Betrachtung der metabolischen Funktion von Hepatozyten in einem dynamischen KultursystemAndreas Grünwald1.101.1.1.1.1.11121.1.2.131.2.1.2.1.1.2.1.1.141.2.1.2.1.3.151.4.161.4.1.76#4776#4761#47169#4717111#24173#37138#4973#4570#24181.4.2.19526#5001.4.3.20101#451.4.4.70#241.4.5.211.5.1.5.1.22565#3631.5.2.1.5.3.231.5.4.1.5.5.1.6.242.252.1.2.1.1.306#2182.1.2.26585#373272.1.3.2.1.4.282.1.5.29302.2.2.2.1.312.2.2.322.2.3.332.2.4.2.3.342.3.1.170#242.3.2.35169#242.3.3.2.3.4.362.3.5.563#242.3.6.377#242.3.7.2.4.372.4.1.2.4.1.1.2.4.1.2.2.4.2.382.4.2.1.536#2722.4.2.2.399#2883.393.1.3.1.1.40577#3253.1.2.41570#3123.1.3.42585#3313.1.4.43575#3123.1.5.44570#3123.2.453.2.1.46585#3323.2.2.47585#3243.2.3.48586#3223.2.4.586#322493.3.503.3.1.586#32251288#2983.3.2.586#32252288#2983.3.3.585#33253285#2983.3.4.585#33254285#2983.4.553.4.1.370#2113.4.2.56370#2113.4.3.370#2113.4.4.57370#2113.4.5.58370#2114.594.1.4.1.1.604.1.2.614.1.3.624.1.4.4.1.5.634.2.644.2.1.4.2.2.4.2.3.4.3.65664.4.675.68 Abkürzungsverzeichnis89 Literaturverzeichnis69707172737475767778Danksagung und WidmungEidesstattliche ErklärungdeInhaltsverzeichnisHilfeAus der Klinik für Allgemein-, Visceral- und Transplantationschirurgie
der Medizinischen Fakultät Charité - Universitätsmedizin BerlinDissertationBetrachtung der metabolischen Funktion von Hepatozyten in einem dynamischen KultursystemZur Erlangung des akademischen Grades
doctor medicinae (Dr. med.)vorgelegt der Medizinischen Fakultät Charité – Universitätsmedizin Berlinvon
Andreas Grünwald aus Stuttgart Prof. Dr. med. Martin Paul Prof. Dr. med. P. Neuhaus Prof. Dr. med. Dr. h.c. R. Hetzer PD Dr. med. H. H. Schauwecker Datum der Promotion: 17. Januar 2005 Abstract Deutsch

Die Arbeit befasst sich mit Methoden der Erfassung metabolischer Funktion einer dynamischen Zellkultur in Bioreaktoren zur klinischen Verwendung als Leberunterstützungssystem. Der Fokus liegt auf der Etablierung von Tests zur Qualitätssicherung als effiziente In- Prozess Kontrollen während der Bereitstellungsphase der Zellkulturen. Weitere Ziele sind ein Beitrag zu Wirksamkeitsnachweis und zur Charakterisierung des Systems im Rahmen von Zulassungen als "Biologic".

Bei der experimentellen Untersuchung unter Verwendung von Leberzellkulturen aus porcinen Organen wurden der Lidocain- MEGX Test, die Elimination von Galaktose und Sorbitol sowie die Elimination von Ammoniak und die Synthese von Harnstoff, Lactat und Albumin berücksichtigt. Dies erfolgte mittels Bolus- und Fliessgleichgewichtsuntersuchungen sowie Konzentrationsbestimmungen.

Die Ergebnisse zeigten für alle Parameter einen hochsignifikanten Unterschied zu Zellfreien Bioreaktoren, sowie einen typischen Verlauf, der in eine initiale Adhäsionsphase, eine stabile Kulturphase und eine darauf folgende erweiterte Phase mit langsamer Abschwächung der Zellleistungen gegliedert werden kann.

Die Parameter erwiesen sich prinzipiell alle geeignet für den Einsatz in der Qualitätssicherung der dynamischen Zellkultur. Ein kombiniertes Untersuchungsschema bestehend aus Parametern die die Integrität der Zellmembranen reflektieren, wie die Freisetzung von Enzymen, sowie metabolischen Parametern wie Lidocain, Galaktose, Sorbitol als auch Syntheseparameter, für Proteine Albumin, als Hepatozyten typische Leistungen die Synthese von Harnstoff und der Abbau von Lactat ist in der Lage einen ausreichend umfassenden Einblick in den Status der dynamischen Zellkultur zu liefern.

 Leberunterstüzung Zellkultur Metabolismus Bioreaktor Lidocain Megx Sorbitol Galaktose Abstract English

Objectives of this work were to find easy to handle every day quality assessment procedure for bioreactors that are intended for clinical trials, further more usefulness of these parameters in characterization and standardization of the Liver Support System.

Parameters for evaluation had been: Lidocaine, Megx, Sorbitol, Galactose, Urea, Albumin and Lactate. Bolus and Continuous metabolic liver functions tests had been done, for synthesis and detoxification parameters liberation was measured by concentration.

Highly significant difference between bioreactor with primary porcine liver cells and cell-free devices was shown by t-tests. Differences to other groups like infected bioreactors had been demonstrated with ANOVA. Results show typical course over the culture period that can be categorized into a initial phase of cell reorganization, a stable culture phase and an extended phase with slow decay. All parameter proved to be suitable for daily routine quality assessment in dynamic cell culture systems. The combination of parameters reflecting different specific cellular function is able to give more comprehensive insights in the status of the cell culture.

 Liver Support Cell-Culture Metabolism Bioreactor Lidocaine Megx Sorbitol Galactose Inhaltsverzeichnis

  • 1.  Einleitung

    • 1.1. Zellkulturmodelle

      • 1.1.1. Statische Zellkulturen

      • 1.1.2. Dynamische Zellkulturen

    • 1.2. Möglichkeiten der Bewertung der Zellfunktion

      • 1.2.1. Morphologisches Erscheinungsbild

        • 1.2.1.1. Lichtmikroskopie

        • 1.2.1.2. Trypan Blau

    • 1.3. Biochemische Untersuchungen - Integrität der Plasmamembran

    • 1.4. Metabolische Untersuchungen

      • 1.4.1.  Grundlagen der Leberfunktionsteste (LFT) in vivo

      • 1.4.2. Lidocain und MEGX

      • 1.4.3. Galaktose

      • 1.4.4. Sorbitol

      • 1.4.5.  Antipyrin

    • 1.5. Syntheseparameter

      • 1.5.1. Ammoniak und Harnstoffsynthese

      • 1.5.2. Aminosäurenstoffwechsel

      • 1.5.3. Albumin

      • 1.5.4. Lactat

      • 1.5.5. Gluconeogenese

    • 1.6. Ziele der eigenen Arbeit

  • 2.  Material und Methoden

    • 2.1. Das dynamische Kulturmodell

      • 2.1.1. Bioreaktor

      • 2.1.2.  Bioreaktormonitor

      • 2.1.3. Systemaufbau

      • 2.1.4. Betriebsmodi des Bioreaktor- Systems

      • 2.1.5. Stand-By Protokoll

    • 2.2. Zellisolierung

      • 2.2.1. Tieroperation

      • 2.2.2. Zellisolierungs- Prozess

      • 2.2.3. Zellaufbereitung und -einfüllung

      • 2.2.4. Adhäsionsphase

    • 2.3.  Viabilitätsuntersuchungen und Analytik

      • 2.3.1.  Bolus Leberfunktionstests

      • 2.3.2.  Kontinuierliche Leberfunktionstests

      • 2.3.3. Lidocain

      • 2.3.4.  MEGX

      • 2.3.5. Galaktose

      • 2.3.6. Sorbitol

      • 2.3.7. Albumin

    • 2.4. Statistik

      • 2.4.1. Statistische Prüfung von Unterschieden zwischen Mittelwerten

        • 2.4.1.1. ANOVA

        • 2.4.1.2. T-Test

      • 2.4.2.  Graphen

        • 2.4.2.1. Fehlerbalken- Diagramm

        • 2.4.2.2. Boxplot

  • 3.  Ergebnisse

    • 3.1. Metabolische Untersuchungen – Bolus LFTs

      • 3.1.1. Lidocain

      • 3.1.2. MEGX

      • 3.1.3. Sorbitol

      • 3.1.4. Galactose

      • 3.1.5. Ammoniak

    • 3.2.  Metabolische Untersuchungen – Kontinuierlicher LFT

      • 3.2.1. Lidocain

      • 3.2.2. MEGX

      • 3.2.3. Sorbitol

      • 3.2.4. Galaktose

    • 3.3.  Syntheseparameter

      • 3.3.1. Pig-Albumin

      • 3.3.2. Ammoniak Basal

      • 3.3.3. Harnstoff

      • 3.3.4. Lactat

    • 3.4.  Kinetik der Testsubstanzen im zellfreien Bioreaktorsystem

      • 3.4.1. Lidocain

      • 3.4.2. MEGX

      • 3.4.3. Sorbitol

      • 3.4.4. Galaktose

      • 3.4.5. Ammoniak

  • 4.  Diskussion

    • 4.1. Metabolische Untersuchungen

      • 4.1.1. Lidocain

      • 4.1.2. MEGX

      • 4.1.3. Sorbitol

      • 4.1.4. Galaktose

      • 4.1.5. Ammoniak

    • 4.2.  Syntheseparameter

      • 4.2.1. Albumin

      • 4.2.2. Ammoniak Basal und Harnstoff

      • 4.2.3. Lactat

    • 4.3. Gesamtbewertung der Zellkulturen

    • 4.4. Ausblick

  • 5.  Zusammenfassung

  • Abkürzungsverzeichnis

  • Literaturverzeichnis

  • Danksagung und Widmung

  • Eidesstattliche Erklärung

Tabellen

  • Tabelle 1: Eigenschaften Kapillarbündel

  • Tabelle 2: Untersuchungen zum Ausschluss von Zoonosen

  • Tabelle 3: Zellisolierungslösungen Alle Lösungen wurden von der Firma Biochrom, Berlin bezogen.

  • Tabelle 4: LFT Substanzen für Bolustests

  • Tabelle 5: LFT Substanzen für kontinuierliche Tests

  • Tabelle 6: sprachliche Interpretation des Signifikanzniveaus

  • Tabelle 7: Bioreaktor-Gruppen – Quality Assessment mit Bolus Test

  • Tabelle 8: Groupierung der Kulturtage in die Variable Kategorie des Kulturtags

  • Tabelle 9: Übersicht Kultuphasen

  • Tabelle 10: Kinetik von Lidocain, Bolus Schema im zellfreien Bioreaktor

  • Tabelle 11: Kinetik von MEGX, Bolus Schema im zellfreien Bioreaktor

  • Tabelle 12: Kinetik von Sorbitol, Bolus Schema im zellfreien Bioreaktor

  • Tabelle 13: Kinetik von Galaktose, Bolus Schema im zellfreien Bioreaktor

  • Tabelle 14: Kinetik von Ammoniak, Bolus Schema im zellfreien Bioreaktor

  • Tabelle 15: Übersicht Qualitätssicherung Zellkultur (In- Prozess Kontrollen)

Bilder

  • Abbildung 1: Lidocain Stoffwechselwege nach Keenaghan

  • Abbildung 2: Harnstoffzyklus, aus Lehninger: Principles of Biochemistry98 

  • Abbildung 3: Kapillarhohlfaserbioreaktor

  • Abbildung 4: a) Bioreaktormonitor und b) Bioreaktormonitor in Betrieb

  • Abbildung 5: Berechnung zur Normalisierung der Bolus LFT Werte

  • Abbildung 6: Berechnung zur Elimination systemischer Fehler Ausgangskonzentration Substrat im Medium

  • Abbildung 7: Fehlerbalkendiagramm mit erklärender Darstellung

  • Abbildung 8: Boxplot mit erklärender Darstellung

  • Abbildung 9: Lidocain Bolus; Das Ergebnis der ANOVA mit Turkey PostHoc Test wird hier graphisch noch einmal dargestellt: die Standard Gruppe unterscheidet sich von der „Zellfreier Bioreaktor“ Gruppe, jedoch nicht von den Gruppen „Therapie“ und „Infiziert“, da hier der Mittelwert und die Streuung zu ähnlich sind. Die * mit den horizontalen eckigen Klammern zeigen die hochsignifikanten Unterschiede.

  • Abbildung 10: MEGX Bolus; Der * mit den horizontalen eckigen Klammern kennzeichnet hochsignifikante Unterschiede zwischen Gruppen im ANOVA Turkey HSD PostHoc Test.

  • Abbildung 11: Sorbitol Bolus; Der * mit den horizontalen eckigen Klammern repräsentiert die signifikanten Unterschiede zwischen den Gruppen, nachgewiesen mittels one-way beetween-groups ANOVA mit Turkey HSD PostHoc Test.

  • Abbildung 12: Galaktose Bolus. Das Ergebnis der ANOVA mit Turkey HSD PostHoc Test wird hier graphisch noch einmal dargestellt: die Standard Gruppe sowie die Gruppe „Zellfreier Bioreaktor“ unterscheiden sich von allen anderen Gruppen. Die * mit den horizontalen eckigen Klammern zeigen die hochsignifikanten Unterschiede.

  • Abbildung 13: Ammoniak Bolus; Die Gruppe „Zellfreier Bioreaktor“ unterscheidet sich im one-way beetween-groups ANOVA mit Turkey HSD PostHoc Test von allen anderen Gruppen hochsignifikant.

  • Abbildung 14: Lidocain, groupiert nach Kategorien der Kulturtage; links mit gelben Boxplots Kontinuierlicher Modus, rechts mit roten Boxplots zum Vergleich Bolus Modus

  • Abbildung 15: MEGX, groupiert nach Kategorien der Kulturtage; links mit gelben Boxplots Kontinuierlicher Modus, rechts mit roten Boxplots zum Vergleich Bolus Modus

  • Abbildung 16: delta-Sorbitol, groupiert nach Kategorien der Kulturtage; links mit gelben Boxplots Kontinuierlicher Modus, rechts mit roten Boxplots zum Vergleich Bolus Modus

  • Abbildung 17: Galaktose, groupiert nach Kategorien der Kulturtage; links mit gelben Boxplots Kontinuierlicher Modus, rechts mit roten Boxplots zum Vergleich Bolus Modus

  • Abbildung 18: Pig-Albumin, groupiert nach a) Kategorien der Kulturtage und b) nach Kulturphasen

  • Abbildung 19: Pig-Albumin, groupiert nach Qualitätskriterium Standard und Infektion

  • Abbildung 20: Ammoniak Basal, groupiert nach a) Kategorien der Kulturtage und b) nach Kulturphasen

  • Abbildung 21: Ammoniak Basal, groupiert nach Qualitätskriterium Standard und Infektion

  • Abbildung 22: Harnstoff, groupiert nach a) Kategorien der Kulturtage und b) nach Kulturphasen

  • Abbildung 23: Harnstoff, groupiert nach Qualitätskriterium Standard und Infektion

  • Abbildung 24: Lactat, groupiert nach a) Kategorien der Kulturtage und b) nach Kulturphasen

  • Abbildung 25: Lactat, groupiert nach Qualitätskriterium Standard und Infektion

  • Abbildung 26: Kinetik von Lidocain, Bolus Schema im zellfreien Bioreaktor

  • Abbildung 27: Kinetik von MEGX, Bolus Schema im zellfreien Bioreaktor

  • Abbildung 28: Kinetik von Sorbitol, Bolus Schema im zellfreien Bioreaktor

  • Abbildung 29: Kinetik von Galaktose, Bolus Schema im zellfreien Bioreaktor

  • Abbildung 30: Kinetik von Ammoniak, Bolus Schema im zellfreien Bioreaktor