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Material und Methoden

3.1 Zellbiologische Methoden

3.1.1 Zellkultur

3.1.1.1 Das Zellmaterial

Abb. 3-1 Rasterelektronenmikroskopische
Abbildungen von HOS TE85 (oben) und
primären Osteoblasten aus dem Mini-Schwein
(unten) in Monolayerkultur, Balken 10 µm.

Humane osteogene Sarkomazellen (HOS TE-85): Die osteogene Zelllinie HOS TE-85 wurde uns freundlicherweise von der Fa. Co.don zur Verfügung gestellt. Die Zellen wurden routinemäßig in DMEM:HAM’s F12 (1:1) kultiviert, dem 10% fetales Kälberserum (FKS), 100 IU/ml Penicillin, 100 mg/ml Streptomycin und 2.5 mg/ml Amphotericin zugesetzt wurden (alle Zellkulturmedien und –zusätze von Biochrom). Die Inkubation erfolgte bei 37°C und 5% CO2 in humider Atmosphäre. Die Zellen wurden alle 3-4 Tage unter Einsatz von Trypsin subkultiviert, jedoch höchstens bis zur 40-ten Passage. Die Verdopplungszeit liegt bei ca. 24 h. HOS TE-85 zeigen osteogene Eigenschaften und eine deutliche ALP-Aktivität. Sie stellen damit ein geeignetes Zellmodell für die Untersuchungen dar.

Primäre Osteoblasten (Mini-Schwein): Primäre Osteoblasten wurden aus dem Femur von Mini-Schweinen isoliert, die uns freundlicherweise vom Fachbereich Versuchstierhaltung der Humboldt-Universität überlassen wurden. Dazu wurde der Femur 5-10 min nach Tötung des Tieres in steriles PBS mit Streptomycin, Penicillin und Amphotericin (in den auch für die Zellkulturen verwendeten Konzentrationen) überführt. Nach der Entfernung von Knochenhaut und Knochenmark wurden die Knochen in ca. 2 mm3 große Stücken zerkleinert, mehrmals mit Puffer gespült und anschließend in Zellkulturflaschen überführt oder eingefroren. Für die Kultivierung kam ebenfalls DMEM:HAM’s F12 (1:1)- Medium zum Einsatz, dem jedoch 20% FKS zugesetzt wurden (Antibiotika/Antimykotikum wie oben). Mediumwechsel erfolgte regelmäßig alle 3-4 Tage; nach ca. 2-3 Wochen konnte erstmalig passagiert werden. Die Zellen konnten maximal bis zur 10. Passage subkultiviert werden. Der Nachweis der Identität der Osteoblasten erfolgte durch Bestimmung ihrer ALP-Aktivität. Der Umsatz des Substrates Di-Natriumphenylphosphat lag nach 30 min bei den primären Osteoblasten mit 0.013 mM/104 Zellen im Bereich des für die HOS TE85 ermittelten Umsatzes von 0.019 mM/104 Zellen. Somit kann davon ausgegangen werden, dass es sich bei den isolierten Zellen wirklich um Osteoblasten handelt.

Fibroblasten L929 (Maus): Die Fibroblastenzelllinie L929, freundlicherweise zur Verfügung gestellt von der AG Membranphysiologie (Prof. Dr. Fuhr), wurden routinemäßig in RPMI 1640 kultiviert, dem 5% fetales Kälberserum (FKS), HEPES 25 mM, 100 IU/ml Penicillin, 100 mg/ml Streptomycin und 2.5 mg/ml Amphotericin zugesetzt wurden. Die Inkubation erfolgte bei 37°C und 5% CO2 in humider Atmosphäre. Subkultiviert wurde ca. einmal pro Woche. Die Verdopplungszeit beträgt ca. 21-24 h.

3.1.1.2 3D-Kultur (Eingebettete Zellen)

Im Hinblick auf eine stärkere Annäherung an in vivo Verhältnisse wurden die Zellen in eine Collagenmatrix eingebettet. Innerhalb dieser Matrix wurden die Zellen mehrere Wochen kultiviert. Die Zellen haften dort sehr schnell an und zeigen bald eine charakteristische Morphologie begleitet von einem etwas verzögerten Wachstum. Auffälliges Merkmal der Zellen ist eine extreme Spindelform, wobei die einzelnen Zellen oft fibrillenartig aneinandergelagert sind. Diese in der 2D-Kultur ungewöhnliche Strukturierung ist vermutlich durch die Anordnung der Collagenfasern bedingt (Abb. 3-3.2, Abb. 3-3.3). Zur Veranschaulichung der Unterschiede in Morphologie und Wachstum sind im Folgenden Abbildungen von zellhaltigen Gelen (3D) und herkömmlich kultivierten Zellen innerhalb einer Monolayer (2D) gegenübergestellt (Abb. 3-3.3). Bei gleicher Zelldichte zum Zeitpunkt der Einsaat wird jedoch dort schon nach 2 Tagen Konfluenz erreicht.

Zur Herstellung dreidimensionaler Zellsysteme wurden 4 Teile Collagen G (Biochrom), 1 Teil 5fach konzentriertes Medium und 2 Teile einer hochkonzentrierten Zellsuspension gemischt, ausplattiert und nach dem gelieren mit frischem Medium überschichtet. Die Zellzahl im Gel betrug ca. 5∙104/well.

Abb. 3-2 Wachstumsverhalten von HOS nach 3, 5 und 7 Tagen, eingebettet in Collagengel. (Balken entspricht 50 µm)

Abb. 3-3 Durchlicht- und Fluoreszenzaufnahmen von HOS. Links: im Gel, rechts: in Monolayer. (Balken entspricht 50 µm)

3.1.1.3 Synchronisation der Zellen

Der individuelle Zustand der Zelle innerhalb des Zellzyklus spielt eine große Rolle bei der Stimulierbarkeit durch verschiedene Reize. Deshalb wurden verschiedene Methoden eingesetzt, um die Zellpopulation von HOS TE-85 zu synchronisieren. Um die Anteile der einzelnen Zellzyklusphasen an der Gesamtpopulation zu bestimmen, wurde der DNA-Gehalt aller Proben mit Hilfe von FACS-basierten Messungen analysiert (siehe 3.1.1.4). Parallel erfolgten bei jeder Probenentnahme Vitalfärbungen mit Trypanblau. Zur Einstellung der einzelnen Zellzyklusphasen wurden verschiedenste Protokolle aus der Literatur verwendet und auf HOS-TE85 angepasst. Es wurden sowohl verschiedene Inhibitorkonzentrationen und also auch verschiedene Applikationszeiten getestet [170,171,172,173,174,175,176]. Außerdem fand eine Überprüfung der Reversibilität statt, indem über mehrere Stunden nach Entfernung des Inhibitors die Zellpopulation charakterisiert wurde.

Für die Synchronisationsexperimente wurden die Zellen in 24-Wellplatten mit einer Dichte von 1∙104/ml eingesät und einen Tag weiterkultiviert, um die Kulturen in die logarithmische Wachstumsphase zu bringen. Der normale Teilungszyklus von HOS-TE85 dauert ca. 24 h, die unbehandelte Population enthält 57% G1/G0-Phasen, 30% S-Phasen und 13% G2/M-Phasen.

Folgende Standardprotokolle für die Akkumulation der Zellpopulation in verschiedenen Zyklusstadien wurden erarbeitet:

G 0 : HOS-Zellen wurden bis etwa 80% Konfluenz in Medium mit 10% FKS kultiviert, dann mehrfach mit Puffer gewaschen und anschließend für 24 h in Medium mit 0.1% FKS überführt. Danach befinden sich ca. 81% der Zellen in G0/G1.

G 1 : Nach der Kultivierung in Medium mit 0.1% FKS für 24 h wurden die Zellen wieder mit 10% FKS versorgt. Nach einer etwa zweistündigen Erholungsphase erfolgt der synchrone Wiedereintritt in den Zellzyklus (78% G1). Die Stimulation wurde 10 h nach der Zugabe von 10% FKS während der späten G1-Phase durchgeführt.

S: Die Zellen wurden zunächst in Medium mit 10% FKS kultiviert. Anschließend wurde dem Medium 2 µg/ml Aphidicolin zugesetzt und die Zellen 15 - 24 h darin kultiviert. Nach der Inkubation wurde mehrfach mit frischem Medium gewaschen und die Zellen wieder in normales Medium überführt. 3 h später wurde mit 85% der höchste S-Phasenanteil erreicht.


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Abb. 3-4 Verteilungen der Propidiumiodid-Fluoreszenz in Populationen
von HOS-TE85 nach Synchronisation

G 2 /M: Nach Inkubation mit 2 µg/ml Aphidicolin für 24 h wurden die Zellen mehrfach mit frischem Medium gewaschen und wieder in normales Medium überführt. Nach einer Erholungsphase von 7 h beginnt der Anteil der Zellen in der G2-Phase zuzunehmen und erreicht nach etwa 12 h mit 52% sein Maximum.

Die Veränderungen im Anteil der einzelnen Zyklusphasen werden z.T. auch in der Zellgröße sichtbar (siehe 3.1.1.5). Der Schwerpunkt der Verteilung verschiebt sich zu kleineren Werten, wenn der G0/G1-Anteil steigt (Serumentzug) bzw. zu größeren Werten, wenn der G2/M-Anteil steigt. Dies gilt so aber nur für normale, d.h. unbeeinflusste Populationen. Bei den hier vorgestellten Methoden wird jedoch meist die DNA-Synthese und Zellteilung gehemmt, während die Proteinproduktion in den Zellen weiterläuft. Man findet daher größere Zellen bei längerer Inhibition (Aphidicolin). Nach Aufhebung der Blockierung kann diese Verschiebung auch noch im nächsten Zyklus erhalten bleiben, nähert sich dann aber wieder den Normalwerten. Somit könnte eine Verschiebung in der Größenverteilung der Zellen Auskunft geben über die Heterogenität der Population und die Stärke der Beeinflussung des Zellstoffwechsels durch den Inhibitor.

3.1.1.4  Zellzyklus-Analyse mittels Durchflusszytometrie (FACS)

Die Durchflusszytometrie (FACS steht für Fluorescence Activated Cell Sorting) ermöglicht das Zählen und die Analyse von physikalischen und molekularen Eigenschaften von Partikeln (Zellen, Kunststoffkügelchen usw.) in einem Flüssigkeitsstrom. Mit Hilfe einer oder mehrerer Fluoreszenzmarkierungen können bestimmte Eigenschaften von Zellen oder Zellpopulationen auf Einzelzellebene erfasst werden. Dabei verhält sich die Anzahl emittierter Photonen (Intensität) proportional zur gebundenen Farbstoffmenge. Außerdem gewinnt man durch die Lichtstreuung Informationen über die Zellgröße (FSC) und die Binnenstruktur wie Granularität des Zytoplasmas und Größe des Zellkerns (SSC).

Abb. 3-5 Beispielkurven zur DNA- Analyse: (A) FSC- SSC- Plot, im Zentrum die
normale Zellpopulation; (B) Histogramm- Plot für die beobachtete Propidiumiodid-
Fluoreszenzintensität, dargestellt ist die Lage der Subpopulationen

Eine Analyse des Zellzyklus erfolgt am einfachsten auf Grundlage einer DNA-Quantifizierung über eine große Anzahl von Zellen. Der am weitesten verbreitete Farbstoff für die DNA-Analyse ist Propidiumiodid (PI). Es interkaliert in doppelsträngige Nukleinsäuren und hat eine sehr hohe Quantenausbeute. Da es aber auch an doppelsträngige RNA binden kann, ist es für eine optimale DNA-Analyse notwendig, die Zellen mit RNase zu behandeln. Die hier angewandte Methode nutzt außerdem Ethanol, um die Zellen zu fixieren und die Membran für PI permeabel zu machen. zeigt zwei typische Darstellungen einer solchen Analyse. In der Histogrammdarstellung der PI-Fluoreszenz findet man zwei deutliche Peaks, der vordere wird der G0/G1- Phase, d.h. dem einfachen DNA-Gehalt zugeordnet, der hintere gehört zur G2/M- Phase, d.h. zum doppelten DNA-Gehalt. Dazwischen liegt der Anteil der S-Phasen, d.h. derjenigen Zellen, deren DNA gerade repliziert wird.


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Fixierung: Die Zellen wurden nach dem Trypsinieren in PBS mit Kalzium aufgenommen, 3 min 500 g zentrifugiert und der Überstand abgesaugt und das Pellet mit 100 µl PBS resuspendiert. Diese Zellsuspension wurde unter permanentem Schütteln in ein vorbereitetes Röhrchen mit 1 ml eiskaltem 70% Ethanol gespritzt und für mindestens 1 h fixiert. Bei -20°C können die Zellen in 70% Ethanol für mehrere Wochen aufbewahrt werden. Unmittelbar vor der PI-Färbung werden die Zellen in PBS ohne Kalzium gewaschen, der Überstand anschließend so vollständig wie möglich abgezogen und das Pellet in 100 µl PBS resuspendiert.

Färbung: Zu 100 µl Zellsuspension werden 5 µl Färbelösung gegeben, die 270 µg/ml Propidiumiodid (Moleculuar Probes), 100 µg/ml RNase (Sigma) und 3.5% des Detergenz Saponin enthält. Nach 15 min Inkubation bei Raumtemperatur werden die Proben bis zur FACS- Analyse (Excitation 488 nm, Emission 630nm (FL2)) kühl und dunkel aufbewahrt [177,178].

Die Messungen wurden in Zusammenarbeit mit der Arbeitsgruppe Tumorimmunologie (Prof. Dr. Walden, Klinik für Dermatologie, Charite Berlin) am Zytometer FACSCalibur (Becton Dickinson) durchgeführt.

Um eine gute statistische Auswertung und Modellierung der Histogrammkurven sicherzustellen wurden für jede Probe mindestens 10000 Ereignisse aufgenommen. Die Auswertung, einschließlich einer Korrektur für Doublets, erfolgte mit dem Programm WinMDI 2.8 (freie Software, Joe Trotter,The Scripps Institute, Flow Cytometry Core Facility, La Jolla, CA, USA). Die Anteile der einzelnen Zyklusphasen konnten mit dem Programm Cylchred 1.0.2 (basierend auf Algorithmen von Watson et al. [179] und Ormerod et al. [180] mit Modifikationen von Ormerod (1991) und Hoy (1996-99)) modelliert werden.

3.1.1.5  Untersuchung der Zellgröße

Zur ergänzenden qualitativen und quantitativen Beurteilung von synchronisierten Zellkulturen wurde ein Zellzähler (CASY1 (Modell TTC), Schärfe System GmbH) verwendet. Das Gerät nutzt kontinuierliche Widerstandsmessungen, um Informationen über Durchmesser und Volumen der gemessenen Partikel zu liefern. Partikel, die die Messkapillare (60 µm) passieren, verdrängen eine ihrem Volumen entsprechende Menge der Elektrolytlösung. Die resultierende Widerstandserhöhung ist ein Maß für ihr Volumen.

3.1.1.6  Untersuchung der interzellulären Kopplung mittels Farbstofftransfer

Eine verbreitete Annahme zur Wirkungsweise elektrischer Felder auf Zellen und Gewebe ist die Beteiligung interzellulärer Kommunikation. Die elektrische Kopplung von Zellen in Monolayerkultur wurde durch die Übertragung eines niedrigmolekularen Farbstoffmoleküls von Zelle zu Zelle nachgewiesen. Dabei kamen zwei verschiedene Protokolle zum Einsatz. Einerseits wurden nach Goldberg et al. [181] parallele Kulturen verwendet, wovon eine mit Farbstoff beladen wurde (Donorzellen). Nach dem Trypsinieren wurden beide Ansätze vermischt (ca. 1:50 gefärbte/ungefärbte Zellen) und in so hoher Dichte in die Messkammern eingesät, dass nach erfolgter Anheftung Konfluenz erreicht war. In einem weiteren Ansatz wurde dieses Verfahren modifiziert [182]. Die gefärbten Zellen wurden hier auf eine bereits seit 2 Tagen kultivierte, ungefärbte Monolayer (Akzeptorzellen) fallen gelassen („Parachute assay“).

In beiden Varianten wurden die Donorzellen mit 5 µM Calcein-AM (Molecular Probes) in PBS für 30 min bei 37°C gefärbt. Die Calcein-Fluoreszenz (Ex 488 nm, Em 520 nm) wurde mit dem Attofluor-Fluoreszenzmikroskop beobachtet und zwischen einer und sieben Stunden nach Beginn des Experiments Bilder aufgenommen. Sowohl in Zellkulturen, die konfluent eingesät wurden als auch in Kulturen, die über mehrere Tage bis zum konfluenten Zustand gewachsen sind, begann der Farbstoff nach kurzer Zeit von der „Donorzelle“ zur „Akzeptorzelle“ überzugehen. Abb. 3-3.6 zeigt Aufnahmen von Präparaten, die nach dem ersten Protokoll, das parallel trypsinierte Kulturen verwendet, hergestellt wurden. Nach ca. einer Stunde waren jedoch erst wenige Zellen angeheftet und damit kaum Akzeptorzellen angefärbt (Abb. 3-3.6A). Eine deutliche Zunahme dieser „hellen Inseln” erfolgt nach zwei Stunden (Abb. 3-3.6C, D). Nach mehr als vier Stunden hatte der Farbstoff auch weiter entfernt liegende Zellen, abhängig von ihrem Kopplungsgrad, erreicht (Abb. 3-3.6B).


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Somit konnten durch beide Versuchsprotokolle funktionierende Gap Junctions in kultivierten Osteosarcomazellen HOS TE85 nachgewiesen werden. Dieses Ergebnis war für Tumorzellen, die keine Kontakthemmung besitzen, nicht unbedingt zu erwarten, zeigt aber, dass diese Zelllinie ein gutes Modell für die interzelluläre Kommunikation darstellt.

Abb. 3-6 Nachweis von Zell-Zell-Kontakten durch Calceintransfer aus einer Donorzelle (jeweils die hellste Zelle ungefähr im Zentrum des Bildes) in benachbarte Zellen. Nach 1 h beginnen die Anheftung der Zellen und die Ausbreitung des Farbstoffs (A), nach 6h hat der Farbstoff auch entfernt liegende Zellen erreicht (B, Bilder aus verschiedenen Ausschnitten). Dynamik des Calceintransfers in identischem Ausschnitt nach 2 h (C) und nach 2.5h (D). Die Pfeile weisen auf Zellen, die im 30-minütigen Beobachtungszeitraum zunehmend angefärbt wurden.

3.1.2 Einzelzell- Fluoreszenzmikroskopie

3.1.2.1 ATTOFLUOR

Abb. 3-7 Schematische Darstellung des Attofluor- Messplatzes.

Bildgebende Fluoreszenzuntersuchungen auf Einzelzellniveau erfolgten am Attofluor- System (Zeiss), welches aus einem Inversmikroskop (Axiovert 100), an das eine ICCD- Kamera und ein Rechner für Steuerung und digitale Bildverarbeitung (Attofluor Ratiovision) angeschlossen sind, besteht (Abb. 3-3.7).

Mit diesem System wurden v.a. zeitaufgelöste Messungen mit zwei verschiedenen Fluoreszenzfarbstoffen durchgeführt, die die gleichzeitige Erfassung von intrazellulärem Kalzium und des Redoxzustandes der Zellen erlauben. Während der Versuche wurden die Proben auf 37°C temperiert und mit 5% CO2 in der Atmosphäre begast.

Fura-2: Der Kalziumsensitive Farbstoff Fura-2 (Molecular Probes) ermöglicht durch die Kombination von zwei Anregungswellenlängen (334 nm und 380 nm) und einer Emissionswellenlänge (520 nm) Ratiomessungen, die relativ robust gegen veränderliche Farbstoffkonzentrationen, speziell auch durch Ausbleichen, die Schichtdicke des Objekts und Fluktuationen in der Intensität der Anregungslampe sind. Die errechneten Verhältniswerte sind ein Maß für die Ca2+- Konzentration und können durch eine geeignete Kalibrierung in Absolutwerte überführt werden. Die in vitro Kalibrierung erfolgte mit Hilfe einer Serie von Puffern bekannter Ca2+- Konzentration, die sich in dünnen Glaskapillaren von rechteckigem Querschnitt befanden. Die Schichtdicke innerhalb der Kapillare beträgt 50 µm und liegt damit noch etwa eine Größenordnung über der durchschnittlichen Dicke adhärenter Zellen. Da die Fluoreszenzanregung [Seite 27↓]von Fura-2 mit ultraviolettem Licht (UV) erfolgt, welches selbst die Zellen beeinflussen kann, wurde die mittlere UV-Dosis für jedes Experiment bestimmt (Kap. 3.1.2.2).

CM-H 2 DCFDA: CM-H2DCFDA (Molecular Probes) ist ein Fluoresceinderivat (Ex 488 nm, Em 520 nm), dessen Fluoreszenzintensität abhängig vom Redoxzustand ist. Durch seine spektralen Eigenschaften kann es simultan zu Kalziummessungen für Mehrfachmarkierung benutzt werden.

Vorbereitung und Färbung: Für die Einzelzell-Fluoreszenzmessungen (Attofluor) wurden 3 Tage alte Kulturen trypsiniert und mit einer Dichte von 5∙103 in die Messkammern eingesät, über Nacht inkubiert und am nächsten Tag verwendet. Die angehefteten Zellen wurden mit Puffer (HBSS mit 1 mM Ca2+ und 10% FKS) gewaschen und für ca. 1 h bei 37°C inkubiert. Die Färbelösung (HBSS s.o.) enthielt 2 - 5 µM Fura-2/AM und/oder 5 µM CM-H2DCFDA. Anschließend wurde intensiv mit Puffer gespült. Für Doppelfärbungen wurde die Stammlösung der Farbstoffe höher konzentriert, um die Konzentration des Lösungsmittels DMSO nicht unnötig zu erhöhen.

3.1.2.2  UV-Dosimetrie

Die Messung der integralen Strahlungsdosis und Dosisleistung in der UV-beleuchteten Fläche erfolgte mit Hilfe einer UV-sensiblen Photodiode (190 – 950 nm) mit einer aktiven Fläche von 2.4 x 2.4 mm. Die Photodiode wurde als Photoelement geschaltet, ihre Ausgangsspannung verstärkt und gemessen. Es findet sich ein nahezu linearer Zusammenhang zwischen Ausgangsspannung und Strahlungsleistung [183].

Befindet sich die Photodiode anstelle des Objekts auf dem Mikroskoptisch, kann die integrale Strahlungsleistung der beleuchteten Fläche in der Objektebene folgendermaßen berechnet werden:

Gleichung 4

Damit ergibt sich die mittlere Strahlungsleistungsdichte (SLD) in der UVA-beleuchteten Fläche

Gleichung 5

Da die Strahlungsleistung und somit auch die Helligkeitsverteilung in der beleuchteten Fläche nicht homogen sind, sagt die Größe der mittleren SLD noch nichts darüber aus, welcher SLD die beobachteten Zellen wirklich ausgesetzt sind. Es ist daher eine Korrektur anhand von Helligkeitsverteilungsbildern (Helligkeitsprofil der UVA- beleuchteten Fläche) notwendig. Diese liefern zum einen das Verhältnis von Helligkeitsmaximum zu Helligkeitsmittelwert in der UVA-beleuchteten Fläche und zum anderen eine Angabe zur Helligkeitsspreizung im Gesichtsfeld der Kamera.

Dann ergeben sich für jede Wellenlänge die Extremwerte der SLD im Gesichtsfeld der Kamera aus:

Gleichung 6

Gleichung 7

Aus dem Messtakt und der Belichtungszeit für eine Einzelmessung (250 ms) kann für jede Wellenlänge die minimale und maximale Dosis im Gesichtsfeld berechnet werden:

 

Gleichung 8

Die gesamte minimale bzw. maximale Dosis erhält man aus der Summe der beiden Wellenlängenanteile. Analog erhält man die gesamte minimale bzw. maximale Dosisleistung aus der Summe beider Wellenlängenanteile der minimalen/maximalen SLD im Gesichtsfeld.


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Für die Dosisbestimmung in den Einzelexperimenten wird jedoch standardmäßig die gesamte mittlere Dosis bzw. die gesamte mittlere Dosisleistung angegeben, die sich aus dem Mittel des entsprechenden Minimal- und Maximalwerts ergeben [183].

3.1.2.3 Untersuchung der Mitogen aktivierten Proteinkinase

Im Unterschied zu den oben beschriebenen Messungen an vitalen Zellen, erfordert diese immunofluorometrische Methode die Fixierung der Zellen. Daher wurden die Zellen direkt im Anschluss an eine 10-minütige Befeldung fixiert.

Die Mitogen aktivierten Proteinkinase (MAPK) wird über eine mehrstufige Signalkaskade aktiviert. Die Untertypen ERK1/ERK2 (auch bekannt als p44/p42) werden speziell durch extrazelluläre Signale reguliert und reichern sich nach einer Stimulation im Zellkern an. Der verwendete Assay (Cellomics) basiert auf einer immunofluorometrischen Bestimmung der ERK-Translokation in den Zellkern. Diese kann durch die Differenz zwischen zytoplasmatischer und nuklearer Fluoreszenzintensität auf Einzelzellniveau bestimmt werden. Positive Kontrollen wurden mit 500 ng/ml des Mitogens Phorbol-12-Myristat-13-Acetat (PMA) stimuliert. Der Antikörper des verwendeten Kits bindet vorzugsweise an die zweifach phosphorylierte (vollständig aktive) Form der ERK, was Kreuzreaktionen zu anderen MAPK (p38, JNK/SAPK) minimieren soll. Die Kreuzreaktivität zu anderen MAPK sowie die Bindung an nicht phosphorylierte ERK wurden durch den Hersteller überprüft.

Für die Färbung werden die Zellen mit Paraformaldehyd fixiert und permeabilisiert. Anschließend erfolgte die Inkubation mit dem ERK-spezifischen primären Antikörper und mit dem Alexa (488 nm) konjugierten sekundären Antikörper für jeweils eine Stunde. Die Kernregion konnte durch eine Parallelfärbung mit dem DNA-Farbstoff Hoechst identifiziert werden.

Die verschiedenen Versuchsvarianten wurden an jedem Versuchstag doppelt durchgeführt und insgesamt dreimal wiederholt. Die Messungen wurden in Zusammenarbeit mit Dr. Pilarczyk (Fraunhoferinstitut für Biomedizinische Technik, Berlin) durchgeführt. Die Fluoreszenzaufnahmen erfolgten an einem inversen Mikroskop (Olympus), das mit einer digitalen Videokamera (Orca-ER, Hamamatsu) ausgestattet und mit einem Computersystem verbunden ist.

3.1.3 Fluorometrische und spektrometrische Untersuchungen von Zellpopulationen

3.1.3.1 Vorbereitung der Zellen

Die Einsaat in Multiwellplatten erfolgte nach 2 verschiedenen Protokollen. Für Messungen über einen längeren Zeitraum wurden die Zellen mit einer Dichte von 3∙104/well (HOS, L929) bzw. 1∙104/well (OB) ausplattiert, weitere 2 Tage kultiviert und anschließend befeldet. Für kurzfristige Messungen wurden die Zellen gleich mit der vierfachen Dichte ausplattiert und nach erfolgter Anheftung (ca. 4 h) weiterbehandelt.

3.1.3.2 Bestimmung der Aktivität der Alkalischen Phosphatase (ALP)

Grundlage dieses Assays zur Bestimmung der ALP-Aktivität ist ein colorimetrischer Nachweis von umgesetztem Substrat. Das Enzym hydrolysiert das Substrat p-Nitrophenylphosphat und bildet p-Nitrophenol und anorganisches Phosphat. Unter alkalischen Bedingungen wird p-Nitrophenol zu einem gelben Komplex umgesetzt, dessen Absorptionsmaximum bei 405 nm liegt. Die Farbintensität der Probe ist proportional der Phophataseaktivität. Verwendet wurde ein Assay (Sigma kit 104) zur Endpunktbestimmung der ALP-Aktivität nach 15 min Inkubation bei 37°C.

Für die Bestimmung von einzelnen Proben wurden 25 µl Zellsuspension mit 125 µl Assay- Puffer und 125 µl Substrat inkubiert und die Reaktion nach 15 min durch Zugabe von 2.5 ml 0.05 N NaOH beendet. Die Messung erfolgte im Spektrophotometer (Shimadzu UV 1202, Küvetten, d = 1 cm) bei 405 nm. Um diesen Assay auch im Microplatereader (Fluostar Optima, BMG) einzusetzen, mussten einige Anpassungen vorgenommen werden: Die Zellen wurden in 96 well- Platten eingesät und nach [Seite 29↓]erfolgter Anheftung wurde das Medium abgezogen. Die Inkubation erfolgte mit 40 µl Puffer und 40 µl Substrat für 15 min, beendet wurde die Reaktion durch Zugabe von 40 µl 1 N NaOH.

Die Aktivität der alkalischen Phosphatase wurde 1, 5, 10, 15 Tage nach der elektrischen Stimulation gemessen.

3.1.3.3 Untersuchung des Proliferationsverhaltens

Parallel zu den oben angegebenen ALP-Untersuchungen erfolgten Proliferationsmessungen über die regelmäßige Bestimmung des DNA-Gehalts. Von den Kulturen in 96well-Platten wurde das Medium abgezogen und mit 10 µl Färbelösung inkubiert. Diese bestand aus PBS mit 0.1% Saponin und 45 µg/ml Propidiumiodid. Nach 15 min Inkubation bei Raumtemperatur wurde die Fluoreszenzintensität bestimmt.

3.1.3.4 Extrazelluläre Bestimmung der Nitrit/Nitrat-Konzentration

Die fluorometrische Bestimmung von Nitrit im Zellkulturmedium erfolgte direkt im Anschluss an die Stimulation nach der Methode von Misko et al. [184]. Dabei reagiert 2,3-Diaminonaphthalen (DAN) unter aciden Bedingungen mit Nitrit zum fluoreszenten 1-(H)-Naphthotriazol. Um den Anteil von Nitrat in der Probe zu erfassen, muss dieses mit Hilfe des Enzyms Nitratreduktase zu Nitrit reduziert werden. Nitrat selbst reagiert nicht mit DAN, so dass die Nitritspezifität der Farbreaktion gegeben ist. Für die Bestimmung von Nitrit im Zellkulturmedium wurde DMEM ohne Phenolrot und ohne weitere Zusätze verwendet, da sowohl Phenolrot als auch Serum die Fluoreszenzintensität bis zu 70% verringern.

20 µl der Probe wurden mit 40 µM NADPH (Enzym Cofaktor von Sigma) und 14 mU Nitratreduktase von Aspergillus niger (Boehringer) in einem Endvolumen von 50 µl in 20 mM Tris, pH 7.6 bei 37°C inkubiert. Nach 1 h wurde die Reaktion durch Verdünnung mit 50 µl Aqua dest. gestoppt, gefolgt von der Zugabe von 10 µl DAN (50 µg/ml in 0.62 M HCl, Sigma). Nach sofortigem Vermischen wurde 10 min im Dunklen und bei Raumtemperatur inkubiert. Durch Zugabe von 14 µl 1N NaOH wird die Reaktion beendet und die Intensität des entstehenden Fluoreszenzsignals maximiert. Die Fluoreszenzmessung erfolgte sofort im Anschluss (Excitation 360 nm, Emission 460 nm). Die Nitritstandards (Reinheit > 98% von Sigma) wurden ebenso wie alle anderen Lösungen für jeden Versuchstag frisch präpariert und während des Versuchs auf Eis gehalten. Aus den Nitritstandards (10 nM – 10 µM), den NADPH zugesetzt wurde, kann nach Subtraktion des Enzymleerwerts (Nitratreduktase und NADPH) der Nitritgehalt der Probe berechnet werden.

3.1.3.5 Extrazelluläre Bestimmung der Wasserstoffperoxid-Konzentration

Der verwendete Assay (Molecular Probes Kit 12212) basiert auf dem fluorometrischen Nachweis von Wasserstoffperoxid (H2O2) mit Hilfe von Amplex Red. Dieses reagiert in Anwesenheit von Meerrettichperoxidase (HRP) in einer 1:1-Stöchiometrie mit H2O2 und bildet das fluoreszente Resorufin (Absorption 563 nm, Emission 587 nm). Die untere Auflösungsgrenze dieser Reaktion liegt bei etwa 50 nM H2O2.

Zur Bestimmung der Menge an H2O2 im Medium wurden die Zellen in 100 µl Krebs- Ringer- Phosphat- Glucose- Puffer (145 mM NaCl, 5.7 mM Na3PO4, 4.68 mM KCl, 0.54 mMCaCl2, 1.22 mM MgSO4, 5.5 mM Glucose, pH 7.35) mit 50 µM Amplex Red und 1 U/ml HRP bei 37°C inkubiert. Damit beginnt die Amplex Red Reaktion, die über mehrere Stunden durch Fluoreszenzmessungen (Excitation 540 nm, Emission 590 nm) verfolgt werden kann. Zwischen den einzelnen Messungen wurden die Zellen im Brutschrank (37°C) gehalten. Die Stammlösungen wurden in 50 mM Natriumphosphat- Puffer, pH 7.4 angesetzt und für jeden Versuchstag frisch präpariert. Die Standardkurve wurde mit H2O2- Konzentrationen von 50 nM – 5 µM in Natriumphosphat- Puffer angefertigt.

3.1.3.6 Immunometrische Bestimmung der Konzentration von cAMP, cGMP und PGE2

Diese Untersuchungen erfolgten mittels enzymgekoppelter, kompetitiver Immunoassays (Assay Designs Inc.), die die Konzentration von zyklischen Nukleotiden in lysierten Proben bzw. von Prostaglandin E2 im Zellkulturmedium erfassen. Der cGMP-Test beispielsweise benutzt polyclonale [Seite 30↓]Antikörper zu cGMP, die kompetitiv an das zyklische Nukleotid oder an ein cGMP-konjugiertes Molekül alkalischer Phosphatase binden. Die Proben werden gleichzeitig mit Antikörper und Konjugat inkubiert und der Überschuss anschließend weggewaschen. Danach wird mit p-Nitrophenylphosphat, dem Substrat der alkalischen Phosphatase inkubiert. Nach Stoppen der enzymatischen Reaktion wird die Absorption bei 405 nm gemessen. Die optische Dichte verhält sich umgekehrt proportional zur Konzentration des nachzuweisenden Moleküls in der Probe.

Für den Nachweis der zyklischen Nukleotide wurden die Zellen unmittelbar nach der Befeldung lysiert und die Inkubation begonnen. Im Gegensatz zu der schnellen Reaktion von diesen sekundären Signalmolekülen, erfolgt die Ausschüttung von Prostaglandinen vermutlich langsamer. Da für die Kinetik der Prostaglandinfreisetzung von Osteoblasten in Zusammenhang mit elektromagnetischen Feldern keine Literaturdaten vorlagen, bezogen wir uns auf Literaturwerte, die für Strömungseffekte an Osteoblasten gelten. Demzufolge wurde die Prostaglandinkonzentration in den Proben 6 h nach Stimulation gemessen [185].

3.2 Applikation der elektrischen Felder

3.2.1 Platinisieren der Elektroden

Die Elektroden zur Stimulation von Zellkulturen (Abb. 3-3.9a, c) bestanden aus Platindraht (Reinheit 99.998%), der, da er in direktem Kontakt mit Zellkulturmedium und Zellen stand, einer Vorbehandlung unterzogen wurde. Dabei wurde die Elektrodenoberfläche mit metallischem Platin überzogen und so eine fraktale Oberfläche erzeugt, die etwa 106-fach größer ist als die des polierten Metalls. Die Vergrößerung der Elektrodenoberfläche hilft jedoch, die Stromdichte in der Messkammer zu verkleinern und elektrolytische Prozesse zu minimieren.

Die Beschichtung der Platinelektroden erfolgte in zwei Schritten. Zunächst wurde die Elektrodenoberfläche mit Isopropanol entfettet und durch elektrolytisch erzeugtes CO2 gereinigt. Dieser Prozess bewirkte außerdem, dass der bei der Beschichtung entstehende gasförmige Wasserstoff nicht so stark in die sich bildende Platinschicht aufgenommen wird. Risse und Abblättern der Platinschicht können so vermieden werden. Dazu wurde 1.2 M Na2CO3-Lösung verwendet; die zu reinigende Elektrode wurde für 1 min anodisch und mit einer Stromdichte von 1mA/mm2 angeschlossen. Anschließend wurde mit destilliertem Wasser gespült. Im zweiten Schritt erfolgte die eigentliche Beschichtung mit einer 31 mM Lösung von H2PtCl6∙6H2O. Der Platingehalt der Elektrolytlösung betrug 40.45%. Die zu beschichtende Elektrode wurde für 10 min kathodisch und mit einer Stromdichte von 0.1 mA/mm2 angeschlossen. Werden zwei Anoden verwendet, die sich beiderseits außen von der zu beschichtenden Kathode befinden, muss diese während der Galvanisierung nicht gedreht werden und die entstehende Beschichtung gelingt gleichmäßiger.

Abb. 3-8 Rasterelektronenmikroskopische Aufnahmen der Platinbeschichtung. A: unbeschichtetes Platin (Balken 20 µm), B-D: Platinbeschichtung (Balken 10 µm, 2µm bzw. 1 µm).

Elektronenmikroskopischen Aufnahmen nach erfolgter Beschichtung (Abb. 3-3.8) zeigen, dass die Oberfläche der Elektroden gleichmäßig mit einer Platinschicht bedeckt ist. Durch diese Deckschicht wird die Elektrodenoberfläche tatsächlich rauer und somit deutlich vergrößert. Diese Strukturierung ist bis zur 20000-fachen Vergrößerung zu beobachten und setzt sich vermutlich fraktal fort.


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3.2.2  Messkammern und Elektrodensysteme

3.2.2.1  Elektroden zur Stimulation von Zellkulturen

Untersuchungen auf Einzelzellniveau sollen die Kinetik zellulärer Signale erfassen und die gleichzeitige Messung und Beobachtung ermöglichen. Das kann nur durch eine Elektrodenanordnung erfolgen, die eine dem Kammerboden paralleles elektrisches Feld erzeugt. Dadurch werden die Zellen zwischen den Elektroden einem homogenen Feld ausgesetzt. Untersuchungen der Elektrodeneigenschaften sind in Kap. 4.1 detailliert dargestellt.

Da unerwünschte Elektrodenprozesse mit der Höhe der angelegten Spannung zunehmen, kann diese nicht beliebig hoch werden. Eine weitere, zellverträgliche Erhöhung der elektrischen Feldstärke ist nur unter Verringerung des Elektrodenabstands möglich. So können mit einer maximalen Spannung von 1.5 V Spitzenfeldstärken von 3 kV/m in der Lösung erzeugt werden. Um einen großen Feldstärkebereich abdecken zu können, kamen zwei verschiedene Systeme zum Einsatz:

- Platin-Elektroden-Kammer für die Applikation von Feldern im Bereich bis 200 V/m unter mikroskopischer Beobachtung (Abb. 3-3.9a)

In dieser Kammer wachsen die Zellen auf einem, von einem Glasrand umgebenem Deckglas. Das System wird von oben bedeckt durch einen Plexiglasblock, der die Gaszufuhr, einen Perfusionszu- und -ablauf, die platinierten Platinelektroden (∅ 0.5 mm) und einen Thermistor enthält. Die Elektroden haben einen Abstand von 1 cm und liegen bodenparallel auf dem Deckglas auf. Eine Beeinflussung der Temperatur (> 0.1 K) durch das Feld konnte nicht festgestellt werden.

Abb. 3-9 Elektrodensysteme für die Stimulation von Zellkulturen. Für die Einzelzell-Fluoreszenzmikroskopie (a, b) und die Anwendung in Multiwellplatten (c) kamen verschiedene Anordnungen zum Einsatz (Erläuterungen im Text).

- Kammer zur Befeldung in höherem Feldbereich unter Verwendung der Mikrosystem-Technik (Abb. 3-3.9b)

Auch diese Kammer (wie oben) ist von einem Plexiglas-Block überdeckt (hier nicht gezeichnet), an welchem über eine Plattfeder der Elektrodenhalter befestigt ist. Die Feder drückt den hier dargestellten Elektrodenhalter auf den Boden des Deckglases. Am Elektrodenhalter sind zwei Glasplatten befestigt, die auf der Innenseite mit einer Titan-Platin-Legierung beschichtet sind. Die Glasplatten haben einen Abstand von 0.5 mm und ermöglichen damit sehr hohe Feldstärken.

Um Zellpopulationenzu beobachten, wurde ein Applikationssystem verwendet, das es ermöglicht, alle Kammern einer 96-Wellplatte gleichzeitig zu befelden. Die Messung verschiedener zellulärer Parameter erfolgt im Anschluss an die Feldapplikation. Schematisch ist die Elektrodenanordnung in einer Kavität der Wellplatte dargestellt.

- Platin-Elektrodenkammer für die Applikation elektrischer Felder in Multiwellplatten (Abb. 3-3.9c)

In dieser Anordnung tauchen zwei platinierte Platin-Drähte (∅ 0.5 mm) in jede Vertiefung der 96-Wellplatte. Die acht Elektrodenpaare einer Reihe sind jeweils miteinander verbunden. Das erlaubt die gleichzeitige Applikation von bis zu zwölf verschiedenen Feldern. Diese Anordnung ist außerdem dafür geeignet, 3D-Kulturen oder Gewebestückchen zu befelden.

3.2.2.2 Mikroelektroden für die tiefe Hirnstimulation

Für die Stimulation von neuronalem Gewebe werden sowohl in der Klinik als auch in der Forschung bipolare, koaxiale Elektroden eingesetzt. Gegenstand unserer Untersuchungen waren Elektroden, die [Seite 32↓]normalerweise im Rattenmodell benutzt werden (Abb. 3-3.10). Die Elektroden wurden von FHC Inc., USA bzw. RMI Inc., USA bezogen. Die Eigenschaften der Elektroden wurden in Kap. 4.2 untersucht.

Abb. 3-10 Schematische Darstellung verschiedener Geometrien von Mikroelektroden.
(S – stacked, F – flat, E- extended, R – round, P – pencil)

Der Durchmesser des Innenpols betrug je nach Geometrie 25 µm (S25, P, R), 75 µm (S75, E, F) bzw. 100 µm (Sx(m), Sx(b)), der des Außenpols lag entsprechend zwischen 75 und 250 µm. Die differente Elektrode (innen) bestand aus Edelstahl oder einer Platin/Iridium-Legierung, hingegen wurde die indifferente Elektrode (außen) immer aus Edelstahl hergestellt. Die beiden Pole der Elektrode waren durch Schichten von Epoxydharz isoliert.

Als Elektrolyt wurde neben NaCl ein künstlicher Liquor (ACSF) eingesetzt, der 124 mM NaCl, 5 mM KCl, 1.25 mM NaH2PO4∙2H2O, 2 mM MgSO4∙7H2O, 26 mM NaHCO3, 2 mM CaCl2∙2H2O und 10 mM Glucose enthielt. Andererseits wurde Astrocyten-Zellkulturmedium verwendet, das aus DMEM mit 10% FKS bestand. Der Einsatz eines einfachen und eines komplex zusammengesetzten Elektrolyten erlaubte, die Bedeutung hochmolekularer Substanzen für das Elektrodenverhalten zu bewerten. Die Leitfähigkeit von ACSF war 14.17 mS/cm und die des Zellkulturmediums 14.03 mS/cm.

3.2.3 Untersuchung der Elektrodeneigenschaften

3.2.3.1 Rasterelektronenmikroskopische Untersuchungen

Rasterelektronenmikroskopische Untersuchungen wurden in Zusammenarbeit mit dem Elektronenmikroskopischen Zentrum der Universität Rostock vorgenommen. Bei dieser Methode wird die Oberfläche der Probe von einem gebündelten Elektronenstrahl abgetastet. Die in die Probe eindringenden Elektronen lösen aus dem Anregungsgebiet Sekundärelektronen heraus, die mit Hilfe eines Detektors aufgefangen werden. Während des Abrasterns wird in Abhängigkeit von der Topologie der Oberfläche aus dem Detektorsignal ein plastisches Abbild der Oberfläche erzeugt.

Verschiedene neue und gebrauchte Mikroelektroden wurden mit einer dünnen, leitfähigen Goldschicht besputtert. Bei den platinisierten Platinelektroden war dieser Schritt nicht notwendig. Die Proben wurden anschließend mit variabler Vergrößerung zwischen 70fach und 20000fach gescannt.

3.2.3.2 Strom-Spannungskennlinie

Das zeitliche Verhalten von Strom und Spannung wurde durch parallele Strom-Spannungsmessungen über einem Messwiderstand, der in seiner Größe dem Kammerwiderstand angepasst wurde, untersucht. Zusätzlich wurden am Impedanzmessplatz HP 4194A (s.u.) Messungen mit variablem Potential und fixer Frequenz durchgeführt.

3.2.3.3 Impedanzspektroskopie

Der wesentliche Vorteil dieser Methode besteht darin, dass ein Bereich von verschiedenen experimentellen Zeitachsen innerhalb eines Experiments bestimmt werden kann, indem die Impedanz des Systems über einen entsprechenden Frequenzbereich gemessen wird.

Alle Spektren wurden bei Raumtemperatur mit dem Impedanzmessplatz HP 4194A aufgenommen, der über einen Computer angesteuert wurde. Die Messungen wurden im Frequenzbereich von 102 bis 4·107 Hz vorgenommen. Die Amplitude des Wechselspannungssignals betrug 10 mV. Da die Impedanz über eine selbstabgleichende Brücke gemessen wird, ist die Messung in diesem Modus nahezu stromlos. Außerdem wurden Messungen mit überlagerter Offsetspannung (DC Bias) durchgeführt, um die Stromdichteabhängigkeit der Impedanz zu bestimmen.


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Nichtlineare komplexe Kurvenanpassungen der gemessenen Impedanzspektren an einen elektrischen Ersatzschaltkreis wurden mit dem Programm LEVM vorgenommen. Das benutzt den Levenberg-Marquardt Algorithmus und erlaubt die Einführung verschiedener realer und virtueller Bauelemente.

3.2.3.4 Numerische Modellierung des Feldverlaufs

Zur dreidimensionalen Modellierung des Feldverlaufs in unmittelbarer Nähe der Elektroden wurde das Programmpaket MAFIA (Solution of Maxwell's Equations by the Finite Integration Algorithm, CST GmbH, Darmstadt) verwendet, welches die Maxwell-Gleichungen in diskretisierter Geometrie mittels der finiten Integrationstechnik (FIT) löst. Wesentlich dabei ist die Verwendung zweier zueinander dualer Gitter, was die Berechnung von Potentialen und Flüssen erlaubt. Für die Berechnungen kam das Modul Elektro- Quasistatik zum Einsatz, das die Berücksichtigung frequenzabhängiger Materialkonstanten erlaubt.

Dreidimensionale Modelle der Elektroden wurden in einer homogenen und isotropen Umgebung platziert. Im Fall der Mikroelektroden war der Gewebeausschnitt um die Elektrodenspitze 500 x 500 x 800 µm groß. Im Fall der platinisierten Platinelektroden wurde die Umgebung so groß gewählt, wie sie durch die jeweilige Kammergeometrie vorgegeben wurde.

Entlang der Elektrodenoberfläche wurde der Gitterabstand so klein gewählt (1-5 µm), dass das Modell rechentechnisch noch bearbeitbar war, in größerer Entfernung von der Elektrode wurde der Gitterabstand erhöht. Die Verhältnis (ratio) des größten zum kleinsten Gitterabstand wurde jedoch, um Fehler in der Kalkulation zu minimieren, auf 32 begrenzt.

Es wurde mit offenen Randbedingungen und einer Rechengenauigkeit von 1∙10-16 gearbeitet. Es wurde vorausgesetzt, dass die Strom-Spannungs-Kennlinie linear und das Medium homogen und isotrop sei.

3.2.4 Befeldungsprotokoll

Ausgehend von der Annahme, dass es ausgewählte Stimulationsfrequenzen gibt, auf die die untersuchten Zellen besonders empfindlich reagieren, diese jedoch nicht bekannt sind, wurde bei den meisten Untersuchungen ein sehr breiter Frequenzbereich gescannt. Dieser reichte von 0.1 Hz bis 100 kHz. Der untersuchte Frequenzbereich lässt sich grob in einen niederfrequenten Anteil, der den Bereich von einigen mHz bis etwa 100 Hz umfasst, und einen höheren Anteil von 1 kHz bis 100 kHz unterteilen. Ersterer wird im Folgenden als niederfrequenter Bereich bezeichnet, letzterer als hochfrequenter Bereich. Im niederfrequenten Bereich kamen vor allem monopolare Pulse, in geringerem Umfang Sinusfelder zum Einsatz. Im hochfrequenten Bereich wurden hingegen ausschließlich symmetrische Signale verwendet. d.h. Sinusfelder und amplitudenmodulierte Sinusfelder. Im gesamten Frequenzbereich wurde standardmäßig mit direkt eingekoppeltem Feld stimuliert, um ausreichend hohe Feldstärken im Medium zu erzeugen.

Um ein möglichst breites Spektrum von potentiellen Einflussfaktoren der Zellantwort auf die elektrische Stimulation zu erfassen, wurden in mehrerer Hinsicht verschiedene experimentelle Protokolle eingesetzt. Zum einen wurden Frequenz und Wellenform variiert (s.o.), zum anderen wurden verschiedene Zelltypen und Zellzustände getestet. Zu letzterem gehörte die Synchronisation der Zellpopulation von HOS TE85 in verschiedenen Zellzyklusstadien und die zwei- und dreidimensionale Kultivierung der Zellen.

Da zur Erklärung einer möglichen Feldwirkung verschiedene plausible Hypothesen existieren, wurden bei der Planung der Experimente unterschiedliche Herangehensweisen verwendet:


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3.2.4.1  Beobachtung auf Einzelzellniveau

Bei den fluoreszenzmikroskopischen Untersuchungen auf Einzelzellniveau erfolgten mit Ausnahme des MAPK-Assays Befeldung und Messung gleichzeitig. So konnte die Kinetik zellulärer Signale erfasst und direkt mit der Feldwirkung verknüpft werden. In einer ersten Versuchsreihe wurden Untersuchungen zum Einfluss monopolarer Rechteckpulse durchgeführt. Die konstant gehaltene Frequenz von 1.5 Hz (133 ms Dauer) entspricht annähernd dem dynamischen Muster, das durch Bewegung wie Laufen erzeugt wird. Die applizierte Feldstärke wurde durch Veränderung der Elektrodenspannung zwischen 10 V/m und 3 kV/m variiert.

In einer weiteren Serie wurden modulierte elektrische Wechselfelder im Frequenzbereich von 100 Hz bis 100 kHz verwendet. Die angegebene Trägerfrequenz wurde stets mit 16 Hz und einer Tiefe von 100% amplitudenmoduliert, da es Literaturhinweise auf die besondere Wirksamkeit dieser Frequenz gibt [186,109,115,116]. Zu Vergleichszwecken wurden auch einige Versuche mit unmodulierten Wechselfeldern durchgeführt. Die elektrische Feldstärke betrug für alle Versuche 200 V/m (Abb. 3-3.11).

Um der Fragestellung nachzugehen, inwieweit oxidative Prozesse an der Zellreaktion beteiligt sind, wurde der oxidative Stress auf die Zellen in einigen Versuchen erhöht. Dies geschah durch verschiedene UVA-Belichtungsprotokolle oder durch Zugabe von radikalbildenden Substanzen (5 µM 3-morpholinosydnonimine (SIN-1), Molecular Probes). Entsprechend den Vorversuchen zur UV-Empfindlichkeit dieser Zellen, wurden jedoch alle Versuche unterhalb der Halbwertsdosis dieser Zellen durchgeführt, die etwa bei 60 kJ/m2 liegt (Abb. 5-5.3).

Die Einzelzell-Versuche bestanden immer aus 5min Vorlaufphase, 5min bzw. 10min Befeldung und 10min Nachbeobachtung. Der Messtakt wurde so eingestellt, dass die applizierte UV-bedingte Gesamtstrahlungsdosis konstant gehalten wurde. Eine tabellarische Übersicht über alle verwendeten Feldformen und –frequenzen und die jeweils untersuchten Messparameter befindet sich im Anhang.

Abb. 3-11 Grafische Übersicht der verwendeten Befeldungsprotokolle für Messungen an Einzelzellen (links) und Zellpopulationen (rechts).

3.2.4.2 Untersuchung von Zellpopulationen

In Untersuchungen von Zellpopulationen erfolgte aufgrund der großen zu bewältigenden Probenzahlen Befeldung und Messung nacheinander. Eine direkte zeitliche Zuordnung der Effekte zum Feldeinfluss ist nur auf statistischem Wege möglich.

Die Untersuchungen umfassten den gesamten oben angegebenen Frequenzbereich von 0.1 Hz bis 100 kHz (Abb. 3-3.11). Im niederfrequenten Bereich wurden monopolare Pulse und Sinusfelder verwendet, im hochfrequenten Bereich wurden jedoch ausschließlich symmetrische Signale benutzt, d.h. Sinusfelder und amplitudenmodulierte Sinusfelder. Die Befeldung erfolgte immer für 30 Minuten. Während dieser Zeit befanden sich die Zellkulturen im Brutschrank, so dass Gasatmosphäre und Temperatur auf dem normalen Niveau gehalten wurden. Die Kulturplatten wurden lediglich zum Einsetzen bzw. Entfernen der Elektroden, die unter der Laminarbox erfolgten, kurz aus dem Brutschrank genommen.

Im gesamten Frequenzbereich wurde standardmäßig mit direkt eingekoppeltem Feld stimuliert, um ausreichend hohe Feldstärken im Medium zu erzeugen. Die dafür verwendeten Elektroden erzeugen ein inhomogenes elektrisches Feld im Versuchsgefäß mit Spitzen bis zu 1 kV/m in unmittelbarer Umgebung der Elektroden. Da aber in jeder Messung der Mittelwert der gesamten Population erfasst wird, gehen wir auch von einer mittleren Feldstärke aus, die 150 V/m beträgt. Diese Angaben zum [Seite 35↓]Betrag der Feldstärke beruhen auf den Ergebnissen der numerischen Modellierung der Messkammer (Kap. 4.2.4).

3.3 Versuchsplanung und Auswertung

Um Störgrößen, die aus der Zellkultur resultieren, zu minimieren wurden nur Zellen bis zur 30. Passage verwendet. Die Kultivierung der Zellen und Vorbereitung der Versuche (Einsaatdichte, Medien, Zeitpunkt) erfolgte nach dem angegebenen Protokoll.

In den Einzelzellversuchen erfolgte die Zuordnung zu einer bestimmten Gruppe nach einem randomisierten Versuchsplan, um systematische Fehler auszuschalten. Die Normierung der Parameter, die während und nach der Feldapplikation gemessen wurden, erfolgte durch die entsprechenden individuellen Werte im Zeitintervall vor Feldapplikation.

Die Versuche in Multiwellplatten (96) sind dadurch gekennzeichnet, dass sich sowohl Kontrollen als auch alle Befeldungsvarianten gleichzeitig auf einer Versuchsplatte befinden, wobei die Anordnung der Versuchsgruppen zufällig variiert wurde. Wenn nicht anders angegeben, wurden alle Varianten dreimal durchgeführt, wobei jede Einzelgruppe 8 Wiederholungen enthielt. Zur Abschätzung des Messfehlers in Multiwellplatten wurde die Genauigkeit und Reproduzierbarkeit der am häufigsten verwendeten Assays überprüft und als Variationskoeffizient angegeben. Die Bestimmung erfolgte indem alle 96 Kavitäten das gleiche Volumen und die gleiche Konzentration einer Lösung enthielten und jede Probe mehrfach gemessen wurde. Die erhaltenen Werte waren Ausgangspunkt zur Bestimmung von systematischem und methodischem Fehler (Tab. 3-3.1).

Tab. 3-1 Relative Variationskoeffizienten für die Messungen in Multiwellplatten. Angegeben sind systematische Abweichungen CVsyst (Mehrfachbestimmung an einer Probe), methodische Abweichungen CVmeth (zwischen verschiedenen Proben identischer Konzentration) und eine mittlere Abweichung CVmittel , die sich aus den beiden ersten Werten zusammensetzt.

  

CV syst [%]

CV meth [%]

CV mittel [%]

ALP

Absorption 405 nm

0.183

0.446

1.529

Propidiumiodid

Fluoreszenz 630 nm

0.631

0.281

0.806

Nitrit

Fluoreszenz 460 nm

0.642

0.523

1.692

     

Vorversuche an unbefeldeten Zellen zeigten überdies, dass nach 14-tägiger Kultivierung keine signifikanten Wachstumsunterschiede zwischen den Kavitäten am Rand und in der Mitte der Multiwellplatte bestehen, die in Folge von Temperaturschwankungen oder verdunstungsbedingten Konzentrationsänderungen im Medium hätten auftreten können.

Die Auswertung der gemessenen Parameter erfolgte in allen Fällen auf die gleiche Art und Weise. Der Messwert jeder einzelnen Probe wurde auf parallel geführte Kontrollen normiert. In den Diagrammen ist der Median dieser relativen Größen mit dem dazugehörigen Standardfehler des Medians aufgetragen. Die Verwendung des Medians war angebracht, da er sich im Gegensatz zum Mittelwert als robust gegen Ausreißer erweist und für die z.T. wenigen, asymmetrisch verteilten Messwerte verlässlichere Ergebnisse liefert. Diese linksschiefe Verteilung der Messwerte ist jedoch bei biologischen und medizinischen Daten sehr häufig und muss bei der statistischen Bearbeitung des Datenmaterials berücksichtigt werden. Da also in nahezu allen Gruppen keine Normalverteilung vorliegt, ist die wichtigste Voraussetzung für die Anwendung parametrischer Testverfahren wie t-Test nicht gegeben und diese dürfen nicht angewandt werden. Es gelang auch nicht, durch eine geeignete Transformation normalverteilte Daten zu erhalten. Daher wurden in jedem Fall verteilungsunabhängige statistische Verfahren eingesetzt. Für den Vergleich unabhängiger Stichproben diente der U-Test nach Mann und Whitney, verbundene Stichproben wurden nach Wilcoxon getestet. Der U-Test ist ein Rangsummentest für ähnliche bis gleiche Verteilungsformen und das nichtparametrische Gegenstück zum t-Test. Er geht davon aus, dass die n=n1+n2 Beobachtungen der Größe nach geordnet und von 1 bis n durchnummeriert werden. Weist die eine der beiden Stichproben im Durchschnitt kleinere Werte auf, so werden sich die Rangsummen der Stichproben unterscheiden.


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08.06.2004