Aus der Klinik für Mund-, Kiefer- und Gesichtschirurgie
– Klinische Navigation und Robotik

der Medizinischen Fakultät Charité
der Humboldt-Universität zu Berlin

Dissertation

Der Nachweis der Telomeraseaktivierung
in Tumorgeweben und dem Tumor benachbarten Geweben von Plattenepithelkarzinomen
im Kopf-Hals-Bereich

Zur Erlangung des akademischen Grades
Doctor medicinae (Dr. med.)

vorgelegt der Medizinischen Fakultät Charité
der Humboldt-Universität zu Berlin

von
Ulrike Gurr

aus Berlin

Dekan: Prof. Dr. Joachim W. Dudenhausen

Gutachter:
1. Prof. Dr. mult. h.c. J. Bier
2. Prof. Dr. Dr. B. Hoffmeister
3. Prof. Dr. Dr. W. Wagner

Datum der Promotion:25.09.2003

Zusammenfassung

Plattenepithelkarzinome der Kopf-Hals-Region sind durch einen aggressiven Krank–heitsverlauf mit häufigem Auftreten von Lokalrezidiven und Zweitkarzinomen gekennzeichnet. Molekulare Veränderungen des Tumorrandes und der Tumor benachbarten Gewebe könnten in Ergänzung zur Histopathologie eine kurative chirurgische Tumorextirpation bestätigen. Wir bestimmten die Telomeraseaktivität in verschiedenen Entfernungen vom Tumorzentrum, um ihre Verwendung als molekularen Marker zu prüfen. Wir untersuchten 80 kryokonservierte Gewebeschnitte von 40 Patienten mit einem Plattenepithelkarzinom im Kopf-Hals-Bereich, davon 33 karzinomfreie Tumorrandgewebe. 50% der 20 karzinomhaltigen Gewebe, 28 % der karzinomfreien Tumorrandgewebe und 35 % der tumorfernen Proben waren telomerasepositiv. Der Vergleich ergab keinen statistisch signifikanten Unterschied. Es konnte keine sichere Korrelation zwischen der Telomeraseaktivität in den untersuchten Geweben mit dem weiteren Krankheitsverlauf gefunden werden, allerdings zeigte die Telomerasepositivität in karzinomfreien Tumorrändern die Tendenz, mit einer besseren Prognose zu korrespondieren. Unsere Befunde sollten an einer größeren und homogeneren Patientengruppe überprüft werden.

Eigene Schlagworte: Kopf-Hals-Tumore, Plattenepithelkarzinom, Tumorrand, Telomerase, Prognose, TRAP-Assay, ELISA

Abstract

Squamous cell carcinomas of the head-neck region are characterised by an aggressive course of disease and a strong tendency to loco-regional recurrence and second primary tumours. As a complement to histopathology, molecular changes of tumour marginal and tumor distant tissue may confirm curative surgical tumour extirpation. We tested telomerase activity at different distances to the tumour centre of squamous cell carcinomas to consider the use for molecular marker. We examined 80 cryo-conserved tissue samples from 40 patients with a squamous cell carcinoma of the head-neck region, among them 33 carcinoma-free margin tissues. 50 % of the carcinoma centres, 28 % of the carcinoma-free margin tissues and 35% of the tumour distant samples were telomerase-positive. The comparison showed no statistically significant difference. We have found no reliable correlation between telomerase activity in the carcinoma-free margin tissues and the further course of disease, but telomerase positivity in carcinoma-free tumour margins tended to correlate with a better prognosis. Confirmation of the results in a larger and more homogeneous patient group is needed.

Keywords: Head-and-neck cancer, squamous cell carcinoma, surgical tumor margin, telomerase, prognosis, TRAP assay, ELISA

Inhaltsverzeichnis

• 1.  Einleitung
  • 1.1. Telomere und Telomerase
    • 1.1.1. Geschichte der Telomere und der Telomerase
    • 1.1.2. Charakterisierung der Telomere und der Telomerase
      • 1.1.2.1 Aufbau und Funktion der Telomere
      • 1.1.2.2 Aufbau und Funktion der Telomerase
      • 1.1.2.3 Regulierung der Telomeraseaktivität
    • 1.1.3. Bedeutung der Telomere und der Telomerase
      • 1.1.3.1 Bedeutung der Telomere
      • 1.1.3.2 Bedeutung der Telomerase
    • 1.1.4. Telomere, Telomerase und Immortalisierung
    • 1.1.5.  Telomeraseaktivierung in Tumoren
      • 1.1.5.1 Telomeraseaktivierung während der Karzinogenese
      • 1.1.5.2 Telomeraseaktivierung in prämalignen Geweben aus demKopf-Hals-Bereich
      • 1.1.5.3  Telomeraseaktivierung in malignen Tumoren und Tumorrandgeweben verschiedener Lokalisation
      • 1.1.5.4 Telomeraseaktivierung in Plattenepithelkarzinomen des Kopf-Hals-Bereiches (HNSCC) und ihren angrenzenden Geweben
  • 1.2. Plattenepithelkarzinome des Kopf-Hals-Bereiches (HNSCC)
    • 1.2.1.  Lokalrezidive und minimal residual disease (MRD)
    • 1.2.2. Ergänzung der histopathologischen Diagnose von Tumorrandgeweben aus Kopf-Hals-Tumoren durch Marker
    • 1.2.3. Risikofaktoren der Plattenepithelkarzinome im Kopf-Hals-Bereich
    • 1.2.4. Epidemiologie der Plattenepithelkarzinome im Kopf-Hals-Bereich
  • 1.3. Nachweismöglichkeiten der Telomerase
    • 1.3.1.  Messung der Telomeraseaktivität durch den TRAP-Assay
    • 1.3.2. Nachweis der Telomeraseaktivität mit einem PCR-ELISA
  • 1.4.  Aufgabenstellung
• 2.  Materialien und Methoden
  • 2.1. Patienten
    • 2.1.1. Charakterisierung der Patientengruppen
      • 2.1.1.1 Charakterisierung der Tumorpatienten
      • 2.1.1.2  Charakterisierung der Kontrollpatienten
  • 2.2.  Materialgewinnung
    • 2.2.1. Gewebeentnahme
    • 2.2.2.  Histopathologische Kontrolle der molekularbiologischuntersuchten Gewebe
    • 2.2.3. Zelllinien und deren Kultivierung
      • 2.2.3.1 Herkunft der Zelllinien
      • 2.2.3.2  Kultivierung der Zelllinien
    • 2.2.4. Aufschluss der Gewebe und Zellen für die PCR
      • 2.2.4.1 Trypsinierung der untersuchten Zelllinien
      • 2.2.4.2  RNA-Lysierung
      • 2.2.4.3 Proteinbestimmung in den Lysaten
  • 2.3. Bestimmung der Telomeraseaktivität
    • 2.3.1. Testprinzip des Nachweises der Telomeraseaktivität
    • 2.3.2. Telomerase-PCR
    • 2.3.3.  Hybridisierung des PCR-Produktes
    • 2.3.4. ELISA zum Nachweis des PCR-Produktes
  • 2.4. Valuierung der Methode
    • 2.4.1. Negativ-, Positiv- und Versuchskontrollen
    • 2.4.2. Untersuchung der negativen Versuchsergebnisse
      • 2.4.2.1 Kontrolle des Amplifikationsprozesses
      • 2.4.2.2 Untersuchung einer Telomerasehemmung
  • 2.5.  Statistische Auswertung der Ergebnisse
• 3. Ergebnisse
  • 3.1. Extinktionsergebnisse des PCR-ELISA
    • 3.1.1. Ermittlung des Cut-off-Wertes
    • 3.1.2. Bewertungsgrundlage der ELISA-Ergebnisse
    • 3.1.3. Bewertung der Telomeraseaktivität in den Geweben der Kontrollpatienten
    • 3.1.4.  Bewertung der Telomeraseaktivität in den Zelllinien
    • 3.1.5. Bewertung der Telomeraseaktivität in den Geweben der Tumorpatienten
    • 3.1.6.  Untersuchung aller negativen Proben
      • 3.1.6.1 Ergebnisse der PCR mit dem internen Standard zur Überprüfung der Hemmung der Taq-Polymerase
      • 3.1.6.2 Ergebnisse der Überprüfung der Telomerasehemmung
    • 3.1.7.  Statistische Auswertung der Telomeraseaktivität
  • 3.2.  Auswertung der Patientendaten
    • 3.2.1. Alters- und Geschlechtsverteilung der Patienten
    • 3.2.2. Nikotin- und Alkoholabusus der Patienten
    • 3.2.3.  Lokalisation der untersuchten Gewebe
    • 3.2.4.  Verlauf der postoperativen Tumorerkrankung
    • 3.2.5.  Statistische Auswertung der klinischen Daten
      • 3.2.5.1 Altersstruktur
      • 3.2.5.2  Nikotin- und Alkoholkonsum
      • 3.2.5.3 Differenzierungsgrad und Stadieneinteilung der Karzinome in Bezug zur Telomeraseaktivität
      • 3.2.5.4 Krankheitsverlauf in Bezug zur Telomeraseaktivität
• 4.  Diskussion
  • 4.1. Telomeraseaktivität in Zelllinien von Plattenepithelkarzinomen
  • 4.2. Bedeutung der Telomeraseaktivierung als diagnostischer und prognostischer Marker
    • 4.2.1. Bedeutung der Telomeraseaktivierung in den Tumorzentren von Plattenepithelkarzinomen im Kopf-Hals-Bereich
      • 4.2.1.1 Beziehung der Telomeraseaktivität in den Geweben aus dem Tumorzentrum zum postoperativen Krankheitsverlauf
      • 4.2.1.2 Beziehung der Telomeraseaktivität in den Geweben aus dem Tumorzentrum zur Tumordifferenzierung und zum Tumorstadium
    • 4.2.2. Bedeutung der Telomeraseaktivierung in Tumorrandgewebenund tumorentfernten Geweben von Plattenepithelkarzinomenim Kopf-Hals-Bereich
      • 4.2.2.1 Theorie der minimal residual disease (MRD) in Tumorrandgeweben und tumorentfernten Geweben
      • 4.2.2.2 Theorie der Feldkanzerisierung in Tumorrandgeweben undtumorentfernten Geweben
      • 4.2.2.3  Aktivierung von mononukleären Zellen in Tumorrandgeweben und tumorentfernten Geweben
      • 4.2.2.4  Bedeutung der Telomeraseaktivität in Tumorrandgeweben als prognostischer Marker
  • 4.3.  Einordnung der Patienten hinsichtlich Tumorlokalisation, Alter und Geschlecht der Patienten sowie Tumorrisikofaktoren
  • 4.4.  Vergleich der Befunde der Telomeraseaktivierung mit dem Nachweis von HPV und p53 in früheren Tumorprojekten
    • 4.4.1.  Vergleich ausgewählter Tumorpatienten zur diagnostischen Bedeutung von Telomeraseaktivität, HPV und p53 in Tumorzentren von Plattenepithelkarzinomen
    • 4.4.2. Vergleich ausgewählter Tumorpatienten zur prognostischen Bedeutung der Telomeraseaktivität
  • 4.5. Ausblick: Möglichkeit einer Anti-Telomerase-Therapie
• 5.  Zusammenfassung
• Literaturverzeichnis
• Abkürzungsverzeichnis
• Danksagung
• Erklärung an Eides Statt
• Publikationen

Tabellen

• Tabelle 1: Telomeraseaktivität in prämalignen Läsionen des Kopf-Hals-Bereiches
• Tabelle 2: Telomeraseaktivität in wichtigen malignen Tumoren
• Tabelle 3: Telomeraseaktivität in Kopf-Hals-Tumoren
• Tabelle 4: Telomeraseaktivität in benachbarten Geweben von Kopf-Hals-Tumoren
• Tabelle 5: Nachweismöglichkeiten von Telomerase und Telomeren (nach Keith et al [73])
• Tabelle 6: Zusammenstellung der drei Patientengruppen
• Tabelle 7: Tumorlokalisation der 40 Tumorpatienten
• Tabelle 8: Charakterisierung der 20 Tumorpatienten der Gruppe I mit drei untersuchten Tumorgebieten
• Tabelle 9: Charakterisierung der 20 Tumorpatienten mit karzinomfreiem Tumorrandgewebe (Gruppe II)
• Tabelle 10: Lokalisation der Gewebe von 40 tumorfreien Kontrollpatienten
• Tabelle 11: Charakterisierung der 40 Kontrollpatienten ohne Tumorerkrankung (Gruppe III)
• Tabelle 12: Herkunft der untersuchten Zelllinien von Plattenepithelkarzinomen
• Tabelle 13: Kultivierung der Zelllinien
• Tabelle 14: Zusammensetzung der Reagenzien zur Proteinbestimmung nach Bio-Rad
• Tabelle 15: In der PCR eingesetztes Reaktionsvolumen von 50 µl
• Tabelle 16: Zusammenstellung der Temperaturen und des zeitlichen Ablaufes der PCR
• Tabelle 17: Für die Hybridisierung und den Nachweis im ELISA verwendete Reagenzien
• Tabelle 18: Zusammensetzung der mitgeführten Versuchskontrollen
• Tabelle 19: Zusätzlich benötigte Reagenzien bei der Verwendung des internen Standards
• Tabelle 20: Extinktionsgruppen zur Bewertung der Telomerasespiegel
• Tabelle 21: Extinktionswerte der tumorfreien Kontrollgewebe von 40 Patienten (Gruppe III)
• Tabelle 22: Extinktionswerte der drei Zelllinien bei verschiedenen Proteinmengen pro 50 µl PCR-Ansatz
• Tabelle 23: Extinktionswerte in den Tumorgeweben von 20 Patienten mit drei untersuchten Tumorgebieten (Gruppe I)
• Tabelle 24: Extinktionswerte in den karzinomfreien Tumorrandgeweben von 20 Patienten (Gruppe II)
• Tabelle 25: Telomerasespiegel der Gewebe von 39 Tumorpatienten
• Tabelle 26: Extinktionen in ausgewählten telomerasenegativen Geweben (n = 21) untersucht auf eine Hemmung der Telomerase
• Tabelle 27: Statistischer Vergleich der Telomerasespiegel* bzw. der Telomeraseaktivität** in den Geweben zwischen Tumor- und Kontrollpatienten
• Tabelle 28: Prozentuale Verteilung der Rauch- und Trinkgewohnheiten der Patienten
• Tabelle 29: Nikotin- und Alkoholkonsum der Patienten
• Tabelle 30: Lokalisation der untersuchten Gewebe
• Tabelle 31: Verlauf der Tumorerkrankung und das therapeutische Vorgehen nach der Gewebeentnahme bei 20 Tumorpatienten mit drei untersuchten Gewebegebieten (Gruppe I)
• Tabelle 32: Verlauf der Tumorerkrankung und das therapeutische Vorgehen nach der Gewebeentnahme bei 20 Tumorpatienten mit dem untersuchten karzinomfreien Tumorrand (Gruppe II)
• Tabelle 33: Statistischer Vergleich der Tumor- und Kontrollpatienten in ihrer Altersstruktur
• Tabelle 34: Korrigierte Residuen bei den Tumor- und Kontrollpatienten beim Nikotinkonsum
• Tabelle 35: Korrigierte Residuen bei den Tumor- und Kontrollpatienten beim Alkoholkonsum
• Tabelle 36: Statistischer Zusammenhang zwischen der Telomeraseaktivität bei den Tumorpatienten in Abhängigkeit vom Tumordifferenzierungsgrad
• Tabelle 37: Statistischer Zusammenhang zwischen der Telomeraseaktivität bei den Tumor–patienten in Abhängigkeit von der Stadieneinteilung
• Tabelle 38: Mittlere Dauer der rezidivfreien Zeit bis zum Eintreten des ersten Krankheitsrück–falls bei 20 Tumorpatienten mit untersuchten Tumorzentren
• Tabelle 39: Mittlere Dauer der rezidivfreien Zeit bis zum Eintreten des ersten Krankheits–rückfalls bei den 33 Patienten mit karzinomfreien Tumorrandgeweb
• Tabelle 40: Statistischer Vergleich der Telomeraseaktivität bei den Tumorpatienten mit dem Auftreten eines Krankheitsrückfalles
• Tabelle 41: Histopathologische Bewertung der 33 karzinomfreien Tumorrandgewebe hinsicht–lich einer lymphozytären Reaktion
• Tabelle 42: Histopathologische Bewertung der 20 tumorentfernten Gewebe hinsichtlich einer lymphozytären Reaktion
• Tabelle 43: Statistischer Zusammenhang zwischen der Telomeraseaktivität und der lympho–zytären Reaktion in den Tumor benachbarten Geweben
• Tabelle 44: Statistischer Zusammenhang zwischen der Telomeraseaktivität und den p53- bzw. HPV-Befunden in Tumorzentrum- und tumorfernen Geweben
• Tabelle 45: Telomerase-, HPV- und p53-Befunde im Tumorzentrum- und tumorfernen Geweben
• Tabelle 46: Telomeraseaktivität, HPV- und p53- Befunde in den Tumorzentren der drei ausgewählten Tumorpatienten 86, 148 und 679

Bilder

• Abbildung 1: Struktur des Chromosoms mit den Telomeren (modifiziert nach Dahse et al [29]; mit freundlicher Genehmigung der Autoren und vom Springer-Verlag)
• Abbildung 2: Chromosomen in der Metaphase im Fluoreszenzmikroskop (nach Parkinson et al [124]; mit freundlicher Genehmigung der Autoren und von Elsevier Science)
• Abbildung 3: Aufbau der Telomerase (modifiziert nach Martens und Lange [98]; mit freundlicher Genehmigung der Autoren und des Verlags)
• Abbildung 4: Standardkurve zur Ermittlung der Proteinkonzentration
• Abbildung 5: Nachweis der Telomeraseaktivität mit Hilfe des PCR-ELISA-Kits (mit freundlicher Genehmigung von Roche-Diagnostics, Mannheim, 1997)
• Abbildung 6: Telomeraseaktivität in den Tumorgeweben von 20 Patienten mit drei untersuchten Tumorgebieten (Gruppe I)
• Abbildung 7: Telomeraseaktivität in Geweben von 40 Patienten mit Plattenepithelkarzinom und in Kontrollgeweben von 40 Patienten ohne Tumor
• Abbildung 8: Verteilung der Gewebe auf die Lokalisation
• Abbildung 9: Altersverteilung der Patientengruppen getrennt nach Geschlecht
• Abbildung 10: Kaplan-Meier-Kurve zur rezidivfreien Zeit für die Tumorpatienten in Abhängigkeit einer Telomeraseaktivität im Tumorzentrum (n = 20)
• Abbildung 11: Kaplan-Meier-Kurve zur rezidivfreien Zeit für die Tumorpatienten in Abhängigkeit einer Telomeraseaktivität im Tumorrand (n = 32)
• Abbildung 12: Telomeraseaktivität in der Zelllinie UM-SCC 14C und im Tumorzentrum von Patient 148 mit vergleichender Gel-Elektrophorese[Matthes und Lehmann, Max-Delbrück-Centrum Berlin-Buch]