3. Patienten und Methoden

3.1 Patienten

↓35

Durchgeführt wurde eine retrospektive Untersuchung von 53 Patienten mit einem Plattenepithelkarzinom des Ösophagus. Der Tumor wurde mit kurativer Intention vollständig im Gesunden reseziert ohne histopathologischen Nachweis von Tumorresten am Schnittrand, d.h. es erfolgte eine R0-Resektion. Alle Patienten wurden an der Universitätsklinik Frankfurt in der Abteilung Abdominal- und Gefäßchirurgie operiert.

Tab. 5:Klinisch-pathologische Charakteristika der Patienten und ihrer Tumore (n=53)*

Geschlecht

Männer/Frauen
(Anzahl der Patienten)

40/13

Alter (Jahre)

Median
Range

54.9
39.6-70.2

T-Stadium

T1
T2
T3
T4

5 (9.4%)
15 (28.3%)
29 (54.7%)
4 (7.5%)

Lymphknotenbefall

Nodal negativ
Nodal positiv

27 (50.9%)
26 (49.1%)

Grading

G1
G2
G3
G4

5 (9.4%)
38 (71.7%)
9 (17%)
1 (1.9%)

Stadium

I
IIa
IIb
III
IV

3 (5.7%)
22 (41.5%)
8 (15.1%)
20 (37.7%)
0

Ösophagektomie

Transösophageal
transhiatal

33 (62.3%)
20 (37.7%)

Zusätzliche Therapie**

Ja
Nein

15 (28.3%)
38 (71.7%)

↓36

Das Geschlechterverhältnis Männer zu Frauen betrug 40 zu 13. Das mediane Alter bei Erstdiagnose betrug 54,9 Jahre (Range 39,6-70,2). Die Operationen erfolgten zwischen 1985 und 1995. Keiner der Patienten hatte bei Erstdiagnose Fernmetastasen. Insgesamt wurden im Zeitraum von 1985 bis 1995 63 Patienten mit einem Plattenepithelkarzinom den Ösophagus behandelt und R0-reseziert. In Paraffin eingebettetes Tumormaterial konnte von 53 Patienten gesammelt werden. Bei den übrigen 10 Patienten, von denen kein Tumormaterial verfügbar war, handelte es sich um 9 Männer und eine Frau, medianes Alter 46 Jahre (Range 42-75), die zwischen 1987 und 1991 operiert wurden.

Stadium und weitere charakteristische Punkte sind in der Tabelle 5 aufgeführt. Bei den meisten Patienten wurde eine transthorakale Ösophagektomie durchgeführt (33/53), alternativ wurde bei 20 Patienten eine transhiatale Ösophagektomie durchgeführt. Bei 49 Patienten wurde ein Magenkonduit eingesetzt, um die gastrointestinale Kontinuität zu gewährleisten. Die verbleibenden 4 Patienten erhielten ein Konduit mit Kolon bzw. Dünndarm. Insgesamt wurden 15 Patienten adjuvant, d.h. postoperativ, mit einer alleinigen Strahlentherapie oder einer kombinierten Radiochemotherapie behandelt.

3.2 Immunhistochemie

Proteinexpression wurde mit Hilfe der Immunhistochemie nachgewiesen. Hierzu wurden 4 µm dünne Schnitte von formalinfixiertem, in Paraffin eingebettetem Tumormaterial angefertigt und diese auf Objektträger aufgezogen. Hierzu wurden die Paraffinblöcke auf –10°C gekühlt. Zur Entparaffinierung wurden die Präparate in Färbekörbe eingesetzt, mindestens 20 Minuten in Xylol und anschließend in einer absteigenden Alkohol-Konzentrationsreihe (96%, 80%, 70%, 50% für jeweils 3-4 Minuten) gewaschen, um das Xylol und das darin gelöste Paraffin zu entfernen. Danach wurde in Aqua bidest. rehydriert und nachfolgend in TBS (Tris-buffered saline)-Puffer der pH-Wert äquilibriert. Zur Antigen-Demaskierung wurden die Proben im Schnellkochtopf mit Citratpuffer (bei pH 6,0) für ca. 5 Minuten gekocht, zum Abkühlen dann ins Wasserbad gestellt.

↓37

Anschließend wurden die Schnitte für 10 Minuten in 3%ige H2O2 Lösung getaucht, um die endogene Gewebsperoxidase in den Schnitten zu inaktivieren. Danach wurden die Objektträger erneut in Aqua bidest. und TBS Puffer für 10 Minuten gewaschen, um das H2O2 zu entfernen und den pH-Wert erneut zu äquilibrieren. Die Flüssigkeit wurde vorsichtig abgetropft und die Objekträger auf Filterpapier geblottet. Die Schnitte wurden danach aus den Färbe-Körben entnommen und nebeneinander auf eine Platte gelegt. Mit einen Fettstift (DAKO Pen) wurden die Schnitte umfahren, damit die folgenden Lösungen sich nur auf dem Präperat verteilen (hydrophobe Abgrenzung) und nicht auf dem gesamten Objektträger. Zur Blockierung unspezifischer Bindungsstellen wurden 2-3 Tropfen unverdünntes Sea-Block Reagenz (Pierce) auf die Schnitte getropft und 10 Minuten inkubiert und anschließend dekantiert.

Die Primärantikörper gegen die jeweiligen Zellzyklus- und Apoptoseregulatoren wurden in TBS verdünnt (Verdünnung siehe Angaben für den jeweiligen Antikörper, Tab. 6). Jeder Schnitt wurde mit 200 µl Lösung überschichtet und für eine Stunde bei Raumtemperatur in einer feuchter Kammer inkubiert. Danach wurde mit TBS Puffer gewaschen und der jeweilige sekundäre Antikörper (Ziege-anti-Maus bzw. Ziege-anti-Kaninchen, beide von Jackson Immuno Research) in der Verdünnung 1:500 dazugegeben und für 30 Minuten bei Raumtemperatur inkubiert. Als Negativkontrolle wurde bei Kontrollpräparaten nur der sekundäre Antikörper eingesetzt bzw. unspezifische, nicht-bindende Antikörper der jeweiligen Spezies verwandt. Danach wurde erneut dreimal mit TBS gewaschen. Zur Detektion der gebundenen Antikörper wurde anschliessend mit Streptavidin-Peroxidase-Konjugat (Dianova, 1:250 in TBS verdünnt) für weitere 30 Minuten inkubiert. Nach Waschen mit TBS wurde zur immunchemischen Färbung des gebundenen Peroxidase-Komplexes Diaminobenzidin (Pierce; DAB/Metalloclone) 1:10 verdünnt in Stable Peroxidase Substrat Puffer (Pierce) hinzugeben. Die Färbereaktion wurde für 5-10 Minuten inkubiert und anschliessend mit Aqua bidest. gestoppt. Alle Schnitte wurden mit Hämatoxylin nach Mayer gegengefärbt. Zur Dehydrierung wurden danach die Präperate in einer aufsteigenden Alkoholkonzentrationsreihe (50%, 70%, 80%, 96%, reiner Alkohol) für 3-5 Minuten eingetaucht. Danach wurden die Objektträger in Xylol getaucht und anschliessend mit Objektgläsern (ClariOn, Natutek) eingedeckt.

Die Auswertung der Färbungen erfolgte lichtmikroskopisch. Die Analysen wurden von 2 unabhängigen Beobachtern ohne Wissen der klinisch-pathologischen Daten durchgeführt. Diese Auswertungen zeigten eine hohe Interbeobachter-Korrelation (Pearson´s Korrelationskoeffizient: 0.926, Fisher´s r zu z Transformation: p<0.0001). Diskordante Fälle wurden gemeinsam durch beide Beobachter nachbegutachtet um Konsens zu erzielen.

↓38

Tab. 6:In der Immunhistochemie eingesetzte Antikörper

Antigen

Klon

Spezies

Isotyp

Klonalität

Hersteller

Verdünnung

Rb

G3-245

Maus

IgG

monoklonal

Pharmingen

1:500

p53

DO-7

Maus

IgG

monoklonal

Dako

1:75

p16

G124-405

Maus

IgG

monoklonal

Pharmingen

1:150

p21

6B6

Maus

IgG

monoklonal

Pharmingen

1:75

p27

G173-524

Maus

IgG

monoklonal

Pharmingen

1:100

Cyclin D1

G124-326

Maus

IgG

monoklonal

Pharmingen

1:75

Cyclin E

HE12

Maus

IgG1

monoklonal

Pharmingen

1:75

Bax

Ab-1

Kaninchen

IgG

polyklonal

Oncogene

Research

1:50

Bcl-2

124

Maus

IgG

monoklonal

Dako

1:200

Ki-67

MIB-1

Maus

IgG

monoklonal

Dianova

1:200

Vier hochvergrösserte (400x) Gesichtsfelder wurden ausgewertet bezüglich der Prozentzahl positiv gefärbter Zellen (0-100% in 5% Schritten für Bax und p53, in 10% Schritten für die übrigen Proteine und der Färbe-Intensität (0 bis +++). Für die folgenden Auswertungen wurden die positiven Zellen in Prozent und auch das Produkt aus der Intensität und Prozentzahl gefärbter Zellen (Färbeindex) berücksichtigt. Die Ergebnisse beider Methoden wurden miteinander verglichen.

Der Prozentsatz positiver Zellen korrelierte gut mit dem Färbeindex: Die Korrelationskoeffizienten nach Pearson (r) und die Signifikanzniveaus (p Werte berechnet durch Fisher´s r zu z Transformation) betragen: für p16INK4a: r=0.901, p<0.0001, für Cyclin D1: r=0.811, p<0.0001 und für Bax: r=0.934, p<0.0001. Aus Gründen der Vereinfachung und klareren Darstelung der Daten werden daher für alle Darstellungen nur die Prozentwerte positiv angefärbeter Zellen dargestellt.

3.3 Extraktion genomischer DNA aus Tumorproben

↓39

Genomische DNA wurde aus den Formalin-fixierten, Paraffin-eingebetteten Tumorproben gewonnen. Hierzu wurden 30 µM dicke Schnitte angefertigt. Die Schnitte wurden anschliessend in N-Oktan deparaffiniert und anschliessend rehydriert. Hiernach wurde die DNA mit Hilfe des Invisorb Spin Tissue Kits (Invitek) extrahiert. Hierzu wurden die Proben über Säulen aus hochdispersen Silikatpartikeln gegeben, die eine effiziente Adsorption der genomischen DNA Fragmente gewährleisten. Zur Lagerung wurde die DNA in 10 mM Tris HCl/0.1 mM EDTA Puffer (pH 8.7) eluiert und bei –20 oC weggefroren.

3.4 p53 Mutationsanalyse

Zur p53-Mutationsanalyse wurden die Exons 5 bis 8 des p53 Gens aus genomischer DNA mittels Polymerasekettenreaktion (PCR) amplifiziert. DNA aus Formalin-fixiertem Gewebe ist stark degradiert. Dies gestattet zuverlässig nur die Amplifikation kurzer DNA Fragmente von maximal ca. 200 Basenpaaren Länge. Aus diesem Grund wurde das Exon 5 in 2 PCR Reaktionen amplifiziert (Exon 5a und 5b). Hierzu wurden die in Tabelle 7 gezeigten Primerpaare eingesetzt.

Für die PCR-Reaktion wurden zuvor beschriebene Standardprotokolle eingesetzt [137,174] unter Verwendung der Taq Polymerase (Invitek). Die Amplifikation erfolgte mittels eines Thermocyclers der Fa. Applied Biosystems (Modell 2400) unter folgenden Bedingungen für Exon 5a: Denaturierung bei 94°C für 5 min. gefolgt von 35 Zyklen bei 94 °C für 30 s, 55 °C für 20 s, 72 °C for 15 s; Exon 5b: 94 °C for 5 min. gefolgt von 35 Zyklen bei 94°C for 30 s, 65°C für 20 s min , 72 °C für 15 s; Exon 6: 94°C für 5 min. gefolgt von 35 Zyklen bei 94°C for 30 s, 60°C für 20 s min , 72°C für 15 s; Exon 7: 94°C for 5 min. gefolgt von 35 Zyklen bei 94°C for 30 s, 58°C für 20 s min , 72°C für 20 s; Exon 8: 94°C for 5 min. gefolgt von 35 Zyklen bei 94°C for 30 s, 60°C für 20 s min , 72°C für 15 s.

↓40

Sequenzaberrationen in den PCR-Amplifikaten wurden mittels SSCP-PCR (single stranded conformational polymorphism PCR) nachgewiesen [175]. Hierzu wurden 5 µl des PCR Amplifikats in 7 µl Ladepuffer (82% Formamid, 10 mM NaOH, 50 mM EDTA, Bromphenolblau und Xylenxyanol (Merck)) gemischt und bei 95 oC für 5 Minuten denaturiert um die Trennung in DNA Einzelstränge zu erreichen. Anschliessend wurden die Proben auf Eis gestellt, um Sie herunterzukühlen und sequenzspezifische Renaturierung der Einzelstränge zu erreichen. Diese denatuerierten Fragmente wurden dann in 10%-igen, nicht-denaturierenden Polyacrylamidgelen (Merck) bei 500V Spannung und 50 mA Stromstärke für 2 Stunden bei 10 oC in einer Multiphor-Elektrophoresekammer (Pharmacia) aufgetrennt. Die separierten DNA Fragmente wurden wie beschrieben in den Gelen mittels Silberfärbung dargestellt. Nach Trocknung der Gele erfolgte die optische manuelle Auswertung und Suche nach aberranten Bandenmustern.

Tab. 7:Für die p53-Mutationsanalyse eingesetzte Primer

Exon

Primer

Codon

Basenpaare

Exon 5a

Vorwärts: CCA GTT GCT TTA TCT GTT CA
Rückwärts: TGT GGA ATC AAC CCA CAG

126 - 150

139

Exon 5b

Vorwärts: CAA CTG GCC AAG ACC TGC
Rückwärts: AAC CAG CCC TGT CGT CTC T

134 - 186

191

Exon 6

Vorwärts: CTC TGA TTC CTC ACT GAT TGC
Rückwärts: GAG ACC CCA GTT GCA AAC CA

187 - 224

163

Exon 7

Vorwärts: TTG CCA CAG GTC TCC CCA A
Rückwärts: AGG GTG GCA AGT GGC TCC

225 - 261

190

Exon 8

Vorwärts: CCT TAC TGC CTC TTG CTT C
Rückwärts: CGC TTC TTG TCC TGC TTG C

262 - 306

199

3.5 K-ras Mutationsanalyse

Punktmutationen des Codons 12 des Protoonkogens K-ras wurden mit Hilfe eines sequenzspezifischen Festphasen-Hybridisierungstests (Invitek) zur spezifischen Detektion mutierter Allele in Mikrotiterplatten durchgeführt. Hierzu wurde genomische DNA in einer ersten PCR mit Hilfe der folgenden Primer (Biotez) amplifiziert:

↓41

Vorwärts-Primer:5‘ AAC-TTG-TGG-TAG-TTG-GAG-CT-3‘

Rückwärts-Primer:5‘-GTT-GGA-TCA-TAT-TCG-TCC-AC-3‘

Zur Anreicherung von mutierten K-ras Sequenzen wurde wie beschrieben eine enzymatische Spaltung der Wildtyp-K-ras Amplifikate durchgeführt [176,177] Wildtyp K-ras enthält eine BstNI Restriktionsschnittstelle die durch Punktmutation des Codons 12 zerstört wird. Durch diesen Anreicherungsschritt wird eine Empfindlichkeitssteigerung der Detektion von mutiertem K-ras um zwei Zehnerpotenzen erreicht. Gleichzeitig wird der Anteil von Wildtyp K-ras im Hybridisierungsansatz (s.u.) erreicht und der Hintergrund unspezifischer Hybridisierungen drastisch vermindert.

↓42

Nach dieser initialen genomischen PCR und BstNI-Verdau wurde das resultierende PCR-Produkt in einer zweiten PCR weiteramplifiziert mit Hilfe des gleichen Vorwärts- und eines sequenzidentischen, aber biotinylierten Rückwärts-Primers.

Die PCR-Amplifikate wurden anschliessend 1:100 verdünnt und 50 µl wurden in Löcher einer Streptavidin-beschichteten 96-Loch Mikrotiterplatte pipettiert (Hoffmann-LaRoche/Boehringer Mannheim) und 30 Minuten bei Raumtemperatur inkubiert, um die Anhaftung der biotinylierten PCR-Ampliikate an die Festphase der Platte zu erlauben. Anschliessend wurde 0.2 M NaOH (Merck) zugegeben, um die Amplifikate in Einzelstränge zu denaturieren. Nach 15 Minuten Inkubation wurde 3-mal mit 1 x PBS/0.1% Tween-20 gewaschen, um ungebundene DNA zu entfernen und den pH-Wert zu äquilibrieren. Die einzelsträngigen, an die Festphase gebundenen Amplifikate wurden anschliessend mit 3 pmol 5‘-Digoxygenin-markierter Proben inkubiert, die aus entsprechenden Sequenzabschnitten des K-ras Codons 12 bestehen, und zwar für Wildtyp des Codon 12 kodierend für Glycin (GGT) oder mutiertes Codon 12: Alanin (GCT), Arginin (CGT), Aspartat (GAT), Cystein (TGT), Serin (AGT) bzw. Valin (GTT). Anschliessend wurden die Platten gewaschen und mit Peroxidase-markiertem Anti-Digoxigenin-Antikörper (Hoffmann-LaRoche/Boehringer Mannheim) inkubiert, erneut gewaschen und dann das chromogene Substrat BMT hinzugegeben. Nach Abstoppen der Farbreaktion mit Schwefelsäure wurde das Hybridisierungsergebnis mit Hilfe eines Plattenphotometers analysiert [176,178].

Als Positivkontrolle wurde genomische DNA der Kolonkarzinomzellinie SW480 und als Negativkontrolle genomische DNA aus peripheren Blutleukozyten gesunder Spender eingesetzt.

3.6 Statistische Auswertung

↓43

Das Gesamtüberleben wurde mit Hilfe der Kaplan-Meier Produktlimit-Methode geschätzt ab Zeitpunkt der Operation. Der Vergleich der Überlebenskurven erfolgte mittels des Log-Rang Mantel-Cox Tests. Uni- und multivariate Analysen wurden mittels des Cox-Proportionalen Risiko-Modells berechnet. Die Mehrzahl der Parameter wurde als dichotomisierte (kategoriale) Variablen eingesetzt. Verglichen wurde T-Stadium T3 und T4 versus T1 und T2, N-Stadium N1 versus N0, UICC Stadium I und II versus III (Stadium IV war aufgrund der Tatsache, dass nur Patienten ohne Fernmetastasen und lokal wenig fortgeschrittenen Tumoren mit kurativer Chance eingeschlossen waren, nicht im Studienkollektiv vertreten), Grading G1 und G2 versus G3, Alter über versus Alter kleiner gleich Median, zusätzliche adjuvante Bestrahlung bzw. Radiochemotherapie ja versus nein, Geschlecht: männlich versus weiblich, Art der Operationstechnik: transthorakal versus transhiatal, p53 Mutation oder K-ras Mutation ja versus nein.

Aufgrund einer früheren Arbeit in kolorektalen Karzinomen [137] wurden die Expressionsdaten für das p53 und Bax Protein in der immunhistochemischen Analyse folgendermassen definiert: ≥20% gefärbte Tumorzellen wurde als “hohe Expression” oder “positiv”, <20% gefärbte Tumorzellen wurde als “niedrige Expression”, oder ”negativ” gewertet.

Für p16INK4a, fanden wir in einer früheren Studie einen Grenzwert von 70% (<70% gefärbte Tumorzellen wurde als “niedrige Expression”, ≥ 70% als “hohe Expression” eingestuft. Ein vergleichbarer Grenzwert wurde unabhängig von einer anderen Gruppe definiert [179]. Im Fall von Rb wurde in Anlehnung an p53 und Bax ebenfalls ein Grenzwert von 20% gesetzt und Tumore mit ≥20% angefärbter Tumorzellen wurden als “Rb-positiv” eingestuft. Im Hinblick auf die geringe Zahl für p21CIP/WAF-1 und Bcl-2 anfärbbarer Zellen wurde zwischen fehlender Expression (p21CIP/WAF-1 oder Bcl-2 negativ) versus >0% positive Zellen kategorisiert. Cyclin D1 Überexpression wurde als Cyclin D1 expression in >60% derTumorzellen definiert. Dieser Grenzwert wurde aufgrund einer „Kerbe“ in der Häufigkeitsverteilung der Tumorzellen mit nukleärer Cyclin D1 Expression definiert als Hinweis auf das Vorhandensein einer distinkten Population von Tumoren mit höherem Cyclin D1 Expressionsniveau. Nukleäre Cyclin E und p27 Expression wurden aufgrund einer solchen 2-gipfligen Verteilung, die zudem mit dem Median koinzidierte, am Median dichotomisiert (≤ 5 % positive Zellen für p27 und ≤ 30 % positive Zellen Cyclin Eversus grösser Median).

↓44

Um Patientengruppen in „intakt“ bzw. „defizient“ zu dichotomisieren wurde die Interaktionsvariable eingesetzt. Die Interaktionsvariable ist definiert als Multiplikationsprodukt kategorialer Variablen, wobei „intakte“ Genotypen als „1“ gesetzt wurden, „defiziente“ hingegen als „0“. Hierdurch wurden alle Patienten bei denen alle untersuchten Parameter „intakt“ waren durch den Wert „1“ der Interaktionsvariablen definiert und kategorisiert. Für alle anderen Patienten (mit einem oder mehreren Defekten der in der Analyse enthaltenen Parameter) wurde hingegen ein Wert „0“ der Interaktionsvariable errechnet.

Univariate Analysen bezüglich des Gesamtüberlebens wurden mittels Berechnung des Proportionalen Risiko-Modells für jeden Parameter einzeln durchgeführt. Für den Vergleich von Variablen untereinander wurden, je nach Fall, der Mann-Whitney U-Test für nicht normalverteilte kontinuierliche Variablen bzw. für kategoriale Variablen der 2-Test oder Fisher´s exakter F-Test eingesetzt. Für die multivariate Regressionsanalyse wurde das Proportionale Risiko-Modell nach Cox sowohl vor- als auch rückwärts entwickelt zur schrittweisen Selektion bzw. Elimination kategorialer Variablen basierend auf Veränderungen der Wahrscheinlichkeitsinteraktion zwischen den verschiedenen Parametern.

Sämtliche statistische Analysen wurden mittels des Statview 5 Softwarepakets der Firma SAS für Apple Macintosh Rechner durchgeführt.


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08.03.2005