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4.  Diskussion

4.1. Metabolische Untersuchungen

Wie in der Aufgabenstellung der Arbeit bereits erläutert steht die Suche nach geeigneten Methoden zur Routinemäßigen Bewertung und Qualitätssicherung von dynamischen Leber- Zellkulturen in Bioreaktoren im Vordergrund dieser Arbeit. Außerdem ist mit den Ergebnissen eine Aussage zum Wirksamkeitsnachweis des Bioreaktors mit der Hypothese „der Bioreaktor ermöglicht lebertypische Leistungen“ möglich, beziehungsweise zum Zurückweisen der dazugehörigen Nullhypothese „der Bioreaktor ermöglicht keine lebertypische Leistungen“. Die untersuchten Protokolle für die quantitativen metabolischen Tests haben in der Praktikabilität Vor- und Nachteile. Die auf dem Bolus Prinzip basierenden Tests sind von einem Fliessgleichgewicht und der damit verbundenen kontinuierlichen Mediumzufuhr unabhängig, sie lassen sich deshalb auch unmittelbar nach einem Therapie Einsatz zur Bewertung der Zellfunktion einsetzen. Die kontinuierlichen metabolischen Tests sind weniger Arbeitsintensiv, da nur einmal täglich eine Probe genommen werden muss, und weniger belastend für die Zellen, da sie ohne 90 min Rezirkulation des Bioreaktorkreislaufs auskommen. Des Weiteren weniger anfällig für Fehler bei der Mischung und Gabe der Testsubstanzen, da diese bereits beim Hersteller des Mediums zugesetzt werden können.

Ein Vergleich mit Werten der bestehenden Literatur, die sich zumeist auf klinische Studien in vivo bezieht ist bei den meisten Substanzen aufgrund der unterschiedlichen Kinetik schwierig.

4.1.1. Lidocain

Die Ergebnisse der verschiedenen Studien zu Lidocain haben verschiedene Aussagen, zu unterschiedlichen Zielen der Arbeit. Die Ergebnisse der Bolus Versuche eignen sich Aufgrund der Groupierung in Standard, Therapie, Infiziert und Zellfreier Bioreaktor zur Charakterisierung. Bei Lidocain zeigte sich im Post Hoc Test der ANOVA lediglich ein Unterschied von der Gruppe Zellfreier Bioreaktor zu den restlichen Gruppen. Die Standard Gruppe kann aber für die Charakterisierung der typischen Stoffwechselleistung herangezogen werden. Durch eine scharfe Abgrenzung zu der Gruppe „Zellfreier Bioreaktor“ ist es möglich z.B. durch Definition der 80% Perzentile ein Qualitäts- und Freigabekriterium für Therapieeinsätze zu schaffen. Der T-Test zwischen der Standard und der Gruppe „Zellfreier Bioreaktor“ zeigte einen hochsignifikanten Unterschied, was zur Untermauerung der Hypothese „der Bioreaktor ermöglicht Lebertypische Leistung“ bzw. zum Zurückweisen der Nullhypothese „der Bioreaktor ermöglicht keine Lebertypische Leistung“ dient. Lidocain ist als Parameter um Infektionen zu detektieren bei individuellen Bakterienstämmen nur indirekt nützlich, Veränderungen um über 10% mehr Stoffwechselleistung im Verlauf zweier Tage sind jedoch immer als verdächtig einzustufen. Veränderungen, die einen deutlichen Abfall der Stoffwechselleistung im Verlauf der ersten 3 Wochen einer Zellkultur zeigten, gingen immer mit einem unerwünschten Ereignis, wie z.B. einer pH Schwankung durch stundenlangen Ausfall der Kohlendioxidgasbeimischung mit anschließender schneller Kompensation durch Natriumbicarbonat einher.

Die kontinuierlichen metabolischen Versuche mit Lidocain geben einen Überblick über den Verlauf während der gesamten Kulturdauer. Über drei Wochen sieht man eine deutliche Differenz zwischen der Konzentration des Fliesgleichgewichts im Bioreaktor und der Konzentration im Medium. Der darauf folgende Abfall der Differenz liegt vor allem an weiteren Versuchen, wie Hypothermie oder Versuche für andere Oxygenierungs- und Konservierungsfragestellungen, die partiell schädigend auf die Zellkultur wirkten.

Die Kinetik von Lidocain im verwendeten Zellkultursystem wurde in mehreren Zellfreien Systemen gemessen. Die Kinetik wird von den einzelnen Kompartimenten des Bioreaktorkreislaufs bestimmt. Initial, beim Zeitpunkt null wird die Substanz in den auf Rezirkulation, d.h. keine Medium Zufuhr oder Ablauf, gebrachten äußeren Bioreaktorkreislauf eingebracht. Dort verteilt es sich sehr schnell. Parallel zu dieser Arbeit wurde eine Studie zur Verteilung mit Phenolrot durchgeführt, dabei wurde eine Aufsättigungskurve mit einem Grenzwert bei etwas über 10 min gemessen. Ein langsamerer Verteilungsvorgang, die Diffusion zwischen Bioreaktorkreislauf und dem Raum innerhalb der Membranen hin zum Zellkompartment, findet verzögert statt. Bei einer noch unpublizierten Phenolrot Kinetikstudie zeigte sich eine Näherungs- Funktion vom Konzentrationsmaximum bis zum letzten Messwert. Die interpolierte Darstellung im Diagram Lidocain Kinetik zeigt die gleiche Kinetik mit gröberem Raster.


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Nach den vorliegenden Ergebnissen kann man die Elimination von Lidocain als geeigneten Parameter für die metabolische Kompetenz des Cytochrom P-450 Systems der Zellkultur ansehen.

Der klinische Nutzen des Lidocain und MEGX Tests wird in der Literatur kritisch diskutiert. Ähnlich den Ergebnissen in der Zellkultur variieren auch in den quantitativen Leberfunktionstesten beim Patienten die Resultate. Darüber hinaus wird eine große Variabilität der Werte sogar in Patienten mit gleichartiger Ätiologie, Aktivität und Störung der Leberfunktion beobachtet118. Die Variabilität ist auch beim ABT groß, was auf bedeutsame interindividuelle Unterschiede in der Performance der microsomalen Enzyme hinweist. Im direkten Vergleich mit dem ABT und GEC konnte der Lidocain / MEGX Test Patienten mit leichter und schwerer Lebererkrankung schlechter differenzieren. Die beste Differenzierung gelang Meyer-Wyss et al mit dem Galaktose- Eliminations- Kapazitäts- Test. In der gleichen Studie wurde auch nur eine schwache Korrelation zwischen den Ergebnissen des GEC, ABT und dem Lidocain / MEGX Test gefunden. Große interindividuelle Schwankungen wurden auch von Bargetzi et al berichtet80.

Lebererkrankungen per se sind mit einer reduzierten microsomalen Cytochrom P450 Enzym- Aktivität verbunden 119 und die gestörte microsomale metabolische Aktivität steht primär in Beziehung zum Verlust von funktioneller Lebermasse 120.

Die Funktion der Zellen ist aber auch von den Kulturbedingungen abhängig. Zusammenhänge zwischen dem Erhalt typischer Leistung, der Induktion von Cytochrom P450 Isoenzymen in Hepatozytenkulturen und dem Sauerstoff- Partialdruck sowie Insulin und Glucagon Konzentration sind für Monolayerkulturen beschrieben121.

Der Metabolismus von Lidocain ist auch in älteren Lebern signifikant reduziert122.

4.1.2. MEGX

Die Interpretation der Ergebnisse für MEGX ist analog zu der von Lidocain, dessen Ausgangssubstanz. Die Variabilität ist bei MEGX am größten, von allen Parametern die gemessen wurden. Sowohl die Schwankungen intraindividuell, also auf eine Zellkultur bezogen, als auch die interindividuellen Unterschiede sind am größten. Bei der Bolus Versuchsreihe zeigt sich eine extrem große Variabilität für die Gruppe „Infektion“. Dies ist damit zu erklären, dass manche Bakterienstämme einen hohen synergistischen Stoffwechseleffekt haben, andere keinen. Deshalb ist ein hoher MEGX Wert, jenseits der in der Standardgruppe gemessenen Werte immer ein dringender Infektionsverdacht. Niedrige Werte jedoch bedeuten keinen Ausschluss, obwohl im Post Hoc Test der ANOVA die Gruppen „Standard“ und „Infektion“ eine signifikante Differenz aufweisen. Der Wertebereich der Standard-Gruppe überschneidet sich vollständig mit der Gruppe „Infektion“. Lediglich der Additionseffekt ist ein Zeichen.

Der T-Test zwischen den Gruppen „Standard“ und „Zellfreier Bioreaktor“ beweist einen signifikanten Unterschied. Die Werte für die zellfreien Bioreaktoren bewegen sich am Detektionslimit des verwendeten Analytik-Testkits, da ohne Zellen keine MEGX Synthese stattfindet.

Bei der Versuchsreihe mit kontinuierlicher Zufuhr von Lidocain kann der Verlauf der MEGX Synthese über 33 Tage hinweg dargestellt werden. Initial, an Tag 0. ist die MEGX Synthese am höchsten, danach hat sie ein weiteres Maximum im Bereich des 14. Tags und pendelt danach im Bereich von 25µg/ml ohne einen deutlichen Trend zu zeigen. Die Extremwerte und Ausreißer sind nicht alle nachvollziehbaren Ereignissen zuzuordnen. MEGX ist wegen seiner Schwankungen kein sensibler Parameter für Qualitätsänderungen im Verlauf, obwohl Werte jenseits des Bereichs der Standard Gruppe immer auf unerwünschte Veränderungen in der Zellkultur hindeuten. Die Festlegung eines Minimalwerts zur Qualitätssicherung ist empfehlenswert.

Die Kinetik von MEGX wurde ebenfalls in zellfreien Bioreaktoren gemessen. Der Verlauf ist der Kinetik von Lidocain ähnlich, da direkte Abhängigkeit besteht. Die Werte befinden sich am Detektionslimit des Abbott Testkits und kommen vermutlich durch spontanen Zerfall und Kreuzreagibilität des Testkits mit Lidocain Zustande und sind deshalb nur bedingt aussagekräftig. Im zellgefüllten Bioreaktor ist die Kinetik durch den Metabolismus von Lidocain charakterisiert und korreliert individuell abhängig von der Zellkultur mit diesem.

In der Tierexperimentellen Erprobung eines Leberunterstützungssystems wurde MEGX und Lidocain bereits verwendet um den Unterschied zwischen zwei Kontrollgruppen (eine Gruppe [Seite 61↓]zellfreies Leberunterstützungssystem- andere Gruppe kein extrakorporales System) und Bioraktor mit Zellen zu demonstrieren123.

Im klinischen Gebrauch ist der MEGX Test umstritten. Manche Autoren geben ihm einen Stellenwert für bestimmte Fragestellungen, wie Lamesch et al, die den MEGX Test für einen nützlichen Parameter halten Patienten nach LTx in gute und schlechte Prognosen zu unterteilen124. Schroeder et al125 halten den Lidocain / MEGX Test für nützlich um Spender Organe zu evaluieren und so das Optimum an verfügbaren Organen zu erreichen. Burdelski et al fand heraus, dass das Risiko der initialen Nicht- Funktion von transplantierten Lebern auf 1 zu 3 reduziert werden kann126, in einer späteren Studie wurde die Korrelation zum Sauerstoffverbrauch nach der Revaskularisierung mit der MEGX Synthese dargestellt127. Für ein 20 Tage Leber- Transplantat Überleben fanden Oellerich et al. eine prognostische Sensivität von 73% und eine Spezifität von 78% des Megx Tests128129. Ercolani et al groupiert Patienten nach MEGX Schwellenwerten von 25 ng/ml und 10 ng/ml Serum- MEGX- Konzentration und berichtet von Signifikanten Aussagen zur Prognose der Patienten, allerdings in Kombination mit dem Child- Pugh- Score 130. Shiffman et al beschreibt die Korrelation von MEGX Synthese und Leberhistologie sowie der Child Klassifikation mit Signifikanten Ergebnissen 131. Fabri et al kommentiert die Ergebnisse von Shiffman et al kritisch: Der Metabolismus ist abhängig von der Leberhistologie aber eine Sensitivität von 65% um Patienten mit Child Klasse A Leberzirrhose zu detektieren, wie von Shiffman berichtet, ist nur ein wenig akkurater als das einfache Werfen einer Münze; die quantitative Messung der Funktion der Leber ist schwierig und mit Fehlern behaftet wegen der interindividuellen Variabilität des Metabolismus von Substraten 132. Huang et al. hat mit einem kleinem Patientenkollektiv und anderen Granzwerten für Sensitivität, Spezifität und Akkuratesse Werte von über 80% 133. Weitere Literatur zu MEGX wurde ansonsten bereits im Abschnitt zur Testsubstanz Lidocain diskutiert.

4.1.3. Sorbitol

Mit Sorbitol kann eine Aussage über die Funktion des Insulinunabhängigen Zuckerstoffwechsels gemacht werden.

Die Unterschiede der Mittelwerte in der ANOVA mit Post Hoc Test sind für die Gruppen „Standard“ verglichen mit „Infektion“ und „Zellfreier Bioreaktor“ signifikant. Um einen Bereich festzulegen, in dem eine normale Funktion der Zellen angenommen werden kann eignet sich die Abgrenzung zwischen Standard Gruppe und „Zellfreier Bioreaktor“. Die obere Quartile der Standard Gruppe könnte dazu die Obergrenze sein, der Minimalwert der Standard Gruppe für Δ-Sorbitol die untere Begrenzung. Ein infizierter Bioreaktor zeigt mehrere extrem niedrige Δ-Sorbitol Werte, was auf einen Summationseffekt durch den Bakterienstoffwechsel hindeutet. Sorbitol hat einen gleichmäßigen intraindividuellen Verlauf und nur mäßige interindividuelle Schwankungen.

Die Fragestellung des Zurückweisens der Nullhypothese „der Bioreaktor ermöglicht keine Lebertypische Leistung“ mittels T-Test zwischen der Standard und „Zellfreier“ Bioreaktor“ Gruppe ist hochsignifikant. Damit leistet auch Sorbitol einen Beitrag zum Wirksamkeitsnachweis des Bioreaktors.

Bei den kontinuierlichen metabolischen Untersuchungen mit Sorbitol durch Zugabe im Medium und einmal täglicher Messung des Fliesgleichgewichts zeigt sich ein guter Verlauf über die Zeitdauer des Routine Stand-By Protokolls. In den ersten beiden Tagen ist der Mittelwert von Δ-Sorbitol etwas geringer als in den darauf folgenden 14 Tagen. Die Werte sind insgesamt stabil auf hohem Niveau, Ausreißern und Extremwerten kann immer ein unerwünschtes Ereignis, wie unsachgemäße Gaseinstellung nach Wechsel einer Gasflasche zugewiesen werden. In den letzten Kategorien der Kulturtage schwanken die Werte da in diesem Zeitrahmen das Standard Protokoll bei vielen Zellkulturen verlassen wurde und Oxygenierungs- und Konservierungsstudien durchgeführt wurden.

Die Kinetik von Sorbitol gemessen in zellfreien Bioreaktor- Systemen ist geprägt durch schnelle Aufsättigung in den ersten 30 Minuten und ein darauf folgendes geringfügig niedrigeres Plateau. Die Verteilung zwischen den verschieden Kompartimenten des Bioreaktor- Systems ist als schnell einzustufen.

Insgesamt ist Sorbitol ein sensitiver Parameter für den Energieverbrauch und ist für die Routine der Qualitätssicherung ein wertvoller Beitrag.

Im klinischen Gebrauch ist Sorbitol erste Wahl als Testsubstanz um den hepatischen Blutfluss mit [Seite 62↓]einer nicht- invasiven Technik zu Messen134. Des Weiteren repräsentiert die nicht- renale Clearance von Sorbitol den funktionellen Fluss in Patienten mit Zirrhose. Bei der Verwendung der Infusions- und Messtechnik von Bradley135136 kann die Differenz zwischen totalem und funktionellem Blutfluss als intrahepatischer Shuntfluss betrachtet werden.

4.1.4. Galaktose

Der Stoffwechsel von Galaktose ist eine Lebertypische Leistung aus dem Bereich des Energiestoffwechsels.

Galktose, bzw. die Differenz des Messwerts zum Mediumleerwert, Δ-Galaktose zeigt bei den Post Hoc Tests der ANOVA zwischen allen Gruppen hochsignifikante Unterschiede. Dies liegt vor allem an der gleichmäßigen Homogenität der Varianz. Galaktose ist als Parameter zur Qualitätssicherung geeignet, der Bereich der tolerierten Werte für ein Zellsystem, dass klinisch Verwendung finden soll, könnte bei der oberen Quartile beginnen und bis zum Minimalwert der Standardgruppe gehen.

Der Beitrag zum Zurückweisen der Nullhypothese und damit zum Wirksamkeitsnachweis durch den T-Test zwischen den Gruppen Standard und „Zellfreier Bioreaktor“ ist hochsignifikant. Die Nullhypothese „der Bioreaktor ermöglicht keine Lebertypische Leistung“ kann mit Galaktose ebenfalls zurückgewiesen werden.

Im zellfreien System ähnelt die Kinetik von Galaktose der des anderen Zuckers Sorbitol. Nach 30 Minuten ist eine Aufsättigung da mit einem Plateau über den gesamten Messzeitraum von 180 Minuten. Eine schnelle Verteilung über alle Kompartimente des Bioreaktor-Systems ist anzunehmen.

Bei den kontinuierlichen metabolischen Leberfunktionstests mit Berechnung der Differenz zwischen Fließgleichgewicht und Mediumleerwert ist Galaktose ebenfalls Sorbitol von der Dynamik ähnlich. In den ersten Tagen sind die Mittelwerte geringfügig unter den Werten der darauf folgenden 2 Wochen, die Werte steigen in der ersten Woche treppenförmig an, wahrscheinlich ist dieses Phänomen mit Enzyminduktion zu erklären 137138. Während der Routinemäßigen Kulturphase unter dem Stand-By Protokoll bewegen sich die Mittelwerte insgesamt auf hohem und gleichmäßigen Level. Allen Ausreißern und Extremwerten in diesem Bereich lassen sich unerwünschte Ereignisse zuordnen. Ab Kategorie des Kulturtags „day 17-21“, wurde das Stand-By Protokoll zugunsten von Oxygenierungs- und Konservierunguntersuchungen verlassen, die Streubreite der Werte in diesem Bereich ist deshalb groß und ohne weitere Groupierung wenig gehaltvoll.

Interferenzen mit anderen Substanzen sind bei Galaktose möglich. Eine Sudie von Keiding et al zeigte, dass Ethanol die Kinetik der Galaktose Elimination stark beeinträchtigt, Km wurde signifikant von 0,23 mmol/l auf 0,03 mmol/l reduziert139. Dies spricht auf jeden Fall für die gleichzeitige Verwendung von Galaktose und Ethanol als Testsubstanzen.

Durch die gute Reproduzierbarkeit und Stabilität ist Δ-Galaktose als guter Parameter für die Qualitätssicherung zu gebrauchen.

Im der klinischen Anwendung ist die die Galaktose- Eliminations- Kapazität bei der Verlaufsbeurteilung eines etablierten Leberschadens nützlich140. Der Zeitpunkt des Eintritts der Leberinsuffizienz kann bei chronisch progressiven Leber- Erkrankungen mit großer Genauigkeit voraus gesagt werden141.

Fabbri et al142 wertete die Ergebnisse von 868 GEK Tests in Patienten mit Lebererkrankungen aus, die Ergebnisse zeigen eine intrinsische Variabilität des Tests von 10%, ausserdem gibt Fabbri den Hinweis die Datenevaluation sorgfältig durchzuführen bei größeren intraindividuellen Schwankungen, die Schlussfolgerung bewertet den Test aber durchaus positiv für die Evaluation von Lebererkrankungen. Des Weiteren ist der Single Sample Galaktose Test der Messung an mehreren Zeitpunkten in der Genauigkeit unterlegen, insbesondere bei Patienten mit fortgeschrittenerer Lebererkrankung143.

4.1.5. Ammoniak

Der Abbau von Ammoniak erfolgt als Lebertypische Leistung vor allem durch den Harnstoffzyklus.


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Die Differenz zwischen der Konzentration von Ammoniak an den Test- Zeitpunkten 0 min und 90 min, Δ-Ammoniak zeigt in der ANOVA einen hochsignifikanten Unterschied zwischen allen Gruppen. Der Post Hoc Test zeigt einen Unterschied zwischen der Gruppe Zellfreier Bioreaktor, Standard, Therapie und Infektion.

Der T-Test ergibt ebenfalls einen hochsignifikanten Unterschied zwischen der Gruppe „Standard“ und „Zellfreier Bioreaktor“. Ammoniak ist somit ebenfalls ein Parameter, der zum Leistungs­nachweis der Leberzellkultur geeignet ist.

Die Kinetik von Ammoniak bei den Bolus Studien ist von einer schnellen Aufsättigung mit Maximum nach 30 min und einem langsamen Abfall geprägt.

Bei den kontinuierlichen Leberfunktionstesten wurde auf eine Zugabe von Ammoniak in höheren Dosen im Medium verzichtet um eine zu hohe Dauerbelastung der Zellen mit exogenem Ammoniak zu vermeiden. Stattdessen wurde eine umfangreiche Analytik des Amino- und Ketonsäurenstoffwechsels mittels HPLC durchgeführt, die in einer eigenständigen, noch unpublizierten Arbeit beschrieben werden.


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4.2.  Syntheseparameter

4.2.1. Albumin

Albumin ist ein Leberspezifischer Parameter, der gerne zur Beurteilung von Zellkulturen herangezogen wird.

Der Verlauf der Albumin Freisetzung gleicht mit seinem Peak initial dem der Enzymliberation. Zu Beginn der Zellkultur kann man von einer hohen Freisetzung durch geschädigte Zellen ausgehen. Im weiteren Verlauf gibt es noch mal ein weiteres Hoch in der zweiten Woche der Zellkultur. Dies wurde in anderen Bioreaktorkonstruktionen ebenfalls beschrieben144.
Albumin ist als Parameter, der die Proteinbiosynthese von Hepatozyten repräsentiert, zur Qualitätssicherung interessant. Außerdem zur Beurteilung der Differenzierung der Leber- Zellkultur.

4.2.2. Ammoniak Basal und Harnstoff

Ammoniak, als Abbauprodukt des Aminosäurestoffwechsels und der weniger toxische Metabolit Harnstoff repräsentieren ebenfalls Lebertypische Leistungen.

Im Verlauf über die Kategorie der Kulturtage ist Ammoniak initial höher, dann stabil und steigt gegen Ende der zweiten Woche treppenförmig an. Harnstoff verhält sich spiegelbildlich dazu. Der Metabolismus der Umwandlung von Ammoniak zu Harnstoff verschiebt sich zugunsten einer Freisetzung von Ammoniak. Eine Antwort auf die Frage ob es sich um eine Anpassung der Zellkultur an die Bedingungen im Bioreaktor handelt oder um einen Verlust differenzierter Zellfunktionen könnte eine Genexpressions- Studie mit variierendem Ammoniak- Spiegel bringen. Für die Bewertung der Zellkultur im Routinebetrieb eignet sich die Bestimmung der Konzentration von Ammoniak und Harnstoff wegen ihrer guten Reproduzierbarkeit und der einfachen Analytik.

Hohe Ammoniak Werte über 500 µmol/l sind immer ein ernstzunehmender Hinweis auf eine Infektion. Eine große Diskrepanz zwischen dem Ammoniak- und dem Harnstoffwert innerhalb eines Messwertes ist ebenfalls ein Anhaltspunkt für eine Infektion.

Die physiologische Ammoniak Elimination und Urea Synthese ohne weiteren Zusatz von Ammoniak im Medium bleibt über den gesamten Kulturzeitraum von bis zu 33 Tagen weitgehend stabil. Dies deckt sich mit Ergebnissen die mit anderen Bioreaktoren von unabhängigen Arbeitsgruppen144 erzielt wurden. Im klinischen Einsatz zeigte das Leberunterstützungssystem, das dieser Arbeit zugrunde liegt, dass es in der Lage ist den Anstieg der Plasma- Ammoniak- Konzentration abzuschwächen und Urea zu synthetisieren bzw. freizusetzen 145.

4.2.3. Lactat

Der Verlauf von Lactat ist durch einen höheren Mittelwert an Tag 1, einer stabilen Phase und einem Ansteigen der Mittelwerte in der zweiten Woche charakterisiert.

Zur Erkennung von Infektionen ist Lactat nur bedingt in der Lage, bei ca. 50% höheren Werten innerhalb einer Zellkultur und eines Tages sollte man unbedingt nach einem unerwünschten Ereignis suchen.

Lactat, als anaerobes Stoffwechselprodukt der Glykolyse, ist ein Parameter, der „Stress“ in der Zellkultur reflektiert wenn er die normalen Werte übersteigt. In der Qualitätssicherung ist Lactat eine wertvolle Information, die auf Probleme in der Gas- bzw. Sauerstoffversorgung hinweist.

Die Aufnahme von Lactat in die Hepatozyten ist von der Konzentration der Glukose146 im Medium und vom pH 147 abhängig Der im Medium enthaltene Glucosewert von gemessenen 12 mmol/l ist aber nur an der unteren Schwelle zur Inhibition der Aufnahme von Lactat in die Zellen.

4.3. Gesamtbewertung der Zellkulturen

Ähnlich den Ergebnissen in der Zellkultur variieren auch in den quantitativen Leberfunktionstesten beim Patienten die Resultate. Darüber hinaus wird eine große Variabilität der Werte sogar in Patienten mit gleichartiger Ätiologie, Aktivität und Störung der Leberfunktion beobachtet118; eine [Seite 65↓]Korrelation zwischen GEC, ABT oder MEGX mit den konventionellen Methoden zur Bewertung der Leberfunktion wie Prothrombin Zeit, Serum Bilirubin oder Albumin Synthese wurde in dieser Studie von von Meyer-Wyss et al nicht gefunden. In der dynamischen Zellkultur haben die individuellen Parameter und Tests ebenfalls nur eine geringe Korrelation, sie stehen jeweils für eine eigenständige Funktion in den kultivierten Zellen und ergeben nur in ihrer Gesamtheit eine umfassendere Aussage über den Status der Zellkultur. Die Variabilität ist durch die individuelle Genetik der als Zellquelle dienenden Schweine bedingt. Galaktose und Sorbitol haben eine geringere Schwankungsbreite als Lidocain und MEGX. Lidocain ist von der Variabilität ebenfalls geringer als MEGX, für den klinischen Einsatz empfiehlt eine Autorengruppe deshalb die Verwendung der Lidocain Elimination der MEGX Synthese vorzuziehen 148. In der Zellkultur verhält sich die Schwankungsbreite ähnlich, es macht Sinn, dieser Empfehlung zu folgen und nur Lidocain als Parameter zur Bewertung des Cytochrom P450 Metabolismus heranzuziehen. Außerdem gilt es zu berücksichtigen, dass Lidocain nur die Funktion eines Teils der Cytochrom P450 Familie reflektiert, wegen der interindividuellen Unterschiede ist es als alleiniger Marker der Zellfunktion deshalb nicht geeignet149.

Die Abhängigkeit der gemessenen Substanzen von der Kinetik ist eine Limitation um den Bioreaktor mit anderen System oder der in vivo Situation beim Menschen zu vergleichen. Wie in der Einleitung bereits erwähnt gehören alle gewählten Substanzen zum Fluss Limitierten Schema der hepatischen Clearance, ein Parameter aus der Enzym Limitierten Gruppe wie Antipyrin wäre für die Zukunft zu empfehlen um eine objektivere Clearance ohne Einfluss der Kinetik berechnen zu können150.

Die Oxygenierung der Zellkulturen ist ein Faktor, der im Routine Betreuungs- Protkoll lediglich durch regelmäßige Blutgasanalysen aus dem Bioreaktorkreislauf gemessen wird. Die metabolische Kapazität der Leberzellen korreliert in der perfundierten Leber für die Elimination von Galaktose und Lactat mit der Zufuhr von Sauerstoff 151. Lactat kann indirekt ein Feedback für die Oxygenierung der Zellkultur geben. Der pH Wert im physiologischen Bereich ist ebenfalls eine wichtige grundsätzliche Vorraussetzung für die einwandfreie Funktion der Zellkultur.

Da die meisten Parameter nur gering korrelieren und jeder einzelne eine Aussage über eine bestimmte Funktion bzw. Zelltypische Leistung mit sich bringt ist es sinnvoll- ähnlich dem vorgehen in der klinischen Diagnostik- mehrere repräsentative Parameter für verschiedene Funktionen zu haben um eine möglich umfangreiches Bild der Zellkultur zu bekommen. Bei den metabolischen Leberfunktionstesten bietet sich die Verwendung von Galaktose und Lidocain an, bei den Enzymen ALT, AST und LDH 152. Als Synthese Parameter sind Albumin für die Proteinbiosynthese und Harnstoff und Ammoniak für die Detoxifikation und den Stoffwechsel der Aminosäuren geeignet.

Die Enzyme, vor allem AST, ALT und LDH (Ergebnisse hier nicht dargestellt) eignen sich als Parameter um einen Zellschaden in der Kultur zu detektieren und sind somit ein wertvoller Beitrag zur Qualitätssicherung. Enzymliberation ist aber nicht geeignet um eine Aussage über den Funktionellen Zustand der Zellkultur zu machen.

Der Metabolismus von Aminosäuren eignet sich wegen der aufwendigen Analytik und Interpretation nicht als Routineparameter zur Qualitätssicherung, sie sind interessant für Studien über die Leistung der Zellkultur.

Der Verlauf der Zellkultur kann in 3 Phasen eingeteilt werden: (1) Erholung und Reorganisation nach der Zellisolierung in den ersten 3 Tagen; (2) Stabile Kulturbedingungen bis Tag 14; (3) moderater Abfall der Funktion ab Tag 14. Dies deckt sich mit allen gemessenen Parametern, den Enzymen, der Synthese Parametern und den metabolischen Parametern117.

Als Untersuchungsschema haben die in der Tabelle 15 aufgeführten Tests sich durch reproduzierbare Ergebnisse und sich ergänzende Informationen über den Status der Leber- Zellkultur zur täglichen Beurteilung der Qualität der Zellkultur bewährt. Sie decken eine akzeptabel repräsentatives Spektrum der Leistung und Status der Zellkultur ab.


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Tabelle 15: Übersicht Qualitätssicherung Zellkultur (In- Prozess Kontrollen)

Art

Funktion in der Qualitätssicherung

Enzym Liberation

Integrität der Plasmamembran bzw. Zellschaden, Abschätzung der Schädigung mittels Enzymmuster

Lidocain / MEGX

Cytochrom P450 Metabolismus

Galaktose

Galaktokinase, Kohlenhydratmetabolismus, Energiestoffwechsel

Sorbitol

Sorbitoldehydrogenase, Kohlenhydratmetabolismus, Fructose Stoffwechselweg

Ammoniak

NH4 Detoxifikation, Harnstoffzyklus, indirekt Aminosäurenmetabolismus

Harnstoff

NH4 Detoxifikation, Harnstoffzyklus, indirekt Aminosäurenmetabolismus

Lactat

Glykolyse, Oxygenierung bzw. „Stress“ in der Zellkultur

Pig- Albumin

Protein Biosynthese, Differenzierung d. Hepatozyten

Oxygenierung, Gasanalyse

Normbereich von pH als Vorraussetzung

Sterilkontrolle

Keimfreiheit

Hinsichtlich der therapeutisch Nutzbarkeit der Zellkultur ist es nicht zwingend nötig einen festen Zeitrahmen zu bestimmen, besser eignet sich die Definition von Normbereichen der in der Übersichts- Tabelle angegebener Parameter. Die Ressourcen sind damit effektiver zu Nutzen und dennoch sicher in der Handhabung.

Für die Definition der Zellkultur als aktives Biologic im Rahmen einer Zulassung bei den dafür zuständigen Autoritäten wie die EMEA (The European Agency for the Evaluation of Medicinal Products) und die FDA (U. S. Food and Drug Administration) eignet sich Harnstoff als Leitparameter, da es ein sensitiver Parameter für den Zustand der Leber- Zellkultur ist. Wahrscheinlich auch die wichtigste typische Leistung von Hepatozyten im als Therapie Indikation vorgesehen Krankheitsbild des akuten Leberversagens. Eine Kombination aus verschiedenen Parametern ist wahrscheinlich die bessere Lösung für die Standardisierung des Systems für klinische Studien.

4.4. Ausblick

Vielfältige Verbesserungen des Managements von dynamischen Bioreaktor- Zellkulturen sind von Interesse. Eine vorgeschlagene Verbesserung zur weiteren Fehlerbereinigung und Standardisierung der Messwerte ist die Einführung etablierter biotechnologischer Bilanzierungsschemata für die Testsubstanzen. Dazu gehört die genaue Protokollierung des Medium- Volumens, das zugeführt wird bzw. abläuft.

Für Untersuchungen zur Funktion von Leberzellen sind weitere interessante Parameter und Enzymfunktionen die Monoxygenasen mit der Testsubstanz Diazepam. Analytik inklusive der bekannten wichtigsten Metaboliten erfolgt am besten durch HPLC. Die klinische Bedeutung der Benzodiazepine beim hepatischen Koma und die repräsentative Lebertypische Detoxifikation machen laut Bader et al. 153 Diazepam zu einem wertvollen Test zur Beurteilung der Funktion einer Zellkultur für den klinischen Einsatz.

Für die initiale Messung der Zellviabilität vor dem Einfüllen der Zellsuspension in einen Bioreaktor bietet sich als anspruchsvollere Methode die Flusszytometrie an154. Dabei hat die Zellsuspension als eine Einzelzell- Suspension vorzuliegen, was eine weitere Aufbereitung der Probe für die Flow Cytometrie und dadurch eine gering gradige Verfälschung des Ergebnisses mit sich bringt. Ein [Seite 67↓]Vorteil gegenüber der einfachen Trypan- Blau Mikroskopie ist die bessere Reproduzierbarkeit, da die Flusszytometrie nicht von subjektiver Bewertung und Auszählung unter dem Mikroskop abhängig ist. Ein wichtigerer Vorteil ist die Möglichkeit, die einzelnen Zellreihen der Co- Kultur aufgeschlüsselt zählen zu können.

Die Gewinnung von mRNA und DNA aus den Bioreaktoren und die damit verbundenen Analytischen Methoden der Molokularbiologie, insbesondere der Genexpression, aber auch die einfache Bestimmung des DNA Bestandteils der Zellen stellen ein Potential dar, das erschlossen werden sollte. Eine Methode der Zellbiopsie aus den Bioreaktoren mittels Kollagenase für Flachmembranbioreaktoren ist in der Literatur von De Bartolo et al155 beschrieben. Nachteil dieser Methode ist jedoch, dass nur eine Endpunktbestimmung möglich ist zu einem Zeitpunkt zu dem der Bioreaktor klinisch nicht mehr einsetzbar ist. Eine Möglichkeit, dies zu umgehen ist die Nutzung von Bioreaktoren in Lab- Scale, die nur für wissenschaftliche Fragestellungen eingesetzt werden.

Die Gen Expression kann Information über den Grad der Differenzierung geben, sowie eine gute Rückkopplung um Variationen in den Kulturbedingungen zu messen oder Unterschiede in Zelllinien so weit wie möglich zu dikriminieren156. Außerdem wird die Gen Expression von Wissenschaftlern des King College in London als Standard für die Bewertung der Zellfunktion in Bioartifiziellen Leberunterstützungssystemen propagiert157. Um einen umfassenden Überblick über das genetische Programm der Zelle zu bekommen bieten Microarrays inzwischen eine Methode, die für viele Fragestellungen reizvoll ist158.

Eine weitere Möglichkeit pharmakokinetische Prozesse zu studieren bietet der Einsatz von Stabilen Isotopen159. Vorgänge wie Absorption, Distribution, Biotransformation und Exkretion sowie Pharmaka- Interaktionen können untersucht werden.

Durch Kryokonservierung und Pharmakologische Modulation bestehen Aussichten die Bereitstellung von Zellbasierten Therapiesystemen auf Abruf zu vereinfachen. Ermutigende Ergebnisse in diesem Bereich wurden von Makowka et al 160 und Maganto et al erzielt 161162163.

Die vorliegende Arbeit untersucht Leberfunktionstests an porcinen Zellen. Die Zellquelle des Leberunterstützungssystems wurde inzwischen im Rahmen kontinuierlicher Verbesserung der Bio- Kompatibilität auf humane Leberzellen umgestellt. Die Leberzellen stammen aus für Transplatation abgelehnten Organen und werden durch eine leicht Modifizierte 5- Schritt Kollagenase- Perfusion gewonnen. Die ersten mikroskopischen Ergebnisse zeigen, dass die Zellen gut in Bioreaktoren kultiviert werden können164. Erste ermutigende klinische Ergebnisse liegen vor69.

Für die Zukunft stehen weitere Zellquellen, darunter die Immunologische beste- autologe Zellen in Aussicht. Der interessanteste Aspekt in dieser Richtung ist sicherlich das zunehmende Wissen über die Differenzierung von Stammzellen und die Regeneration von Organen. Das Potential der adulten Stammzellen ist sehr viel versprechend. Die Mechanismen in vitro zu steuern ist allerdings nur rudimentär möglich. Eine gute Übersicht bietet ein Review von Gerlach und Zeilinger165. Eine weitere Alternative könnten genetisch modifiziere xenogene Zellen sein, wie porcine Zellen mit humanen Blutgruppenantigenen sowie Komplement- Aktivierungs- Inhibitoren auf den Zellmembranen. Diese transgene Schweine wurden im Rahmen der Erforschung der Xenotransplantation entwickelt166.

Die möglichen Verbesserungen des bestehenden Leberunterstützungssystems liegen nicht nur auf der Seite der Zellen und der Biologie, auch das Zellkultursystem mit dem Bioreaktor als Hauptkomponente ist ein Ansatzpunkt, im Bereich des Engineering. Ebenso der Bioreaktormonitor als Steuereinheit der Zellkultur: Feedback-Regulation durch Erfassung physikalischer und chemischer Parameter wie Druck und pH- Wert mittels Sensoren, gekoppelt mit Mikrocontroller gesteuerten Pumpen und Gaszufuhr bzw. –mischung kann potentiell die Anzahl der wegen unabgestimmtes Handling der Zellkultur bedingten Ausreißer und Extremwerte sowie mittels geringere Schwankungsbreite in den Kulturbedingungen auch geringe Variabilität bei den Ergebnissen bewirken.

In den letzten Jahren entstand aus verschiedenen wissenschaftlichen Bereichen wie Tissue Engineering und Entwicklungs- Biologie die neue Disziplin Regenerative Medizin, die sich eingehend mit der Erforschung von Gewebe- und Organfunktionen beschäftigt, fokussiert auf das Ziel Therapieformen zu finden. Die vorliegende Arbeit beabsichtigt einen bescheidenen Wissenszuwachs im Bereich dynamischer Zellkulturen beizusteuern.


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08.03.2005