4. Ergebnisse

4.1 Nachbeobachtung

↓45

Analysiert wurden 53 Patienten mit Plattenepithelkarzinom des Ösophagus, bei denen in kurativer Absicht eine R0-Resektion durchgeführt wurde. Die Daten bezüglich Alter, Geschlecht, Stadium, Grading, Art der Operation und evtl. nachfolgender adjuvanter Radio- bzw. Radiochemotherapie sind in Tabelle 5 dargestellt. Am Ende der Nachbeobachtungszeit waren noch 9 von 53 Patienten (17%) am Leben. Das mediane Follow-up nach Ösophagektomie für diese 9 zensierten Patienten betrug 48 Monate (Range 24-144 Monate) Das mediane Gesamtüberleben bezogen auf das gesamte Kollektiv lag bei 13,7 Monaten. Nach Korrektur für die 30-Tage-perioperative Mortalitätsrate betrug die 1-, 2-, und 5-Jahres-Überlebensrate 52%, 24% beziehungsweise 17%.

4.2 Analyse des Rb-Signalwegs

Die immunhistochemisch bestimmten Daten zur Proteinexpression sind in Abbildung 11 dargestellt. Gezeigt ist (1) der Prozentsatz angefärbter Tumorzellen im Gewebsschnitt (Abb. 11A) und (2) der Färbeindex (FI, Abb. 11B), der durch Multiplikation der Prozentzahl angefärbter Zellen mit der Färbeintensität (negativ, einfach bis dreifach positiv) errechnet wurde [180]. Expressionsdaten konnten für alle 53 Patienten für p16, p21, p53, Bax, für Rb und Cyclin D1 in 52 und für Bcl-2 in 51 Tumorproben erhoben werden.

Die immunhistochemische Analyse des Rb-Proteins im Karzinomgewebe zeigte eine breite Variabilität der Expression mit einer vorwiegend nukleären Färbung. Der Median der nukleären Rb-Expression lag bei 52.2% positiver Zellen (Interquartil-Range 47.5%) und 110 für den FI (arbiträre Einheit, Interquartil-Range 165). Der Prozentsatz positiver Zellen und der FI zeigten eine ähnliche Verteilung. Dies weist darauf hin, dass Rb-positive Zellen insgesamt ein hohes Expressionsniveau aufweisen. Sieben der Tumore zeigten Rb Expression unter 20% positive Zellen und wurden als Rb-negativ kategorisiert.

↓46

Die nukleäre Cyclin D1 Expression zeigte einen Median von 30% positiver Zellen (Interquartil-Range 35%) mit einem Median des FI von 30 (Interquartil-Range von 62.5, Abb. 11). Dies weist auf eine möglicherweise niedrigere Expression im Vergleich zu Rb hin. Dreiundvierzig Tumore zeigten Cyclin D1 Expression unter 60% Cyclin D1-positiver Zellen und wurden als niedrig exprimierend eingestuft. Die restlichen 9 Tumore wurden als Cyclin D1 überexprimierend klassifiziert.

Abb. 11:Expressionsniveau von Komponenten des Rb-Signalwegs, Bax und Bcl-2, analysiert mittels Immunhistochemie

Gezeigt sind Box-Grafiken für (A) den Prozentsatz positiver Zellen bzw. (B) den Färbeindex (FI).

Nukleäre p16INK4 Expression zeigte einen medianen Prozentsatz angefärbter Tumorzellen von 35.0% (Interquartil-Range von 62.5%) mit einem medianen FI von 75.0 (Interquartil-Range 150.0). Sechsunddreissig Tumore zeigten weniger als 70% p16-exprimierende Zellen und wurden als p16-niedrig exprimierend kategorisiert.

↓47

Abbildung 12 zeigt eine repräsentative immunhistochemische Färbung für Expression des CDK Inhibitors p16INK4a. Diese Abbildung zeigt als Nebenbefund gesundes nicht-verhornendes Plattenepithel der Ösophagusschleimhaut, das durch den Tumor unterwandert und interstitiell infiltriert wurde und eine deutlich geringere p16 Färbung aufweist.

Abb. 12: Plattenepithelkarzinom des Ösophagus

Normale Ösophagusschleimhaut (oberer Bildrand) wird durch Plattenepithelkarzinomzellen unterwandert. Angefärbt wurde p16INK4a das ein vorwiegend nukleäres Expressionsmuster zeigt.

Die Immunhistochemie für p21CIP/WAF-1 zeigte eine generell niedrige Expression im Vergleich zu den anderen Zellzyklusregulatoren. Der mediane Prozentsatz der nukleären p21 Expression lag bei 10.0% (Interquartil-Range 49%) und für den medianen FI bei 15 (Interquartil-Range 103.0). Neun Tumore zeigten keinerlei p21 Expression und wurden als p21-negativ klassifiziert.

↓48

Der mediane Prozentsatz für nukleäre Überexpression von p53 lag bei 50% (Interquartil-Range 75.0%) mit einem medianen FI von 140.0 (Interquartil-Range 200.0). Zehn der 53 Ösophaguskarzinome zeigten keinerlei p53 Expression, 4 der 53 Tumore zeigten weniger als 20% p53-exprimierende Zellen. Diese insgesamt 14 Tumore wurden als p53-negativ definiert.

Der mediane Prozentsatz Bax exprimierender Tumore betrug 30% (Interquartil-Range 75%) mit einem medianen FI von 50 (Interquartil-Range 140.0). Zehn der 53 Tumore zeigten keinerlei Bax Expression und 11 Tumore zeigten Bax Expression in weniger als 20% der Tumorzellen. Diese 21 Tumore wurden als Bax-negativ klassifiziert.

Im Fall von Bcl-2 zeigte sich eine generell niedrige Expression. Demzufolge wurde der Median der Bcl-2 Expression bei 0% positiver Zellen bzw. einem FI von 0 bestimmt. Der Mittelwert des Prozentsatzes positiver Zellen betrug 10.3%. Achtundzwanzig der 51 messbaren Tumore zeigten keinerlei Bcl-2 Expression und die verbleibenden 23 Tumore wurden als Bcl-2 positiv kategorisiert.

4.3 Mutationsanalyse von p53 und Bax in Relation zu Protein-Expressionsprofilen

↓49

Die p53 Muationsanalyse wurde nach Extraktion der genomischen DNA aus dem Paraffin-eingebetteten Gewebe mittels SSCP-PCR für die Exons 5 bis 8, also die DNA-Bindungsdomäne, durchgeführt. In diesem Bereich sind mindestens 95% der p53-Mutationen lokalisiert. In 12 der 53 Tumore wurden insgesamt 21 Mutationen nachgewiesen: eine in Exon 5, zwei in Exon 6, 5 in Exon 7 und 13 in Exon 8.

Im Hinblick auf frühere Berichte, dass p53 Mutation mit Überexpresion des p53 Proteins korrelieren soll, wurden p53 Mutationsstatus und Expression des p53 Proteins korreliert. In Übereinstimmung mit früheren Berichten [137,180,181,182] wurde allerdings kein Zusammenhang zwischen p53 Mutation und Expressionsniveau des p53 Proteins gefunden (Abb. 13). Das Expressionsniveau von p53 war geringfügig, aber nicht signifikant, in p53 mutierten Tumoren erhöht (Mann-Whitney U-Test, p = 0.195).

P53 ist ein transkriptioneller Aktivator des Bax-Gens. Zu klären war daher, ob die Inaktivierung von p53 durch Mutation mit dem Bax-Expressionsverlust korreliert. Überraschenderweise war das Expressionsniveau von Bax in den p53 mutierten Tumoren nicht vermindert (p = 0.633). Dies lässt vermuten, dass p53 nicht der entscheidende Aktivator des Bax-Gens ist und dass noch weitere, wichtigere Faktoren das Bax Gen regulieren.

↓50

Abb. 13:Expressiosspiegel der untersuchten Gene in Relation zum p53 Mutationsstatus

Die Box-Grafiken zeigen den Prozentsatz positiver Zellen. Schwarze Boxen: p53-mutierte Tumore; graue Boxen: p53 Wildtyp-Tumore.

Eine weitere mögliche Ursache für den Expressionsverlust von Bax wurden in einer früheren Untersuchung Framehift-Mutationen des G8-Trakts im Exon 3 des Bax Gens bestimmt. Durch Verrutschen des Leserasters werden durch solche Mutationen prämature Stopcodons eingefügt, so dass es zur Produktion trunkierter, nicht funktionsfähiger und auch nicht mittels der verwendeten Antikörper nachweisbarer Bax-Proteine und somit zum Expressionsverlust von Bax kommt. Im Gegensatz zu kolorektalen [137] und Magenkarzinomen [183] fanden sich keine Bax Frameshift-Mutationen, so dass dieser Mechanismus als kausales Prinzip für den Verlust der Bax-Expression bei Ösophagus-Plattenepithelkarzinomen ausgeschlossen werden kann.

In Analogie zu Bax waren die Proteinspiegel des p21CIP/WAF-1 Proteins in den p53 mutierten Tumoren nur grenzwertig vermindert (Mann-Whitney U-Test, p = 0.334). Dies lässt vermuten, dass weitere Regulatoren an der Aktivierung der Expression des p53-Zielgens p21 beteiligt sind.

↓51

In früheren Untersuchungen wurde zudem p53 als direkter bzw. indirekter transkriptioneller Repressor des bcl-2 Gens beschrieben. Somit wäre in den p53 mutierten Tumoren eine erhöhte Bcl-2 Proteinexpression zu erwarten. Im Gegensatz hierzu wurde in der vorliegenden Untersuchung ein leicht vermindertes Expressionsniveau des Bcl-2 Proteins in den p53-mutierten Tumoren beobachtet, das jedoch nicht signifikant erniedrigt war (p = 0.068).

Insgesamt konnte somit für kein einziges der untersuchten Gene ein signifikant vermindertes oder erhöhtes Proteinexpressionsniveau in Abhängigkeit des p53 Mutationsstatus beobachtet werden.

4.4 Korrelation von Expressionsprofilen mit klinischen und pathologischen Parametern

Im nächsten Schritt wurde die Beziehung von klinischen und pathologischen Parametern mit p53 Mutation und Expressionsprofilen der immunhistochemisch untersuchten Gene analysiert. Die Expressionsspiegel von Rb, Cyclin D1, p16, p21, p53, Bax und Bcl-2 wurden hierbei als kontinuierliche Variablen mit den dichotomisiert kategorisierten Variablen für Tumorstadium, Grading und N-Status mit Hilfe des ungepaarten Mann-Whitney U-Tests analysiert (Abb. 14).

↓52

Es fand sich kein signifikanter Unterschied zwischen den klinisch-pathologischen Subgruppen und p53 Mutation bzw. der Expression von Bax, p53 und p16 (2-Test, p > 0.05). Die Expression von Bax war geringfügig niedriger in G1/2 Tumoren im Vergleich zu Tumoren mit G3 Grading. Dieser Unterschied war allerdings nicht signifikant (Mann-Whitney U-Test, p = 0.071, Abb. 14B).

Das Expressionsniveau des Rb Proteins zeigte keinerlei Bezug zu Nodalstatus, Tumorgrösse bzw. Stadium (I bis III). Im Gegensatz hierzu zeigte Cyclin D1 ein höheres Expressionsniveau in N1-Tumoren, was allerdings auch nicht signifikant war (Abb. 14A; p = 0.114).

Interessant war, dass das Vorhandensein lokaler Lymphknotenmetastasen (N1) signifikant mit einem Verlust der p21 Expression assoziiert war (Abb. 14A; p=0.039). Bezüglich des p53 Mutationsstatus fand sich ein solcher Bezug allerdings nicht. Im Gegensatz zu p21 zeigte das anti-apoptotische Bcl-2, wie auch Bax, keine signifikante Assoziation mit den getesteten klinisch-pathologischen Parametern.

↓53

Abb. 14:Immunhistochemisch bestimmte Expressionspiegel von Komponenten des Rb-Signalwegs, Bax und Bcl-2 in Relation zu klinisch-pathologischen Parametern

Gezeigt sind Box-Grafiken für den prozentualen Anteil positiver Zellen.
A:Nodalstatus, N0 (weisse Boxen) versus N≥1 Stadium (graue Boxen)
B:Tumor-Grading, G1/G2 (weisse Boxen) versus G3 Grading (graue Boxen)
C:T Stadium (Grösse), T1/2 (weisse Boxen) versus T3/4 Tumore (graue Boxen)
D:AJCC Stadium, Stadium I/II (weisse Boxen) versus Stadium III (graue Boxen).

Fünfzehn der Patienten erhielten zusätzlich zur Operation eine Strahlen- bzw. kombinierte Radiochemotherapie. Diese Patienten zeigten keine signifikanten Verteilungsunterschiede bezüglich Bax-positiver (7 von 21 erhielten zusätzliche Therapie) bzw. Bax-negativer Tumore (8 von 32 erhielten zusätzliche Therapie). Ebenso zeigte sich kein Unterschied für p16 hochexprimierende (6/17) und niedrig exprimierende Tumore (9/36), Rb positive (13/45) versus Rb negative (1/7), Bcl-2 negative (8/28) versus Bcl-2 positive (7/23), p21 negative (2/9) versus p21 positive (13/44) und Cyclin D1 überexprimierende (4/9) versus Cyclin D1 niedrig exprimierende (11/43) Tumore (Fisher´s exakter Test p > 0.3 für alle Variablen).

4.5 Einfluß von Cyclin D1, p16INK4a, Rb, p53, p21, Bax und Bcl-2 auf das Überleben

Um den Einfluss von Cyclin D1, p16INK4a, Rb, p21CIP/WAF-1, p53, Bax and Bcl-2 Proteinexpression und p53 Mutation auf die Krankheitsprognose zu bestimmen, wurden univariate Analysen für den Einfluss der einzelnen Faktoren auf das Gesamtüberleben durchgeführt. Die Patienten wurden hierfür mit Hilfe dichotomisierter Variablen stratifiziert (vgl. Material und Methoden). Es wurden folgende Gruppen gebildet: Rb hoch- versus niedrig exprimierend/negativ, Cyclin D1 niedrig exprimierend versus überexprimierend, p16 hoch- versus niedrig exprimierend, p21 positiv versus negativ, p53 positiv versus negativ, Bax positiv versus negativ, Bcl-2 positiv verus negativ und p53 Wildtyp versus p53 mutiert.

↓54

Die Analyse wurde mit den Genen begonnen, die den Fortschritt der Zelle im Zellzyklus aus der G1 in die S-Phase kontrollieren: Rb, Cyclin D1 und der Cyclin-abhängige-Kinase Inhibitor p16INK4a.

In der univariaten Analyse zeigten Patienten mit Tumoren, die wenig Cyclin D1 exprimieren, aber p16 und Rb hoch exprimieren ein deutlich besseres Gesamtüberleben (Abb. 15). Das mediane Gesamtüberleben betrug 15.0 Monate für Patienten mit Cyclin D1 niedrig exprimierenden Tumoren, jedoch nur 5.8 Monate für Patienten mit Cyclin D1 überexprimierenden Tumoren (Log-Rang Mantel-Cox Test: p = 0.034, Abb. 15A).

Patienten mit hoher p16INK4a Expression in ihren Tumoren zeigten ein medianes Überleben von 23.8 Monaten versus 9.7 Monate für diejenigen mit p16 niedrig exprimierenden Tumoren (Log-Rang Mantel-Cox Test: p=0.011; Abb. 15B).

↓55

Schließlich zeigten Patienten mit extremem Verlust der Rb Expression ein medianes Überleben von 8.3 Monaten im Vergleich zu 13.9 Monaten für Patienten mit Rb hoch exprimierenden Tumoren (p = 0.202, nicht signifikant; Abb. 15C).

Insgesamt diskriminieren alle drei Analysen zwischen Patienten mit längerem Überleben und solchen, die früh versterben. Allerdings erreichte dies im Fall von Rb keine statistische Signifikanz.

Abb. 15:Kaplan-Meier Überlebensanalyse für Cyclin D1, p16INK4a, Rb und den kombinierten Cyclin D1/p16/Rb Status

A:Cyclin D1 niedrig exprimierende (durchgezogene Linie und weisse Kreise) versus Cyclin D1 überexprimierende Tumore (gestrichelte Linie; Cut-off Punkt für Cyclin D1 Überexpression: nukleäre Cyclin D1 Expression in > 60% der Tumorzellen),
B:p16INK4a hoch exprimierende (durchgezogene Linie und weisse Kreise) versus p16INKa niedrig exprimierende Tumore (gestrichelte Linie und schwarze Kreise; Cut-off Punkt für hohe p16 Expression: nukleäre p16 Expression in ≥ 70% der Tumorzellen),
C:Rb positive (durchgezogene Linie und weisse Kreise) versus Rb negative Tumore (gestrichelte Linie und schwarze Kreise; Cut-off Punkt für Verlust der Rb Expression: nukleäre Rb Expression in < 20% der Tumorzellen),
D:Cyclin D1 niedrig/p16 hoch/Rb positive Tumore (durchgezogene Linie und weisse Kreise) versus Tumors mit einem oder mehreren Defekten in der Genexpression (gestrichelte Linie und schwarze Kreise).
Zensierungsereignisse sind mit Kreisen gekennzeichnet.

↓56

Zusätzlich zu diesen Einzelgen-Analysen wurde hinterfragt, ob die kombinierte Analyse aller drei Gene die prognostische Relevanz der drei Gene und die Diskriminierung zwischen guter versus schlechter Prognose verbessern kann. Hierfür wurde die Interaktionsvariable der dichotomisierten Variablen berechnet (Cyclin D1 * p16 * Rb), wobei Cyclin D1niedrig, p16INK4a hoch bzw. Rbhoch als „1“, d.h. „intakt“ und Cyclin D1hoch, p16INK4a niedrig bzw. Rbnegativ als „0“, d.h. „defekt“ gesetzt wurden.

Hierdurch wurden die Patienten in 2 Gruppen mit „günstigem“ versus „ungünstigem“ Risikoprofil kategorisiert. Durch diese statistische Prozedur wurden Patienten mit intakter Gen-Expression von solchen unterschieden, die einen oder mehrere Defekte der analysierten Gene tragen. Tatsächlich zeigt die Abbildung 4D, dass Patienten mit Cyclin D1niedrig, p16INK4a hoch und Rbhoch Expression (13 von 51 Patienten) ein medianes Überleben von 45.8 Monaten zeigten im Vergleich zu nur 8.3 Monaten für Patienten mit Cyclin D1hoch und/oder p16INK4a niedrig und/oder Rbnegativ Expressionsprofil (p = 0.019).

Im Gegensatz hierzu waren weder p53 Mutation (Abb. 16A) noch p53 Überexpression (nicht gezeigt) signifikant mit einem schlechteren Überleben assoziiert. Dennoch wurde der Einfluss der p53 Mutation auf molekulare Subgruppen mit zusätzlichen Defekten von Zellzyklus- bzw. Apoptose-regulierenden Genen bestimmt. Abbildung 16A zeigt, dass p53 Mutation alleine nur grenzwertig mit einem schlechteren Überleben verbunden ist. Es befanden sich alle Patienten mit Langzeitüberleben in der p53-Wildtyp-Gruppe. Das mediane Überleben von Patienten mit p53 Wildtyp-Tumor betrug allerdings nur 12.2 Monate im Vergleich zu 13.9 Monaten für Patienten mit p53-mutiertem Tumor. Dieser Unterschied im Überleben war nicht signifikant (Logrank Test, p = 0.6274).

↓57

Im Gegensatz zu p53 zeigte die Analyse der p21CIP/WAF-1 Expression einen Unterschied im Gesamtüberleben der beiden Gruppen wobei Patienten mit p21-Verlust eine schlechtere Prognose zeigten (Abb. 16B). Patienten mit Tumoren, die einen kompletten Verlust der p21 Expression aufweisen, zeigten ein signifikant kürzeres Gesamtüberleben (Median von 7.7 Monaten nach Operation) im Vergleich zu Patienten mit p21 exprimierenden Tumoren (Median 13.9 Monate, p = 0.024). Die p21 positive Kohorte enthielt auch alle Langzeitüberlebenden.

Abb. 16:Kaplan-Meier Überlebensanalyse für p53 Mutation, p21CIP/WAF-1 Expression und für den kombinierten p53/p21 Status

A:p53 Wildtyp (durchgezogene Linie und weisse Kreise) versus p53 mutierte Tumore (gestrichelte Linie). P53 Mutationsanalyse wurde mittels SSCP-PCR für Exons 5 bis 8 durchgeführt.
B:p21CIP/WAF-1 positive (durchgezogene Linie und weisse Kreise) versus p21CIP/WAF-1 negative Tumore (gestrichelte Linie und schwarze Kreise; Cut-off Punkt für p21 Positivität: nukleäre p21 Expression in über 0% der Tumorzellen),
C:p53 Wildtyp/p21 positive Tumore (durchgezogene Linie und weisse Kreise) versus Tumore mit p53 Mutation oder p21 Expressionsverlust oder beiden Ereignissen (gestrichelte Linie und schwarze Kreise).
Zensierungsereignisse sind mit Kreisen gekennzeichnet.

Die Kombination von p53 Mutation und p21 Expression als p53 Mutation*p21 Expression wurde als Interaktionsvariable berechnet, wobei p53 Wildtyp und p21 Expression mit „1“, d.h. „intakt“, gesetzt wurden (wie zuvor für Rb, Cyclin D1 und p16 beschrieben). Diese kombinierte Signalwegsanalyse konnte allerdings die Unterscheidung zwischen Patienten mit guter bzw. schlechter Prognose nicht verbessern. Patienten mit p53 Wildtyp und hoher p21 Expression zeigten ein medianes Überleben von 13.7 Monaten verglichen mit 8.2 Monaten für Patienten mit Inaktivierung eines oder beider Gene (p = 0.179; Abb. 16C). Ein ähnlich negatives Ergebnis ergab sich aus der Korrelation von p53 Mutation und Bax Expression (nicht gezeigt), die der Einzelgen-Analyse von Bax nicht überlegen war (nicht gezeigt). Somit ist, im Gegensatz zu p21, p53 Mutation oder Überexpression kein relevanter Faktor zur Prognoseabschätzung von Patienten mit Plattenepithelkarzinom des Ösophagus. P53 Mutation bzw. Überexpression wurden daher von den weiteren Analysen ausgeschlossen.

↓58

In Analogie zu diesen Analysen wurden Bax und Bcl-2 untersucht. Der Verlust der Bax Expression war signifikant mit einer schlechteren Prognose verbunden. Patienten mit Bax-negativen Tumoren zeigten ein kürzeres medianes Überleben (8.2 Monate) verglichen mit Patienten deren Tumore Bax exprimieren (14.9 Monate, p = 0.0028). Alle Langzeit-Überlebenden befanden sich in der Bax-positiven Gruppe (Abb. 17A).

Im Gegensatz zu Bax zeigte Bcl-2 Positivität bzw. Fehlen der Bcl-2 Expression keinen Einfluss auf das Gesamtüberleben der Patienten (Abb. 17B). Patienten mit Bcl-2 negativen Tumoren zeigten ein medianes Überleben von 12.2 Monaten wohingegen das mediane Überleben von Patienten mit Bcl-2 exprimierenden Tumoren bei 14.0 Monaten lag (p = 0.435). Bax Positivität und Bcl-2 Negativität, beides Marker für Apoptose-Empfindlichkeit, wurden jeweils mit „1“ kodiert. Allerdings erlaubte die Nutzung der Interaktionsvariablen Bax*Bcl-2 keine Diskriminierung zwischen guter und schlechter Prognose (p = 0.401; Abb. 17C). Bax positive/Bcl-2 negative Tumore zeigten ein medianes Überleben von 19.3 Monaten während die Patienten der anderen, Bax negativen und/oder Bcl-2 positiven Gruppe ein medianes Überleben von 11.6 Monaten zeigten. Somit konnte durch Einbeziehung von Bcl-2 in die Bax-Analyse keine Verbesserung der prognostischen Aussagekraft im Vergleich zur Einzelgen-Analyse von Bax erreicht werden.

Abb. 17:Kaplan-Meier Überlebensanalyse für Bax und Bcl-2 Expression und für den kombinierten Bax/Bcl-2 Status

A:Bax positive (durchgezogene Linie und weisse Kreise) versus Bax negative Tumore (gestrichelte Linie). Der Cut-off Punkt für Bax Positivität wurde bei ≥ 20% positive Tumorzellen gesetzt.
B:Bcl-2 positive (durchgezogene Linie und weisse Kreise) versus Bcl-2 negative Tumore (gestrichelte Linie und schwarze Kreise; Cut-off Punkt für Bcl-2 Positivität wurde bei > 0% positive Tumorzellen gesetzt.
C:Bax positive/Bcl-2 negative Tumore (durchgezogene Linie und weisse Kreise) versus Tumore mit Bax Verlust, positiver Bcl-2 Expression oder beiden Ereignissen (gestrichelte Linie und schwarze Kreise).
Zensierungsereignisse sind mit Kreisen gekennzeichnet.

↓59

Diese Beobachtung deckt sich mit funktionellen experimentellen Daten die zeigen, dass Bax die Apoptose-fördernde Wirkung unabhängig von Bcl-2 (und dessen Homologen) entfalten kann, z.B. bei der Aktivierung der mitochondrialen Apoptose-Signalkaskade. Bcl-2 wurde aufgrund der fehlenden prognostischen Relevanz in den weiteren Analysen nicht berücksichtigt.

Schließlich wurde hinterfragt, ob die prognostische Aussagekraft von Bax mit den Ergebnissen aus der Analyse des Rb-Signalwegs kombiniert werden kann, um die Identifikation von Patienten mit guter bzw. schlechter Prognose ihrer Tumorerkrankung zu verbessern. Dies machte umso mehr Sinn, als Bax und die Komponenten des Rb-Signalwegs unabhängig voneinader inaktiviert werden (getestet wurde die Interaktionsvariable Cyclin D1*p16*Rb gegen Bax; 2 test: p=0.12).

Für die Kaplan-Meier Analysen wurden die Patienten mit Hilfe der Interaktionsvariablen Cyclin D1*p16*Bax in Patienten mit niedriger Cyclin D1 Expression, hoher p16 Expression und intakter Bax Expression versus die Patienten mit einer oder mehrerer deregulierter Komponenten (Überexpression von Cyclin D1 und/oder Verlust von p16 und/oder Verlust von Bax) gruppiert.

↓60

Kontingenztafel-Analysen zeigten, dass es keine Korrelation zwischen Bax, p16 und Cyclin D1 gab (Fisher´s exakter Test: p = 0.1733 für Cyclin D1/p16, p = 0.3184 für Cyclin D1/Bax und p = 0.3745 für Bax/p16; jeweils hoch versus niedrig exprimierende Tumore).

Abbildung 18 zeigt, dass der Einschluss aller drei Faktoren in das Modell die Identifikation einer Patientengruppe ermöglicht, die sich durch eine sehr gute Krankheitsprognose auszeichnet (Cyclin D1niedrig/p16hoch/Baxpositiv, n=10 von 51 Patienten). Das Gesamtüberleben dieser Patientengruppe erreicht ein Plateau, dass nicht unter das mediane Überleben fällt und alle Langzeitüberlebende enthält. Die Logrank-Analyse der beiden Patientengruppen ergibt einen p-Wert von 0.011 und belegt somit ein deutlich und signifikant besseres Gesamtüberleben der Cyclin D1niedrig/p16hoch/Baxpositiv Patientengruppe. Die entsprechenden, mittels Kaplan-Meier Analyse geschätzten 1-, 2- und 5-Jahresüberlebensraten sind in der Tabelle 8 aufgeführt.

Überraschenderweise konnte durch Einbeziehung von Rb und p21 Expression keine weitere Verbesserung der Identifikation von Patienten mit guter bzw. schlechter Prognose erreicht werden. Alle Patienten in der Cyclin D1niedrig/p16hoch/Baxpositiv, also der „intakten“ Gruppe zeigten in ihren Tumoren auch p21 und Rb Expression oberhalb der Cut-off Werte. Somit war das günstige Cyclin D1niedrig/p16hoch/Baxpositiv in allen Fällen mit p21 und Rb Ko-Expression assoziiert. Dies erklärt auch, warum durch Einbeziehung von Rb und p21 in die Cyclin D1niedrig/p16hoch/Baxpositiv Gruppe keine Verbesserung der prognostischen Wertigkeit erreicht werden konnte, da beide Gruppen vollständig kongruent sind. Konsequenterweise sind p21 und Rb in diesem Modell auch keine unabhängigen prognostischen Faktoren und wurden in der multivariaten Analyse sowohl durch vorwärts bzw. rückwärts gerichtete Variablenselektion eliminiert (siehe unten).

↓61

Abb. 18:Kaplan-Meier Analyse des Gesamtüberlebens von Patienten mit Plattenepithel-Karzinom des Ösophagus für den kombinierten Cyclin D1/p16INK4a/Bax Status

Zensierte Ereignisse sind mit Kreisen markiert. Cyclin D1 niedrig exprimierende, p16INK4a hoch exprimierende, Bax positive Tumore (durchgezogene Linie und weisse Kreise) werden mit Patienten verglichen, deren Tumore entweder Cyclin D1 überexprimieren und/oder p16INK4a nierig exprimieren und/oder Verlust der Bax Expression zeigen (gestrichelte Linie und schwarze Kreise).

4.6 Multivariate Regressionsanalyse für das Gesamtüberleben

Die Analyse der Tumorgrösse (T-Stadium), Lebensalter, Geschlecht und Tumorstadium zeigte in der univariaten Analyse keine prognostische Signifikanz, ist daher nicht gezeigt und wurde deshalb auch nicht im multivariaten Modell analysiert. Unter den „konventionellen“, klinisch-pathologischen Parametern ist insbesondere der N-Status, also das Vorhandensein lokoregionärer Lymphknotenmetastasen, als prognostischer Faktor akzeptiert [184]. Die 27 Patienten mit N0-Status zeigten demzufolge ein medianes Überleben von 18.7 Monaten im Gegensatz zu 8.3 Monaten medianem Überleben für die Patienten mit N1-Stadium (Logrank Test: p = 0.084). Die univariaten Analysen des N-Status und molekularer Risikofaktoren sind in Tabelle 9 gezeigt.

Tab. 8:1-, 2- und 5-Jahres-Gesamtüberleben (geschätzt nach der Kaplan-Meier Methode)

  

Gesamtüberleben

  

Status *

Anzahl der Patienten *

1-Jahr

2-Jahre

5-Jahre

N-Status N0

27 (50.9%)

66.7%

29.6%

24.7%

N-Status N1

26 (49.1%)

42.3%

19.2%

9.6%

normale Cyclin D1 Expression

9 (17.3%)

62.8%

27.9%

22.0%

Überexpression von Cyclin D1

43 (82.7%)

22.2%

11.1%

0

p16INK4ahoch (32.1%)

17 (32.1%)

70.6%

47.1%

33.6%

p16INK4a niedrig (67.9%)

36 (67.9%)

47.2%

13.9%

10.4%

Rb hoch

45 (86.5%)

57.8%

28.9%

20.4%

Rb niedrig/negativ

7 (13.5%)

14.3%

0

0

Expression von p21

44 (83%)

59.1%

29.5%

20.9%

p21 niedrig/negativ

9 (17%)

33.3%

0

0

Bax positiv

21 (39.6%)

68.8%

37.5%

26.5%

Bax negativ

32 (60.4%)

33.3%

4.8%

0

Cyclin D1*p16*Rb Interaktion = 1 (intakt)

13 (25.5%)

84.6%

53.8%

44.9%

Cyclin D1*p16*Rb Interaktion =0 (defekt)

38 (74.5%)

44.7%

15.8%

8.4%

Cyclin D1*p16*Bax Interaktion = 1 (intakt)

10 (19.2%)

100%

70.0%

58.3%

Cyclin D1*p16*Bax Interaktion = 0 (defekt)

42 (80.8%)

45.2%

14.3%

7.6%

↓62

Tab. 9: Univariate Regressionsanalyse, Cox Proportional Hazard Modell.

 

Relatives Risiko (RR)

95% Konfidenz- Intervall

p
univariat

N-Status (N1)*

1.684

0.927-3.064

0.087

Cyclin D1 Überexpression (>60% pos.)

2.942

1.381-6.270

0.0052

p16INK4a niedrig (≤70% pos.)

2.437

1.208-4.916

0.0129

Rb negativ (<20% pos. Zellen)

1.706

0.744-3.914

0.2070

p53 Mutation (Exon 5 to 8)

1.185

0.596-2.359

0.6278

p53 Überexpression (≥20% pos. Zellen)

0.955

0.488-1.867

0.8919

p21CIP/WAF-1 negativ (0% pos.)

2.322

1.091-4.940

0.0288

Bax negativ (< 20% pos.)

2.547

1.352-4.798

0.0038

Bcl-2 positiv (>0% pos. cells)

1.280

0.688-2.382

0.4364

Interaktion Cyclin D1*p16INK4a*Rb

3.477

1.515-7.982

0.0033

Interaktion p53 Mutation*p21

1.523

0.821-2.827

0.1821

Interaktion Bax*Bcl-2

1.356

0.664-2.768

0.4034

Interaktion of Cyclin D1*p16INK4a*Bax

5.620

1.958-16.126

0.0013

Diese prognostische Signifikanz für den Nodalstatus war in der multivariaten Analyse kein unabhängiger prognostischer Faktor wenn gleichzeitig die Regulatoren des Rb Signalwegs sowie Bax und deren Interaktionsvariablen analysiert wurden. Die multivariate Analyse mit Vorwärts- der signifikantesten und Rückwärtsselektion der am wenigsten signifikanten Parameter elimierte den N-Status als unabhängigen prognostischen Faktor aus dem Modell. Nur Bax, Cyclin D1 und die Interaktionsvariable Cyclin D1*Bax*p16 verblieben nach der schrittweise vor- und rückwärts durchgeführten Elimination im multivariaten Proportionalen Risiko-Modell nach Cox. In diesem Regressionsmodell betrug das relative Risiko für frühen Tod nach Therapie RR = 3.70, p = 0.0231 für Patienten mit Cyclin D1niedrig/p16hoch/Baxpositiv Tumoren, RR = 2.69, p = 0.0157 für Cyclin D1 überexprimierende Tumore und RR = 2.11, p = 0.0344 für Baxnegative Tumore (Tab. 10).

Tab. 10:Multivariate Regressionsanalyse (Cox Modell)

 

Relatives Risiko (RR)

95% Konfidenz-Intervall

p
multivariat

Verlust der Bax Expression

2.11

1.056-4.196

0.0344

Cyclin D1 Überexpression

2.69

1.205-6.009

0.0157

Interaktion Cyclin D1*p16INK4a*Bax

3.70

1.197-11.457

0.0231

↓63

Die einzelnen Parameter p16INK4a, p21CIP/WAF-1 verblieben nicht im multivariaten Cox Modell in Folge der überlegenen Wertigkeit der Interaktion zwischen p16INK4a, Cyclin D1 and Bax Expression und wurden durch vorwärts bzw. rückwärts-gerichtete Variablen-Selektion aus dem Modell eliminiert.

4.7 Analyse des späten G1-Restriktionspunkts (Cyclin E und p27KIP)

Um die Identifikation von Patienten mit guter bzw. schlechter Prognose weiter zu verbessern, wurden 2 weitere Regulatoren des Rb-Signalwegs in die Analyse einbezogen: der CDK Inhibitor p27KIP1 und Cyclin E, der Ko-Aktivator der CDK2 Kinase am späten G1-Restriktionspunkt. Für beide Regulatoren war zuvor in anderen Karzinomentitäten eine prognostische Relevanz gezeigt worden und zwar sowohl für Verlust von p27KIP1 [185,186,187] als auch für Überexpression von Cyclin E [185,188,189,190,191,192]. Für das Ösophaguskarzinom lagen zum Zeitpunkt des Beginns der Analysen noch keine Daten vor. Mittlerweile wurde für beide Regulatoren eine prognostische Relevanz postuliert, jedoch nicht sicher gezeigt.

Expressionsdaten für Cyclin E konnten in 51 der 53 Primärtumore erhoben werden. Der Median der Expression lag bei 30 % positiv angefärbter Zellen (Range 0-95). Für den Färbeindex lag der Median bei 60 (Range 0-285). Für die weiteren Analysen und zur Kategorisierung der Daten in hoch versus niedrig exprimierende Tumore wurde der Median als Cut-off-Punkt gewählt. Sowohl für den Prozentsatz angefärbter Zellen als auch für den Färbeindex zeigte sich eine 2-phasiger Verteilung mit einer Abgrenzbarkeit der beiden Gipfel am Median.

↓64

Die Proteinexpression von nukleärem p27 konnte in allen 53 Primärtumoren untersucht werden und lag im Median bei 5,0 % angefärbter Zellen (Range 0-70). Der Median des Färbeindex lag ebenfalls bei 5,0 (Range 0-210). Für beide Parameter wurde der Median als Cut-off Punkt gewählt.

Die Kombination von p27 und Cyclin E, d.h. die Interaktionsvariable Cyclin E*p27 konnte bei 51 Tumorproben analysiert werden.

Bezüglich der Kaplan-Meier Analysen für das Gesamtüberleben der Patienten wurde für die Überexpression von Cyclin E überhaupt kein Einfluss auf die Prognose der Tumorerkrankung gefunden (Log-Rang Mantel-Cox Test: p = 0,985; Abb 19B). Hingegen zeigte der Verlust von p27 einen allerdings nicht signifikanten Effekt auf das Gesamtüberleben der Patienten (Log-Rang Mantel-Cox Test: p = 0,129; Abb. 19A). Ebenso zeigte sich für die Kombination von Cyclin E und p27 kein besseres Ergebnis und auch die Interaktionsvariable konnte nicht signifikant zwischen guter und schlechter Prognose diskriminieren (Log-Rang Mantel-Cox Test: p = 0,102; Abb. 19C).

↓65

Im Hinblick auf die positiven Daten in anderen Tumorentitäten und die teils widersprüchlichen Daten bei Patienten mit Ösophaguskarzinom bestand die Möglichkeit, dass Effekte von Cyclin E bzw. p27 durch Defekte in anderen Rb-Signalwegskomponenten überdeckt werden könnten. Aus diesem Grund wurde der p27- und der Cyclin E-Status mit der Interaktionsvariablen für Rb, Cyclin D1, p16 und p21 in Relation gesetzt. Abbildung 20 zeigt, dass hohe Expression von p27 sowohl bei Patienten mit intakter Expression von Rb, Cyclin D1, p16 und p21 (Abb. 20A; Log-Rang Mantel-Cox Test: p = 0,235) als auch bei Patienten mit einem oder mehreren Defekten in der Expression dieser Gene mit einer guten Prognose assoziiert ist (Abb. 20B; Log-Rang Mantel-Cox Test: p = 0,106) ohne allerdings statistische Signifikanz in diesen beiden separaten Analysen zu erreichen. Dennoch ist bemerkenswert, dass die Kombination von intaktem p27 und intakten anderen Rb-Signalwegskomponenten eine Subgruppe von Patienten mit über 70%igem 5-Jahresüberleben identifiziert. Prognostische Signifikanz (Log-Rang Mantel-Cox Test: p = 0,001) erreichte p27 allerdings, wenn es gemeinsam mit der Rb*Cyclin D1*p16*p21 Rb-Signalweg-Interaktionsvariablen zur Stratifikation der Patientengruppen getestet wurde.

Abb. 19:Kaplan-Meier Analyse des Gesamtüberlebens von Patienten mit Plattenepithel-Karzinom des Ösophagus für Expression von p27KIP1 und Cyclin E.

Zensierte Ereignisse sind mit Kreisen markiert. (A) P27 hoch (intakt) exprimierende Tumore (durchgezogene Linie und weisse Kreise) werden mit Patienten verglichen, deren Tumore p27 niedrig exprimieren (gestrichelte Linie und schwarze Kreise). (B) Cyclin E niedrig exprimierende Tumore (durchgezogene Linie und weisse Kreise) werden mit Patienten verglichen, deren Tumore Cyclin E hoch exprimieren (gestrichelte Linie und schwarze Kreise). (C) Interaktionsvariable für Cyclin E und p27 wobei niedrige Cyclin E Expression und hohe p27 Expression als „intakt“ definiert wurde (durchgezogene Linie und weisse Kreise). Patienten mit einem oder beiden Defekten wurden in die „defekte“ Kohorte gruppiert (gestrichelte Linie und schwarze Kreise).

Abb. 20:Kaplan-Meier Analyse des Gesamtüberlebens von Patienten mit Plattenepithel-Karzinom des Ösophagus für Expression von p27KIP1 in Relation zu zusätzlichen Defekten im Rb-Signalweg

Zensierte Ereignisse sind mit Kreisen markiert. P27 hoch exprimierende Tumore (durchgezogene Linie und weisse Kreise) werden mit Patienten verglichen, deren Tumore p27 niedrig exprimieren (gestrichelte Linie und schwarze Kreise). Verglichen wird der p27 Status mit weiteren Defekten im Rb Signalweg. In (A) wurden Patienten mit intaktem Rb, p16, Cyclin D1, und p21 analysiert. In (B) sind Tumore mit einem oder mehreren Defekten in Rb, p16, Cyclin D1, und p21 analysiert.

↓66

Aufgrund der kleinen Fallzahl p27-intakter Patienten in der Rb-Signalwegs-intakten Subgruppe wurde allerdings darauf verzichtet, diesen Parameter in eine neue Interaktionsvariable einzurechnen. Ebenso wurde die kategoriale p27-Expression aufgrund der geringen Fallzahlen und der fehlenden Signifikanz von p27 alleine bezüglich der Krankheitsprognose nicht in die uni- und multivariaten Regressionsanalysen einbezogen. Erwähnenswert ist allerdings noch, dass eine Kontingenztafel-Analyse zeigte, dass es keinen Zusammenhang zwischen der Inaktivierung von p27 und der Rb*Cyclin D1*p16*p21 Interaktionsvariablen gibt (2-Test: p = 0,867). Somit kann davon ausgegangen werden, dass p27 unabhängig von den anderen Komponenten des Rb-Signalwegs inaktiviert wird.

Abb. 21:Kaplan-Meier Analyse des Gesamtüberlebens von Patienten mit Plattenepithel-Karzinom des Ösophagus für Expression von Cyclin E in Relation zu zusätzlichen Defekten im Rb-Signalweg

Zensierte Ereignisse sind mit Kreisen markiert. Cyclin E niedrig (intakt) exprimierende Tumore (durchgezogene Linie und weisse Kreise) werden mit Patienten verglichen, deren Tumore Cyclin E hoch exprimieren (gestrichelte Linie und schwarze Kreise). Verglichen wird der Cyclin E Status mit weiteren Defekten im Rb Signalweg. In (A) wurden Patienten mit intaktem Rb, p16, Cyclin D1, und p21 analysiert. In (B) sind Tumore mit einem oder mehreren Defekten in Rb, p16, Cyclin D1, und p21 analysiert.

Analog zu Analyse der p27-Inaktivierung in Relation zum Rb-Signalweg wurde Cyclin E analysiert. Im Einklang mit der fehlenden prognostischen Relevanz bei der Einzelgen-Analyse von Cyclin E zeigte sich kein Einfluss von p27 bei getrennter Betrachtung der Patienten mit intaktem Rb, Cyclin D1, p16 und p21 (Abb. 21A; Log-Rang Mantel-Cox Test: p = 0,677) und bei Patienten, deren Tumore einen oder mehrere Defekte in diesen Signalwegskomponenten tragen (Abb. 21B; Log-Rang Mantel-Cox Test: p = 0,776). Hieraus kann gefolgert werden, dass die Überexpression von Cyclin E zwar beim Plattenepithelkarzinom des Ösophagus beobachtet wird und somit möglicherweise pathogenetisch relevant ist, allerdings keinen Einfluss auf die Prognose der Erkrankung hat.

4.8 Deregulation von Zellzykluskomponenten und Tumorproliferation

↓67

Zusätzlich zur Inaktivierung von Zellzyklus- und Apoptoseregulatoren wurde die Proliferationsaktivität der Tumore durch immunhistochemischen Nachweis des Ki-67 Antigens analysiert. Das Ki-67 Antigen ist beginnend ab der späten G1-Phase bis in die M-Phase exprimiert. Ruhende Zellen in G0 und Zellen in der frühen G1-Phase hingegen sind nicht mit Antikörpern gegen Ki-67 anfärbbar. Somit ist die Anfärbbarkeit für Ki-67 ein indirektes Maß für die Anzahl im Zellzyklus voranschreitender Zellen und erlaubt die indirekte Abschätzung der Wachstumsfraktion eines Tumors.

Ki-67 konnte bei 49 der 53 Primärtumore angefärbt werden. Der Median des Prozentsatzes gefärbter Zellen lag bei 12,6 % Ki-67 positive Zellen. Für die kategoriale Datenanalyse wurde daher der Cut-off Punkt von 12,6 % gewählt. Tumore mit Ki-67 Expression über 12,6 % wurden als hoch exprimierende und Tumore kleiner oder gleich 12,6 % positive Zellen als niedrig exprimierende Tumore klassifiziert.

Eine Kaplan-Meier Analyse für das Gesamtüberleben der Patienten zeigte allerdings keinen Einfluss von Ki-67 auf die Krankheitsprognose (Abb. 22, Log-Rang Mantel-Cox Test: p = 0,897).

↓68

Interessanterweise zeigte sich auch keine signifikante Korrelation von hoher bzw. niedriger kategorialer Ki-67 Expression in Bezug zu einzelnen Zellzyklusregulatoren. Der Vergleich der Expressionsniveaus zeigte bei Ki-67 hoch exprimierenden Tumoren eine gering erniedrigte Expression von Rb, p16, p21, p53, jedoch nicht für Cyclin D1 und E, p27, Bax und Bcl-2 (Mann-Whitney U-Test, sämtliche p > 0,05).

Abb. 22:Kaplan-Meier Analyse des Gesamtüberlebens von Patienten mit Plattenepithel-Karzinom des Ösophagus für Expression von Ki-67

Zensierte Ereignisse sind mit Kreisen markiert. Ki-67 niedrig (intakt) exprimierende Tumore (durchgezogene Linie und weisse Kreise) werden mit Patienten verglichen, deren Tumore Ki–67 hoch exprimieren (gestrichelte Linie und schwarze Kreise).

Abb. 23:Immunhistochemisch bestimmte Expressionspiegel von Komponenten des Rb-Signalwegs, Bax und Bcl-2 in Relation zu Ki-67 Expression

Gezeigt sind Box-Grafiken für den prozentualen Anteil positiver Zellen. Graue Boxen: niedrige Ki-67 Expression, weisse Boxen: hohe Ki-67 Expression.

↓69

Dies liess vermuten, dass kein einzelner Faktor, sondern die Summe der Störungen des Signalwegs in stark deregulierter Proliferation resultiert. Aus diesem Grund wurden die Ki-67 Expression mit den Interaktionsvariablen Rb*Cyclin D1*p16*p21 und Cyclin E*p27 in Beziehung gesetzt. Abbildung 24 zeigt den Unterschied im Expressionsniveau von Ki-67 für die Interaktionsvariablen des Rb Signalwegs. Sowohl die kombinierte Störung von Rb, Cyclin D1, p16 und p21, als auch die zusätzliche Inaktivierung von p27 und Cyclin E resultierten in erhöhten Expressionsspiegeln von Ki-67 als Surrogatmarker für Tumorzellproliferation. Hierbei zeigte sich sowohl für Deregulation von Rb*Cyclin D1*p16*p21 als auch für Cyclin E*p27 eine vergleichbare Erhöhung des Prozentsatzes Ki–67-positiver Zellen der auch durch die kombinierte Inaktivierung beider Faktoren nicht weiter anstieg.

Abb. 24:Expressionspiegel von Ki-67 in Relation zur Inaktivierung von Komponenten des Rb-Signalweg

Gezeigt sind Box-Grafiken für den prozentualen Anteil positiver Zellen. Verglichen wurde der Einfluss der kombinierten Störung von Rb, p16 und p21 (Verlust), sowie Cyclin D1 (Überexpression) im Verhältnis zur zusätzlichen kombinierten Inaktivierung (Verlust) von p27 und Cyclin E (Überexpression). +: intakter Signalweg, -: deregulierter Signalweg.

4.9 K-ras Mutation und Inaktivierung von Signalwegen

Aktivierende Punktmutationen von K-ras konnten bei 13 (24,5 %) der 53 Patienten nachgewiesen werden. Interessanterweise zeigten K-ras mutierte Tumore eine höhere Bax Expression, die allerdings keine statistische Relevanz erreichte (Mann-Whitney U-Test: p = 0,116, Abb. 25). Eine anderweitige Korrelation mit der Expression der analysierten Gene fand sich nicht.

↓70

Abb 25: Einfluss von K-ras Mutation auf das Expressionsniveau von Bax

Bax Expression wurde mittels Immunhistochemie quantifiziert. Dargestellt ist der Prozentsatz positiv angefärbter Zellen. K-ras Mutation im Codon 12 wurde mittels eines sequenzspezifischen Festphasenhybridierungstests bestimmt.

Hinsichtlich des Gesamtüberlebens zeigte sich ein schwacher, allerdings nicht signifikanter positiver Einfluss auf das Gesamtüberleben, der mit der höheren Bax-Expression in Verbindung stehen könnte (Abb. 26; Log-Rang Mantel-Cox Test: p = 0,287).

Abb. 26:Kaplan-Meier Analyse des Gesamtüberlebens von Patienten mit Plattenepithel-Karzinom des Ösophagus für Mutation des zellulären K-ras Proto-Onkogens

Zensierte Ereignisse sind mit Kreisen markiert. K-ras-Wildtyp Tumore (durchgezogene Linie und weisse Kreise) werden mit Patienten verglichen, deren Tumore aktivierende Punktmutationen des K-ras Codons 12 tragen (gestrichelte Linie und schwarze Kreise).

↓71

Da bisher keine derartigen Effekte von K-ras auf die Krankheitsprognose des Ösophaguskarzinoms bekannt waren und für beide Gene eine sequentielle Inaktivierung im Rahmen der Adenom-Karzinom-Sequenz postuliert ist, wurde die Relation von K-ras zu p53-Mutation untersucht. Interessanterweise fand sich im vorliegenden Kollektiv keine signifikante Imbalance der Verteilung von p53 und K-ras Mutation. Bei Annahme einer völlig unabhängigen Verteilung beider genetischer Ereignisse errechnet sich eine theoretische Frequenz für kombinierte p53 und K-ras Mutation von 5,5 %; tatsächlich findet sich in 7,6 % eine kombinierte Mutation beider Gene (Tab. 11;2-Test: p = 0,431). Dies lässt darauf schliessen, dass K-ras Mutation unabhängig von p53-Mutation auftritt und dass die onkogene Deregulation von K-ras nicht zwingend mit einer Inaktivierung von p53 einhergeht.

Ebenso zeigte sich anhand von Kontingenztafelanalysen kein signifikanter Bezug zur Inaktivierung von Rb-Signalwegs-Inaktivierungen in Relation zur Rb*Cyclin D1*p16*p21 Interaktionsvariablen, so dass Inaktivierung von Rb-Signalwegskomponenten unabhängig von K-ras zu erfolgen scheint. Auch hier sind errechnete Frequenz für Inaktivierung beider Parameter (19,5 %) und tatsächliche Häufigkeit (17,6) für die kombinierte Inaktivierung von K-ras nahezu deckungsgleich(Tab. 12;2-Test: p = 0,476).

Tab. 11:Relation von aktivierenden K-ras Mutationen zu p53-Mutation*

Status:

p53 Wildtyp

p53 mutiert

Summe

K-ras Wildtyp

32 (60,4 %)

8 (15,1 %)

40 (75,5 %)

K-ras Codon 12 mutiert

9 (17 %)

4 (7,6 %)

13 (24 ,5 %)

Summe

41 (77 ,4 %)

12 (22 ,6 %)

53 (100 %)

↓72

Tab. 12:Relation von aktivierenden K-ras Mutationen zum Rb-Signalweg

Status:

Rb-Weg intakt

Rb-Weg defekt

Summe

K-ras Wildtyp

8 (15,7 %)

30 (58,8 %)

38 (74,5 %)

K-ras Codon 12 mutiert

4 (7,8 %)

9 (17,6 %)

13 (25 ,5 %)

Summe

12 (23 ,5 %)

39 (76 ,5 %)

51 (100 %)


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08.03.2005