktose zu Galaktonolacton verbunden mit der Umwandlung von NAD+ zu NADH. Als Umgebungsbedingungen der Reaktion wurde 25°C, pH 9 und Tris-HCL Puffer gewählt.

2.3.7. Albumin

Pig-Albumin wurde immunoturbidimetrisch bestimmt. Das Prinzip dieser Methode ist die Messung der Adsorption der Trübung einer Suspension mit Immunkomplexen, bestehend aus dem zu bestimmenden Protein und dagegen gerichtete Antikörper. Dabei wurde ein Zentrifugal-Analysegerät (Cobas Fara II Analyzer, Hoffmann La Roche, Grenzach) eingesetzt. Der Nachweis erfolgte mit gegen Pig-Albumin gerichtetem Kaninchen-Antiserum (Nordic, Biogenzia, Bochum). Gereinigtes Pig-Albumin wurde als Standard verwendet (Nachweisgrenze: 2 µg/ml).

2.4. Statistik

Das Codebook, die Zusammenstellung aller Variablen mit Typ und Art der Erfassung, für die Daten wurde im Rahmen der Entwicklung einer Access Datenbank (Version 7, Microsoft Corporation, Redmond, USA) erstellt. Die Datenauswertung erfolgte mittels dem SPSS 11.5 Software Packet von SPSS Inc., Chicago, USA. Die ausgewählte Statistik basiert auf den Methoden, die in den Büchern von Felix Brosius111, Julie Pallant112 und Hans-Ullrich Harten et al113 und der Wolfram Research Webseite von Eric Weisstein114 beschrieben sind. Die Auswahl der verwendeten statistischen Methoden, die einfaktorielle ANOVA und der T-Test für unabhängige Stichproben, beruhen auf der Art der jeweils zugrunde liegenden Daten und wird jeweils bei der Exploration der Daten im Ergebnissteil begründet. Es wurden die gängigen Standardverfahren für die vorliegenden [Seite 37↓]Daten benutzt.

2.4.1. Statistische Prüfung von Unterschieden zwischen Mittelwerten

Ein statistischer Test ist ein statistisches Prüfverfahren, mit dessen Hilfe beurteilt werden kann, ob man aufgrund vorliegender Messwerte die so genannte Nullhypothese annehmen oder verwerfen kann. Mit einer Nullhypothese wird behauptet, dass sich beispielsweise zwei Mittelwerte nicht signifikant voneinander unterscheiden, da deren Unterschiede nur auf zufällige Verzerrungen zurückzuführen sind. Über die Annahme oder Ablehnung einer Nullhypothese wird aufgrund eines statistischen Tests, eines so genannten Signifikanztests, entschieden. Wird die Nullhypothese abgelehnt, dann wird eine Alternativhypothese formuliert, die davon ausgeht, dass der Unterschied zwischen den Mittelwerten nicht zufällig entstanden sondern statistisch bedeutsam, also signifikant ist.

Bei der Prüfung statistischer Hypothesen können prinzipiell zwei Arten von Fehlern gemacht werden: Fehler 1. Art (Alpha-Fehler) und Fehler 2. Art (Beta-Fehler). Ein Fehler 1. Art liegt vor, wenn die Nullhypothese abgelehnt wird, obwohl sie richtig ist. Von einem Fehler 2. Art spricht man, wenn die Alternativhypothese abgelehnt wird, obwohl sie richtig ist.

Die Signifikanztests enthalten nun Berechnungsverfahren, um aus den gegebenen Stichprobenwerten Prüfgrößen zu bestimmen. Diese Prüfgrößen folgen wiederum bestimmten theoretischen Verteilungen aus denen man die so genannte Irrtumswahrscheinlichkeit p berechnen kann. Diese Irrtumswahrscheinlichkeit p ist die Wahrscheinlichkeit, einen Fehler 1. Art zu begehen, d.h. die Nullhypothese zu verwerfen, obwohl sie richtig ist und stattdessen die Alternativhypothese anzunehmen.

Die so bestimmte Irrtumswahrscheinlichkeit p wird als Wert zwischen 0 und 1 oder zwischen 0 und 100% angegeben. Der Wert, das so genannte Signifikanzniveau, bei dem man sich entschließt, die Nullhypothese zu verwerfen, ist prinzipiell frei wählbar.

Für die Prüfung der Unterschiede zwischen Mittelwerten wurden der T-Test und die ANOVA angewendet. Bei beiden ist der sprachliche Gebrauch für das Signifikanzniveau und übliche Grenzwerte, repräsentiert durch die Irrtumswahrscheinlichkeit p gleich:

Tabelle 6: sprachliche Interpretation des Signifikanzniveaus

Irrtumswahrscheinlichkeit p (bzw. alpha)

Sprachgebrauch

p ≤ 0,01

Hochsignifikant

p ≤ 0,05

Signifikant

p > 0,05

Nicht signifikant

2.4.1.1. ANOVA

Mit einer einfaktoriellen ANOVA (ANalysis Of VAriance) lässt sich, ähnlich dem T-Test für unabhängige Stichproben, eine Hypothese überprüfen, der zufolge eine Variable in unterschiedlichen Teilgruppen der Grundgesamtheit einen gleich hohen Mittelwert aufweist. Mit der ANOVA lassen sich mehrere Mittelwerte von mehreren Teilgruppen der Grundgesamtheit vergleichen. Die einfaktorielle (one-way) ANOVA lässt eine Gruppierungsvariable zu.

2.4.1.2. T-Test

Der T-Test bei unabhängigen Stichproben überprüft wie die ANOVA Unterschiede zwischen den Mittelwerten. Im Gegensatz zur ANOVA ist der T-Test dabei auf zwei Teilgruppen beschränkt.


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2.4.2.  Graphen

2.4.2.1. Fehlerbalken- Diagramm

Mit einem Fehlerbalken- Diagramm kann man den Mittelwert und die Streuung, im Falle dieser Arbeit repräsentiert durch die 2- fache Standardabweichung, darstellen. Die Streuung liefert Informationen über den wahrscheinlichen Mittelwert in der Grundgesamtheit.

Abbildung 7: Fehlerbalkendiagramm mit erklärender Darstellung

2.4.2.2. Boxplot

Der Boxplot stellt an der Abszisse die Gruppen dar. Die Quartilen sind die obere und untere Begrenzung der Box, der Median ist der Balken in der Mitte. Die T-förmigen Ausläufer der Boxen sind die größten und kleinsten Werte, das Maximum und Minimum. Kreise sind Ausreißer, im Bereich von mehr als das 1,5 fache der Boxlänge, gerechnet ab der äußeren Kante der Box. Extremwerte, mit über der 3 fachen Entfernung der Boxlänge, sind –so weit dargestellt- Sternförmig.

Abbildung 8: Boxplot mit erklärender Darstellung


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08.03.2005