Ergebnisse

Metabolische Untersuchungen – Bolus LFTs

Bei allen Testsubstanzen sind beachtliche interindividuelle Unterschiede zwischen den aus verschiedenen Organen isolierten Zellkulturen in den Bioreaktoren zu Beobachten. Die Verläufe über die Kulturtage haben generell eine sichtbare Tendenz. In den ersten drei Tagen ist bei allen Substanzen ein Anstieg in der Clearance und größere Schwankungen zu sehen.

Um auf die Fragestellung der Nutzbarkeit der Bolus LFT zur Qualitätssicherung einzugehen wurden die Bioreaktoren nach funktionellen Kriterien in 4 Gruppen aufgeteilt, je nach Verlauf der Bioreaktoren.

QA Gruppe (englische Bezeichnung)

Beschreibung

Standard (Standard)

Alle Bioreaktoren, mit primären porcinen Leberzellen, welche nicht in eine der anderen Gruppen fallen.

Therapie (Therapy)

Alle Bioreaktoren, mit primären porcinen Leberzellen, welche zur Therapie an einem Patienten eingesetzt wurden.

Infiziert (Infected)

Alle Bioreaktoren, mit primären porcinen Leberzellen, welche zumindest hochwahrscheinlich infiziert waren.

Zellfreier Bioreaktor (Blind-Device)

Bioreaktoren ohne Leberzellen als Kontrolle.

Tabelle 7: Bioreaktor-Gruppen – Quality Assessment mit Bolus Test

Lidocain

Die Werte sind hinreichend normalverteilt und auf Intervallskalenniveau. Insgesamt liegen für delta-Lidocain (Δ-Lidocaine) 179 Messwerte vor. Das Minimum liegt bei 0.02 ng/ml, das Maximum erzielte ein infizierter Bioreaktor mit 6,67 ng/ml. Es handelt sich mit größter Wahrscheinlichkeit um einen Summationseffekt durch die Stoffwechselleistung der Bakterien. Ein Bioreaktor, der nicht in die Statistik einging, erreichte 10-fach höhere Werte bei der Lidocain Elimination sowie der MEGX Synthese. Die wahrscheinlichste Erklärung retrospektiv dafür ist ein Verdünnungsfehler um eine Zehnerpotenz bei der Herstellung der Injektionslösung. Die maximale Clearance dieses Bioreaktors beträgt 3,65 ng/ml am 6. Tag.

Eine einfaktorielle ANOVA zwischen den Bioreaktor-Gruppen wurde zur Erkundung der Unterschiede durchgeführt. Die Homogenität der Varianz ist knapp signifikant im Levene Test, Levene- Wert 2,462; Signifikanz 0,06. Zwischen den 4 Gruppen ergab sich ein statistisch hochsignifikanter Unterschied, F(3, 175)=36,66; p=0,000. Zu Bewertung der Validität des Effekts wurde Eta-Quadrat berechnet mit 0,38, dies ist nach Cohen ein großer Effekt. Der Post-Hoc Vergleich mit dem Turkey HSD Test zeigt, dass der Mittelwert der Standard Gruppe (M=0,44; SD=0,26) sich signifikant (alpha=0,05) von dem Mittelwert der Gruppe „Zellfreier Bioreaktor“(M=1,79; SD=0,56) unterscheidet, aber nicht zu den Mittelwerten der Gruppen „Infiziert“(M=0,64; SD=0,78) und „Therapie“(M=0,45; SD=0,21).

Um besser auf die Fragestellung der Hypothese: „der Bioreaktor ermöglicht Lebertypische Leistung“ bzw. auf das Zurückweisen der Nullhypothese einzugehen wurde ein T-Test bei unabhängigen Stichproben durchgeführt, zwischen den Gruppen „Standard“ (M=0,44; SD=0,26) und „Zellfreier Bioreaktor“(M=1,79; SD=0,56). Da bei den beiden Gruppen der Levene Test die Homogenität der Varianz nicht nachgewiesen hat wurden die T-Test Werte für diese Ausgangssituation berechnet. Der T-Test ergab folgende Werte: t(29,58)= -11,85; p=0,000, das bedeutet ein zurückweisen der Nullhypothese ist mit einer Irrtumswahrscheinlichkeit von 0% behaftet. Eta Squared ist 0,61; d.h. mit 61% Chance treffen diese Werte auf die Grundgesamtheit zu. Das Eta Quadrat fällt vor allem wegen den wenigen Messwerten der Gruppe „Zellfreier Bioreaktor“ (N=26) relativ gering aus. Die wenigen Werte sind durch die geringe Anzahl von Bioreaktoren bzw. Tagen in dieser Gruppe bedingt.

Abbildung 9: Lidocain Bolus; Das Ergebnis der ANOVA mit Turkey PostHoc Test wird hier graphisch noch einmal dargestellt: die Standard Gruppe unterscheidet sich von der „Zellfreier Bioreaktor“ Gruppe, jedoch nicht von den Gruppen „Therapie“ und „Infiziert“, da hier der Mittelwert und die Streuung zu ähnlich sind. Die * mit den horizontalen eckigen Klammern zeigen die hochsignifikanten Unterschiede.

MEGX

Es liegen 186 Messwerte intervallskaliert für die Differenz des 0 min und 90 min Wertes der Synthese von Monoethylglycinxylidid (Δ-MEGX) vor. Das Minimum liegt bei 0,51 µg/ml bei einem Zellfreien Bioreaktor, das Maximum bei 727,61 µg/ml in einem infizierten Bioreaktor, demselben, der bereits bei der Ausgangssubstanz Lidocain außergewöhnlich hohe Eliminationsraten zeigt. Die Werte zeigen im Histogramm (nicht dargestellt) eine linksschiefe Normalverteilung.

Um die Unterschiede zwischen allen Bioreaktor-Gruppen zu erfassen wurde eine einfaktorielle ANOVA durchgeführt, obwohl eine Vorraussetzung, die Homogenität der Varianz mit einem Levene- Wert von 16,87 und p=0,00, nicht gegeben ist. Im Boxplot zeigt sich auch deutlich, dass die Gruppen „Therapie“ und „Infiziert“ eine deutlich größere Variabilität haben als die übrigen Gruppen. Durch die Aufschlüsselung nach Gruppen mittels Post Hoc Turkey HSD Tests und die Anzahl der Messwerte lässt sich die Verletzung der Homogenität der Varianz aber in diesem Fall akzeptieren. Die einfaktorielle ANOVA ergab: F(3, 182)=12,09; p=0,000. Die Größenordnung des Effekts, berechnet mit Eta-Quadrat ist mit 0,17 als groß zu bewerten. Der Post Hoc Vergleich mit dem Turkey HSD Test zeigt einen signifikanten Unterschied auf dem p<0,05 Niveau für die Gruppen „Standard“ (M=31,31; SD=48,36) verglichen mit „Infektion“ (M=108,70; SD=143,65), sowie die Gruppen „Therapie“ (M=98,97; SD=68,66) verglichen mit „Zellfreier Bioreaktor“ (M=1,91; SD=0,96) und die Gruppe „Infektion“ (M=108,70; SD=143,65) verglichen mit „Zellfreier Bioreaktor“

Um die Nullhypothese der Frage der Lebertypischen Leistung zu prüfen wurde eine T-Test zwischen den Gruppen „Standard“(M=31,31; SD=48,36) und „Zellfreier Bioreaktor“ (M=1,91; SD=0,96) durchgeführt. Die Homogenität der Varianz zwischen den beiden Gruppen ist im Levene Test nicht signifikant. Der T-Test für unabhängige Stichproben mit nicht gleichen Varianzen ergab t(71,15)=5,16; p=0,000. Die Aussagekraft der Unterschiedlichkeit der Mittelwerte war moderat, berechnet mit Eta-Quadrat von 0,21.

Das Fehlerbalken- Diagramm macht auch deutlich, dass die Variabilität und der Mittelwert der Gruppe „Zellfreier Bioreaktor“ sich von allen anderen zu stark Unterscheidet, da die Werte mangels Synthese lediglich durch spontanen Abbau von Lidocain oder durch Messfehler bzw. Messwerte im Bereich der Nachweisgrenze zustande kommen. Die höheren Werte in der infizierten Gruppe kommen durch Bioreaktoren zustande, bei denen die Bakterien mit zur MEGX Synthese beigetragen heben, bei unauffälligem Stoffwechselverhalten der Bakterien kann der Verlauf durchaus im Bereich der Standardwerte liegen. Die „Therapie“ Gruppe hatte viele Proben in Plasma mit hohem Bilirubin-Spiegeln, was zu Verfälschungen des Ergebnisses führen kann115.

Abbildung 10: MEGX Bolus; Der * mit den horizontalen eckigen Klammern kennzeichnet hochsignifikante Unterschiede zwischen Gruppen im ANOVA Turkey HSD PostHoc Test.

Sorbitol

Für die Elimination von Sorbitol, Δ-Sorbitol, liegen N=188 Messwerte vor, das Maximum liegt bei einem Bioreaktor der Gruppe „Zellfreier Bioreaktor“ mit 162,20 mg/dl und das Minimum bei 3 mg/dl. Die Werte sind normalverteilt und intervallskaliert.

Um die Unterschiede in den Mittelwerten der Gruppen zu erkunden wurde wiederum eine einfaktorielle ANOVA durchgeführt. Alle Vorraussetzungen inklusive der Homogenität der Varianz wurden erfüllt. Die ANOVA ergab einen hochsignifikanten Unterschied zwischen den Gruppen, F(3, 184)=36,54; p=0,000. Das Eta-Quadrat als Maß der Aussagekraft war 0,35, nach Cohen ein großer Effekt. Der durchgeführte Post Hoc Turkey HSD Test, der innerhalb der Gruppen die Unterschiede der Mittelwerte darstellt ergab signifikante Differenzen zwischen der Standard Gruppe (M=58,32; SD=22,69) und den Gruppen „Infiziert“ (M=80,31; SD=25,27) und „Zellfreier Bioreaktor“ (M=110,78; SD=30,99). Die Gruppe „Therapie“ (M=46,87; SD=15,02) unterschied sich signifikant von den Gruppen „Infektion“ und „Zellfreier Bioreaktor“. Außerdem unterschiedet sich die Gruppe „Infiziert“ ebenfalls von der Gruppe „Zellfreier Bioreaktor“.

Der für die Fragestellung Nullhypothese Funktion der Zellen im Bioreaktor durchgeführte T-Test basiert auf der Gleichheit der Varianz, nachgewiesen durch den Levene Test mit F=0,001; p=0,971. Der T-Test zur Überprüfung, ob sich die Mittelwerte der beiden Gruppen „Standard“ (M=58,32; SD=22,69) und „Zellfreier Bioreaktor“ (M=110,78; SD=30,99) in der Grundgesamtheit unterscheiden ergab t(97)=-9,23; p=0,000. Die Aussagekraft, berechnet mit Eta-Quadrat ist 0,47, d.h. eine mittelmäßige Chance, dass die Werte die Grundgesamtheit repräsentieren. Da der Test aber hochsignifikant ist und der Unterschied der Mittelwerte deutlich, dürfte sich in der Grundgesamtheit allenfalls die Mittelwerte in einem Maße ändern, dass keinen gravierenden Einfluss auf die Irrtumswahrscheinlichkeit des T-Tests hat.

Das Fehlerbalken- Diagramm veranschaulicht die Ergebnisse der Statistik. Die Mittelwerte der Elimination von Sorbitol, in Bezug auf die Standard Gruppe, unterscheiden sich am deutlichsten für die Gruppe „Zellfreier Bioreaktor“.

Abbildung 11: Sorbitol Bolus; Der * mit den horizontalen eckigen Klammern repräsentiert die signifikanten Unterschiede zwischen den Gruppen, nachgewiesen mittels one-way beetween-groups ANOVA mit Turkey HSD PostHoc Test.

Galactose

Die Werte für die Differenz des Messwerts 90 min abzüglich 0 min, delta-Galaktose (Δ-Galktose) sind normalverteilt. Es gibt insgesamt N=185 intervallskalierte Werte. Das Maximum liegt bei 159,40 mg/dl und das Minimum bei 7,80 mg/dl.

Die einfaktorielle ANOVA wurde mit gegebener Homogenität der Varianz, nachgewiesen mit dem Levene Test, durchgeführt. Der Vergleich der Δ-Galktose Werte ergab einen signifikanten Unterschied, F(3, 181)=59,52; p=0,000. Das Eta-Quadrat als Maß der Aussagekraft war 0,46, nach Cohen ein großer Effekt. Im Turkey HSD Test, der die Unterschiede der Mittelwerte mit Angabe der Signifikanz zwischen den einzelnen Gruppen berechnet zeigte sich, das die Standard Gruppe (M=81,92; SD=15,96) sich hochsignifikant von allen anderen Gruppen unterscheidet. Die Gruppe „Therapie“ und „Infiziert“ unterscheidet sich zusätzlich noch hochsignifikant von der Gruppe „Zellfreier Bioreaktor“. Die einzelnen Gruppen mit Mittelwerten und Standardabweichung: „Therapie“ (M=99,34; SD=10,10), „Infiziert“ (M=98,20; SD=11,42) und „Zellfreier Bioreaktor“ (M=122,89; SD=15,05).

Der T-Test zwischen den Gruppen „Standard“ (M=81,92; SD=15,96) und „Zellfreier Bioreaktor“ (M=122,89; SD=15,05) basiert ebenfalls auf der Vorraussetzung der Gleichheit der Varianz im Levene Test. Das Ergebnis des Independant- Sample T-Tests ist t(95)=-11,50; p=0,000. Die Aussagekraft, berechnet mit Eta-Quadrat ist 0,58, d.h. eine mittelmäßige Chance, dass die Werte die Grundgesamtheit repräsentieren. Hier gilt dasselbe wie bei Sorbitol: selbst wenn die Mittelwerte in der Grundgesamtheit etwas anders sein sollten ist praktisch kein Effekt auf die Irrtumswahrscheinlichkeit, repräsentiert durch die Signifikanz p des T-Tests zu erwarten.

Das Fehlerbalken- Diagramm zeigt die Mittelwerte und die zweifache Standardabweichung. Ausreißer und Extremwerte sind nicht dargestellt. Wieder deutlich zu sehen ist der Unterschied zwischen der „Standard“ Gruppe und „Zellfreier Bioreaktor“.

Abbildung 12: Galaktose Bolus. Das Ergebnis der ANOVA mit Turkey HSD PostHoc Test wird hier graphisch noch einmal dargestellt: die Standard Gruppe sowie die Gruppe „Zellfreier Bioreaktor“ unterscheiden sich von allen anderen Gruppen. Die * mit den horizontalen eckigen Klammern zeigen die hochsignifikanten Unterschiede.

Ammoniak

Für Δ-Ammonia existieren N=171 valide intervallskalierte Werte. Das Maximum liegt bei 1662 µmol/l in einem infizierten Bioreaktor, das Minimum bei -721 µmol/l. Es gibt einige negative Werte, auch im Boxplot zu ersehen, die dadurch Zustande kommen, dass der Ammoniak Wert zum Zeitpunkt 90 min nach Injektion der Testsubstanz geringer ist als zum Zeitpunkt 0 min, unmittelbar vor Substanzgabe. Die wahrscheinlichste Erklärung dafür ist, dass die Leistung der Zellen von dem Substratangebot abhängt und die Kapazität der beteiligten Enzymsysteme hoch ist und das regulär im der Zellkultur anfallende Ammoniak überschießend verstoffwechselt wird. Die Werte sind hinreichend Normalverteilt, mit einer leichten Linksverschiebung.

Die einfaktorielle ANOVA, durchgeführt mit durch Levene Test signifikant nachgewiesener Gleichheit der Varianzen ergab einen hochsignifikanten Unterschied zwischen den Mittelwerten der Gruppen, F(3, 167)=24,74; p=0,000. Das dazu berechnete Eta Quadrat ist 0,30; ein wiederum großer Effekt nach Cohen. Der Post Hoc Turkey HSD Test zeigt einen signifikanten Unterschied der Standard Gruppe (M=78,06; SD=177,27) sowie der „Therapie“ (M=104,83; SD=319,53) und „Infiziert“ (M=128,67;SD=271,41) Gruppe zur Gruppe „Zellfreier Bioreaktor“ (M=519,58 ; SD=179,32).

Der Vergleich auf Gleichheit der Mittelwerte mittels T-Test für unabhängige Stichproben ergab einen hochsignifikanten Unterschied mit t(91)=-10,75; p=0,000 für die Gruppen „Standard“ und „Zellfreier Bioreaktor“. Die Homogenität der Varianzen ist im Levene Test signifikant. Das Eta Quadrat ist 0,56, somit ist die Wahrscheinlichkeit bei 56%, dass die Daten die Grundgesamtheit repräsentieren. Aufgrund des bemerkenswerten Unterschieds der Mittelwerte ist die Signifikanz deshalb keinesfalls gefährdet.

Abbildung 13: Ammoniak Bolus; Die Gruppe „Zellfreier Bioreaktor“ unterscheidet sich im one-way beetween-groups ANOVA mit Turkey HSD PostHoc Test von allen anderen Gruppen hochsignifikant.

Metabolische Untersuchungen – Kontinuierlicher LFT

Wie im Material und Methoden Teil bereits erwähnt wurde vom gemessenen Wert und dem Mediumleerwert jeweils die Differenz gebildet. Um eine solide Daten- Basis für die Darstellung und Auswertung der Messwerte über die Zeit als Abszissenachse zu haben wurden die 33 Kulturtage in SPSS mittels der Funktion „Variablen kategorisieren“ in 10 Gruppen aufgeteilt. Dabei bildet SPSS eine neue kategorische Variable indem es die Fälle anhand von –in diesem Fall- 10 Percentillen aufteilt. Die neue Variable Kategorie des Kulturtags bzw. „Category of Culture Day“ umfasst in den ersten Kulturtagen nur wenige Tage zusammen, mit steigender Kulturdauer mehrere. Dies hängt mit dem Studiendesign zusammen, da in den ersten Tagen täglich Proben genommen wurden, danach nur alle 3 Tage und mit der Laufzeit der Bioreaktoren zusammen, die zu unterschiedlichen Zeitpunkten Abbruchkriterien erreichten oder für den klinischen Einsatz verwendet wurden, so dass die Anzahl der verfügbaren Werte mit zunehmender Kulturdauer sinkt.

Kategorie des Kulturtags (category of culture day)

Erster Tag

Letzter Tag

N

% of Total N

day 0

0

0

45

8,7%

day 1&2

1

2

75

14,5%

day 3

3

3

34

6,6%

day 4&5

4

5

62

12,0%

day 6

6

6

33

6,4%

day 7-9

7

9

68

13,2%

day 10-12

10

12

50

9,7%

day 13-16

13

16

50

9,7%

day 17-21

17

21

47

9,1%

day 22-33

22

33

53

10,3%

Total

0

33

517

100,0%

Tabelle 8: Groupierung der Kulturtage in die Variable Kategorie des Kulturtags

Die statistische Auswertung der Kontinuierlichen metabolischen Leberfunktionsteste beschränkt sich vor allem auf die Darstellung als Boxplots. Bei den Verläufen der einzelnen Bioreaktoren (nicht dargestellt) im Liniendiagram zeigen sich Unterschiede zwischen den einzelnen auf jeweils einer Zellquelle, oder genauer einer porcinen Leber basierenden Zellkulturen. Diese interindividuellen Unterschiede werden durch die Darstellung der Messwerte in Kategorien nach Tagen nur bedingt durch die Streuung sichtbar. Dafür aber der typische intraindividuelle Verlauf über die Zeit mit dem Zentralwert (Median) und der Variabilität.

Lidocain

Lidocain stellt die Differenz des täglichen Messwerts zum ebenfalls gemessenen Mediumleerwert (M=5,42 ng/ml; SD=0,46) dar, d.h. ein Wert von Null bedeutet keinen Metabolismus. Die insgesamt 149 validen Werte sind als Boxplot mit den Kategorien der Kulturtage als Abszisse dargestellt. Der Boxplot zeigt die Quartilen als obere und untere Begrenzung der Box dar, den Median als Balken in der Mitte. Die T-förmigen Ausläufer, die „Whisker“, der Boxen sind die größten und kleinsten Werte. Kreise sind Ausreißer, im Bereich von mehr als das 1,5 fache der Boxlänge, gerechnet ab der äußeren Kante der Box.

Bereits 6 bis 12 Stunden nach der Zelleinfüllung, entspricht der Kategorie „day 0“, zeigen die Zellen eine gute Leistung mit einem Mittelwert von 4,43 ng/ml und einer Standardabweichung von 0,29. Der erste und zweite Tag, Kategorie „day 1&2“, verhalten sich ähnlich. In diesen ersten drei Tagen ist die Mediumzufuhr noch höher, außerdem befinden die Zellen sich dabei noch in Reorganisation. Es folgt im weiteren Kulturverlauf eine Steigerung mit dem Höhepunkt in Kategorie „day 10-12“, mit einem Mittelwert M=4,99 ng/ml und einer Standardabweichung von 0,23. In den Kategorien „day 13-16“ (M=4,98 ng/ml; SD=0,26), „day 17-21“ (M=4,17 ng/ml; SD=1,47) und „day „22-33“ (M=3,94 ng/ml; SD=0,91) fallen die Werte wieder etwas ab, jedoch wird auch die Streubreite größer. Dies, sowie die Ausreißer und Extremwerte nach unten, ist eine Folge von einem Teil der Bioreaktoren, die durch verschiedene Ursachen wie der Beginn der Durchführung von Oxygenierungs- und Hypothermiestudien116 ab dem Tag 18 zu einem Ende der regulären Stand-By Periode gebracht wurden. Andere Bioreaktoren, bei denen das reguläre Stand-By Standardprotokoll aufrechterhalten wurde, liefen auch noch nach über 30 Tagen mit Umsatzraten über 4 ng/ml Lidocain.

Abbildung 14: Lidocain, groupiert nach Kategorien der Kulturtage; links mit gelben Boxplots Kontinuierlicher Modus, rechts mit roten Boxplots zum Vergleich Bolus Modus

Der Vergleich der kontinuierlichen Lidocain Ergebnisse zu den Bolus Werten wird wegen den Unterschiedliche Messmethoden und der daraus resultierende unterschiedlichen Interpretation der Ergebnisse lediglich zu einem Vergleich des Verlaufs über die Zeitachse. Während bei der Bolus Methode die Bolus Werte aus der Differenz des gemessen Wertes bei 90 min und des Ausgangswertes bei 0 min errechnet wurden (s. Kapitel 1.5.1) wurde bei den kontinuierlichen Lidocain Untersuchungen die Konzentration der Substanz als Fliesgleichgewicht gemessen und die Differenz zur Ausgangskonzentration im Medium gebildet (s. Kapitel 1.5.1). Bei den kontinuierlichem Modus repräsentieren höhere Werte eine größere Elimination der Substanz, bei dem Bolus Modus repräsentieren niedrigere Werte eine höhere Elimination der Substanz. Der Tag 0 unterscheidet sich ebenfalls: bei der Bolus Methode wurde am Tag 0 der Wert im Zellfreien Bioreaktor gemessen und bei der kontinuierlichen Methode der Wert mit Zellen nach 6 und 12 Stunden.

Der Verlauf über die Zeitachse ist bei beiden Testmethoden ähnlich, bei den Bolus Tests wurde allerdings das reguläre Stand- By Protokoll zum Bioreaktor Betrieb bis zum Erreichen von Abbruchkriterien der Zellkulturen aufrecht erhalten, deshalb ist der Leistungsabfall über dem 21 Kulturtag wesentlich milder. Ausreißer, Extremwerte und große Unterschiede in der Variabilität zwischen den Kategorien der Kulturtage lassen sich fast alle bei Betrachtung der Einzelverläufe der Zellkulturen durch individuelle Ereignisse erklären.

MEGX

Bei MEGX ist der Mediumleerwert 0, es wird kein MEGX beigefügt und im Medium auch nicht Synthetisiert. Deshalb sind die direkt gemessenen Synthesewerte (N=151) gezeigt. Der Trend im Verlauf ist in der Mitte und am Ende dem von Lidocain ähnlich, am Anfang, an Tag 0, Kategorie „day 0“ jedoch am höchsten mit einem Mittelwert von 62,37 µg/ml und einer Standardabweichung von 49,76. Dem folgt ein Abfallen der Mittelwerte bis Kategorie „day 3“ (M=24,58 µg/ml; SD=29,93). Die Mittelwerte steigen jedoch wieder an, bis Kategorie „day 6“ (M=52,30 µg/ml; SD=24,08), Kulturtag 13 bis 17. Dan folgt ein weiterer kontinuierlicher Abfall bis Kategorie „day 22-33“ (M=21,00 µg/ml; SD=24,80). Die Zunahme der Streubreite ist sicherlich eine teilweise Verzerrung der Werte durch Hypothermieintervalle und Beendigung des regulären Stand- By Betriebs nach dem 18. Kulturtag. Bei MEGX auffällig sind zahlreichen Ausreißer und Extremwerte, sowie die große Varianz. Die wahrscheinlichste Ursache dafür sind größere Intra- und Interindividuelle Schwankungen, die noch ausgeprägter bei den Bolus Tests mit MEGX zu beobachten waren.

Abbildung 15: MEGX, groupiert nach Kategorien der Kulturtage; links mit gelben Boxplots Kontinuierlicher Modus, rechts mit roten Boxplots zum Vergleich Bolus Modus

Zum Vergleich ist der Verlauf von MEGX über die Kategorien der Kulturtage im Bolus Modus dargestellt. Beim Bolus Protokoll wurden am Tag 0 die Werte im Zellfreien Kultursystem bestimmt. An den folgenden Tagen wurde der gemessene MEGX Synthesewert 90 min nach der Bolus-Injektion von Lidocain von dem MEGX Wert 0 min vor dem Bolus subtrahiert. In beiden Fällen repräsentieren höhere Werte eine größere Synthese. Der Median von MEGX im Bolus Modus hat einen zweigipfeligen Verlauf. Außerdem ist eine auffällige Zunahme der Streubreite mit steigender Kulturdauer zu beobachten.

Sorbitol

Der Sorbitol Boxplot stellt wieder den Unterschied zwischen täglich gemessener Sorbitol Konzentration und dem Mediumleerwert (M=175,8 mg/dl; SD=1,84) dar. Am Tag 0 (M=137,7 mg/dl; SD=11,18) und Kategorie „day 1&2“ (M=151,01 mg/dl; SD=11,63) erreicht die Zellkultur bereits recht hohe Werte in der Elimination von Sorbitol. Bis zum größten Mittelwert in der Kategorie „day 10-12“ (M=153,48 mg/dl; SD=22,66), pendeln die Werte großteils im Bereich von 148 bis 154 mg/dl. In Kategorie „day 17-21“ (M=94,54 mg/dl; SD=69,25) und Kategorie „day 22-33“ (M=69,34 mg/dl; SD=54,63) fällt der Mittelwert ab. Das Maximum in Kategorie „day 17-21“ ist bei 132,3 mg/dl, das Maximum in Kategorie „day 22-33“ ist bei 156,9 mg/dl und wurde in einem im regulären Stand-By Betrieb laufenden Bioreaktor gemessen. Der Abfall der Mittelwerte und die größere Varianz in den Kulturtagen über 18 Tage ist wie bei den anderen Test-Substanzen im Kontinuierlichen Modus vor allem durch Hypothermie- und Begasungsversuche oder andere Manipulationen jenseits des regulären Stand-By Protokolls zu erklären.

Der Vergleich der Elimination von Sorbitol zwischen Kontinuierlichem und Bolus Modus ist von der Interpretation ähnlich wie bei Lidocain. Beim Kontinuierlichen Modus repräsentieren höhere Werte eine größere Elimination, beim Bolus Modus stellen niedrigere werte eine höhere Elimination dar und der Tag 0 Wert beim Bolus Modus ist wieder im zellfreien Kultursystem gemessen. Der Verlauf der Sorbitol Elimination über die Zeitachse ist bei beiden Testmodi unterschiedlich: während beim Kontinuierlichen Testschema ein Anstieg der Elimination von Tag 0 bis Tag 3 stattfindet gefolgt von einer stabilen Plateauphase bis zur Kategorie „day 13-16“, der letzten Kategorie mit Einhaltung des regulären Stand-By Protokolls. In den weiteren Kategorien, die die Kulturtage 17-33 wiedergeben, folgt ein Abfallen des Medians und eine Zunahme der Streubreite, wie bereits bei Lidocain gesehen. Bei den Bolus Tests wurde das reguläre Stand-By Protokoll über die gesamte dargestellte Zeitachse aufrechterhalten.

Abbildung 16: delta-Sorbitol, groupiert nach Kategorien der Kulturtage; links mit gelben Boxplots Kontinuierlicher Modus, rechts mit roten Boxplots zum Vergleich Bolus Modus

Bei den Bolus Werten ist am Anfang der Kulturphase bis Tag 3 eine geringfügig größere Streubreite zu sehen, der Median der Elimination bewegt sich allerdings kontinuierlich über die gesamte Kulturdauer langsam in den Bereich höherer Werte, d.h. es wird mit zunehmender Kulturdauer weniger Sorbitol innerhalb der 90 min zwischen Injektion und Messung metabolisiert.

Galaktose

Für Galaktose wurde wieder die Differenz zwischen gemessenem Wert und Mediumleerwert (M=100,1 mg/dl; SD=1,84) gebildet. Am Tag 0, Kategorie „day 0“ erreicht Galaktose einen Mittelwert von 48,86 mg/dl mit einer Standardabweichung von 9,74. In der Kategorie „day 1&2“ (M=60,99 mg/dl; SD=13,14), Kategorie „day 3“ (M=66,85 mg/dl; SD=13,59), gehen die Werte stufenweise nach oben- mit Ausnahme von „day 4&5“ und erreichen in Kategorie „day 10-12 ihren höchsten Mittelwert mit 91,05 md/dl und der Standardabweichung von SD=1,98.

Abbildung 17: Galaktose, groupiert nach Kategorien der Kulturtage; links mit gelben Boxplots Kontinuierlicher Modus, rechts mit roten Boxplots zum Vergleich Bolus Modus

Die Kategorie „day 4&5“ bildet in allen Testsubstanzen eine Ausnahme, am deutlichsten allerdings bei Galaktose, da in dieser Zeit mehrere Zellkulturen Abbruchkriterien erreichten. Kategorie „day 13-16“ ist auf vergleichbar hohem Niveau (M=90,84 mg/dl; SD=4,60). Ab Kategorie „day 17-21“ (M=51,82 mg/dl; SD=35,78) gehen die Mittelwerte durch die für manche Reaktoren durchgeführten Änderungen im Protokoll und somit Kulturverlauf auf geringere Werte zurück. Wie bereits bei Sorbitol, Lidocain und MEGX besprochen steigt deshalb auch die Variabilität erheblich an. Kategorie „day 22-33“ weist nur noch einen Mittelwert von 13,66 mg/dl bei einer Standardabweichung von 25,50 auf. In dieser Kategorie fallen allerdings viele Werte unter Bedingungen jenseits des regulären Stand-By Protokolls, das Maximum in einem mit regulärem Stand-By Protokoll betriebenen Bioreaktor beträgt 96,6 mg/dl.

Der Vergleich des Verlaufs über die Kulturdauer zwischen der Kontinuierlichen und der Bolus Methode ist Sorbitol ähnlich. Am Anfang folgt allerdings ein langsamerer Anstieg bei dem Kontinuierlichen Modus, die Plateauphase wird später erreicht, die Bioreaktoren mit den Abbruchkriterien am Tag 4&5 (s.o.) beeinflussen den Median und Mittelwert stärker als bei den anderen Parametern. Bei den Bolus Messwerten ist eine Kontinuität über die gesamte Kulturdauer zu beobachten.

Syntheseparameter

Die Syntheseparamter Pig-Albumin, Ammoniak Basal, Lactat und Harnstoff wurden im Rahmen der metabolischen Bolus Untersuchungen gemessen. Die Darstellung erfolgt über den bei den Kontinuierlichen LFT bereits verwendeten Kategorien der Kulturtage und über Kulturphasen. Ähnlich wie bei der Enzym- Freisetzung117 wurden die Syntheseparameter in Phasen des Zellkulturverlaufs eingeteilt Die Phasen sind:

Phase

Kurzbezeichnung

Beschreibung

P0

blind device

Tag 0, Zelleinfüllung

P1

initial

Tag 1 bis 3, Initiale Adhäsions- und Reorganisationsphase der Zellkultur

P2

stable

Tag 4 bis 14, stabile Kulturphase

P3

extended

Tag 15 und folgende, erweiterte Phase, über die Zeitachse langsames Nachlassen der Funktion

Tabelle 9: Übersicht Kultuphasen

Da die Syntheseleistung von Zellen zu den hochdifferenzierten Aufgaben zählt sind die Syntheseparameter interessant für die Fragestellung der Nutzbarkeitsdauer und Reproduzierbarkeit der Zellkultur.

Pig-Albumin

Pig-Albumin wird von den Zellen zum Teil synthetisiert, zum Teil wird es von apoptotischen Zellen freigesetzt. Diese Summe aus Synthese und Freisetzung wird als Liberation zusammengefasst gemessen. Es liegen N=155 Messwerte vor. Die Werte sind linksverschoben Normalverteilt.

Die Liberation von Pig-Albumin verhält sich im Zeitlichen Verlauf etwas anders als die metabolischen Testsubstanzen. An Tag 1, sind die Werte am höchsten, Mittelwert 243 mg/l, Standardabweichung 298. Neben dem initialen Hoch, welches vor allem auf der Freisetzung von Albumin durch geschädigte Zellen beruht, gibt es ein stabiles Plateau bis Tag 14. Danach fällt die Pig- Albumin Synthese wieder leicht ab, wobei nach Tag 21 das Standard Stand-By Protokoll nicht verlassen wurde.

Abbildung 18: Pig-Albumin, groupiert nach a) Kategorien der Kulturtage und b) nach Kulturphasen

Die Darstellung nach den Kulturphasen fasst den Verlauf kompakter zusammen als die Darstellung über die Kategorien der Kulturtage.

Abbildung 19: Pig-Albumin, groupiert nach Qualitätskriterium Standard und Infektion

Um auf die Frage der Qualitätssicherung einzugehen wurden die Gruppen Standard (M=; SD=) und Infektion (M=; SD=) für Pig-Albumin mittels T-Test für unabhängige Stichproben verglichen. Im Levene Test wurde die Gleichheit der Varianzen angenommen, der dazugehörige T-Test brachte mit t(153)=0,735 ; p=0,464 keinen signifikanten Unterschied zwischen den Gruppen zum Vorschein. Pig-Albumin ist als Parameter um eine Infektion zu detektieren nicht geeignet.

Ammoniak Basal

Der Ammoniak Spiegel der Zellkultur ohne Bolus Belastung ist Ammoniak Basal bzw. Ammonia Base Level. Insgesamt liegen 253 Messwerte vor. Die Werte sind linksverschoben Normalverteilt.

Abbildung 20: Ammoniak Basal, groupiert nach a) Kategorien der Kulturtage und b) nach Kulturphasen

Den geringsten Mittelwert hat die stabile Kulturphase (Tag 4 bis 14), den höchsten die Kulturphase jenseits des 14 Tages. Am Tag 1 ist der Median ebenfalls über den der stabilen Kulturphase. Der Boxplot mit den Phasen stellt die Ergebnisse des Boxplots über die Kategorien der Kulturtage kompakter dar.

Ammoniak ist ein wichtiger Parameter für Hepatozytenkulturen, er reflektiert eine Lebertypische Leistung und kann zur Beurteilung der nutzbaren Kulturdauer der Zellkultur herangezogen werden.

Abbildung 21: Ammoniak Basal, groupiert nach Qualitätskriterium Standard und Infektion

Im T-Test für unabhängige Stichproben ergab sich zwischen den Gruppen Standard (M=114,06 µmol/l; SD=124,31) und Infiziert (M=182,29 µmol/l; SD=404,49) mit t(149,8)=-1,82 und p= 0,071 kein signifikanter Unterschied. Gleiche Varianzen wurden im Levene Test zurückgewiesen.

Ausreißer und Extremwerte über 1000 µmol/l sind bei infizierten Zellkulturen vorgekommen. Werte über 500 µmol/l ohne plausible Erklärung sind immer ein dringender Hinweis auf eine Infektion.

Harnstoff

Harnstoff wurde wie Ammoniak in Phasen des Kulturverlaufs eingeteilt. Insgesamt liegen N=268 Messwerte vor. Die Werte sind gut normalverteilt.

Abbildung 22: Harnstoff, groupiert nach a) Kategorien der Kulturtage und b) nach Kulturphasen

Die höchsten Mittelwerte liegen für die stabile Kulturphase von Tag 4 bis 14 vor. Die Mittelwerte in der Adhäsionsphase von Tag 1 bis 3 sind nur geringfügig darunter. Nach Tag 14 fällt der Mittelwert ab, vor allem jenseits der 25 Tage Kulturdauer (nicht dargestellt).

Abbildung 23: Harnstoff, groupiert nach Qualitätskriterium Standard und Infektion

Der T-Test für unabhängige Stichproben mit im Levene test nachgewiesener Gleichheit der Varianz zwischen den Qualitäts- Gruppen Standard (M=54,60 mg/dl; SD=11,50) und Infektion (M=42,65 mg/dl; SD=12,69) ergab t(266)=8,06, p=0,000, d.h. einen hochsignifikanten Unterschied. Da die Differenz der Mittelwerte lediglich 9,03 beträgt ist der praktische Nutzen von Harnstoff bei der Detektion von Infektionen gering.

Lactat

Für Lactat liegen N= Messwerte vor. Die Werte sind linksschief Normalverteilt.

Abbildung 24: Lactat, groupiert nach a) Kategorien der Kulturtage und b) nach Kulturphasen

Im Verlauf verhält sich Lactat ähnlich den anderen Syntheseparametern. An Tag 1 ist der Median hoch und die Varianz groß, dann folgt eine weitgehend stabile Kulturphase bis Tag 14 und ein dezenter Anstieg der Werte über 2 Wochen Kulturverlauf.

Abbildung 25: Lactat, groupiert nach Qualitätskriterium Standard und Infektion

Der T-Test für unabhängige Stichproben zwischen den Gruppen Standard und Infektion findet für die Gruppen Standard und Infektion einen signifikanten Unterschied (alpha=0,05), mit t(149,5)=-2,47 und p=0,015. Die Differenz der Mittelwerte beträgt lediglich -7,12, was Lactat ähnlich wie Harnstoff zu keinem eindeutigen Parameter macht um Infektionen zu diskriminieren.

Kinetik der Testsubstanzen im zellfreien Bioreaktorsystem

Um den Einfluss der Verteilung und der Adsorption sowie spontaner Zerfall und ähnliche Fehlergrößen abschätzen zu können wurde die Kinetik der Testsubstanzen im Schema der metabolischen Bolus Leberfunktionsteste im zellfreien Gerät gemessen.

Lidocain

Die Kinetik von Lidocain wurde in N=9 zellfreien Bioreaktoren gemessen. Die Tabelle gibt die Mittelwerte und Standardabweichung zu den Analytikzeitpunkten 0, 30, 60 und 90 min wieder.

Zeitpunkt

Mittelwert (mg/l)

SD

0 min

0,01

0,01

30 min

2,29

0,66

90 min

1,91

0,47

180 min

1,86

0,44

Tabelle 10: Kinetik von Lidocain, Bolus Schema im zellfreien Bioreaktor

Das auf diesen Mittelwerten basierende Liniendiagram zeigt die Kinetik graphisch, die Ausläufer der Messwerte nach oben und unten zeigen die Standardabweichung. Die Kinetik von Lidocain ist der von Phenolrot sehr ähnlich (unpublizierte Ergebnisse). Die höchste Konzentration wurde nach 30 min, dem ersten Zeitpunkt, gemessen, bei Phenolrot ist das Maximum bereits bei etwas über 10 min erreicht. Danach sieht man einen Abfall der Konzentration im Bioreaktorkreislauf durch Verteilungsphänomene zwischen den Bioreaktor- Kompartimenten Pumpenschlauch und Membranbündel und dem Zellkompartment. Zwischen 30 und 60 min ist der Abfall steiler als zwischen 60 und 90 min, was auf eine einsetzende Sättigung der Konzentration in allen Kompartimenten hindeutet.

Abbildung 26: Kinetik von Lidocain, Bolus Schema im zellfreien Bioreaktor

MEGX

Die Kinetik von MEGX wurde analog zu der von Lidocain in 9 Bioreaktoren ohne Zellen gemessen. Die Werte befinden sich am Detektionslimit des verwendeten IFP Assay von Abbott. Sie kommen vor allem wahrscheinlich durch spontanen Zerfall von Lidocain zustande oder durch Kreuzreaktion des Tests mit Lidocain.

Zeitpunkt

Mittelwert (µg/ml)

SD

0 min

1,85

0,96

30 min

4,35

2,11

90 min

4,25

2,00

180 min

4,89

1,81

Tabelle 11: Kinetik von MEGX, Bolus Schema im zellfreien Bioreaktor

Die graphische Darstellung zeigt den 0 min Leerwert am Detektionslimit des verwendeten Testkits. Die Werte für 30, 60 und 90 min zeigen einen Verlauf, der durch die Verteilung und spontanen Zerfall von Lidocain sowie Kreuzreagibilität des Tests bestimmt ist.

Abbildung 27: Kinetik von MEGX, Bolus Schema im zellfreien Bioreaktor

Sorbitol

Die Kinetik von Sorbitol wurde wie bei den anderen Testsubstanzen gemessen. Im Wesentlichen zeigt der Verlauf eine schnelle Aufsättigung und einen sehr geringen Abfall.

Zeitpunkt

Mittelwert (mg/dl)

SD

0 min

0,00

0,00

30 min

144,10

13,17

60 min

143,22

14,12

90 min

143,60

18,24

180 min

143,48

12,83

Tabelle 12: Kinetik von Sorbitol, Bolus Schema im zellfreien Bioreaktor

Sorbitol wird rasch gleichmäßig verteilt und bleibt im zellfreien geschlossenen rezirkulierendem System, d.h. keine frische Mediumzufuhr, auf einem konstanten Niveau über 180 min.

Abbildung 28: Kinetik von Sorbitol, Bolus Schema im zellfreien Bioreaktor

Galaktose

Galaktose hat eine ähnliche Kinetik wie Sorbitol. Galaktose hat allerdings bereits bei 0 min einen Mittelwert von 41 mg/dl, da das Medium es in dieser Konzentration (40 mg/dl ± 5 %) als Bestandteil enthält, welcher die Versorgung der Zellen mit verschiedenen Kohlenhydraten gewährleistet.

Zeitpunkt

Mittelwert (mg/dl)

SD

0 min

41,38

3,07

30 min

166,60

12,89

60 min

166,48

14,83

90 min

166,42

15,74

180 min

167,07

15,61

Tabelle 13: Kinetik von Galaktose, Bolus Schema im zellfreien Bioreaktor

Das Zeitverlauf- Konzentration- Diagram für Galaktose zeigt den raschen Anstieg vom Mediumbasiswert zu den Bolus Konzentrationen in den ersten 30 min. Die Konzentration bleibt dann über 3 Stunden fast konstant.

Abbildung 29: Kinetik von Galaktose, Bolus Schema im zellfreien Bioreaktor

Ammoniak

Ammoniak hat eine eigene Kinetik. Im Medium befindet sich bereits gemessen ein geringer Ammoniak Spiegel von 59,7 µmol/l. Durch Zugabe des Bolus von 750 µmol NH4Cl erreicht die Ammoniak Konzentration nach 30 min einen Mittelwert von 652 µmol/l. Dieser bleibt auf diesem hohen Wert bis 90 min und fällt dann auf durchschnittlich 629 µmol/l nach 180 min ab.

Zeitpunkt

Mittelwert (µmol/l)

SD

0 min

59,67

12,01

30 min

652,11

107,84

60 min

654,22

99,04

90 min

648,11

85,56

180 min

629,00

57,79

Tabelle 14: Kinetik von Ammoniak, Bolus Schema im zellfreien Bioreaktor

Die Kinetik von Ammoniak ist charakterisiert durch eine schnelle Aufsättigung und ein langsames Abfallen, wie in dem Liniendiagram veranschaulicht.

Abbildung 30: Kinetik von Ammoniak, Bolus Schema im zellfreien Bioreaktor