5. Diskussion

↓72

Die Enstehung maligner Tumoren ist ein multifaktorieller Prozess und ist die Folge von Veränderungen verschiedenster zellulärer Regulationsmechanismen die schliesslich zu ungehemmter Proliferation, infiltrativem Wachstum in gesunden Geweben und Metastasierung führen. Der Fortschritt bei der Aufklärung der hieran beteiligten Signalwege zeigte früh, dass die Störung von sowohl Zellzyklus-Regulation als auch Zelltod-Mechanismen, d.h. Apoptose-Programmen, wesentliche Faktoren beim Übergang von normalem zu malignem Zellwachstum darstellen. Ist ein maligner Tumor in Folge derartiger genetischer Veränderungen entstanden, dann können zusätzliche Störungen der Proliferations- und Apoptosekontrolle zur weiteren Enthemmung der Zellproliferation und zunehmender Therapieresistenz führen. Es kommt zur Tumorprogression. Ursächlich hieran beteiligt sind neben den eigentlichen Zellzyklus- und Apoptose-Regulatoren auch Störungen in Signalwegen, die genetische und chromosomale Stabilität kontrollieren, wie z.B. DNA Reparatur und Zellzyklus-Checkpunktkontrolle, aber auch Veränderungen des Tumormikromilieus, z.B. zelluläre Interaktionen mit der Tumorstroma und Veränderungen in der Tumor-Angiogenese.

Der Eintritt ruhender Zellen aus der G0 in die G1-Phase und aus der G1 in die S-Phase wird durch mehrere, konsekutiv wirkende Restriktionspunkte in der G-Phase vermittelt. Hierdurch wird die Progression der proliferierenden Zelle durch die frühe in die späte G1-Phase und der Übertritt in die S-Phase reguliert. Sind diese Checkpunkte inaktiviert, dann ist es der Zelle gestattet in die S-Phase überzugehen und die DNA-Synthese zu beginnen, sowie die spätere M-Phase vorzubereiten. Dieser Vorgang wird engmaschig kontrolliert durch die koordinierte und Phasen-spezifische Expression der G1-Phase Cycline: D1, D2, D3 und E. Diese Kofaktoren werden für die Aktivierung von Cyclin-abhängigen Kinasen (CDK) benötigt, wobei D-Cycline mit CDK4 und CDK6, Cyclin E hingegen mit CDK2 interagiert. Die hierdurch aktivierten CDK phosphorylieren das Rb-Protein (bzw. dessen Homologe) in mehreren konsekutiven Schritten und heben hierdurch die Rb-vermittelte Repression von S-Phase-aktivierenden Transkriptionsfaktoren wie E2F und c-myc auf. Die Aktivierung dieser Faktoren in Folge der Inaktivierung von Rb treibt die Zelle in die S-Phase. Aufgrund der zentralen regulatorischen Rolle und der Abhängigkeit der G1-Checkpunktkontrolle von einem intakten Rb-Genprodukt wird dieser die G1/S-Phase Progression vermittelnde Signalweg auch als Rb-Signalweg bezeichnet [68].

↓73

Im Hinblick auf diese wichtige Rolle bei der Wachstumskontrolle überrascht es nicht, dass Inaktivierungen oder Überaktivität einer oder mehrerer Signalwegskomponenten in praktisch jeder malignen Zelle nachgewiesen werden können. Interessanterweise können sich verschiedene dieser Signalwegsstörungen gegenseitig ausschliessen und treten alternativ auf. Aufgrund dieser Komplexität ist es nahezu unmöglich, die Konsequenzen für Tumorbiologie und klinisches Verhalten von Tumoren abzuschätzen wenn nur einzelne Gene untersucht werden.

Ziel dieser Arbeit war daher, kombinierte Inaktivierungen von Kontrollgenen in Plattenepithekarzinomen des Ösophagus zu untersuchen und deren Bedeutung für das klinische Ansprechen zu klären. Im Deatil konnte gezeigt werden, dass die Kombination eines intakten Rb-Signalwegs mit hoher Expression von Rb und p16INK4a gepaart mit niedriger Expression von Cyclin D1 eine Subgruppe von Patienten mit exzellenter Prognose der Tumorerkrankung und gutem Therapieansprechen identifiziert.

Die Identifikation von Patienten mit einer solch guten Prognose kann weiter verbessert werden, wenn Störungen des Rb Signalwegs in Kontext zu Störungen von Zelltodprogrammen gebracht werden. Dies gilt insbesondere für das pro-apoptotische Bax-Protein, dessen Expression in Tumoren durch transkriptionelle Inaktivierung bzw. Mutation des Bax-Gens gestört sein kann.

↓74

Die Identifikation von Patienten mit guter Prognose ist von besonderer klinischer Bedeutung in der Therapie des Ösophaguskarzinoms, da die Behandlungsmöglichkeiten und auch deren Erfolg limitiert sind, insbesondere bei Patienten mit lokal fortgeschrittenen oder gar metastasierten Tumoren. Nach wie vor ist Behandlung der Wahl die chirurgische Entfernung des Tumors. Zusätzliche adjuvante oder neoadjuvante, mehr oder weniger agressive Radio- oder Radiochemotherapien haben bisher nicht zu einer wesentlichen Verbesserung des Behandlungserfolgs und der generell schlechten Prognose des Ösophaguskarzinoms geführt [184]. Dies macht verständlich, warum neue prognostische Marker als klinische Entscheidungshilfe benötigt werden, um die Therapieplanung und klinische Entscheidungsfindung zu erleichtern. So könnten Patienten mit besonders guter Prognose möglicherweise von einer de-eskalierten Therapie profitieren bzw. könnten unnötige Therapien mit geringen Erfolgschancen bei Patienten mit hohem genetischen Risiko vermieden werden. Alternativ könnten Patienten mit ungünstigem genetischen Risikoprofil und wahrscheinlicher Resistenz für konventionelle Radiochemotherapie neuen Therapiemodalitäten zugeführt werden.

5.1 Molekulare Prognosefaktoren des Ösophaguskarzinoms

Aufgrund der Schwankungsbreite von Therapieansprechen, tumorfreiem und Gesamtüberleben von Patienten mit Ösophaguskarzinom bei Einteilung der Patienten nach konventionellen klinisch-pathologischen Parametern wie z.B. der UICC/TNM- oder der AJCC-Klassifikation, besteht erheblicher Bedarf, die Prognose der Patienten präziser abzuschätzen. Dies gilt insbesondere auch im Hinblick auf den deutlichen Trend zu risikoadaptierten Tumortherapien und neuen Tumortherapeutika wie z.B. Tyrosinkinasehemmern. Insbesondere im Hinblick auf den sehr kritisch diskutierten Stellenwert neoadjuvanter und adjuvanter Radio- bzw. Radiochemotherapien ist eine bessere Planbarkeit und Risikoanpassung der meist aggressiven Therapien wünschenwert.

Ein möglicher Weg ist, die zellulären Signalwege zu untersuchen, die an der Tumorentstehung, Tumorprogression und, insbesondere, der Aktivierung und Exekution von Zelltod nach zytotoxischer Tumortherapie beteiligt sind. Die Störung von Zelltod- und Zellzyklus-Signalwegen trägt nicht nur zur Tumorentstehung bei, sondern ist mit verantwortlich für die Tumorbiologie und den klinischen Verlauf der Erkrankung [138]. Das Entstehen von Tumoren wird hierbei von multifaktoriellen Prozessen bestimmt. Allerdings sind, trotz des zunehmend besseren Verständnisses der generellen molekularen Grundlagen der Tumorgenese, die molekulare Ätiologie des Ösophaguskarzinoms und insbesondere die Mechanismen der Tumorprogression nach wie vor ungeklärt.

↓75

Neben ihrer Rolle bei der Tumorpathogenese zeigte sich in einer Vielzahl von Untersuchungen, dass die Inaktivierung bestimmter Tumorsuppressorgene bzw. deregulierte Überaktivität bestimmter Onkogene mit einer besseren oder schlechteren Prognose assoziiert ist. Hierbei ermöglichte insbesondere die Analyse Zellzyklus- und Apoptose-regulierender Signalwege einen neuen Ansatz für die individuelle Risikoabschätzung. Es ist akzeptiert, dass Radiotherapie mit ionisierenden Strahlen und die meisten Chemotherapeutika ihre Wirkung durch Aktivierung von Zellzyklusarrest und/oder Apoptose entfalten. Ebenso ist etabliert, dass maligne Tumoren Störungen in Apoptoseprogrammen aufweisen, die funktionell von zusätzlich nachweisbaren Störungen der Proliferationskontrolle dieser Tumorzellen abgrenzbar sind. Die Untersuchung von Apoptose-Signalwegen in Kombination mit der Analyse der Zellzyklus-Kontrolle und deren Störungen ist daher ein vielversprechender experimenteller Ansatz zur Identifikation neuer prognostischer und für Therapieansprechen prädiktiver Faktoren in Tumoren.

5.2 Rolle chromosomaler Veränderungen

Eine Viezahl von Untersuchungen hat chromosomale Veränderungen in Ösophaguskarzinomen und präneoplastischen Geweben identifizieren können. Die Identifikation bevorzugt betroffener chromosomaler Regionen hat hierbei geholfen, Onkogene und Tumorsuppressorgene zu identifizieren, die an der Karzinogenese des Ösophaguskarzinoms beteiligt sind. Regionen mit Amplifikation enthalten mit hoher wahrscheinlichkeit Onkogene mit erhöhter Aktivität im Tumor. Regionen, die bevorzugt deletiert sind und einen Verlust der Heterozygotie (loss of heterozygosity, LOH) zeigen, enthalten hingegen häufig Tumorsuppressorgene, deren Inaktivierung wichtig für die Tumorgenese ist. Chromosomale Veränderungen bzw. Inaktivierung der Funktion durch Mutation oder Expressionsveränderungen durch epigenetische Ereignisse, wie z.B. Promotormethylierung, und die betroffenen Kandidatengene sind in Tabelle 13 zusammengefasst.

Durchflusszytometrische Untersuchungen haben zudem konsistent einen hohen Grad an Aneuploidie in Ösophaguskarzinomen gezeigt und zwar sowohl bei Adeno- als auch bei Plattenepithelkarzinomen [193,194,195,196]. Insbesondere konnte gezeigt werden, dass präneoplastische Läsionen mit Aneuploidie mit einem besonders hohen Karzinomrisiko assoziiert sind. Weiterhin ist ausgeprägte Aneuploidie, wie sie durch die relativ grobe DNA-Gehaltsmessung erfasst werden kann, in einigen Studien ein negativer prognostischer Faktor [197,198,199,200], der allerdings in einigen Studien kein unabhängiger Faktor war. Unklar ist jedoch nach wie vor, wie diese teils massive Aneuploidie entsteht und ob sie generell Ursache oder Folge der Karzinogenese und der deregulierten Proliferation von Tumorzellen ist.

↓76

Tab. 13:Lokalisation, Funktion und Pathogenese genetischer Veränderungen beim Ösophaguskarzinom

Chromosom

Gen

Synonym

Funktion

TS

ONC

Art der Veränderung

2p21

MSH2

HMSH2

DNA Mismatch-Reparatur

 

LOH

3p21

-Catenin

CTNNB1

Zelluläre Adhäsion, Signaltransduktion

 

4

Amplifikation
Mutation

3p21

MLH1

HMLH1

DNA Mismatch-Reparatur

4

 

LOH

5q21

APC

FAP Gen

Zelluläre Adhäsion, Signaltransduktion

4

4

LOH
Mutation

6p21

p21

WAF1, CIP1, SDI

CDKI, hemmt Zellzyklus-Progression, aktiviert Seneszenz

4

 

Methylierung

7p12-13

EGFR

c-erbB1, Her-1

Wachstumsfaktor-Rezeptor, Signaltransduktion

 

4

Amplifikation, Induktion

7p22

PDGF

 

Wachstumsfaktor-Rezeptor, Signaltransduktion

 

4

Induktion

8q24

c-myc

 

Transkriptionsfaktor, löst S-Phase Progression aus

 

4

Amplifikation, Induktion

9p21

p16

INK4a, CDKN2a, MTS1

CDKI, hemmt Zellzyklus-Progression, aktiviert Seneszenz

4

 

LOH, Mutation, Methylierung

9p21

p15

INK4b, CDKN2b

CDKI

4

 

LOH, Methylierung

11q13

Cyclin D1

CCDN1, PRAD1

Cyclin, Kofaktor für CDK4 und 6

 

4

Amplifikation

11q13

FGF

bFGF

Wachstumsfaktor

 

4

Induktion

11q13

HBGF

Int2

Wachstumsfaktor

 

4

Induktion

12p13

p27

KIP1

CDKI

4

 

Methylierung

13q14

Rb

RB1

Zellzyklus-Inhibitor, hemmt Eintritt in die S-Phase

4

 

LOH, Mutation, Methylierung

16q22

E-Cadherin

CDH1

Zelluläre Adhäsion, Signaltransduktion

4

4

LOH, Mutation

17p13

p53

 

Hemmt Zellzyklus-Progression, aktiviert Seneszenz und Apoptose

4

 

LOH, Mutation

17q21

Her2

Neu, cerbB2, EGFR2

Wachstumsfaktor-Rezeptor, Signaltransduktion

 

4

Amplifikation

18q21

DPC4

 

Signaltransduktion im TGF Signalweg

4

 

LOH

18q21

Bcl-2

 

Hemmt Apoptose

  

Induktion

18q21

DCC

 

Zelluläre Adhäsion, Signaltransduktion

4

 

LOH

19q13

Bax

Bcl-2 assoziiertes X-Protein

Vermittelt Apoptose

4

 

Methylierung (?)

22q13

PDGF

c-sis

Wachstumsfaktor

 

4

Induktion

* TS: Tumorsuppressorgen, ONC: Onkogen; einige Mutanten von Tumorsuppressorgenen können als Onkogene wirken und Zellproliferation antreiben.

5.3 Marker für Tumorproliferation und deren prognostische Relevanz

Tumorproliferation kann direkt über DNA-Gehaltsmessung, Erfassung des mitotischen Index oder indirekt über die Expression proliferationsassoziierter Proteine bestimmt werden. Am gebräuchlichsten hierfür sind das Ki-67/MIB-1 Antigen, PCNA (proliferating cell nuclear antigen), Topoisomerase II. Während Ki-67 Zellen erfasst, die sich in später G1-Phase, S-, G2- und M-Phase befinden, sind PCNA- und Topisomerase II-Expression spezifischer mit der S-Phase-Fraktion assoziiert. Für Plattenepithekarzinome wurde in mehreren Studien eine negative prognostische Bedeutung für Ki-67 Expression gefunden [201,202,203]. In diesen Studien konnte aber zumeist keine Unabhängigkeit für Ki-67 Expression als prognostischen Faktor gezeigt werden und Ki-67 Positivität korrelierte teils mit ungünstigen klinisch-pathologischen Faktoren wie hohem T-Stadium oder N1-Stadium oder Auftreten eines Lokalrezidivs [204,205]. Hingegen zeigten andere Studien keinen prognostischen Einfluss [206,207].

Für PCNA ergibt sich ein ähnlicher Trend. In einigen Studien wurde hohe PCNA Expression als zumeist abhängiger negativer pognostischer Faktor beschrieben [208] [209] [210]. Hingegen zeigt im Vergleich zu Ki-67 eine größere Anzahl von Studien das Fehlen einer prognostischen Signifikanz [202,211,212,213]

↓77

Einige Studien konnte für Ki-67 und PCNA sogar einen prädiktiven Wert für die lokale Tumorkontrolle durch Radiotherapie zeigen: Tumoren mit hoher Expression von Ki-67 bzw. PCNA zeigten eine höhere Wahrscheinlichkeit für komplette Remission nach alleiniger Radiotherapie [214] und eine geringere Rate an Lokalrezidiven nach definitiver Bestrahlung [205]. Dies zeigt indirekt, dass Tumore mit einem hohen Anteil an proliferierenden Zellen empfindlicher auf DNA-Schädigung reagieren im Vergleich zu Tumoren mit geringem Proliferationsanteil.

Für Topoisomerase II konnte eine deutliche Überexpression in Ösophaguskarzinomen gezeigt werden [215]. Insegsamt liegen jedoch deutlich weniger publizierte Ergebnisse vor als für Ki-67 und PCNA. In einer Studie konnte gezeigt werden, dass Topisomerase II Expression ein prädiktiver Faktor für das Ansprechen von Plattenepithelkarzinomen auf Polychemotherapie ist [216]. Interessanterweise korrelierten weder der Anteil Ki-67 positiver noch TUNEL-positiver, d.h. apoptotischer Zellen als Mass für die Fähigkeit zur Spontanapoptose, mit der therapeutischen Antwort dieser Tumore.

In präneoplastischen Läsionen konnte, ebenso wie im Fall der Aneuploidie, sowohl für starke Anfärbbarkeit der Gewebe mit Antikörpern gegen Ki-67 als auch für PCNA, also erhöhte Proliferation, ein erhöhtes Risiko für maligne Transformation gezeigt werden [217].

5.4 Inaktvierung des Rb-Signalwegs und prognostische Bedeutung

↓78

Als Ursache für die deregulierte Proliferationskontrolle findet sich in jedem Tumor eine funktionelle oder genetische Inaktivierung von Komponenten des Rb-Signalwegs. In diesem Zusammenhang zeigte sich, dass die Inaktivierung des RB1 Gens ein häufiges Ereignis in malignen Tumoren ist. Die biallelische Inaktivierung von Rb ist mit hoher Penetranz mit kindlichen Retinoblastomen assoziert [95].

Beim Ösophaguskarzinom wurde Verlust der Heterozygotie im RB1 Genlokus, also Deletion eines der beiden RB1 Allele, in 48 bis zu 67% der Patienten mit Plattenepithekarzinom beschrieben [218,219,220,221]. Hingegen ist die Rolle von Rb Mutationen nur schlecht definiert, wahrscheinlich im Hinblick auf die komplexe Struktur und die Größe des RB1 Genlokus.

Eine andere Studie zeigte Verlust des Rb-Proteins in 24% der Plattenepithelkarzinome des Ösophagus. Allerdings konnte, wie in der gegenwärtigen Untersuchung, kein Bezug zur Proliferations-Aktivität der Tumore etabliert werden [222]. Ein anderer Bericht zeigte hohe Rb Proteinexpression bei 161 von 172 Fällen wobei nur 11 Karzinome negativ waren. In dieser Studie konnte der isolierte Verlust der Rb Expression, anlog zu den hier erhobenen Daten, nicht mit einem signifikant schlechterem Gesamtüberleben in Verbindung gebracht werden [223].

↓79

Für Cyclin D1 wurde zuvor bei Vorliegen einer Überexpression des Proteins ein negativer Effekt auf die Prognose beschrieben [179]. Wie auch bei anderen Tumoren mit Überexpression von Cyclin D1 kann dies, wie für das Plattenepithelkarzinom des Ösophagus gezeigt wurde, durch Genamplifikation des für Cyclin D1 kodierenden CCND1 Genlokus erfolgen [224]. Cyclin D1 Überexpression ist direkt mit der Proliferationsaktivität ösophagealer Plattenepithelkarzinome assoziiert, wie die Expression von PCNA, eines indirekten Markers für Proliferation, zeigte [204,222]. Dies legt nahe, dass Deregulation von Cyclin D1 eine der treibenden Kräfte der Proliferation in diesen Tumoren ist. Neben der Bedeutung für die Tumorproliferation wurde auch die Bedeutung der Cyclin D1 Expression für das Therapieansprechen untersucht. In einigen Studien konnte Überexpression von Cyclin D1 als negativer prognostischer Faktor etabliert werden [141,179,225,226,227,228,229,230,231] während andere Studien keine prognostische Relevanz fanden [203,232]. Patienten mit CCND1 Genamplifikation zeigten ebenfalls eine schlechtere Prognose [141]. Bei 34 Patienten mit neoadjuvanter Radiochemotherapie zeigte sich zudem eine Reduktion der Größe des Primärtumors um 75,3% in der Cyclin D1-negativen und um 42,7% in der Cyclin D1-positiven Gruppe (p = 0,0025) [233], so dass Cyclin D1-Überexpression als prädiktiver Faktor für Ansprechen auf Radiochemotherapie dienen könnte.

Eine vergleichbare Störung des G1-Restriktionspunkts kann in humanen Tumoren durch Inaktivierung des p16INK4a Gens entstehen [179]. Inaktivierung von p16 kann auf verschiedenen Ebenen entstehen, und zwar durch homozygote Inaktivierung beider INK4a Genloci, heterozygote Inaktivierung eines Lokus und Inaktivierung des zweiten Lokus durch Methylierung, Punktmutation, Deletion in Exon 1 oder 2 mit resultierenden aberranten Proteinen oder Abschaltung durch epigenetische Mechanismen, insbesondere Hypermethylierung von CpG Inseln im p16 Promotor oder Inaktivierung beider Allele über letztgenannte Mechanismen. Die Mehrzahl dieser genetischen oder epigenetischen Veränderungen führt zu veringerter oder komplettem Verlust der p16INK4a Proteinexpression [234]. Aus tumortherapeutischer Sicht ist zudem von Interesse, dass humane Tumorzellen mit fehlender p16 Aktivität resistent gegenüber DNA-Schädigungs-induziertem Wachstumsarrest sind im Vergleich zu Zellen mit intakter p16 und Rb Expression und Funktion [235].

In der gegewärtigen Analyse ist gezeigt, dass Patienten mit intakter Rb und p16INK4a Expression und gleichzeitig fehlender Cyclin D1 Überexpression eine deutlich bessere Prognose zeigten als die Patienten, bei denen ein oder mehrere Defekte in diesen Genen nachweisbar waren. Dies ist im Einklang mit den oben beschriebenen publizierten Daten zu Einzelgenanalysen. Allerdings zeigte sich eine deutliche Überlegenheit der Multi- gegenüber der Einzelgenanalyse. Der Grund hierfür liegt sicherlich in der Tatsache begründet, dass Inaktivierungen von Komponenenten des Rb-Signalwegs häufig alternativ sind und bei Betrachtung nur eines Gens nicht sicher zwischen Tumoren mit bzw. ohne Inaktivierung des Rb-Signalwegs und entsprechend deregulierter Wachstumskontrolle des Tumors unterschieden werden kann.

5.5 Störung des späten G1-Restriktionspunkts

↓80

Neben der Inaktivierung des frühen G1-Restriktionspunkts spielt die Störung des späten G1 Restriktionspunkts eine wesentliche Rolle in der Tumorpathogenese und -biologie. Überexpression von Cyclin E ist ausreichend, um S-Phaseprogression auszulösen. Cyclin E/CDK2 Komplexe werden wiederum durch den CDK Inhibitor p27KIP1 gehemmt. Für den Verlust der p27 Proteinexpression konnte in publizierten Studien gezeigt werden, dass diese Störung mit einer schlechteren Prognose assoziiert ist [209,236,237,238,239]. Ein solcher Einfluss auf die Krankheitsprognose konnte jedoch nicht für erhöhte Proteinexpression von Cyclin E gezeigt werden [229,231,240]. Ebenso zeigten andere Studien keine prognostische Relevanz für das Niveau der p27 Expression [230,241].

Insgesamt war die Datenlage zu p27, vor allem aber für Cyclin E, unklar bezüglich der prognostischen Bedeutung. Aus diesem Grund wurden beide Schlüsselkomponenten in die Analyse des Rb-Signalwegs einbezogen. Wie diese Analysen in der vorliegenden Arbeit zeigen, ist der Verlust von p27 von grenzwertig signifikanter Bedeutung für die Prognose. Patienten mit hoher Expression des p27 Proteins zeigten eine etwas bessere Prognose als Patienten mit p27 Verlust. Interessanterweise war dieser Effekt unabhängig vom Rb/Cyclin D1/p16/p21 Status. Ebenso zeigte eine Kontingenztafelanalyse, dass Verlust von p27 und Inaktivierung der anderen untersuchten Rb-Signalwegskomponenten unabhängig voneinander auftreten. Durch Einbeziehung von p27 ist somit eine Verbesserung der Prognoseabschätzung möglich. Hingegen zeigte sich kein Einfluss von Cyclin E auf die Prognose und zwar weder bei Betrachtung von Cyclin E alleine bzw. im Kontext mit der Inaktivierung anderer Rb-Signalwegskomponenenten. Der Grund hierfür ist unklar, insbesondere im Hinblick auf die positiven Daten zu Cyclin E als prognostischen Faktor in anderen Tumorentitäten. Allerdings kann aufgrund der vorliegenden Daten im Einklang mit publizierten Studien geschlossen werden, dass Cyclin E keine treibende Kraft in der Tumorprogression des Ösophaguskarzinoms darstellt.

Diese Interpretation wird gestützt durch die Analysen zum Zusammenhang zwischen Inaktivierung von Rb-Signalwegskomponenenten im Verhältnis zur Ki-67 Expression als Surrogatmarker für Tumorzellproliferation. Hier zeigte sich wie erwartet, dass die Tumorzellproliferation in Folge der Deregulation von Rb/Cyclin D1/p16/p21 erhöht war, die zusätzliche Inaktivierung von p27 und Cyclin E aber keine weitere Steigerung bewirkte.

5.6 Prognostische Bedeutung der Inaktivierung von Komponenten des p53-Signalwegs

↓81

Um die Identifikation von Patienten mit günstigem oder ungünstigem Risikoprofil, d.h. Langzeitüberleben oder frühem Tod nach Therapie ihres Plattenepithelkarzinoms des Ösophagus weiter zu verbessern, wurden Komponenten des p53 Signalwegs in die Analyse einbezogen, und zwar p53 und die beiden p53-Effektoren p21CIP/WAF-1 und Bax. P53 wird als Effektormolekül verschiedener Stress-Signalwege aktiviert und wirkt über die Aktivierung von Inhibitoren des Zellzyklus wachstumshemmend bzw. kann Apoptose induzieren, z.B. durch Stimulation der Bax-Proteinexpression.

Das p53 Protein ist ein transkriptioneller Aktivator bzw. Repressor einer Vielzahl und, mit Entwicklung neuer genomweiter Detektionsmethoden, ständig zunehmender Anzahl von Genen die an der Regulation von Zellzyklus und Apoptose beteiligt sind (Übersicht in [70,121]). Mutationen des p53 Gens werden in bis zu 50% der Fälle in verschiedenen Tumoren inklusive des Ösophaguskarzinoms gefunden [242,243]. Bis zum heutigen Zeitpunkt wurde eine Vielzahl von Untersuchungen zur Bedeutung des p53 Status und dessen Bezug zu Prognose oder Antwort auf Tumortherapie bei Patienten mit Plattenepithelkarzinom des Ösophagus durchgeführt. Das Ergebnis dieser monogenetischen Untersuchungen war allerdings enttäuschend. Initial wurde in einer Reihe von Untersuchungen ermutigende Ergebnisse publiziert, die p53 Inaktivierung durch Mutation oder Überexpression des p53 Proteins als negativen prognostischen Faktor zeigten [203,244,245,246,247,248,249]. Allerdings fand sich eine solche Assoziation von p53 Mutation und schlechter Prognose in einer Reihe weiterer, zumeist neuerer Untersuchungen nicht, so dass p53 nicht der entscheidende die Tumorbiologie und Prognose zu bestimmende Faktor beim Plattenepithelkarzinom des Ösophagus zu sein scheint [204,250,251,252].

Mutiertes p53 Protein hat häufig die Fähigkeit verloren, an p53-Erkennungssequenzen in p53-regulierten Promoteren zu binden [253]. Dies kann zu einem Defekt in der Expression von Zielgenen wie z.B. Bax führen. Zusätzlich kann die direkte Inaktivierung von weiter downstream im Signalweg gelegenen p53-Effektoren die Fähigkeit von p53 Zellzyklus-Arrest oder Apoptose auszulösen aufheben [70,174,254,255]. Aus diesem Grund wurden die p53-Effektoren Bax und p21CIP/WAF-1 in die Analyse einbezogen.

↓82

Bax ist ein Aktivator des mitochondrialen Apoptose-Signalwegs und kann direkt die Freisetzung von Cytochrom c aus Mitochondrien auslösen. Cytochrom c bildet zusammen mit dATP bzw. ATP und dem zytosolischen Protein APAF-1 und der Procaspase-9 das mitochondriale Apoptosom. Die Bindung von Cytochrom c und (d)ATP an APAF-1 löst eine Konformationsänderung in APAF-1 aus, wodurch die Bindung von Procaspase-9 in das Apoptosom ausgelöst wird. Hierdurch wird die autokatalytische Spaltung und Prozessierung der Procaspase-9 zur aktiven Caspase-9 begünstigt und die Caspase-Kaskade zur Aktivierung der Effektorcaspasen 3, 6, und 7 initiiert. Bax ist nicht nur ein zentraler Effektor der Apoptose sondern spielt auch eine zentrale Rolle in der Hemmung der Onkogen-induzierten Tumorgenese über den p53-Signalweg [256]. Weiterhin ist Bax ein Schlüsselfaktor in der Vermittlung der p53-abhängigen und -unabhängigen Apoptose nach Chemotherapie-induzierter DNA-Schädigung [257].

Wildtyp p53 ist ein transkriptioneller Aktivator des Bax Gens [258] und Überexpression von Wildtyp p53 erhöht die Expression des Bax Proteins [259]. Im Gegensatz hierzu führt die Inaktivierung von p53 nicht zwangsläufig zum Verlust der Bax Expression, da zusätzliche Faktoren an der Regulation der Aktivität des Bax Gens und der Bax Proteinexpression beteiligt zu sein scheinen [174,181]. Gleiches gilt für p21CIP/WAF-1 und dies vermag die fehlende Korrelation zwischen p53 Status und Expressionsniveau von Bax und p21CIP/WAF-1 Protein beim Plattenepithelkarzinom des Ösophagus zu erklären [138].

Im Gegensatz zu p53 war die Inaktivierung beider p53 Effektorgene, d.h. sowohl von Bax als auch von p21CIP/WAF-1 bei den jeweiligen Einzelgenanalysen mit einer schlechteren Prognose der Patienten korreliert. Wesentlich interessanter für die gegenwärtige Analyse war aber, dass die Inaktivierung von Bax unabhängig von der Inaktivierung der Komponenten des Rb Signalwegs Rb, p16 und Cyclin D1 war. Aus diesem Grund erlaubte die Kombination der Parameter Bax, Cyclin D1 und p16INK4a und, in eingeschränktem Umfang, von p21CIP/WAF-1 und Rb selbst, eine bessere Diskriminierung zwischen Patienten mit schlechter Prognose und hohem Risiko für frühen Tod nach Therapie und den Patienten mit guter Prognose und Langzeitüberleben in der aktuellen multifaktoriellen Analyse.

↓83

Schliesslich wurde gezeigt, dass die relativ niedrige Expression und die geringfügigen Expressionsunterschiede von Bcl-2 nicht relevant für die Krankheitsprognose sind. Dies ist von Interesse, da in einer Vielzahl von Veröffentlichungen das Expressionsverhältnis von antiapoptotischen Mitgliedern der Bcl-2 Familie wie z.B. Bcl-xL oder Bcl-2 selbst in Relation zu den pro-apoptotischen Mitgliedern wie z.B. Bax als entscheidend für die Apoptose-Empfindlichkeit und das Resistenzverhalten bei Chemo- oder Radiotherapie dargestellt wird. Neuere Ergebnisse hingegen zeigen, dass Bax, unabhängig von Bcl-2, Apoptose über den mitochondrialen Signalweg aktivieren kann indem es direkt und unabhängig von Bcl-2 die Freisetzung von Cytochrom c aus Mitochondrien auslöst [161]. In diesem Zusammenhang zeigten Untersuchungen bei Kindern mit akuter lymphoblastischer Leukämie, dass Verlust von Bax, jedoch nicht Veränderungen in der Bcl-2 Expression mit dem Wiederauftreten der Erkrankung und einem Defekt in der Aktivierung der Caspase-Signalkaskade assoziiert ist [182]. Zusätzlich bestimmt das Expressionsniveau von Bax, jedoch nicht des Bcl-2 Proteins, die Empfindlichkeit für Chemotherapie-induzierte Apoptose bei Patienten mit chronischer lymphatischer Leukämie [181]. Gleichermassen zeigte sich keine prognostische Relevanz der Bcl-xL Expression in einer grossen Serie von 172 Patienten mit Plattenepithelkarzinom des Ösophagus [260]. Dies bestätigt den Befund der vorliegenden Untersuchung und in anderen Tumorentitäten, dass Bax von grösserer Bedeutung für die Resistenz gegen Tumortherapie und für schlechte Prognose im Vergleich zu Bcl-2 oder Bcl-xL zu sein scheint [181,182].

5.7 Inaktivierung von Kontrollgenen und Mechanismus der Karzinogenese

Neben dieser Bedeutung für die Prognose deutet die offensichtliche Unabhängigkeit dieser genetischen Ereignisse auf unterschiedliche Mechanismen der Karzinogenese und Tumorprogression hin. Solche genetischen Ereignisse und Kombinationen von Inaktivierungen spezifischer Signalwegskomponenten können wiederum die Basis für die Entwicklung spezifischer klinisch-pathologischer Merkmale sein wie im vorliegenden Fall Grading und Nodalstatus. In der vorliegenden Studie zeigte sich eine klar Assoziation zwischen p21CIP/WAF-1 Verlust und Vorliegen lokoregionärer Lymphknotenmetastasen, d.h. N1-Status und konsequenterweise einem schlechteren Gesamtüberleben. Hingegen zeigten alle weiteren Korrelationen zwischen p21 Expressionsniveau mit klinisch-pathologischen Parametern ein negatives Ergebnis. Die Ursache hierfür könnte in der Tatsache liegen, dass die Mehrzahl dieser Ereignisse multifaktoriell bestimmt sind und daher, wie auch die Prognose der Tumorerkrankung, mit spezifischen genetischen Risikoprofilen korreliert und, weniger wahrscheinlich, mit Inaktivierung einzelner Gene. Hierfür spricht auch, dass nur durch Analyse von Kombinationen von Zellzyklusregulatoren des Rb-Signalwegs ein Einfluss auf die Wachstumsfraktion der Tumorzellen gefunden wurde.

5.8 Onkogene Transformation und Inaktivierung von Signalwegen

Auch bezüglich der Tumorpathogenese konnten in der vorliegenden Untersuchung teils überraschende Ergebnisse herausgearbeitet werden. Unstrittig ist, dass aktivierende Mutationen von K-ras eine wichtige Rolle bei der malignen Transformation gastrointestinaler Tumoren spielen. Für das K-ras Onkogen konnte in tierexperimentellen Systemen klar gezeigt werden, dass die onkogene Transformation obligat mit einer Inaktivierung des p14ARF/p53 Signalwegs einhergeht. Die alleinige Überaktivität zellulärer Onkogene wie K-ras oder c-myc löst in den betroffenen Zellen programmierten Zelltod oder Seneszenz aus und schützt hierdurch den Organismus vor ungehemmter und deregulierter Proliferation genetisch geschädigter Zellen in denen es zur Deregulation von Onkogenen gekommen ist.

↓84

Überraschend war daher, dass K-ras Mutation nicht mit einer erhöhten Rate von p53 Mutation einherging. Bezüglich der Bax Expression zeigte sich sogar eine erhöhte Bax-Expression bei den K-ras mutierten Tumoren. Ebenso war K-ras Mutation unabhängig von p53-Mutationen. Gleichfalls bestand kein Zusammenhang zwischen K-ras Mutation und Inaktivierung von Komponenten des Rb-Signalwegs, d.h. Verlust von Rb, p16, p21, p27, p53 Proteinexpression bzw. Überexpression von Cyclin D1 oder Cyclin E.

Der Grund für diese scheinbar paradoxen Befunde könnte in der Biologie der durch K-ras aktivierten Signalwege liegen. Neben der Stimulation der Proliferation durch Aktivierung der MAP-Kinasekaskade, Aktivierung von fos/jun Transkriptionsfaktoren und hieruas resultierender Durchbrechung des G1-Restriktionspunkts vermittelt K-ras über die Aktivierung der PI3-Kinase und der nachgeschalteten PKB/Akt Kinase Schutz vor Apoptose. Somit haben K-ras mutierte Tumore weniger Bedarf, den Rb-Signalweg oder den p14ARF/p53/Bax Signalweg durch genetische Ereignisse wie Mutation, Deletion oder globale Veränderungen des DNA-Methylierungsmusters zu inaktivieren. Dies könnte auch die andeutungsweise bessere Prognose der K-ras mutierten Tumore in dieser Studie erklären.

Zusammenfassend zeigen die vorliegenden Daten, dass eine Multigen- oder „Multimarker“-Analyse von Genen, die konsekutiv oder synergistisch in Zellzyklus- und Apoptose-Signalwegen agieren zur Prognoseabschätzung der Analyse individueller Gene deutlich überlegen ist [174,255]. Die Identifikation solcher genetischer Markerprofile sollte sich auch zukünftig als nützlich für die klinische Entscheidungsfindung in der Therapie maligner Tumore erweisen und wird konventionelle klinische pathologische Faktoren komplementieren, die bisher keine ausreichende Prognoseabschätzung erlauben.

↓85

Ziel sich nun anschliessender Untersuchungen ist daher, die Untersuchung der hier als prognostisch relevant identifizierten Rb-Signalwegskomponenten und Apoptosekontrollgene um zusätzliche Parameter zu erweitern, um die Ausagekraft weiter zu verbessern, und den prädiktiven Wert in kontrollierten, prospektiven Studien zur zytotoxischen adjuvanten bzw. palliativen Chemo- und Radiochemotherapie von Patienten mit Ösophaguskarzinom zu validieren und zu spezifizieren.


© Die inhaltliche Zusammenstellung und Aufmachung dieser Publikation sowie die elektronische Verarbeitung sind urheberrechtlich geschützt. Jede Verwertung, die nicht ausdrücklich vom Urheberrechtsgesetz zugelassen ist, bedarf der vorherigen Zustimmung. Das gilt insbesondere für die Vervielfältigung, die Bearbeitung und Einspeicherung und Verarbeitung in elektronische Systeme.
XDiML DTD Version 4.0Zertifizierter Dokumentenserver
der Humboldt-Universität zu Berlin
HTML-Version erstellt am:
08.03.2005