1. Einleitung

1.1 Das Ösophaguskarzinom

↓1

Das Ösophaguskarzinom ist ein sehr agressiver Tumor und hat nach wie vor, trotz Fortschritten in der Chirurgie und Einsatz aggressiver multimodaler Therapiekonzepte, eine schlechte Prognose. Zum heutigen Stand der Forschung akzeptierte Therapie der Wahl ist die Operation und eventuell anschließend Radiotherapie, wenn möglich in Form einer kombinierten Radiochemotherapie [1,2]. Leider haben die bisherigen Therapiekonzepte die Prognose (und damit das Gesamtüberleben) jedoch nicht wesentlich verbessern können. Die meisten Patienten befinden sich bei Erstdiagnose bereits schon in einem fortgeschrittenem Stadium. Abgesehen vom hohen Risiko eines operativen Eingriffes liegt die 2 Jahres-Überlebensrate auch bei optimaler Therapie nur bei ca 20% [3].

Ziel dieser Arbeit ist daher, über Bestimmung von molekularen Markern die Agressivität der Tumoren individuell zu bestimmen, um zukünftig die Therapie für jeden Patienten durch Eskalation bzw. De-Eskalation optimieren und damit das Überleben signifikant verbessern bzw. unnötige Therapien vermeiden zu können.

1.1.1 Epidemiologie

In der Bundesrepublik ist die Inzidenz mit 4-5 Neuerkrankungen eines Ösophaguskarzinoms pro 100.000 Einwohner pro Jahr eher niedrig. Für das Jahr 2000 betrug die altersstandardisierte Inzidenz für sämtliche Ösophaguskarzinome im Saarland, dem einzigen Bundesland zuverlässig geführten Krebsregister in West-Deutschland, 10,47 für Männer und 2,19 Neuerkrankungen für Frauen pro 100000 Einwohner, 1997 betrug die altersstandardisierte Inzidenz 11.0 für Männer und 2.3 für Frauen, die altersstandardisierte Mortalität betrug 1997 pro 100000 Einwohner 10,3 für Männer und 1,0 für Frauen (Tab. 1; Quelle: Krebsregister des Saarlands: URL www.krebsregister.saarland.de ). In einigen Regionen Chinas, der ehemaligen Sowjetunion, in Südafrika und im Iran ist die Inzidenz hingegen hoch (100-500 Plattenepithelkarzinome pro 100000 Einwohner pro Jahr).

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Tab. 1:Standardisierte und kumulative Mortalitätsraten für das Ösophaguskarzinom 1997

Standardisierte und Kumulative Mortalitätsraten
für das Ösophaguskarzinom (ICD9: 150) im Saarland 1997

       
 

Rohe Mortalität*

Mortalität standardisiert nach Altersstruktur für WHO „Standardbevölkerungen“**

Kumulative Mortalität***

    
  


Welt


Europa


BRD

0-14 Jahre

35-64 Jahre

0-74 Jahre

Frauen

1,3

0,6

0,8

1,0

-

0,03

0,07

Männer

9,7

5,7

8,4

10,3

-

0,34

0,64

Um die Einschätzung der Relation dieser Zahlen zu gestatten zeigt Abbildung 1 die altersstandardisierten häufigsten Mortalitätsraten für Männer und Frauen für das Jahr 1998 im Saarland.

Im Jahr 1997 betrug die Anzahl bösartiger Neubildungen insgesamt 2787 Erkrankungen bei Männern und 2738 bei Frauen im Saarland. Hiervon entfielen auf Ösophaguskarzinome (ICD Ziffer 150 nach ICD9): 59 Männer (2,1%) und 16 Frauen (0,58%). Somit ist das Ösophaguskarzinom der 9.-häufigste Tumor bei Männern, nimmt jedoch nur Platz 23 bei Frauen ein. Der prozentuale Anteil des Ösophaguskarzinoms an Gastrointestinaltumoren (Ösophagus, Magen, Dünn- und Dickdarm, Rektum) insgesamt beträgt 59/544 (10,8 %) für Männer und 16/505 (3,2 %) für Frauen.

↓3

Abb. 1:Altersstandardisierte häufigste Mortalitätsraten für Männer und Frauen für das Jahr 1998 im Saarland.

Das Plattenepithel- und das Adenokarzinom unterscheiden sich epidemiologisch und ätiologisch. Plattenepithelkarzinome des Ösophagus gehen bis zu 10% mit einem Zweitkarzinom überwiegend im Hals-Nasen-Ohren-Bereich oder der Lunge einher. Im Gegensatz zum Plattenepithelkarzinom ist das Adenokarzinom eine Erkrankung der westlichen Welt. Das mediane Alter bei Erstdiagnose liegt bei 65 Jahren und somit 10 Jahre über dem der Patienten mit Plattenepithelkarzinom. Männer sind 7-mal häufiger betroffen. Auffällig ist, daß das Adenokarzinom des Ösophagus in den letzten Jahrzehnten an Häufigkeit zunimmt. Die Ursache hierfür ist noch unklar, liegt aber möglicherweise in der besseren Früherkennung. Diskutiert werden muss aber auch eine veränderte Sichtweise der Pathologen und einige dieser jetzt als Adenokarzinome des Ösophagus betrachteten Tumore sind möglicherweise früher als Magenkarzinome der Cardia klassifiziert worden. Dies vermag auch die regional verschiedenen Häufigkeiten des Adenokarzinoms unabhängig von pathogenetischen Einflüssen (s.u.) zumindest teilweise zu erklären.

Abb. 2: Prozentuale Anteile der häufigsten Lokalisationen maligner Tumore für das Jahr 1997 im Saarland.

Neuerkrankungen Ösphaguskarzinom (nicht grafisch dargestellt): Platz 9 bei Männern (2,1 %), Platz 23 bei Frauen (0,58 %).

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Auffällig ist, dass es Regionen mit deutlich erhöhter Inzidenz des Ösophaguskarzinoms gibt. Hohe Inzidenzen wurden zwischen 1988 und 1992 berichtet für die Calvados-Gegend in Frankreich mit 22,3/100.000 Neuerkrankungen/Jahr, Hong-Kong und Japan. Die niedrigste Inzidenz wurde mit 1,7/100.000 in Israel berichtet [4,5,6,7,8]. Die weltweit höchsten Inzidenzen werden allerdings in Regionen Chinas und im Iran beobachtet. Dort wird in einigen Regionen eine Inzidenz von bis zu 300 Neuerkrankungen pro 100.000 Einwohner/Jahr beobachtet. Insgesamt lag die landesweite Inzidenz in China aber bei 18.8/100.000 zwischen 1973 bis 1975 und fiel zwischen 1990 bis 1992 auf 17,4/100.000 ab, vermutlich aufgrund veränderter Ernährung und verbesserter Nahrungshygiene. Die höchsten Inzidenzen werden in der Linxian und der Nanao Region, sowie Shanghai beobachtet [9,10,11,12]. Im Iran finden sich die höchsten Inzidenzen im Norden und Nordosten des Landes im Gebiet der Turkomanen mit Inzidenzen bis 144/100.000 für Männer und 48/100.000 für Frauen und prozentualen Anteilen von bis zu 9% aller Tumoren [13,14,15,16]. Die Ursachen für diese Unterschiede in der Inzidenz sind unklar. Neben Karzinogenexposition [17,18] werden genetische Unterschiede oder infektiöse Ursachen wie die Infektion mit onkogenen humanen Papillomviren [19] als Ursache für die regionalen Unterschiede diskutiert.

Insbesondere Karzinogenexposition über die Nahrung [15,20,21,22,23], Alkohol- [18,20] und Nikotinabusus [17], aber auch thermische Irritation [16] werden als auslösende Faktoren für Plattenepithelkarzinome diskutiert, letztere allerdings kontrovers [24]. Hingegen ist die intestinale Metaplasie des Barrett-Ösophagus mit einer erhöhten Rate von Adenokarzinomen des Ösophagus assoziiert [25,26,27]. Im Einklang mit diesen Befunden ist, dass Faktoren, die mit Refluxkrankheit assoziiert sind, sowohl als Risikofaktoren für Barrett-Ösophagus als auch für Adenokarzinome identifiziert werden konnten. Vor allem Übergewicht [28] und Behandlung mit Medikamenten, die den Sphinktertonus der Cardia herabsetzen, z.B. Asthmamedikamente, Nitroglycerin und Benzodiazepine [29]. Zusätzlich wurde die Behandlung mit H2-Blockern mit dem Auftreten von Adenokarzinomen des Ösophagus in Verbindung gebracht [30].

1.1.2 Pathogenese und Pathologie

Wie bereits erwähnt gelten exogene Noxen wie Alkoholabusus, Rauchen und nitrosaminhaltige Nahrungsmittel als wahrscheinliche Ursachen. Weitere Auslöser sind chronische Entzündungen, z.B. in Folge gastrointestinalen Refluxes, der vor allem die Entstehung einer intestinalen Metaplasie und somit von Adenokarzinomen begünstigt. Allerdings scheinen bei einem Teil der Patienten auch onkogene Viren an der Pathogenese beteiligt zu sein.

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Der erste Bericht, der eine Beteiligung humaner Papillomviren (HPV) an der Entstehung sowohl benigner als auch maligner Tumoren des Plattenpithels des Ösophagus zeigte stammt aus dem Jahr 1982 [31]. Seitdem wurde in einer Vielzahl von Studien mit verschiedenen Detektionsmethoden wie In-situ-Hybrisierung, Southern-Blot Analysen, PCR und proteinchemischen Nachweismethoden HPV in Papillomen und Karzinomen des Ösophagus nachgewiesen [19,32]. Von 1485 mittels In-situ-Hybridiserung untersuchten Tumoren waren 22,9 % und von 2020 mittels PCR untersuchten Tumoren 15,2 % positiv für Bestandteile des HPV Genoms [33]. Zusätzlich belegen tierexperimentelle Untersuchungen, serologische Nachweise von Antikörpern gegen HPV und epidemiologische Untersuchungen in diesen Kohorten, sowie in vitro Studien, die pathogenetische Rolle von HPV beim Ösophaguskarzinom, besonders in den Endemiegebieten Chinas [34,35]. Allerdings konnten in nicht-endemischen Gebieten nur bei einem kleinen Bruchteil der Patienten HPV nachgewiesen werden, so dass dies einer der Gründe für die geographischen Unterschiede in der Inzidenz dieses Karzinoms sein könnte [33].

Tumore des Ösophagus sind in Mitteleuropa in der grossen Mehrzahl epitheliale Tumoren, vor allem Plattenepithelkarzinome (80-90%) und Adenokarzinome (10-20%). Erwähnenswert ist allerdings, dass die Inzidenz der Adenokarzinome in den letzten Jahrzenten drastisch zunimmt. Dieser Trend wurde zuerst in den USA [36,37,38,39,40], später dann auch in Europa, Japan, Australien und Mittelamerika beobachtet [41,42,43,44,45,46,47,48,49,50,51,52,53]. Seit 1994 ist das Adenokarzinom in den USA der häufigste Ösophagustumor und hat das Plattenpithelkarzinom klar überholt. Hingegen wurde dieser Trend weder in Osteuropa noch in China bisher beobachtet.

Aufgrund der guten lymphatischen Drainage der Ösophagusschleimhaut metastasieren Ösophaguskarzinome rasch lymphogen. Typisch ist eine lymphogene Schleimhautmetastasierung und eine intramurale, submuköse Karzinomausdehnung, vor allem nach proximal. Fernmetastasen treten bei proximalen Tumoren vor allem in der Lunge (venöser Abfluß über Vv. thyroidea, V. azygos oder V. hemiazygos in die obere V. cava), bei distalen Tumoren vor allem in der Leber (venöser Abfluß über V. coronaria ventriculi in die Pfortader) auf. Neben der Beurteilung des histologischer Typ (Plattenepithelkarzinom, Adenokarzinom etc.), des Differenzierungsgrads und der Infiltrationstiefe ist für die exakte Stadieneinteilung nach UICC/TNM und AJCC (s.u.) und somit auch für die Therapieplanung die histopathologische Beurteilung des lymphogenen Metastasierungsmusters für lokale Lymphknoten (N0 vs. N1 Stadium) und entfernterer Lymphknotenstationen (M0 vs. M1) von essentieller Bedeutung [54].

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Aufgrund des häufigen submukösen Wachstums und der hohen Tendenz zur Infiltration benachbarter Strukturen ist die makroskopische Beurteilung der Exzision im Gesunden durch Operateur und Pathologen und die histiopathologische Beurteilung der Schnittränder durch den Pathologen von besonderer Bedeutung [54]. Die makroskopisch und mikroskopisch gelungene Exzision im Gesunden (R0-Resektion) ist ein wichtiger unabhängiger positiver prognostischer Faktor [55].

1.1.3 Diagnose und Stadieneinteilung

Der Ausgangspunkt der Diagnose sind oft die Symptome Gewichtsverlust, Brustschmerzen, mit oder ohne Dysphagie. Da eine Schluckstörung in der Regel erst auftritt, wenn 2/3 des Ösophaguslumens vom Tumor verlegt sind, oder das Lumen weiniger als 1 cm weit ist, stellt die Dysphagie eher ein Spätymptom dar. Aufgrund der späten Diagnose ist die Erkrankung häufig bereits lokal fortgeschritten oder bereits metastasiert. Dies erklärt zumindest zum Teil die schlechte klinische Prognose des Ösophaguskarzinoms.

In einer Serie von 5044 Patienten, die 1994 in den USA behandelt wurden, waren als häufigste Symptome zum Zeitpunkt der Erstdiagnose Schluckbeschwerden bei 74 % der Patienten, Gewichtsverlust bei 57.3 %, gastrointestinaler Reflux bei 20.5 %, Schmerzen beim Schlucken bei 16.6 % und Atemnot bei 12.1 % der Patienten als Leitsymptome erhoben worden. Bei ungefähr 50 % der Patienten war der Tumor im unteren Drittel der Speiseröhre lokalisiert. Bei 51,6 % der Patienten zeigte die Histologie ein Plattenepithelkarzinom und bei 41.9 % ein Adenokarzinom. Ein Barrett-Ösophagus war insgesamt bei 15,4 % der Patienten vorhanden, zeigte sich jedoch bei 39 % der Patienten mit Adenokarzinom. Dies ist im Einklang mit der erhöhten Wahrscheinlichkeit von Patienten mit intestinaler Metaplasie der Ösophagusschleimhaut, ein Adenokarzinom zu entwickeln.

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Patienten bei denen der Tumor chirurgisch entfernt wurde (also eine Positivselektion) zeigten folgende Stadien nach AJCC: Stadium I: 13,3 %, Stadium II: 34,7 %, Stadium III: 35.7 % und Stadium IV: 12.3 %. Eine Radiochemotherapie (ohne Operation) erhielten 39,5 % der Patienten und nur 13,2 % der Patienten wurden mittels chirurgischer Entfernung des Tumors in Verbindung mit einer adjuvanten Radio- bzw. Radiochemotherapie behandelt. Das 1-Jahresüberleben für die Gesamtgruppe betrug 43%, wobei 70 % der Patienten im Stadium I aber nur 18 % der Patienten im Stadium IV 1 Jahr nach Diagnosestellung am Leben waren [36]. Diese Daten sind auch für Deutschland repräsentativ [56,57,58]. Allerdings haben, wie auch im gegenwärtig in dieser Arbeit untersuchten Kollektiv, die meisten Patienten trotz aggressiver multimodaler Therapie eine schlechte Prognose mit einem 5-Jahresüberleben von nur etwa 15 bis 20 %.

Die Diagnose erfolgt aktuell meist endoskopisch mittels Ösophagogastroskopie. Präoperative Staginguntersuchungen sollten Endosonographie, Röntgen des Thorax, Computertomographie des Thorax, evtl. des Abdomens bei distalen Tumoren, Abdomensonographie und histologische Sicherung des Tumorbefundes umfassen [59]. Zur Beurteilung des Ausbreitungsmusters wird zudem die Bronchoskopie bei suprabifurkalen Tumoren und die Laparoskopie bei infrabifurkalen Tumoren empfohlen. Ferner werden Untersuchung der Ösophagus- und Magen-Darm-Passage mit Breischluck empfohlen, bei zervikalem Karzinom mit wasserlöslichem Kontrastmittel aufgrund der Gefahr einer bronchialen Fistelung.

Für die endgültige Beurteilung des N-Stadiums ist die sorgfältige histopathologische Untersuchung des Tumorresektats nach Operation zwingend erforderlich. Die AJCC Richtlinien sehen die histopathologische Untersuchung von mindestens 6 mediastinalen Lymphknoten vor [60]. Aufgrund der Tatsache, dass ein grosser Teil der Patienten bereits zum Zeitpunkt der Diagnosestellung im fortgeschrittenen Stadium ist, bedingt, dass nur ein geringer Prozentsatz der Patienten chirurgisch behandelt wird. Im Hinblick auf eine bessere Planbarkeit der Behandlungsmodalitäten und der Tatsache, dass ein hoher Prozentsatz der Patienten aufgrund ihrer fortgeschrittenen Erkrankung nicht operiert wird, wurde eine klinische und eine pathologische TNM Klassifikation etabliert (cTNM und pTNM) [60].

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Die Einteilung der Tumoren erfolgt einerseits anhand des Bezuges zum Tracheobronchialsystem (infrabifurkale, suprabifurkale und rein zervikale) und andererseits nach der TNM-Klassifikation der UICC (Union International Contre le Cancer) und der AJCC (American Joint Commission for Classification of Cancer) (siehe Tab. 2 und 3 [61,62]).

* Aus operationstechnischen Gründen und im Hinblick auf das Muster der lympohogenen Streuung wird der thorakale Ösophagus (ca. 18 cm ab Zahnlinie) in 3 Segmente unterteilt: oberer Teil ab obere Thoraxapertur bis Trachealbifurkation, ca. 18 bis 24 cm ab Zahnlinie; mittlerer Teil von Bifurkation bis etwa 32 cm ab Zahnlinie; unterer Teil: letzte 8 cm bis ösophagogastraler Übergang inklusive des abdominellen Anteils bis ca. 40 cm ab Zahnlinie.

Die vom AJCC etablierte klinische Stadieneinteilung beruht sowohl auf dem TNM-Stadium der UICC als auch auf der klinischen Prognose und praktischen chirurgischen Aspekten, u.a. der Resezierbarkeit.

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Tab. 3:Klinische Stadieneinteilung der Ösophaguskarzinome nach AJCC [60]

Stadium

TNM Klassifikationen

  

0

Tis

N0

M0

I

T1

N0

M0

II A

T2

N0

M0

 

T3

N0

M0

II B

T1

N1

M0

 

T2

N1

M0

III

T3

N1

M0

 

T4

jedes N

M0

IV

jedes T

jedes N

M1

IV A

jedes T

jedes N

M1a

IV B

jedes T

jedes N

M1b

1.1.4 Therapie und klinische Prognose

Das Ösophaguskarzinom hat trotz Fortschritten in der Chirurgie und trotz Einsatz multimodaler Therapiekonzepte eine schlechte Prognose, die zumindest teilweise durch eine frühe regionäre lymphatische und häufige hämatogene Metastasierung bedingt ist. Retrospektive Aufarbeitungen chirurgischer und strahlentherapeutischer Studien ergaben für resektable lokalisierte Tumoren eine Fünfjahresüberlebensrate von 10-30%, für fortgeschrittene, meist nur bestrahlte Patienten sogar von nur 4 - 6%.

Die heute zu Verfügung stehenden diagnostischen Verfahren wie CT, MR und Endosonographie belegen, daß früher die Tumorausdehnung und lokoregionäre Infiltration häufig unterschätzt wurden. Ösophaguskarzinome wachsen submukös entlang der Lymphbahnen. Bei fehlender Serosa wird eine frühe Invasion in das Mediastinum und andere benachbarte Strukturen wie das Gefäß- und Bronchialsystem begünstigt.

↓10

Aufgrund der Tumorlokalisation, der Tumorausdehnung und individueller Patientenmerkmale sind selbst bei optimistischer Sicht nur etwa 50 - 60% aller Ösophaguskarzinome prognostisch sinnvoll operabel.

Für das therapeutische Vorgehen entscheidend sind die Lokalisation und das TNM Stadium der UICC, sowie die hierauf basierende AJCC Stadieneinteilung (s.o.) und insbesondere auch der Allgemeinzustand und Begleiterkrankungen des Patienten. Entscheidend für die Indikation zur Operation, der Therapiemodalität der ersten Wahl, sind die Risiken des geplanten Eingriffs und die Wahrscheinlichkeit einer R0-Resektion. Nur die R0-Resektion mit radikaler Tumorentfernung und regionärer Lymphadenektomie ist als kurativer Ansatz zu bewerten. Dies ist allerdings nur bei etwa 35% aller Patienten möglich.

Die im folgenden kurz geschilderten Therapiemodalitäten basieren auf den Empfehlungen der Arbeitsgemeinschaft der Wissenschaftlichen Medizinischen Fachgesellschaften. Richtlinien zur Strahlentherapie des Ösophaguskarzinoms wurden erarbeitet von: Deutsche Gesellschaft für Radioonkologie (DEGRO) e.V., Deutsche Gesellschaft für Medizinische Physik (DGMP) e.V., Arbeitsgemeinschaft Radiologische Onkologie (ARO) in der Deutschen Krebsgesellschaft (DKG) e.V., Berufsverband Deutscher Strahlentherapeuten (BVDSt) e.V. Für die internistische und chirurgische interdisziplinäre Therapie des Ösophaguskarzinoms wurde eine Interdisziplinäre Leitlinie durch die Arbeitsgemeinschaft internistische Onkologie (AIO), die Chirurgische Arbeitsgemeinschaft für Onkologie (CAO), die Arbeitsgemeinschaft für Radiologische Onkologie (ARO) und die Arbeitsgemeinschaft für Rehabilitation und Nachsorge (ARNS) der Deutschen Krebsgesellschaft erarbeitet [63]. Beide Leitlinien können in der jeweiligen aktuellen Version über das Internet abgerufen werden: http://www.uni-duesseldorf.de/WWW/AWMF/ll/ll_onkol.htmhttp://www.uni-duesseldorf.de/WWW/AWMF/ll/ll_onkol.htm.

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Bei nicht R0-resektablen Ösophaguskarzinomen oder funktionell inoperablen Patienten wird die Strahlenbehandlung als Therapiemodalität der nächsten Wahl empfohlen. Die Strahlentherapie kann perkutan und/oder als intraluminale Brachytherapie durchgeführt werden. Im Rahmen kurativer Therapieansätze ist der kombinierte und simultane Einsatz einer zytostatischen Chemotherapie additiv zur Bestrahlung sinnvoll.

Bei operablen Patienten kommen neoadjuvante, d.h. präoperative, oder adjuvante, d.h. postoperative Radiochemotherapiekonzepte mit platinhaltigen Substanzen zum Einsatz. Trotz zahlreicher Studien bei dieser Tumorentität konnte die Prognose im Vergleich zur alleinigen chirurgischen Behandlung durch die zusätzliche Radiochemotherapie allerdings nicht wesentlich verbessert werden (Tab. 4).Patienten mit kompletter Remission nach Radiochemotherapie (pT0pN0) profitieren möglicherweise bezüglich lokoregionärer Kontrolle und Überleben. Endgültige Ergebnisse dieser Studien stehen allerdings noch aus. Von Interesse ist hierbei, dass Patienten mit Adenokarzinom im Vergleich zu Patienten mit Plattenepithelkarzinom ein etwas besseres Überleben zeigen [64], und zwar im frühen Krankheitsstadium (pT1) 83% 5-Jahresüberleben für Adenokarzinom und 63% für Plattenepithelkarzinom [58].

Tab. 4: Stadienabhängiges Überleben von Patienten mit Ösophaguskarzinom

Überleben

Stadium I und IIA

Stadium IIB und III

Stadium IV

Median

wird nicht erreicht

12-14 Monate

9-12 Monate

2-Jahresüberleben

55% -70%

10% -25%

<10%

1.1.5 Operative Therapie

↓12

Das Risiko der operativen Therapie bei Patienten mit Oesophaguskarzinom ist wesentlich von der Erfahrung des Operateurs und der Institution abhängig. Mittlerweile konnte durch Optimierung der Operationstechniken und durch bessere supportive Massnahmen die perioperative Mortalität in den mesiten Zentren deutlich unter 10% gesenkt werden [57]. Daher sollte die operative Therapie in Zentren mit spezieller Erfahrung in der Ösophaguschirurgie erfolgen. Entscheidend für die Indikation zur Operation sind die Beurteilung des Risikos des geplanten Eingriffs und die Abschätzung der Wahrscheinlichkeit einer vollständigen Tumorentfernung (R0-Resektion). Die R0-Resektion (radikale Entfernung des Tumors mit regionalem Lymphabflussgebiet) ist die wesentliche Voraussetzung für einen kurativen Behandlungserfolg [55,57,65].

Für nichtinvasive Plattenepithelkarzinome (pTis) und bis zu 2 cm große, gut differenzierte Mukosakarzinome ist eine Mukosaresektion im Gesunden als ausreichende Therapie anzusehen, sofern durch sorgfältige endoskopische Untersuchung sichergestellt ist, dass keine weiteren Tumorareale im Ösophagus vorhanden sind und regelmäßige endoskopische Nachuntersuchungen stattfinden (4).

Für suprabifurkale T1/T2-Ösophaguskarzinome ist die subtotale Oesophagusresektion mit abdominaler und mediastinaler (vermutlich auch zervikaler) Lymphadenektomie (3-Feld-Dissektion) indiziert. Fortgeschrittene Tumoren (T3/T4) sind in Anbetracht ihres frühen Bezugs zum Tracheobronchialsystem häufig lokoregional nicht R0-resektabel. Sie sollten unter Studienbedingungen einer neoadjuvanten Strahlenchemotherapie mit dem Ziel zugeführt werden, ein sogenanntes „Downstaging“ zu erreichen, um hierdurch sekundär die radikale operative Therapie zu ermöglichen. Bei diesem Konzept ist allerdings mit einer Erhöhung des postoperativen Risikos in Form von Anastomoseninsuffizienz und Wundheilungsstörungen zu rechnen.

↓13

Für infrabifurkale T1/T2-Ösophaguskarzinome ist die subtotale Ösophagusresektion mit abdominaler und mediastinaler Lymphadenektomie (2-Feld-Dissektion) indiziert. Auch im fortgeschrittenen Tumorstadium kann dieses Vorgehen erfolgen, allerdings ist bei T4-Tumoren mit einem erhöhten Operationsrisiko und ungünstiger Langzeitprognose zu rechnen. Neoadjuvante Therapiemodalitäten unter Einschluss der Strahlentherapie sind derzeit in der Erprobung. Sie sind jedoch nur innerhalb kontrollierter Studien indiziert. Als Alternative kommt bei Patienten im Stadium II/III bei hohem operativem Risiko die Radiochemotherapie zur Anwendung. Sinnvolle prospektive randomisierte Studien zur ausschließlichen Radiochemotherapie fehlen bisher.

Bezüglich des therapeutischen Vorgehens beim zervikalen Ösophaguskarzinom besteht hingegen kein Konsens.

1.1.6 Präoperative (neoadjuvante) Therapie

Die alleinige präoperative Radiotherapie ist nicht zu empfehlen. Die neoadjuvante (präoperative) kombinierte Radiochemotherapie ist prinzipiell wirksam. Sie sollte bei resektablem Tumor derzeit nur innerhalb klinischer Studien eingesetzt werden. Sie wird vor allem bei lokal fortgeschrittenen suprabifurkalen und zervikalen Plattenepithelkarzinomen angewandt. Die Effizienz einer präoperativen Radiochemotherapie fortgeschrittener aber primär resektabler Tumore ohne Bezug zum Bronchialsystem (suprabifurkaler oder zervikaler Sitz) ist bislang nur durch Phase II Studien belegt. Wirksame Substanzen sind 5-Fluorouracil, Cisplatin und Taxane. Empfohlen wird die Applikation einer Referenzdosis von 36 - 40 Gy bei Einzeldosen von 1,8 Gy täglich. Zielvolumen ist der tumorinfiltrierte Ösophagus einschließlich eines kranialen und kaudalen Sicherheitssaumes von mindestens 3 cm sowie gegebenenfalls die regionären Lymphknoten in Abhängigkeit von der Lokalisation des Primärtumors. Die Lungenfunktion der Patienten muss hierbei beachtet werden.

1.1.7 Postoperative (adjuvante) Therapie

↓14

Die wenigen randomisierten Studien lassen es nicht zu, eine eindeutige Indikation bei R0-resezierten Tumoren für eine postoperative Radiotherapie abzuleiten. Die postoperative Strahlentherapie vermindert allerdings die lokoregionäre Rezidivrate ohne allerdings die Überlebensrate zu verbessern. Bei R1- oder R2-resezierten Tumoren sollte daher eine postoperative Radiotherapie erfolgen, bei ausreichendem Allgemeinzustand und Funktionsstatus des Patienten in Form einer simultanen Radiochemotherapie.

Es sollte eine Einzeldosis von 1.8 (- 2.0 Gy) täglich und, in Abhängigkeit vom R-Status (R0 , R1 oder R2 ) eine Gesamtreferenzdosis von 50 bis max. 56 Gy appliziert werden, bei präoperativer Radio-/Radiochemotherapie wird eine entsprechende Dosisreduktion durchgeführt um die Toxizität zu verringern.

1.1.8 Definitive Radiotherapie

Für Patienten mit einem Karnofsky-Index von 60% und mehr (WHO Grad 0-2) ist bei kurativer Therapieintention (bei Fehlen von Fernmetastasen) die primäre kombinierte und simultane Radiochemotherapie (z.B. mit 5-FU/Cisplatin oder 5-FU/Mitomycin) empfohlen. Die intraluminale Brachytherapie im Afterloadingverfahren kann eventuell als Boost appliziert werden. Die Gesamtreferenzdosis sollte (einschließlich Afterloading) 66 - 70 Gy nicht überschreiten, bei Einzelfraktionen von 1,8 - 2 Gy für die perkutane Therapie und 5 -7 Gy ( in 0,5 cm Gewebetiefe) pro Applikation für das intraluminale Afterloading.

1.1.9 Palliative Radiotherapie

↓15

Für Ösophaguskarzinompatienten in schlechtem Allgemeinzustand oder weit fortgeschrittenem Tumorstadium (M1) ist als Strahlentherapie primär die intraluminale Brachytherapie im Afterloadingverfahren zur Passageaufweitung und Verbesserung der Dysphagie empfohlen. Bei ein- bis zweimal wöchentlichem Afterloading werden hierbei Einzeldosen von 5 - 7 Gy kalkuliert auf 0,5 cm Gewebetiefe (entsprechend einem Quellenabstand von 7-10 mm je nach gewähltem Applikator) appliziert. Die Häufigkeit der Behandlung richtet sich nach der individuellen Symptomatik. Zur Stabilisierung der palliativen Passageaufweitung ist häufig die Implantation eines Stents oder auch Tubus sinnvoll. Bei ausgedehntem extramuralem Tumor sollte eine kleinvolumige perkutane Strahlenbehandlung durchgeführt werden.

1.2 Tumorbiologie und Molekulare Prognosefaktoren

Die Regulation von Zellproliferation und Zelltod erfolgt durch eng miteinander verknüpfte Signalwege. Im normalen und ausgereiften, adulten, sich aber dennoch ständig selbst erneuernden Gewebe besteht ein dynamisches Gleichgewicht zwischen Zellproliferation durch mitotische Teilung und Zelluntergang durch programmierten Zelltod (Apoptose)[66,67,68]. Beide Phänomene werden durch komplizierte Regulationssysteme engmaschig kontrolliert [69,70]. Dies spiegelt sich auch in der Bedeutung dieser beiden zellbiologischen Phänomene bei der Entstehung von benignen [71] und malignen Tumoren wieder [72,73,74,75,76]

Die ungehemmte Aktivierung von Zellzyklus-aktivierenden Signalwegen erleichtert die Tumorentstehung, ebenso wie die Inaktivierung von Zelltodsignalwegen [77]. Eine onkogene Kooperation zwischen Zellzyklus- und Apoptose-Deregulation konnte z.B. bei der malignen Transformation durch das c-myc und das Bcl-2 Gen in transgenen Mäusen gezeigt werden [78]. Überexpression von Bcl-2 im B-Zellkompartiment allein löste Hyperplasie der B-Zellregionen in den Lymphgeweben aus. Die spontane oder transgene Überexpression des c-myc Gens führte hingegen zu hochmalignen B-Zell-Lymphomen. Ebenso fördert das K-Ras Onkogen nicht nur Zellwachstum sondern hemmt auch Zelltod-Signalwege [79].

↓16

Abb. 3:Balance von Zellvermehrung und Zelluntergang

In normalem Gewebe herrscht ein Gleichgewicht zwischen Zellproliferation und Zelltod. Unerwünschte Zellen werden durch Apoptose eliminiert. In malignen Tumoren entsteht ein Ungleichgewicht: Zellproliferation nimmt zu und Apoptose ist gehemmt. In der malignen Progression, z.B. durch Entstehung von Resistenz gegen zytotoxische Therapien oder bei Metastasierung, nimmt diese Imbalance weiter zu.

Alle malignen Tumore weisen solche Störungen der Proliferations- und der Zelltodkontrolle auf (Abb. 3). Maligne Tumore sind häufig genetisch instabil und akkumulieren nach den initialen transformierenden genetischen Ereignissen weitere, sekundäre genetische Veränderungen [80]. Dies kann zu einem weiteren Verlust der Proliferationskontrolle und noch stärkerer Apoptose-Resistenz führen. Solche Veränderungen werden im Rahmen der Tumorprogression beobachtet, d.h. bei der Entstehung aggressiverer und Therapie-resistenter Tumore (Abb. 3), z.B.als Folge einer Chemo- oder Strahlentherapie.

Neuere Daten zeigen, dass die Hemmung von Zelltod zumeist nicht direkt an der eigentlichen malignen Transformation beteiligt ist, sondern nur das Überleben der betroffenen Zellen verlängert, es entsteht ein hyperplastisches Gewebe mit erhöhtem Zellgehalt. Hierdurch wird allerdings die Akkumulation genetischer Veränderungen erleichtert, die dann sekundär zum Verlust der Proliferationskontrolle führen. Beide Phänomene können also nicht isoliert betrachtet werden, und die beteiligten Signalwege sind auf einer Vielzahl von Ebenen engmaschig miteinander verknüpft.

1.2.1 Zellvermehrung

↓17

Wesentliche Erkenntnisse zur Regulation der Proliferation wurden in Hefezellen gewonnen, vor allem der Bierhefe Saccharomyces cervisiae und der Spalthefe Schizosaccharomyces pombe [81,82,83]. Defektmutanten dieser Eukaryonten führten zur Entdeckung der Cycline als Motor des Zellzyklus. Die Expression dieser Proteine oszilliert und zu bestimmten Phasen des Zellzyklus werden bestimmte Cycline hoch- oder herunterreguliert [84]. Die Cycline [85] regulieren die Enzymaktivität Cyclin-abhängiger Kinasen (CDK, s.u.), die über die Phosphorylierung von Substratproteinen das Fortschreiten der Zelle im Zellzyklus koordinieren [86,87].

Zudem steuern weitere Gene die Aktivität dieser Kinasen und ermöglichen hierdurch die Kontrolle des Fortschreitens der Zelle durch die Phasen des Zellzyklus. Dies erfolgt an bestimmten Zeitpunkten, die bestimmte Schlüsselsignale erfordern, um Fortschreiten im Zellzyklus zu ermöglichen und daher als Check- oder auch Restriktionspunkte bezeichnet werden [85,88]. Im engeren Sinne sind Checkpunkte „Mechanismen, die eine Abhängigkeit zwischen zwei ansonsten biochemisch nicht miteinander vernetzten Regelwerken herstellen“. Die einzelnen Abschnitte des Zellzyklus setzen sich aus einer ganzen Reihe solcher in festgelegter Folge ablaufender und zeitlich aufeinander abgestimmter Prozesse zusammen, die letztlich zur Teilung der Zelle in zwei Tochterzellen führen. Hierbei ist die exakte Verdopplung und Verteilung des Genoms in die beiden Tochterzellen zu fordern, um genetische Stabilität zu gewährleisten.

Solche Checkpunkte, die mittlerweile in jeder Zellzyklusphase bekannt sind, gestatten das Fortschreiten der Zelle im Zyklus nur dann, wenn bestimmte Signalkombinationen vorliegen. Ist dies nicht der Fall, dann werden Signalwege aktiviert, die zu Zellzyklusarrest und Reparatur oder programmiertem Zelltod, Apoptose, führen.

1.2.2 Der G1-Restriktionspunkt und Zellzyklusregulation durch den Rb-Signalweg

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Zellwachstum entsteht durch Progression der Zelle durch den Zellzyklus [89], der sich aus 4 definierten, voneinander abgrenzbaren Phasen zusamensetzt: G1, S, G2 und M-Phase. Das Fortschreiten einer Zelle aus der G0-Ruhephase in die G1-Phase (Gap-Phase 1) des Zellzyklus und aus der G1-Phase in die S-Phase wird durch den G1-Restriktionspunkt in der späten G1-Phase reguliert [90,91]. Ist dieser Kontrollmechanismus durch physiologische Stimuli, wie z.B. Wachstumsfaktoren (s.u.) oder Deregulation von Kontrollgenen (in Tumorzellen), aufgehoben, dann geht die Zelle ungebremst in die S-Phase über und beginnt mit der DNA-Synthese. Ist die S-Phase abgeschlossen, dann gelangt die Zelle nach Durchlaufen der G2-Phase, in der die Segregation der replizierten DNA vorbereitet wird, in die M-Phase, die Mitose. Die Zellteilung wird im Anschluss beendet und die aus der Mitose hervorgegangenen Tochterzellen befinden sich nun wieder in der G1-Phase.

Neben dem G1-Restriktionspunkt gibt es im Verlauf des Zellzyklus zusätzliche Checkpunkte, die den Fortschritt der Zelle durch jede der Phasen des Zellzyklus kontrollieren. Einer dieser Punkte liegt in der späten G2-Phase (G2/M-Kontrollpunkt), weitere in der S- und in der M-Phase.

Eine Dysregulation des Zellzyklus kann zwei für die maligne Transformation bedeutsame Folgen haben: Zum einen kann die Zellzahl durch eine erhöhte Proliferationsrate und/oder einen Block der physiologischen Apoptose erhöht werden (Hyperplasie), und zum anderen können Störungen an den Checkpunkten bzw. der dort ablaufenden Reparaturmechanismen zu einer erhöhten Mutagenese führen. Zellen sind während des Zellzyklus sehr empfindlich und können wesentlich leichter irreversibel und letal geschädigt werden. Diese Checkpunkte werden z.B. durch Bestrahlung oder DNA-Schädigung durch Zytostatika aktiviert, wodurch die Zelle nicht nur in der G1-Phase, sondern auch in der S-, vor allem aber auch in der G2 und den einzelnen Schritten der M-Phase arretiert werden kann, um die entstandenen Schäden zu reparieren. Die Progression der Zelle durch den Zellzyklus wird durch den Rb-Signalweg kontrolliert.

1.2.3 Zellzyklus-Hemmung durch die Retinoblastom (Rb) Genfamilie

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Die Rb-Familie besteht aus den funktionell und strukturell nahe verwandten Genprodukten Rb, p107 und p130 [92,93,94,95,96,97]. Die Inaktivierung beider Rb Allele, vorwiegend durch Keimbahn-Mutationen, ist mit der Entstehung von Retinoblastomen assoziiert. Neben diesen familär, schon im frühen Kindesalter auftretenden Tumoren wird eine Inaktivierung von Rb infolge somatischer Mutationen oder Deletion des Genlokus in einer Vielzahl von Tumoren, auch beim Erwachsenen, beobachtet.

Abb. 4:Regulation der S-Phase Progression durch E2F

Nach mitogener Stimulation werden Rb-Proteine in 2 Schritten phosphoryliert. Der erste Phosphorylierungsschritt wird durch D-Cycline und die Cyclin-abhängigen Kinasen CDK4 und CDK6 vermittelt. Der zweite Phosphorylierungsschritt erfolgt durch den Cyclin E/CDK2-Komplex. Das nun mehrfach phosphorylierte Rb kann Transkriptionsfaktoren wie E2F nicht mehr inhibieren und die nun freien E2F/Dp Heterodimere können Promotoraktivierung vermitteln und Gene aktivieren, die S-Phase Progression auslösen (S-Phase-Promotoren).

Die wachstumskontrollierende Funktion von Rb-Proteinen beruht auf ihrer Fähigkeit, reversibel an Transkriptionsfaktoren wie z.B. E2F (s.u.) zu binden [98]. pRb (Rb-Protein) ist ein transkriptioneller Repressor, der durch die Interaktion mit diesen E2F-Transkriptionsfaktoren spezifisch die Promotoraktivierung Zellzyklus-regulierender Gene hemmt. Wird Rb durch die Bindung an E2F an einen Promotor gebunden, dann hemmt es ebenfalls umgebende Transkriptionsfaktoren und blockiert hierdurch die Transkriptionsmaschinerie für das betroffene Gen. Hierdurch wird die Transkription Zellzyklus-promovierender Gene gehemmt und die Zelle wird im Zellzyklus (in diesem Fall in der G1-Phase) arretiert. Die Bindungstasche in Rb (Pocket-Domäne) für diese Transkriptionsfaktoren prägte den Begriff „Pocketproteine“, der häufig synonym für die Rb-Proteinfamilie gebraucht wird [92].

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Die Bindung von pRb an E2F wird durch den Phosphorylierungsstatus von pRb reguliert (s.u.) [94,95]. In seiner hypophosphorylierten Form inhibiert pRb Transkriptionsfaktoren der E2F/Dp Familie und verhindert hierdurch die Hochregulation von Genen, die z.B. für die Aktivierung der DNA-Synthese während der S-Phase benötigt werden. Um im Zellzyklus fortschreiten zu können, muss daher Rb phosphoryliert und hierdurch funktionell inaktiviert werden (Abb. 4).

Diese Rb-Phosphorylierung wird durch Cyclin-abhängige Kinasen (Cyclin-dependent kinases, CDK) vermittelt. Die Aktivität dieser Kinasen wird durch spezifische Ko-Faktoren, die Cycline reguliert, deren Expression in den verschiedenen Phasen des Zellzyklus rasch ansteigt und ebenso rasch gegen Ende der jeweiligen Zellzyklusphase wieder abfällt, also im Zellzyklus oszilliert.

1.2.4 Zellzyklus-Regulation durch Cycline, CDK und ihre Inhibitoren

Der Übergang von einer in die nächste Phase des Zellzyklus wird durch Cyclin-abhängige Kinasen reguliert. Diese Enzyme bilden einen Komplex mit jeweils spezifischen Ko-Faktoren, den Cyclinen. Die aktiven Cyclin/CDK-Komplexe phosphorylieren Substratproteine, z.B. die Pocketproteine der Rb-Familie (Abb. 5). Cyclin/CDK-Komplexe regulieren hierdurch die entscheidenden Kontrollpunkte des Zellzyklus.

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Werden ruhende Zellen durch Wachstumsfaktoren stimuliert, dann erfolgt die Regulation der initialen Schritte der Zellvermehrung und der Eintritt in die S-Phase durch D-Typ Cycline (Cyclin D1, D2 und D3) und ihre katalytischen Partner CDK4 und CDK6. Solche proliferationsaktivierenden Signale, z.B. über die Ras-Aktivierung und die MAP-Kinase Kaskade [99] oder NF-B-Aktivierung, stimulieren die Expression von Cyclin D1 bzw. dessen beiden Homologen Cyclin D2 und D3. Die neu gebildeten Cycline binden an CDK4 und CDK6, wodurch deren Kinase-Aktivität angeschaltet wird. Diese Cyclin-CDK Komplexe vermitteln dann die Phosphorylierung von pRb.

Dieses Prinzip der Aktivierung einer CDK durch ein spezifisches Cyclin findet sich in allen Zellzyklusphasen. So interagiert in der frühen G1 Phase Cyclin D mit CDK4 und CDK6, gefolgt von Cyclin E/CDK2 in der späten G1 Phase, Cyclin A/CDK2 in der S-Phase, Cyclin A/Cdc2 (CDK1) in der späten S-Phase und dem S/G2 Übergang, sowie Cyclin B/Cdc2 (CDK1) in der G2-Phase und dem G2/M Übergang (Abb. 5). Während in epithelialen Zellen vorwiegend D1-Cyclin funktionell relevant ist, sind in hämatopoetischen Zellen besonders D2- und D3-Cyclin exprimiert [100].

Die D-Typ Cycline (Cyclin D1, D2, D3) kontrollieren gemeinsam mit Cyclin E [101] den G1 Restriktionspunkt (Abb. 4 und 5). Rb wird durch diese D-Cycline und die assoziierten Kinasen CDK4/6 phosphoryliert, wodurch es zur Hochregulation von Cyclin E kommt, das durch Aktivierung von CDK2 einen zweiten Rb-Phosphorylierungsschritt in der späten G1-Phase auslöst [93,101]. CDK2 vermittelt, gemeinsam mit Cyclin E, nicht nur Progression in die S-Phase und Beginn der DNA-Replikation sondern auch Duplikation des Centrosoms, den ersten Schritt zur Verrdopplung der Chromosomen.

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Die Aktivität der CDK wird durch spezifische Inhibitoren negativ reguliert. Diese Inhibitoren werden als CDKI bezeichnet (Cyclin-dependent kinase inhibitors). Bisher konnten 2 Subfamilien der CDKI identifiziert werden: die CIP/KIP Familie, die multiple verschiedene Cyclin/CDK-Komplexe hemmen kann und die INK4-Familie, die spezifisch CDK4 und CDK6 hemmt (Abb. 5).

Die Aktivität von CDK2 (assoziiert mit Cyclin E) kann durch CIP/KIP (CDK inhibiting protein/kinase inhibiting protein) CDKI Proteine gehemmt werden (p21Waf1/Cip1, p27Kip1 und p57Kip2). Diese CIP/KIP-Faktoren verfügen über eine konservierte, homologe Domäne, die die Bindung und Hemmung von CDK2 und CDK4 vermittelt. Diese Proteine wirken stöchiometrisch und hemmen bevorzugt CDK2-Komplexe, obwohl sie in vitro mit allen in der G1-Phase gebildeten CDK-Komplexen interagieren können.

Abb. 5:Regulation der Zellzyklusphasen durch Cycline und Cyclin-abhängige Kinasen (CDK) sowie deren Inhibitoren (CDKI).

In jeder der Zellzyklusphasen sind spezifische Cycline exprimiert, die mit spezifischen CDK (Cyclin Dependent Kinases) interagieren und sie hierdurch aktivieren. Diese CDK phosphorylieren Rb und ermöglichen den Fortschritt der Zelle durch den Zellzyklus bis Rb gegen Ende des Zellzyklus durch Phosphatasen dephoshoryliert wird und die aus der Mitose hervorgegangenen Tochterzellen nach Ende der M-Phase erneut in der G1-Phase sind. CDKI (CDK Inhibitors) können diese Cyclin/CDK Komplexe in jeder Zellzyklusphase hemmen und Zellzyklusarrest auslösen. Die CDKI der INK4a-Familie hemmen G1-Phase Cycline während die CDKI der KIP-Familie auch S- und G2-Phase Cyclin/CDK-Komplexe hemmen.

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Die INK4-Familie (Inhibiert CDK4) besteht aus 4 nahe verwandten Faktoren: p16INK4a, p15INK4b, p18INK4c und p14INK4d [102]. Die INK4 Familienmitglieder verhindern die Progression aus der G1-Phase in die S-Phase des Zyklus, indem sie die Phosphorylierung von Rb verhindern. Dies erfolgt durch Hemmung der D-Cyclin-abhängigen CDK4 und CDK6. Das somit hypophosphorylierte Rb hemmt wiederum die Aktivität von Transkriptionsfaktoren (z.B. E2F) und verhindert hierdurch die Expression von Cyclin E und weiteren für die S-Phase-Progression benötigten Faktoren. Dies erklärt auch, warum INK4 CDKI für ihre Wirkung Rb benötigen.

Die CDKs zeigen im Verlauf des Zellzyklus eine relativ lange Halbwertszeit. Im Gegensatz hierzu oszillieren die Expressionsspiegel der Cycline in den verschiedenen Phasen des Zellzyklus, und die Phasen-spezifischen Cycline werden rasch beim Übergang in die nächste Phase des Zellzyklus nach Export aus dem Zellkern in das Zytoplasma ubiquitinyliert und über das Proteasom abgebaut, begleitet vom Anstieg des Expressionsniveaus des nächsten Cyclins. Demzufolge führt die Herunterregulation der Cyclin B Spiegel am Ende der G2- und Beginn der M-Phase zur Hypophosphorylierung von Rb und ermöglicht somit, im Zusammenspiel mit dem APC/Mad-Signalweg und De-Aktivierung des Anaphase-Checkpunkts das Ende des Zellzyklus nach Abschluss der Mitose [103].

Die Rolle von Rb in den späteren Zellzyklusphasen ist allerdings weniger gut definiert [94,95,96,97]. Sicher ist, dass Rb in der G2/M-Phase dephosphoryliert wird. Auch in der S-Phase wurde eine hemmende Wirkung von (dephosphoryliertem) Rb auf die DNA-Synthese beschrieben. Rb bleibt daher über die S- und G2-Phase phosphoryliert, bis es dann gegen Ende der Mitose dephosphoryliert wird, und die Zelle hierdurch erneut in der G1-Phase arretiert ist. Rb-Dehosphorylierung erfolgt unter anderem durch die PP1 Proteinphosphatase [94]. Auch für die PTEN-Phosphatase wurde eine, allerdings indirekte Wirkung auf die pRb-Phosphorylierung beschrieben. Überexpression des PTEN Tumorsuppressorgens kann Proliferation von Tumorzellen hemmen und geht mit einer Dephosphorylierung von pRb einher. Dieser Effekt wird über die PI3- und Akt-Kinase vermittelt.

1.2.5 Zellzyklus und Apoptose

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Signale, die den Progress von Zellen im Zellzyklus auslösen, aktivieren immer auch Zelltodsignale. Nur durch die Koordination mit Überlebens-Signalen bzw. bei Vorliegen von Zellzyklus-arretierenden Signalen kann die normale Zelle bzw. die Tumorzelle überleben [68].

Hierdurch wird verständlich, warum die Überexpression von Zellzyklus-stimulierenden Transkriptionsfaktoren wie E2F-1 und dessen Homologen [104] oder c-myc [105] oder auch von Cyclin D1 [106] Apoptose auslöst. Werden hingegen gleichzeitig Überlebenssignale wie z.B. durch Bcl-2 oder Bcl-xL oder andere Apoptose-Hemmer vermittelt, dann überlebt die Zelle das Proliferationssignal, geht nicht in die Apoptose und schreitet im Zellzyklus fort [107]. Möglicherweise soll durch die gleichzeitige Aktivierung von Proliferations- und Zelltodsignalen die akzidentelle Aktivierung der Zellproliferation vermieden werden. Solche fehlerhaft proliferierenden Zellen würden dann über Apoptose absterben. Dies erklärt zum Teil, warum Tumoren häufig Inaktivierungen von Zelltodsignalwegen aufweisen.

Ebenso kann die Aktivierung von Zelltodsignalen im Zellzyklus gehemmt werden, indem die Zelle in der jeweiligen Zellzyklusphase zum adäquaten Zeitpunkt arretiert wird. Zellzyklusinhibitoren wie die CDKIs, vor allem p21Cip/Waf, können daher anti-apoptotische Wirkung zeigen [108]. Allerdings kann auch die kontinuierliche Arretierung von Zellen im Zellzyklus in Phasen ausserhalb der G0/G1-Phase Zelltodsignalwege aktivieren. Hierdurch wird garantiert, dass nur solche Zellen überleben, die den Zellzyklus korrekt durchlaufen haben. Dies erklärt, warum langanhaltender Zellzyklus-Arrest an verschiedenen Checkpunkten Apoptose-Programme aktiviert. Dies gilt insbesondere für Zellen in denen gleichzeitig Proliferations-aktivierende und Zellzyklus-arretierende Signale aktiv sind, also divergierende, konkurrierende Signalwege aktiviert wurden. Dies könnte erklären, warum für alle CDKIs (vor allem p16 [109], p21 [110] und p27 [111]) nach adenoviralem Gentransfer (der gleichzeitig auch die DNA-Replikationsmaschinerie der S-Phase aktiviert) eine Zelltod-fördernde Wirkung gezeigt werden konnte.

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Die Aktivierung dieser Zellzyklus-assoziierten Zelltodsignale wird über Phasen-spezifische Regulatoren vermittelt. Der gegenwärtige Stand der Erkenntnis ist allerdings noch sehr fragmentarisch. Durch diese strenge Kontrolle von Zellzyklusarrest sowie von Apoptose oder Zellüberleben wird in normalen Zellen dereguliertes Wachstum verhindert. Die Koordination einer Vielzahl komplexer, nachgeschalteter Regulationswege war somit aus evolutionsgeschichtlicher Sicht die Basis für die Entwicklung komplexer vielzelliger Organismen.

Besonders gut untersucht sind die Regulation des G1-Restriktionspunkts und die Mechanismen der Vernetzung mit Apoptose-Signalwegen. Deregulation des G1-Restriktionspunkts führt über Ras-, c-myc und E2F-vermittelte Signale neben der Transkription von S-Phase Genen auch zur Induktion des p14ARF/INK4a Proteins [112]. In der Maus wird das entsprechende Homolog als p19ARF bezeichnet [113]. ARF steht hierbei für „Alternatives Leseraster (Reading Frame)“. P14ARF ist, neben dem CDKI p16INK4a, das zweite Genprodukt des INK4a Genlokus und wird durch Verwendung eines eigenen Promotors und eines alternativen Exons 1 (Exon 1) in mRNA translatiert und gespleisst. Dieses alternative Spleissen resultiert bei der Protein-Translation in einem anderen, verschobenen Leseraster des Exons 2 (Abb. 6). Durch dieses alternative Leseraster entsteht ein Protein mit völlig anderer Aminosäuresequenz und Funktion als p16INK4a [112,113].

Abb. 6:Intron/Exon-Struktur des INK4a Genlokus

Alternatives Spleissen und Verwendung von Exonen resultiert in der Expression zweier verschiedener Gene vom selben Genlokus. Beide Gene werden hierbei von unabhängigen Promotoren kontrolliert, die in Tumorzellen unterschiedlich inaktiviert sein können. Der CDK Inhibitor p16INK4a wird vom Exon 1 alpha, Exon 2 und Exon 3 gebildet. Im Gegensatz hierzu wird das auf Aminosäure-Ebene komplett nicht-homologe p14ARF von Exon 1 beta, und einem Teil von Exon 2 kodiert. Exon 2 wird aufgrund des alternativen Spleissens in einem verschobenen Leseraster translatiert.

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Während p16INK4a vorwiegend Zellzyklusarrest vermittelt induziert p14ARF bevorzugt Apoptose (Abb. 7). p14ARF bindet an das Mdm-2-Protein (mdm steht für murine double minute, da das Gen initial in der Maus entdeckt wurde; das humane Mdm-2 wird daher auch als Hdm-2 bezeichnet). Unter normalen Bedingungen bewirkt Mdm-2 durch einen negativen Rückkopplungsmechanismus, dass die Proteinspiegel von p53 sehr niedrig sind: p53 ist ein transkriptioneller Aktivator des mdm-2 Gens. Das Mdm-2 Protein wiederum bindet an p53, bewirkt die Ubiquitinylierung und den Abbau von p53 über das Proteasom [114]. Die p53 Proteinexpression und Aktivität wird somit über diesen Regulationsmechanismus vorwiegend post-translational reguliert. Die Bindung von p14ARF an Mdm-2 destabilisiert Mdm-2, indem es die Ubiquitinylierung und den Abbau von Mdm-2 über das Proteasom vermittelt (s.u.) [112,115]. Durch die Verminderung der Mdm-2 Proteinmenge wird der negative Rückkopplungssignalweg für p53 gehemmt: p53 wird hierdurch stabilisiert und die p53 Proteinexpression erhöht (Abb. 7).

Abb. 7:Der p14ARF/p53 Signalweg

DNA-Schädigung oder die deregulierte Aktivierung Zellzyklus-fördernder Gene führen zur Aktivierung der Expression von p16Ink4 und von p14ARF. P16 vermittelt Zellzyklusarrest in der G1-Phase durch Hemmung von D-Typ-Cyclin/CDK4/6-Komplexen. P14ARF hingegen destabilisiert Mdm-2 und fördert dessen Abbau über das Proteasom. Mdm-2 ist ein Inhibitor von p53 und löst dessen Abbau über das Proteasom aus. Da p14ARF Mdm-2 inaktiviert, wird wiederum p53 stabilisiert, das nun nicht mehr über Mdm-2 dem Abbau über das Proteasom zugeführt wird. P53 kann nun seine Wirkung als transkriptioneller Aktivator von Zellzyklus-hemmenden Genen (z.B. p21Cip/WAF-1, 14-3-3) und Apoptose-fördernden Genen (z.B. Bax, PUMA, Noxa, PIG3 (p53-induziertes Gen 3), p53AIP1 (p53 Apoptose-induzierendes Protein-1), IGF-BP3, DR5, CD95/Fas) und transkriptioneller Repressor von Überlebens-Genen (z.B. Bcl-2) entfalten.

C-myc und E2F vermitteln folglich über einen p14ARF/Mdm-2/p53-abhängigen Signalweg Zelltod. Allerdings wurden mittlerweile auch p53- [116] und p21/p27-unabhängige Signalwege [117] von p14ARF zur Aktivierung von Zellzyklusarrest beschrieben, so dass wahrscheinlich an der p14ARF-vermittelten Apoptose noch weitere, p53-unabhängige Signalwege beteiligt sind. Interessant ist in diesem Zusammenhang, dass p14ARF auch unabhängig von p53 und Bax den mitochondrialen Apoptosesignalweg aktivieren kann [118].

1.2.6 Kontrolle von Zellzyklus und Apoptose durch p53

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Das p53 Gen zählt zu den am häufigsten inaktivierten Genen in malignen Tumoren. Das p53 Protein ist ein wichtiger Regulator der Zellproliferation und der Apoptose und wird z.B. nach DNA-Schädigung, zum Beispiel durch ionisierende γ -Strahlung, aktiviert und kontrolliert eine Vielzahl von Zellantworten. Eine besonders wichtige Funktion besteht in der Hemmung des Zellwachstums und in der Aktivierung von Mechanismen, die zur Apoptose führen. Über diese Mechanismen kann p53 Tumorwachstum verhindern und wird daher als Tumorsuppressor bezeichnet. Durch Mutationen oder Deletion der chromosomalen Region auf dem kurzen Arm des Chromosoms 17 (17p) kann p53 inaktiviert werden.

Eine Reihe von Arbeiten zeigte, dass eine solche p53-Inaktivierung mit einer schlechteren Prognose der zugrundeliegenden Tumorerkrankung einhergehen kann [119]. P53 wird nicht nur transkriptionell sondern vorwiegend posttranslational reguliert [120]. Die basale Proteinexpression ist gering, wird jedoch durch genotoxische Schäden (Bestrahlung, Chemotherapie) oder andere zelluläre Stressfaktoren wie Hypoxie, Hitze, virale Infektion oder Onkogen-Aktivierung (z.B. E2F und c-myc) erhöht, da diese Vorgänge, z.B. über p14ARF, das p53-Protein stablisieren, indem sie seinen Abbau über das Proteasom hemmen und seine Halbwertszeit verlängern (Abb. 7). P53 kann sowohl als Transkriptionsfaktor für Gene wie APAF-1, p21Cip/WAF, Bax, PUMA, NOXA, p53-AIP1, 14-3-3, Gadd45, IGF-BP3, PIG-Gene etc. [121,122,123,124] dienen, als auch als transkriptioneller Repressor die Expression anderer Gene direkt oder indirekt reprimieren (z.B. Bcl-2, Cdc2 und Cyclin B) [120]. Bezüglich der p53-vermittelten Effektormechanismen wie Zellzyklus-Arrest oder Aktivierung von Apoptose-Signalwegen existieren deutliche Unterschiede zwischen verschiedenen Zelltypen, wodurch ein Teil der diversen Daten in der Literatur erklärt werden kann. Die Inaktivierung von p53-Homologen wie p73 und anderen ist weniger gut untersucht. Mittlerweile liegen jedoch eine Reihe von Daten vor, die zeigen, dass diese Homologen über die selben Effektormechanismen wirken wie p53 und, ebenso wie p53, durch Deletion der entsprechenden Genregion in malignen Tumoren inaktiviert werden können [125,126,127]. Mutationen der p53-homologen Gene scheinen jedoch selten zu sein. Kürzlich wurden allerdings neben der Mutation von p53 auch Mutationen im p53 Homolog p63 [128] in der Blastenkrise der chronischen myeloischen Leukämie (CML) beschrieben. Das Homolog p73 hingegen ist in Tumoren extrem selten mutiert, wird aber in der Blastenphase der CML in aberranten Spleissvarianten exprimiert, deren funktionelle Bedeutung noch nicht vollständig geklärt ist [129]. Das Fehlen der N-terminalen Domäne (N-p73) resultiert in Proteinvarianten mit dominant-negativer Funktion, die DNA-Bindung und Tetramerisierung funktionaler p73 und p53 Komplexe blockieren können [130,131].

Abb. 8:Zelluläre Antwort auf genotoxische Schäden

Schematische Darstellung der Signaltransduktionsebenen, die zelluläre Antwort auf Schädigung der DNA und der DNA-Replikation vermitteln, z.B. nach Replikationsfehlern, Bestrahlung oder chemischer Schädigung.

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Der p53-vermittelte Zellzyklusarrest und die Aktivierung von DNA-Reparaturmechanismen nach Bestrahlung oder chemischer Mutagenese ermöglicht der Zelle sich von der genotoxischen Schädigung zu erholen und zu überleben [88,132]. Versagen die Reparaturmechanismen, dann überwiegen die ebenfalls von p53 aktivierten Zelltodsignale und die Zelle stirbt (Abb. 8). Experimentelle Daten hierzu kamen erstmals von der Gruppe von Vogelstein, die zeigten, dass der knock-out von p21Cip/Waf (oder auch von p53, eines der transkriptionellen Aktivatoren von p21) die Fähigkeit von Tumorzellen inaktiviert, nach DNA-Schädigung im Zellzyklus beim G1 und G2/M Restriktionspunkten zu arretieren [108]. Tumorzellen, die durch gezielten Gen-knock-out von p53 [133] bzw. p21 [108] oder 14-3-3 [134] einen G2-Checkpunkt-Defekt aufwiesen, wurden nach DNA-Schädigung durch Chemotherapie polyploid und starben daraufhin über Apoptose. P53 kann daher in einer solchen Situation also auch als Zelltod-hemmendes Gen wirken, in dem es über seine Zellzyklus-arretierende Wirkung Apoptose-Mechanismen hemmt und Reparatur ermöglicht.

Dennoch haben p53-mutierte Tumorzellen auf Grund ihres Apoptose-Defekts einen Selektionsvorteil (Abb. 8). Ein Teil der malignen Zellen überlebt aufgrund des Apoptosedefekts die zytotoxische Behandlung und wird durch die Therapie selektiert [135]. Klinisch resultiert dies in einem Therapie-unempfindlicheren Rezidivtumor. Prinzipiell gilt ein solcher Selektionsvorteil auch für Tumorzellen, die andere Defekte in Zelltodsignalwegen erworben haben, z.B. Inaktivierung von p14ARF [136] oder auch Bax [137,138].

1.2.7 Inaktivierung von Zellzyklusregulatoren in Tumoren

Maligne Tumore sind durch Deregulation der Zellproliferation gekennzeichnet. Es ist daher auch nicht überraschend, dass über verschiedenste Veränderungen, die in vielen Fällen noch völlig ungeklärt sind, Zellzyklus-aktivierende Gene dereguliert werden, die den Eintritt aus der G1- in die S-Phase ermöglichen. Neben den Cyclinen D1, D2 und D3 sind dies vor allem E2F-Homologe und das c-myc-Gen.

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C-myc nimmt hierbei eine besondere Stellung ein, da es bei hochmalignen B-Zell-Lymphomen und in soliden Tumoren durch Genamplifikation oder auch durch chromosomale Translokation dereguliert werden kann. In der Mehrzahl der Burkitt-Lymphome erfolgt dies durch t(8;14) Translokation oder andere Translokationen, die das c-myc-Gen unter die Kontrolle von Immunglobulin-Enhancer-Sequenzen bringen, die dann die konstitutive Expression des c-myc Gens vermitteln. Beschrieben wurden auch Punktmutationen, die die Bindung und Inaktivierung durch pRb blockieren. Ein weiterer Mechanismus der myc-Deregulation ist die Genamplifikation, die bei ca. 10% der hochmalignen B-Zell-Lymphome nachgewiesen werden kann [139] und bei 23 bis 31 % der Ösophaguskarzinome [140,141].

Störungen von hemmenden Zellzyklus-Regulatoren können in nahezu jedem Tumor nachgewiesen werden: Eine Vielzahl maligner Tumore zeigt eine gestörte CDKI Aktivität. Als mögliche Ursachen der Inaktivierung kommen in Frage: (1) verminderte Expression durch Promotormethylierung, (2) Deletion der entsprechenden Region (3) Mutation des CDKIs, (4) Mutation der entsprechenden CDK und (5) Störung eines Regulators der CDKI Expression.

Die Bedeutung einer Deregulation der CDKIs für die Tumorbiologie ist noch nicht vollständig geklärt. Sicher ist, dass ein Verlust dieser Zellzyklusinhibitoren die Deregulation des Zellzyklus verstärkt. Unklar ist jedoch, ob es sich hierbei um ein primäres Ereignis handelt, das ursächlich an der Tumorentstehung beteiligt ist oder ein sekundäres genetisches Ereignis im Rahmen der Tumorprogression.

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Der Verlust solcher CDKIs ist häufig mit einer schlechten Prognose der Erkrankung verbunden. Besonders gut untersucht wurde dies im Fall von p16 [138,142]. Solide Tumoren zeigen häufig eine p16-Überexpression. Der Verlust dieser hohen p16 Expression ist bei einer Vielzahl von Tumoren mit einer schlechteren Prognose verbunden, unter anderem auch beim Ösophaguskarzinom [138,143]. Weiterhin spielt p16-Inaktivierung auch eine pathogenetische Rolle bei der malignen Transformation des Barrett-Ösophagus [144,145]. . Ebenso konnte für Mantelzonen-Lymphome gezeigt werden, dass ein Verlust der entsprechenden chromosomalen Region (9p) mit einem höheren Proliferationsindex, einer deutlich schlechteren Krankheitsprognose bzw. der Transformation zu hochmalignen Lymphomen assoziiert ist [143]. Neben p16 wird beim Ösophaguskarzinom und anderen Tumoren auch p21 bzw. p27-Verlust beobachtet, ebenso wie Überexpression der CDKI Gegenspieler, Cyclin E und A. Von Interesse ist hierbei, dass normale p27 Expression und Funktion durch hohe Cyclin E Spiegel überwunden werden kann (wie auch andere CDKI). Dies kann, neben gesteigerter transkriptioneller Aktivierung der Genexpression, auch durch Hemmung des Abbaus erfolgen. Mutationen des F-Box-Proteins Cdc4 führen zu erhöhten Cyclin E-Spiegeln, die Wildtyp p27 überwinden können [146].

Hieraus wird auch klar, dass unterschiedliche Ereignisse den G1-Restriktionspunkt deregulieren können. Die Defekte können auf jeder Ebene des Signalwegs auftreten. Das Resultat ist das gleiche: Deregulation von S-Phase-Progression. Häufig sind diese Defekte alternativ, d.h. es ist entweder p16 oder Cyclin D1 oder Rb betroffen. Allerdings können Tumorzellen auch mehrere Defekte akkumulieren. Unklar ist jedoch noch, ob solche kombinierten Defekte nur redundant sind oder synergistisch wirken und mit einer höheren Malignität und noch rascherem Wachstum korrelieren.

1.2.8 Zelltodsignalwege

Programmierter Zelltod, Apoptose, wird durch distinkte Signale und Signalwege reguliert (Abb. 9). Ein diesen Signalwegen gemeinsames Prinzip ist die Ausbildung eines zytosolischen Signaltransduktionskomplexes (DISC; Death-inducing signaling complex), an die sich kaskadenartig verstärkende Aktivierung einander nachgeschalteter Apoptose-fördernder Faktoren anschliesst, welche die Aktivierung exekutierender Enzyme, der Caspasen vermitteln [147]. Dies ist ein evolutionär konserviertes Prinzip, das zu solch archaischen Organismen wie dem Wurm Cenorhabditis elegans und wahrscheinlich noch älteren Organismen wie den fakultativ mehrzelligen Schleimpilzen (Dictyostelium) und sogar Bakterien zurückverfolgt werden kann [67,70].

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Die bisher am besten molekular definierten DISC-Signalwege werden durch Mitchondrien [148] und die Death-Rezeptoren der TNF-Rezeptorsuperfamilie vermittelt [147,149]. Es gibt zudem Hinweise, dass auch andere Zellkompartimente wie das endoplasmatische Retikulum (ER) über die Aktivierung der Caspase-12 Apoptose induzieren können, z.B. bei Stressreaktionen des ER im Rahmen deregulierter Entleerung des Calcium-Speichers oder massiver Akkumulation pathologischer Proteine (Unfolded Protein Response, UPR) bei Virus-Infektionen oder Amyloid-Protein beim M. Alzheimer.

Die Ausbildung und Aktivierung eines DISC resultiert in der raschen Rekrutierung von Inducer-Caspasen (wie der Caspase-2, -8, -9, -10, oder -12). Diese Inducer-Caspasen aktivieren in der Signalkaskade nachgeschaltete Effektor-Caspasen (Caspase-3, -6- und –7), die dann die Apoptose exekutieren und hunderte von regulatorischen Proteinen degradieren, sowie andere Protease-Systeme und Endonucleasen aktivieren [150]. Vergleichbar den Enzymkaskaden der Blutgerinnung oder des Komplementsystems wird durch die Aktivierung der Caspase-Signalkaskade eine lawinenartige Verstärkung des initialen Signals erreicht. Hierdurch wird die irreversible Zerstörung der Zelle eingeleitet.

Abb. 9:Apoptose-Signalwege

Das grundlegende Konzept der Aktivierung und Hemmung der Apoptose-Signalkaskade kann evolutionsgeschichtlich bis zu archaischen Organismen wie dem Nematoden Cenorhabditis elegans zurückverfolgt werden. Der humane Apoptosehemmer Bcl-2 ist ein Homolog des C. elegans ced-9 Gens (cell death Gen-9), das Apoptose-fördernde Bax ist ein Homolog von egl-1, APAF-1 enthält eine Domäne mit Homologie zu ced-4 und Caspase-3 ist ein Homolog von ced-3. Die Aktivierung eines Zelltod-Effektors wie Bax führt zur Bildung eines Apoptose-induzierenden Signalkomplexes (Death-inducing signaling complex, DISC) und zur Aktivierung von Initiator-Caspasen. Bak lokalisiert besonders ausgeprägt auch im Endoplasmatischen Retikulum (ER) und kann dort die Apoptose-Induktion nach ER-Stress vermitteln (z.B. bei Unfolded Protein Response, UPR). Analog hierzu wird bei Aktivierung von Death-Rezeptoren durch die entsprechenden Liganden ein zytoplasmatischer DISC aus z.B. dem Adapterprotein FADD und der Procaspase-8 gebildet. Die Initiator-Caspasen aktivieren Downstream-Caspasen, die den apoptotischen Zelltod exekutieren. Inhibitoren können diese Signalwege auf jeder Ebene inhibieren; auf der Ebene der Aktivatoren (z.B. Bcl-2), der Adapter (z.B. Bcl-2, FLIP, SOD, CARD-9), bzw. auf der Ebene der Caspasen: FLIPL und IAPs.
CED: C elegans death gene, ER: endoplasmatic reticulum, UPR: unfolded protein response, SOD: silencer of death domain. FLIPS: short splice variant of Fas-linked inhibitory protein, FLIPL: long splice variant, FADD: Fas-associated death domain, IAP: Inhibitor of Apoptosis Proteins, CARD: Caspase-Rekrutierungs-Domäne.

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Die Bildung eines DISC wurde erstmals für Death-Rezeptor-vermittelte Apoptose für den CD95/Fas-Rezeptor beschrieben [151]. Durch Rezeptor-Oligomerisierung ausgelöst durch Bindung des Liganden oder durch agonistische Antikörper erfolgt die Rekrutierung von FADD (Fas associated death domain) Adapterproteinen über Bindung des Adapterproteins an die zytosolisch lokalisierte Todesdomäne (death domain) des Rezeptors. FADD kann wiederum über seine DED (death effector domain) die Procaspasen-8 bzw. –10 rekrutieren. SOD-Proteine (silencer of death domain) können hingegen die Rekrutierung von FADD hemmen [152]. Ebenso können FLIP-Proteine die Bindung der Procaspase-8 (kurze und lange Spleissvariante, FLIPS, FLIPL) bzw. die Aktivierung der Procaspase-8 hemmen (FLIPL) [153].

Ein vergleichbarer Komplex (nicht homologer) Signalproteine wurde später für den mitochondrialen Apoptose-Signalweg definiert. Hier wird der DISC von dem zytosolischen Adapterprotein APAF-1 gebildet, das mitochondriale Ko-Faktoren (Cytochrom c und (d)ATP) bindet und hierdurch aktiviert wird [154]. Aktiviertes APAF-1 rekrutiert über die nun zugängliche CARD-Domäne die Pro-Caspase-9, die sowohl im Zytosol lokalisiert ist, als auch aus Mitochondrien freigesetzt wird. Dieser Proteinkomplex aus APAF-1, Cytochrom c und Pro-Caspase-9, sowie ATP, stellt den mitochondrialen DISC dar, der auch als mitochondriales Apoptosom bezeichnet wird.

1.2.9 Mitochondrien und Apoptose

Die Aktivierung des mitochondrialen Apoptose-Signalwegs (Abb. 10) wird von Bcl-2 (B cell lymphoma gene 2), Bcl-xL (lange Spleissvariante des Bcl-x Proteins) und andere Apoptose-hemmende Mitglieder der Bcl-2-Genfamilie kontrolliert und gehemmt [155]. Im Gegensatz hierzu vermögen Apoptose-fördernde Mitglieder dieser Genfamilie, wie z.B. Bax (Bcl-assocaited X protein) [156], Bak [157] und Bok [158], direkt Mitochondrien zu aktivieren. Der Verlust der Bax Expression ist in den meisten Tumoren mit der Resistenz gegen zytotoxische Therapiemodalitäten verbunden [137,159,160]. Der Apoptose-regulierende Mechanismus der Bcl-2 Familienmitglieder ist, obwohl Bcl-2 als eines der ersten Gene in dieser Signalkaskade identifiziert wurde, immer noch nicht vollständig klar. Als gesichert gilt, dass Bax und dessen Homologe Bak und Bok direkt Mitochondrien aktivieren können, die daraufhin Cytochrom c und ATP aus dem Raum zwischen innerer und äusserer Mitochondrienmembran freisetzen [161]. Dieser Vorgang kann durch Bcl-2 gehemmt werden [162].

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Die Aktivierung der Mitochondrien kann hierbei in distinkte Aktivierungsschritte unterteilt werden: (1) Die Konformationsänderung im N-Terminus von Bax löst die Translokation vom Zytoplasma und Insertion in die äussere Mitochondrienmembran aus. (2) Dies führt als ein sehr frühes Ereignis zur Öffnung von Kanälen und Freisetzung von ATP und Cytochrom c. (3) Die Atmungskette als Energielieferant bleibt aktiv. (4) Erst später kommt es durch den Einstrom zytosolischer Ionen und H2O zum Zusammenbrechen des mitochondrialen Membranpotentials (Verlust vonm), der mitochondrialen Permeabilitäts-Transition, mit Anschwellen der Mitochondrien und Platzen der äusseren und später auch der inneren Membran und letzlich (5) dem Zusammenbrechen der Atmungskette [148,163]. Es ist nach wie vor nicht völlig geklärt, wie diese Kanäle gebildet werden. Sowohl für Bcl-2 als auch Bax konnte gezeigt werden, dass diese Proteine nicht nur über die BH-Domänen (Bcl-2 Homologie) dimerisieren, sondern auch oligomerisieren können, um selbst Kanäle zu bilden [164]. Neben dieser Kanalbildung regulieren Bcl-2 und Bax aber auch spannungsabhängige mitochondriale Kanäle [165], die in der äusseren Membran durch das VDAC-Protein (Voltage Dependent Anion Channel) [166] und in der inneren Membran durch das ANT-Protein (Adenin-Nukleotid Transporter) gebildet werden [167]. Die Aktivität dieser Kanäle kann durch den peripheren Benzodiazepin-Rezeptor, der auch in der äusseren mitochondrialen Membran lokalisiert ist, moduliert werden.

Das nun zytosolische Cytochrom c bindet an APAF-1, und zwar an dessen WD40-Domäne [168]. Gemeinsam mit der Bindung von ATP bzw. dATP an die CED4-Homologiedomäne von APAF-1 wird hierdurch eine Konformationsänderung in APAF-1 ausgelöst, wodurch die CARD-Domäne (Caspase-Rekrutierungs-Domäne) exponiert wird. Dies ermöglicht die Bindung der Procaspase-9 an die APAF-1 CARD-Domäne. Die WD40-Domäne vermittelt auch die Dimerisierung von APAF-1 [169], wodurch mindestens 2 Procaspase-9 Proteine in engen räumlichen Kontakt gelangen und sich autokatalytisch zum biologisch aktiven Caspase-9 Heterotetramer spalten [170]. Neuere Daten lassen vermuten, dass dieses mitochondriale Apoptosom durch weitere CARD-enthaltende Proteine zu grossen multimeren Proteinkomplexen assoziiert. Dies erleichtert die Aktivierung der Initiator-Caspase. Die aktive Caspase-9 kann durch limitierte Proteolyse die Effektor-Caspasen-3, -6 und –7 aktivieren und hierdurch die Exekution der Apoptose einleiten [150].

Neben Cytochrom c werden noch weitere Proteine aus den apoptotischen Mitochondrien freigesetzt, unter anderem (1) AIF (Apoptosis Inducing Factor), der hohe Homologie zu bakteriellen Flavoproteinen aufweist, in den Zellkern transloziert und dort eine Caspase-unabhängige DNA-Fragmentierung in hochmolekulare Fragmente auslöst [171]. Die Morphologie des AIF-induzierten Zelltods ähnelt mehr der Nekrose. Der Beitrag dieses Faktors zum apoptotischen Zelltod ist allerdings nach wie vor nicht völlig geklärt. (2) SMAC (second mitochondrial activator of caspases) [172], das die Aktivität der anti-apoptotischen IAPs (s.u.) hemmt und hierdurch die Exekution der Apoptose verstärkt und (3) Hsp10, das anti-apoptotische Funktion hat und die Aktivierung der Procaspase-9 hemmen kann [173].

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Die Apoptose-hemmende Wirkung von Bcl-2 ist Gegenstand aktueller Diskussionen. Bis vor kurzem wurde die hemmende Wirkung von Bcl-2 im Apoptosom lokalisiert. Grundlage hierfür war, dass eine direkte Bindung von Bcl-xL über dessen Bcl-2-Homologie-Domäne Nr. 4 (BH4) an Ced-4, das C. elegans Homolog von APAF-1 demonstriert wurde [169]. Diese Interaktion ist jedoch physikalisch sehr schwach und mittlerweile konnte durch zellbiologische Untersuchungen gezeigt werden, dass Bcl-2 die Apoptose-fördernde Wirkung von APAF-1 nicht zu blockieren vermag. Als wahrscheinlichstes Modell wird daher zur Zeit favorisiert, dass Bcl-2, Bcl-xL und deren funktionelle Apoptose-hemmenden Homologen die Wirkung der Apoptose-Promotoren Bax, Bak und Bok inhibieren. Dieser Effekt wird über die physische Interaktion über die Bcl-2 Homologie-Domänen BH1, BH2, vor allem aber auch über die BH3 Domäne vermittelt. APAF-1 hingegen wirkt nachgeschaltet und übt seine Caspase-aktivierende Funktion erst nach Freisetzung des Cytochrom c aus.

Die Unterfamilie der BH3-only Proteine der Bcl-2 Genfamilie, die nur eine BH3, aber keine BH1, BH2, oder BH4 Domäne enthalten, reguliert den Vorgang der Aktivierung des mitochondrialen Signalwegs, indem sie Apoptose-hemmende Proteine wie Bcl-xL und Bcl-2 aus der Bindung an Bax verdrängen können und hierdurch Bax (oder auch Bak) aktivieren. Solche Wirkungen wurden mittlerweile für Bad, Bim und Bid gezeigt. Diese BH3-only Proteine agieren wahrscheinlich als Bindeglieder zwischen spezifischen Signalkaskaden und der mitochondrialen Apoptose-Signalkaskade.

Abb. 10:Aktivierung des mitochondrialen und des Death-Rezeptor-vermittelten Apoptose-Signalwegs.

A. Aktivierung von Death-Rezeptoren führt zur Bildung eines DISC. Im Fall des CD95/Fas Rezeptors führt die Bindung des trimeren Fas Liganden an ein Rezeptor-Trimer zur DISC-Bildung: das FADD Adapterprotein wird über die Death-Domänen in CD95 und FADD rekrutiert. Dies stimuliert die Bindung von Pro-Caspase-8 (C8) über die Death-Effektor Domäne (DED) in pro-C8, wodurch die Aktivierung von pro-C8 zur aktiven C8 induziert wird.
B. Der mitochondriale Apoptose-Signalweg kann über die Aktivierung von p53, z.B. nach DNA-Schädigung, aktiviert werden. Über Bax wird die Freisetzung von Cytochrom c induziert. Dies führt zur Aktivierung des APAF-1 Adapterproteins, wodurch die Rekrutierung von pro-C9 in den Komplex ausgelöst wird. Pro-C9 wird autokatalytisch aktiviert und die Effektor-Caspase-Signalkaskade aktiviert.
DD: Death Domäne, DED: Death Effektor-Domäne, DISC: Death-Inducing Signaling Complex, FADD: Fas-assoziierte Death Domäne.


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08.03.2005