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Zellbiologische Ergebnisse – Wirkung elektrischer Felder auf zelluläre Parameter von Knochenzellen

5.1  Die intrazelluläre Kalziumkonzentration

5.1.1  Beeinflussung der Messung durch die UV-Empfindlichkeit der Zellen

5.1.1.1  UV-Empfindlichkeit von Osteosarcoma- Zellen

In Vorversuchen musste festgestellt werden, dass bereits unbefeldete HOS TE85 einen Anstieg in der intrazellulären Kalziumkonzentration zeigten. Diese Reaktion war abhängig vom Messtakt und damit von der während der Messung applizierten Dosis des Fluoreszenzanregungslichts. Da die Anregungswellenlängen für den Kalzium-sensitiven Farbstoff Fura-2 im ultravioletten Bereich des Spektrums liegen (334 nm und 380 nm), sind die Zellen während eines 30minütigen Experiments einer nicht zu unterschätzenden UVA-Strahlungsdosis ausgesetzt.

Die morphologischen Veränderungen, die HOS TE85 während längerer UVA-Belichtung erfahren, zeigt Abb. 5-5.1. Im Laufe des Experiments kugeln sich die bestrahlten Zellen zunehmend ab, teilweise werden auch Vesikel abgeschnürt.

Abb. 5-1 Mikroskopische Durchlichtbilder von HOS TE85 während längerer Belichtung mit 334/380 nm.

Abb. 5-2 Exemplarisches Verhalten der intrazellulären
Kalziumkonzentration während der Versuchszeit. Man
findet Peaks, Oszillationen, langsame und schnelle Anstiege
mit anschließend erhöhter Kalziumkonzentration (von oben nach unten).

Deshalb wurde die Strahlungsleistung des ultravioletten Fluoreszenzanregungslichts vor und nach jedem Experiment gemessen und deren Mittelwert der Dosisberechnung zugrunde gelegt (siehe Kap. 3.1.2.2). Diese berücksichtigt die Dauer eines einzelnen Anregungsblitzes und den verwendeten Messtakt.

Die maximale Dosisleistung während der Experimente betrug 844 W/m2 für 334 nm und 2768 W/m2 für 380 nm. Bei schnellstmöglichem Messtakt entsprechen diese Werte einer maximalen Dosis von 317 kJ/m2 für 334 nm und 1038 kJ/m2 für 380 nm. Demzufolge betrug die gesamte Dosis 1355 kJ/m2. Das ist der Maximalwert, der jedoch nur für die Zellen in der Mitte des mikroskopischen Gesichtsfeldes gilt, Zellen am Rand des Gesichtsfeldes waren einer geringeren Dosis ausgesetzt.

Die Variation der Dosis erfolgte in erster Linie durch die Veränderung des Messtakts. Unabhängig davon sinkt die Strahlungsleistung und Strahlungsdosis mit zunehmendem Alter der Lampe. Während der Zeit, in der diese Experimente durchgeführt wurden, sank die Dosisleistung von 1115 W/m2 auf 225 W/m2. Um diesen altersbedingten Prozess zu kompensieren, musste der Messtakt verkürzt [Seite 48↓]werden. Das bedeutete aber sowohl eine Veränderung der Strahlungsdosis als auch der Strahlungsleistung. Beide Parameter können aus diesem Grund nicht unabhängig voneinander verändert werden.

Als Reaktion auf die applizierte UVA-Dosis beobachteten wir ein sehr heterogenes Verhalten der intrazellulären Kalziumkonzentration. Das beinhaltete sowohl transiente Veränderungen (Peaks) als auch anhaltende Anstiege und Oszillationen (Abb. 5-5.2). Die Auswertung erfolgte daher durch Einteilung aller Zellen eines Versuches in zwei Klassen: reagierend und nicht reagierend. Als reagierend wurden solche Zellen bewertet, die entweder einen transienten oder dauerhaften Anstieg der internen Kalziumkonzentration zeigen. Die prozentualen Anteile dieser beiden Klassen korrelieren vor allem mit der Strahlungsdosis, weniger mit der Strahlungsdosisleistung (Abb. 5-5.3, Abb. 5-5.4). Es war experimentell jedoch nicht möglich, beide Parameter unabhängig voneinander zu verändern.

Die Regression der Daten erfolgte mit einem vereinfachten sigmoiden Modell:

.

Gleichung 10

Damit erhält man für die Halbwertsdosis x 50 (48 ± 7)kJ/m 2 und 1.2 ± 0.3 für den Exponenten p . Der Korrelationskoeffizient r 2 beträgt 0.55 und bestätigt die Dosisabhängigkeit für den beobachteten Effekt.

Abb. 5-3 Prozentualer Anteil der reagierenden HOS TE85-Zellen an der Gesamtzellzahl in Abhängigkeit von der gesamten mittleren Strahlungsdosis während eines Versuches. Die durchgezogene Linie zeigt die sigmoide Kurvenanpassung mit dem dazugehörigen 95%-Vertrauensbereich (gestrichelte Linie, schwarz) und den 95%-Bereich der Gesamtpopulation (gestrichelte Linie, grau).

5.1.1.2 UV-Empfindlichkeit von Osteoblasten

Abb. 5-4 Prozentualer Anteil der reagierenden primären OB an der Gesamtzellzahl in Abhängigkeit von der gesamten mittleren Strahlungsdosis während eines Versuches. Die durchgezogene Linie zeigt die sigmoide Kurvenanpassung mit dem dazugehörigen 95%-Vertrauensbereich (gestrichelte Linie, schwarz) und den 95%-Bereich der Gesamtpopulation (gestrichelte Linie, grau).

Für primäre Osteoblasten konnte eine ähnliche Abhängigkeit der intrazellulären Kalziumkonzentration von der UVA-Dosis gefunden werden. Wir bereits bei Osteosarcomazellen beobachtet wurde, bewirken hohe Strahlungsdosen in nahezu allen Zellen eine Erhöhung der Kalziumkonzentration. In den durchgeführten Experimenten konnte die Dosis jedoch nicht soweit verringert werden, dass keine Veränderung des zellulären Kalziumspiegels mehr erfolgte. Das weist darauf hin, dass primäre Zellen empfindlicher gegenüber UVA-Strahlung sind. Das wird auch durch die Ergebnisse der Regression [Seite 49↓]bestätigt. Da der Kurvenanpassung jedoch nur relativ wenige Experimente zugrunde gelegt werden konnten, sind die ermittelten Parameter mit einem großen Fehler behaftet. Man erhält für die Halbwertsdosis x 50 (22 ± 10)kJ/m 2 und 0.6 ± 0.2 für den Exponenten p . Der Korrelationskoeffizient r 2 beträgt 0.34.

5.1.1.3 Abhängigkeit der UV-Empfindlichkeit vom individuellen Zustand der Zellen

Abb. 5-5 Zeitlicher Verlauf der Stimulierbarkeit von synchronisierten HOS
TE85 durch UVA (● 60kJ/m2), relativer Anteil an G2- (○) und G1-Phasen (Δ).

Abb. 5-6 UV-Dosisabhängigkeit der Zellreaktion von synchronisierten HOS
TE85 am G1/S-Übergang (● 0:00h) und nach Wiedereintritt in den Zellzyklus
(○ 2:30h, S-Phase).

Der Hypothese folgend, dass nur ausgewählte zelluläre Stadien sensibel auf bestimmte äußere Reize sind, wurden HOS TE85 mittels Aphidicolin synchronisiert. Aphidicolin ist ein Inhibitor der DNA-Polymerase und bewirkt eine Akkumulation der Zellen am Übergang von der G1- zur S-Phase. Nach Entfernen des Inhibitors erfolgt der relativ synchrone Wiedereintritt in den Zyklus. Dadurch nimmt der Anteil der S-Phasen von 30% (normal) auf maximal 85% (synchronisiert) zu. Im Anschluss wurde die Reaktion der Zellen auf UVA-Belichtung in verschiedenen Stadien des Zellzyklus untersucht. Die verwendete Dosis von 60kJ/m2 entspricht in etwa der für unsynchronisierte Zellen ermittelten Halbwertsdosis [183]. Abb. 5-5.5 zeigt den zeitlichen Verlauf der UVA-Wirkung auf die intrazelluläre Kalziumkonzentration von HOS TE85. Außerdem enthält die Abbildung die prozentualen Anteile von G1- und G2-Phasen an der Gesamtpopulation. Direkt am Übergang von der G1- zur S-Phase beobachtet man eine sehr starke UVA-Wirkung, die aber mit dem Wiedereintritt in den Zellzyklus sehr schnell nachlässt und während des folgenden Beobachtungszeitraums auf einem mittleren Niveau verbleibt. Daraus lässt sich schlussfolgern, dass die UV-Empfindlichkeit von HOS TE85 während der S-Phase nicht erhöht ist. Vielmehr scheinen die späte G1-Phase, insbesondere der G1/S-Übergang, sowie die G2-Phase strahlungsempfindliche Punkte innerhalb des Zellzyklus zu sein. Aufgrund des hohen Anteils an G1-Phasen (>50%) in unsynchronisierten Populationen führt diese Tatsache zu einem relativ hohen „Grundrauschen“ durch UV-bedingte Zellreaktionen.

Im Anschluß wurde für festgelegte Punkte des Zellzyklus die Dosisabhängigkeit bestimmt (Abb. 5-6). Als Zeitpunkte wurden der G1/S-Übergang und die frühe S-Phase, 2:30h nach dem Wiedereintritt in den Zellzyklus ausgewählt. Bei ersterem wurde eine sehr starke UV-Wirkung beobachtet (Abb. 5-5.5), am zweiten Punkt trat die maximale Feldwirkung auf (Kap. 5.1.4). Die sigmoide Kurvenanpassung lieferte folgende Parameter:

 

x50

p

Zeit 0:00h

41 ± 5

1.1 ± 0.2

0.54

Zeit 2:30h

68 ± 10

4.4 ± 3.4

0.49

Das zeigt, dass sich nicht nur die Halbwertsdosis verändert, sondern vor allem die Steigung der Kurve. Das bewirkt während der S-Phase eine verringerte Empfindlichkeit gegenüber geringen Strahlungsdosen. Hohe Dosen führen aber zu einem starken Effekt, der mit den Beobachtungen an anderen Zellpopulationen vergleichbar ist. Das weist auf die Existenz einer maximal verträglichen UV-Dosis unabhängig vom Zellzyklus hin.


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5.1.2  Wirkung niederfrequenter gepulster elektrischer Felder auf Osteosarcomazellen

Der Einfluss niederfrequent gepulster elektrischer Gleichfelder auf die intrazelluläre Kalziumkonzentration von HOS-Zellen wurde während der direkten Applikation einer Rechteckspannung konstanter Pulslänge (entsprechend 1.5 Hz) und variabler Amplitude untersucht. Zur Feldapplikation in den Zellkulturen wurden die im Vorfeld untersuchten Elektroden verwendet (Kap. 3.2.2.1 und 4.1). Mit den verwendeten Elektrodenanordnungen konnte ein Feldstärkenbereich von 10 V/m bis 3 kV/m abgedeckt werden.

Die Untersuchungen der intrazellulären Kalziumkonzentration unter dem Einfluss elektrischer Felder zeigen einen prinzipiellen Unterschied zu anderen, rezeptorvermittelten Zellprozessen wie z.B. der Wirkung von PTH. In jenem Fall wird durch die spezifische Bindung des Agonisten an den Rezeptor eine Signalkaskade in Gang gesetzt, die einen eindeutigen und dosisabhängigen zellulären Effekt vermittelt. Kalzium trägt als Bestandteil dieser Signalkaskade vorrangig durch schnelle, transiente Veränderungen seiner freien zytoplasmatischen Konzentration zur Weiterleitung externer Stimuli bei.

Bei den im Folgenden beschriebenen Experimenten wurden jedoch sehr heterogene Reaktionen der internen Kalziumkonzentration beobachtet, die sowohl transiente als auch dauerhafte Veränderungen sowie Oszillationen umfassten (Abb. 5-5.2 und Abb. 5-5.14). Dieses Verhalten ähnelt den bereits beschriebenen UVA- bedingten Zellreaktionen und könnte ein Hinweis darauf sein, dass keiner der beiden Effekte durch einen spezifischen Rezeptor vermittelt wird. Dabei ist nicht eindeutig klar, welche der beobachteten Zellreaktionen für die Vermittlung eines dauerhaften Feldeffekts relevant ist. Diese Heterogenität in den Zellreaktionen stellte uns vor das Problem, eine sinnvolle Auswertemethode zu finden.

Relativ leicht zugänglich und robust gegen Ausreißer und Streuungen erwiesen sich Intervall-Medianwerte, die zellindividuell ermittelt und in Verteilungskurven zusammengefasst werden (Abb. 5-5.7). Wie bereits erwähnt, waren die Messwerte in fast allen Fällen linkssteil und damit nicht normalverteilt. Aufgrund dieser Asymmetrie durften keine parametrischen statistischen Verfahren wie z.B. der t-Test angewandt werden.

Abb. 5-7 Auswertung der Kalziumkinetik von Einzelzellen. Links: Die Mediane der Zeitintervalle vor, während und nach Feldapplikation werden bestimmt; alle Einzelwerte liefern die oben gezeigten Histogramme. Rechts: Vergleich der Verteilungsform über Histogrammdarstellungen (oben) und Boxplots (unten). Der Boxplot ist ein Diagramm auf der Grundlage des Medians, der Quartile und der Extremwerte. Die Box stellt den Interquartilbereich (25-75%) mit 50% der Werte dar. Die von der Box ausgehenden Linien führen jeweils bis zum höchsten und niedrigsten Wert, ohne Ausreißer zu berücksichtigen. Die quer über die Box gelegte Linie gibt die Lage des Medians wieder.

Um festzustellen, ob sich die intrazelluläre Kalziumkonzentration während des Versuchs überhaupt verändert, wurde ein „innerer Vergleich“ durchgeführt. Dabei werden die Medianwertverteilungen [Seite 51↓]verschiedener Intervalle ein und desselben Versuchs miteinander verglichen (z.B. vor Feld/nach Feld). Dieser mit dem Wilcoxon-Test durchgeführte innere Vergleich bestätigt, dass sich die intervallspezifischen Kalzium-Medianwerte jeder Versuchsgruppe voneinander unterscheiden. Ein signifikanter Unterschied zwischen diesen Verteilungen kann aber sowohl UV- als auch Feld-bedingt sein. Es ist sogar anzunehmen, dass sich beide Effekte überlagern. Deshalb wurden anschließend Vergleiche für Medianwertverteilungen ein und desselben Intervalls verschiedener Versuche durchgeführt. Um verlässliche Aussagen in der Befeldungs- bzw. in der Nachbeobachtungsphase zu erhalten, war es jedoch wichtig, dass es in der Vorlaufphase (ohne Feld) keine Unterschiede zwischen den Versuchen gibt. Solche Unterschiede können u.a. durch Zellzustand, Farbstoffkonzentration, Beleuchtungsintensität und Temperatur bedingt sein. Deshalb wurde der Intervall-Median jedes Versuchsabschnitts für jede einzelne Zelle auf den Anfangswert (Vorlauf) bezogen und die Verteilungen so normiert.

In allen Versuchsgruppen konnte bei der Mehrzahl der Zellen ein Anstieg in der intrazellulären Kalziumkonzentration beobachtet werden. Darunter fallen auch transiente Veränderungen wie sie beispielsweise von Peaks oder Oszillationen hervorgerufen werden. Das Auftreten solcher Veränderungen war jedoch zeitlich nicht auf die Dauer der Feldapplikation begrenzt. Sehr oft konnte auch nach Abschalten des Feldes ein weiteres Ansteigen der Kalziumkonzentration beobachtet werden. In einigen Versuchen begann der Anstieg bereits mit dem Versuchsbeginn und kann daher nicht durch das Feld ausgelöst worden sein.

Verteilung der intrazellulären Kalziumkonzentration von HOS TE85 nach der Applikation von PEMF verschiedener Feldstärke. Die Zellzahlen in jeder Versuchsgruppe (N) und die asymptotische Signifikanz (2-seitig) für Verteilungsunterschiede (U-Test) sind angegeben (p≶0.001 ***/+++, p≶0.01 **/++, p≶0.05 */+), wobei (*) während Feld gegen Kontrolle, (+) nach Feld gegen Kontrolle symbolisiert.

55.8 Betrachtet man die Verteilung der Kalzium-Medianwerte nach der PEMF-Applikation im Vergleich zur Kontrolle (Abb. 5-5.8), lässt sich feststellen, dass sowohl in Kontroll- als auch in Feldexperimenten die mittlere Kalziumkonzentration zunimmt. Die Verteilungen sind jedoch nicht symmetrisch, sondern ausnahmslos linksschief. D.h. es gibt einen größeren Anteil an Zellen, die einen überdurchschnittlich hohen Kalziumgehalt haben. Bei Feldexperimenten nimmt die Spannweite der Verteilung sogar noch zu. Zum Teil wird die linke Flanke der Verteilung steiler als die entsprechende Kontrolle, d.h. dass sich weniger Zellen im unteren Konzentrationsbereich befinden. An der rechten Flanke bilden sich in einigen Gruppen Schultern, die ebenfalls auf eine Verschiebung zu höheren Konzentrationen hindeuten. Eventuell handelt es sich dabei sogar um eine bestimmte, sensiblere Subpopulation von Zellen. Die Erhöhung der mittleren Kalziumkonzentration und die Verbreiterung der Verteilung sind im [Seite 52↓]mittleren Feldstärkebereich von 30 V/m bis 300 V/m am stärksten ausgeprägt. Eine Veränderung der Verteilungsform ist jedoch nicht zwangsläufig mit einer deutlichen Verschiebung des Medians verbunden (Abb. 5-5.8, 30 V/m).

Die größten Konzentrationsunterschiede im Vergleich zur Kontrolle treten in der Nachbeobachtungszeit auf. Diese Werte sind immer höher als die entsprechenden Konzentrationen während der Feldapplikation. Dieses Verhalten lässt auf überwiegend langsame, andauernde Anstiege der Kalziumkonzentration oder auf Peaks mit nachfolgend erhöhter Konzentration schließen. Im Ergebnis bleibt die zytosolische Kalziumkonzentration der Zellen längerfristig erhöht.

Abb. 5-9 Verteilung der intrazellulären Kalziumkonzentration von HOS TE85 nach der Applikation von PEMF verschiedener Feldstärke und zusätzlichem oxidativen Stress. Die Zellzahlen in jeder Versuchsgruppe (N) und die asymptotische Signifikanz (2-seitig) für Verteilungsunterschiede (U-Test) sind angegeben (p<0.001 ***/+++, p<0.01 **/++, p<0.05 */+), wobei (*) während Feld gegen Kontrolle, (+) nach Feld gegen Kontrolle symbolisiert.

In Abb. 5-5.9 sind Versuche dargestellt, die mit zusätzlichem oxidativen Stress durch die Zugabe von SIN-1 durchgeführt wurden. Qualitativ sind die Verteilungen der Kalzium-Medianwerte denen der normalen Versuche vergleichbar, jedoch treten bestimmte Verteilungsunterschiede stärker hervor (vgl. Abb. 5-5.8). Auch hier handelt es sich um linksschiefe Verteilungen, die sowohl für Kontroll- als auch für Feldexperimente einen Anstieg der mittleren Kalziumkonzentration aufzeigen. Der erhöhte Anteil von reaktiven Sauerstoffspezies in der Versuchslösung manifestiert sich auch in einer stärkeren Rechtsverschiebung, d.h. zu höheren Kalziumkonzentrationen, der Kontrollen. Den gleichen Effekt findet man auch in den befeldeten Gruppen, er ist jedoch wesentlich stärker ausgeprägt und tritt wiederum besonders im mittleren Feldstärkebereich auf.

Aber im Vergleich zu den normalen Versuchen, d.h. denen ohne erhöhtes Stressniveau, sind die Unterschiede zur Kontrolle deutlicher und die Verschiebungen der Verteilung treten in einem größeren Feldstärkebereich auf. Während in den normalen Versuchen nur der Feldstärkebereich von 30 V/m bis 300 V/m wirksam war, konnten bei gleichzeitiger Erhöhung des oxidativen Stress im gesamten Messbereich signifikante Abweichungen von der Kontrollgruppe gefunden werden. Diese Unterschiede manifestieren sich in einer echten Verschiebung des Medians.

Auch in dieser Versuchsserie sind die Unterschiede in der Kalziumkonzentration im Zeitraum nach der Befeldung am größten. Das spricht auch hier für eine andauernde Erhöhung der zytosolischen Kalziumkonzentration. Das lässt eine überwiegende Beteiligung von langsameren Influxprozessen vermuten.

Einen zusammenfassenden Vergleich der Versuche ohne/mit zusätzlichem oxidativen Stress bietet LINKlink. In beiden Fällen ist die Erhöhung der intrazellulären Kalziumkonzentration gegenüber der Kontrolle im mittleren Feldstärkebereich am größten. Zusätzlicher oxidativer Stress verstärkt diesen Effekt noch. Besonders erfolgversprechend erscheint der Bereich von 100 V/m bis 1000 V/m. Außerdem muss man davon ausgehen, dass die gleichzeitige Erhöhung des oxidativen Stresses während der Experimente nicht nur zu einer einfachen Addition beider Effekte führt. Da die in Abb. 5-5.10 dargestellten Einzelwerte der normalen Versuche in Relation zur Kontrolle (-), die der zusätzlich gestressten Versuche jedoch in Relation zur entsprechend positiven Kontrolle (+) erhalten wurden, hätte eine bloße Addition beider Effekte keinen Unterschied zwischen den Versuchsreihen zur Folge gehabt. Man kann deshalb eine synergistische Wirkung von oxidativem Stress und gepulsten elektrischen Feldern vermuten.

Abb. 5-10 Die intrazelluläre Kalziumkonzentration von HOS TE85 ohne (-)/mit (+) zusätzlichem oxidativen Stress nach der Applikation von PEMF verschiedener Feldstärke in Relation zur Kontrolle. Aufgetragen sind die Mediane der Verteilungen aus Abb. 5-5.9 bzw. Abb. 5-5.8.

5.1.3 Wirkung niederfrequent modulierter, elektrischer Hochfrequenzfelder auf Osteosarcomazellen

In einer weiteren Versuchsreihe wurde der Einfluss modulierter elektrischer Wechselfelder im Frequenzbereich von 100 Hz bis 100 kHz untersucht. Die angegebene Trägerfrequenz wurde stets mit 16 Hz und einer Tiefe von 100% amplitudenmoduliert. Um der Fragestellung nachzugehen, inwieweit die oxidative Wirkung des UVA-Anregungslichts und das applizierte elektrische Feld synergistisch wirken, wurden alle Versuche mit zwei unterschiedlichen Messtakten (10 sec und 30 sec) durchgeführt. Das entspricht einer durchschnittlichen UV-Dosis von 30 kJ/m2 bzw. 15 kJ/m2.

Wie zu erwarten ist die Verteilung der Kalziummittelwerte nach der Applikation von amplitudenmodulierten Sinusfeldern ebenfalls linksschief (Abb. 5-5.11). Das gilt sowohl für Kontroll- als auch für Feldexperimente. Anders als in der Serie mit gepulsten Feldern treten aber in dieser Versuchsreihe nur geringe Veränderungen der mittleren intrazellulären Kalziumkonzentration auf. Prinzipiell muss aber berücksichtigt werden, dass die Gesamtdauer dieser Versuche durch die Befeldungsdauer 5 min kürzer war als die der Serie mit gepulsten Feldern. Die Absolutwerte der Kalziumkonzentration können daher nicht direkt miteinander verglichen werden. Aufgrund der unterschiedlichen Länge der Versuchsintervalle während Befeldung und nach Befeldung verhalten sich die entsprechenden Konzentrationsveränderungen auch nicht proportional. Es fällt jedoch auf, dass in einigen Gruppen (300 Hz, 10 kHz, 30 kHz) besonders große Unterschiede zwischen den beiden Intervallmedianwerten auftreten, die für einen verzögerten Anstieg der Kalziumkonzentration oder einzelne Peaks in der Nachbeobachtungsphase sprechen. Auffallend kleine Unterschiede der Intervallmedianwerte (100 Hz, 3 kHz, 100 kHz) sind in erster Linie durch Änderungen in der Verteilungsform verursacht. Der Median der Kalziumkonzentrationen wird dabei nur geringfügig verschoben.

In Versuchen mit geringer UVA-Belastung treten während der Befeldung prinzipiell niedrigere mittlere Kalziumkonzentrationen auf als in den entsprechenden Kontrollen. Lediglich im Bereich von 300 Hz bis 1 kHz ist dieser vermindernde Effekt weniger ausgeprägt. Im Nachbeobachtungszeitraum setzt [Seite 54↓]sich dieses Verhalten fort. Zusätzlich verschwindet der Unterschied zwischen Kontrollgruppe und der 30 kHz-Gruppe. Das bedeutet, dass in der Gruppe 30 kHz der dauerhafte Anstieg der Kalziumkonzentration v.a. nach Feldapplikation erfolgte. Eventuell während der Applikation auftretende Peaks haben nur einen geringen Einfluss auf den Intervallmedian.

Abb. 5-11 Verteilung der intrazellulären Kalziumkonzentration von HOS TE85 nach der Applikation von amplitudenmodulierten Sinusfeldern verschiedener Frequenz (durchschnittliche UVA- Dosis 15 kJ/m2). Die Zellzahlen in jeder Versuchsgruppe (N) und die asymptotische Signifikanz (2-seitig) für Verteilungsunterschiede (U-Test) sind angegeben (p<0.001 ***/+++, p<0.01 **/++, p<0.05 */+), wobei (*) während Feld gegen Kontrolle, (+) nach Feld gegen Kontrolle symbolisiert.

In Versuchen mit erhöhter UVA-Belastung traten Verteilungsunterschiede schon eher, nämlich bereits während der Befeldung auf, die sich im Nachbeobachtungszeitraum manifestierten. Aus der veränderten Lage des Medians kann man zwei verschiedene Effekte ableiten (Abb. 5-5.12). Im unteren Frequenzbereich bis etwa 3 kHz wird die Verteilung schmaler und die mittlere Kalziumkonzentration nimmt im Vergleich zur Kontrolle ab. Mit Ausnahme der Frequenz um 1 kHz sind diese Unterschiede statistisch signifikant. Bei höheren Frequenzen verbreitert sich die Verteilung und verschiebt sich zu höheren Konzentrationswerten. Insbesondere in der Gruppe 30 kHz findet man deutliche Erhöhungen gegenüber der Kontrollgruppe. Diese Beobachtung spricht für eine synergistische Wirkung von Feld und UV-Strahlung in diesem Frequenzbereich.

Bei Befeldung mit Frequenzen bis 3 kHz existiert kaum ein Unterschied zwischen den Gruppen mit hoher und niedriger UVA-Belastung relativ zur Kontrolle. Vergleicht man die absoluten Konzentrationen, treten nach erhöhter Strahlungsbelastung immer höhere Werte auf als nach niedriger Belastung. Diese sind jedoch immer kleiner als die entsprechenden Kontrollwerte. D.h., dass der UV-bedingte Anstieg der Kalziumkonzentration während der Feldapplikation geringer ist. Das weist auf eine potentielle Schutzwirkung des Feldes hin.

Unterschiede in der Verteilung zeigen sich vor allem in der Breite und der Schiefe der Verteilung und dem Auftreten von lokalen Dichtemitteln. Diese zeigen das Vorhandensein von Subpopulationen an und treten bei Frequenzen größer als 1 kHz, jedoch nicht bei 3 kHz auf. Gleichzeitig sind die Verteilungen dieser Gruppen, außer bei 30 kHz, deutlich weniger linksschief als die Kontrollen. Dieser Effekt wird verursacht durch das Herauslösen einer Subpopulation von Zellen mit erhöhter Kalziumkonzentration aus der Gesamtpopulation. Die mittlere Konzentration der Hauptpopulation wird durch den Einfluss des Feldes kaum verändert. Dieser Fakt manifestiert sich auch durch das Auftreten der zwei Dichtemittel.


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Abb. 5-12 Verteilung der intrazellulären Kalziumkonzentration von HOS TE85 nach der Applikation von amplitudenmodulierten Sinusfeldern verschiedener Frequenz und erhöhter UVA- Belastung (durchschnittliche UVA- Dosis 30 kJ/m2). Die Zellzahlen in jeder Versuchsgruppe (N) und die asymptotische Signifikanz (2-seitig) für Verteilungsunterschiede (U-Test) sind angegeben (p<0.001 ***/+++, p<0.01 **/++, p<0.05 */+), wobei (*) während Feld gegen Kontrolle, (+) nach Feld gegen Kontrolle symbolisiert.

Abb. 5-5.13 fasst die oben dargestellten Ergebnisse zusammen. Sowohl in Versuchen mit normaler als auch in Versuchen mit erhöhter UVA-Belastung sind nur geringe Änderungen der intrazellulären Kalziumkonzentration gegenüber der Kontrolle festzustellen. Ausnahmen bilden die Gruppen 100 Hz, 3 kHz und 30 kHz, die einen Nettoabfall bzw. einen Nettoanstieg des Kalziumgehalts zeigen. Unter normaler UVA-Belastung bzw. in frühen Phasen des Experiments kann ein Schutzmechanismus des Feldes vor weiterer oxidativer Schädigung der Zellen vermutet werden.

Abb. 5-13 Die intrazelluläre Kalziumkonzentration von HOS TE85 mit normaler und erhöhter UVA-Belastung nach der Applikation von amplitudenmodulierten Sinusfeldern verschiedener Frequenz in Relation zur Kontrolle. Aufgetragen sind die Mediane der Verteilungen aus Abb. 5-5.12 bzw. Abb. 5-5.11.

In einer weiteren Versuchsreihe wurde getestet, welche Rolle die Amplitudenmodulation von 16 Hz spielt. Dazu wurden modulierte und unmodulierte Befeldungsversuche mit der Trägerfrequenz 3kHz gegenübergestellt, die zwischen 200 und 600 Einzelzellen enthielten. Die Ergebnisse sprechen für eine geringfügig stärkere Wirkung (p<0.05) der modulierten Felder.


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5.1.4  Elektrische Stimulation von synchronisierten Osteosarcomazellen

Die oben dargestellten Ergebnisse legen nahe, dass nur ein geringer Teil der gesamten Zellpopulation durch ein externes elektrisches Feld stimulierbar ist und das es sich bei dieser Subpopulation um Zellen innerhalb einer bestimmten Zellzyklusphase handelt. Um zu untersuchen, ob sich die These erhärten lässt, wurden Befeldungsversuche an Aphidicolin- synchronisierten Zellen durchgeführt. Mit Hilfe von Messungen des intrazellulären Kalziumgehalts wurde die Stimulierbarkeit von HOS-Zellen in zeitlicher Abhängigkeit von deren Progression durch den Zellzyklus (Beginn 1 h nach Wiedereintritt in Zyklus an G1/S, Ende max. 6h später) bewertet.

Um die Anzahl der freien Parameter einzuschränken, wurden nur folgende Feldvarianten eingesetzt:

Alle Versuche wurden bei 37°C durchgeführt und die Zellen für 10min befeldet. Die UV-Dosis in diesen Versuchen lag mit 15kJ/m2 deutlich unter der oben erwähnten Halbwertsdosis.

Wie bereits in Kap. 5.1.1.1 festgestellt wurde, kann auch der Einfluss anderer (feldunabhängiger) Faktoren, v.a. UV-Anregungslicht zu Erhöhungen des zellulären Kalziumspiegels führen. Das muss jedoch von potentiellen Feldeffekten deutlich getrennt werden. Im Gegensatz zu den bisher untersuchten, unsynchronisierten Zellkulturen, scheint dies bei synchronisierten Kulturen aus folgenden Gründen möglich: die UV-Sensibilität ist im Zeitraum der beobachteten Feldwirkung relativ gering. Die Applikation elektrischer Felder kann jedoch deutliche Veränderungen der Kalzium-Konzentration, v.a. durch Peaks und sprungartige Anstiege, hervorrufen. Bei Reaktionen, die vermutlich durch UV-Licht verursacht werden, treten seltener Peaks auf, es überwiegen langsame anhaltende Anstiege. Damit ergibt die Auswertung der Peakhäufigkeit ein sehr viel sichereres Maß als die oben benutzte Methode der Intervallanstiege, die ja auch durch UV ausgelöst werden können.

Obwohl man unter einem Peak eher ein scharfes Maximum mit steilen Flanken versteht, wurden bei der erfolgten Auswertung nicht nur solche Ereignisse, sondern auch sehr steile, peakähnliche Anstiege der Kalziumkonzentration mit anschließend stark erhöhtem Kalziumspiegel als Peaks gewertet.

Zunächst ist festzustellen, dass auch synchronisierte Kulturen auf Einzelzellniveau noch immer ein heterogenes Verhalten zeigen (Abb. 5-5.14). Das mag in der “Effektivität” der Synchronisation begründet liegen, die nie 100%ig war und zwischen den Versuchstagen schwankte. Der unmittelbare Nachweis der Zellzyklusphasen mit Fluoreszenzimaging im Anschluss an die Kalzium-Messungen war jedoch nicht erfolgreich. Alternativ erfolgte eine qualitative Bewertung mit Hilfe von FACS-Analysen an parallel geführten Zellkulturen. Diese erlaubt jedoch nur Aussagen über die Verteilung der einzelnen Phasen und die Vitalität der Gesamtpopulation.

Als Reaktion auf ein externes elektrisches Feld können verschiedenartige Veränderungen der internen Kalziumkonzentration beobachtet werden. Dazu gehören einfache Peaks (Abb. 5-5.14A-C), wiederholte Peaks bzw. Oszillationen (Abb. 5-5.14E-G) und langsamere, langanhaltende Veränderungen. Die Peaks können verschieden lang sein, und wiederholt und zu verschiedenen Zeitpunkten in Bezug auf die Feldapplikation auftreten. Daher scheint es keine einheitliche Latenzzeit bzw. Mindestdauer für die Feldeinwirkung für HOS TE85 zu geben. Wenn sehr starke Peaks auftreten, findet man oft mehr oder weniger gleichzeitige Reaktionen in benachbarten Zellen, was auf die Bedeutung der Zell-Zell-Kommunikation hinweist. Mit etwa der gleichen Häufigkeit wie Peaks treten langsame, aber anhaltende Veränderungen der Kalziumkonzentration auf. Meist handelt es sich dabei um Konzentrationsanstiege. Diese können auch Oszillationen oder Peaks überlagert sein (Abb. 5-5.14G). Zum Teil beobachtet man nur stärkere Fluktuationen der Kalziumkonzentration, die zu einer Nettoerhöhung führen (Abb. 5-5.14F, H). Im Fall hoher Basiskonzentrationen führt dieses veränderte Transportverhalten zum Absinken der internen Konzentration (Abb. 5-5.14J, L).

Bei Anwesenheit von EDTA in der Außenlösung nimmt die Intensität der beobachteten Reaktionen ab (Abb. 5-5.14D, H, L). Es können jedoch immer noch intrazelluläre Kalziumpeaks ausgelöst werden. Auch langsamere Veränderungen, die sowohl zur Erhöhung der Konzentration als auch zu deren Erniedrigung führen können, treten auf. Lediglich sehr schnelle, sprungartige Erhöhungen der internen Kalziumkonzentration konnten bei Anwesenheit von EDTA nicht beobachtet werden. Das deutet [Seite 57↓]darauf hin, dass diese langfristigen und auch sehr starken Effekte durch verstärkten Influx extrazellulären Kalziums hervorgerufen werden.

Abb. 5-14 Beispiele für Reaktionen synchronisierter Zellen auf Feldapplikation. Der Balken kennzeichnet das Befeldungsintervall. (D), (H), (L) in HANKS-Puffer mit 1mM EDTA, alle anderen in HANKS-Puffer mit 1mM CaCl2.

Für das Entstehen von Peaks bzw. Oszillationen scheinen vor allem intrazelluläre Kalziumspeicher von Bedeutung zu sein. Der Influx externen Kalziums könnte als eine Art Verstärkungsfaktor dienen.

Trotz dieser Heterogenität ist in nahezu allen Versuchen ein deutliches Zeitfenster für die (maximale) Stimulierbarkeit zu finden (Abb. 5-5.15). Das zeitliche Verhalten der Zellreaktion korreliert gut mit dem Anteil der S-Phasen in der Population. Zur Auswertung wurden alle Daten in 30minütige Klassen geordnet und anschließend Klassenmittelwerte gebildet (Abb. 5-5.16). Der Zeitpunkt der maximalen Peakhäufigkeit befindet sich in allen Versuchsgruppen vergleichbar im Bereich zwischen 2 und 3 Stunden nach Entfernen des Aphidicolinblockes. Somit zeigt sich eine erhöhte Sensibilität in der frühen S-Phase. Im Vergleich zum zeitlichen Verhalten der Reaktion auf andere Stimuli (Kap. 5.1.1), sind jedoch mehr oder weniger stark ausgeprägte reizspezifische Zeitfenster zu vermuten. Abb. 5-5.17 zeigt die mittleren Peakhäufigkeiten in den verschiedenen Versuchsgruppen, bestimmt zu den jeweiligen Zeitpunkten der maximalen Peakhäufigkeit aus Abb. 5-5.16. Außerdem ermöglicht diese Abbildung den Vergleich zu entsprechenden Experimenten an unsynchronisierten Zellkulturen. Synchronisierte Kontrollen zeigen im Vergleich zu unsynchronisierten Zellkulturen eine etwas höhere Reaktionshäufigkeit. Es ist aber nicht klar, ob das dem Einfluss des verwendeten Inhibitors oder der geringeren Zahl der Experimente zuzuschreiben ist.

Insgesamt findet man in den Kontrollen und in den Gruppen geringer Feldstärke (P10, P100) nur wenige Peaks. Ihr Anteil ist mit dem in befeldeten unsynchronisierten Kulturen vergleichbar. Diese geringe Anzahl an Peaks macht es in diesen Gruppen schwierig, einen Zeitpunkt der maximalen Peakhäufigkeit zu bestimmen. Größere Abweichungen von den übrigen Gruppen sind die Folge. In allen anderen Gruppen ist die Anzahl der Peaks leicht erhöht, im Fall von gepulsten Feldern hoher Feldstärke sogar deutlich erhöht. Noch höhere Feldstärken konnten mit der verwendeten Elektrodenanordnung nicht realisiert werden.


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Abb. 5-15 Zeitlicher Verlauf der Peakhäufigkeit und des S-Phasenanteils der Zellpopulation.

Abb. 5-16 Zeitpunkt der maximalen Peakhäufigkeit in den verschiedenen Versuchsgruppen. K: Kontrolle, P10/100/200: unipolare Rechteckpulse mit 10/100/200V/m, Sin: unmodulierter Sinus 200V/m, Sin AM: amplitudenmodulierter Sinus 200V/m.

Aufgrund der unterschiedlichen Peakhäufigkeiten bei verschiedenen Feldstärken kann man von einer Schwellenfeldstärke ausgehen, oberhalb derer deutliche Effekte auftreten. Unterhalb dieser Schwelle, nämlich bis ca. 100 V/m treten sowohl in den unsynchronisierten als auch in den synchronisierten Zellkulturen nur geringe Effekte auf.

Abb. 5-17 Mittlere maximale Peakhäufigkeit synchronisierter und unsynchronisierter Zellkulturen. Abkürzungen siehe Abb. 5-5.16.

Abb. 5-18 Relative Häufigkeit von Zellen mit während des Versuchs unveränderter Kalziumkonzentration innerhalb einer Population von synchronisierten HOS-Zellen. Abkürzungen siehe Abb. 5-5.16.

Neben der Veränderung in der mittleren Peakhäufigkeit in Abhängigkeit vom Zellstadium beobachtet man auch einen erhöhten Anteil langsamer Kalziumanstiege während des Befeldungsintervalls im Vergleich zu den Kontrollen. Das gilt für alle eingesetzten Felder, unabhängig von Pulsform, Frequenz und Feldstärke, jedoch nicht in Anwesenheit von EDTA.

Aufschluss über den Mechanismus des UV-induzierten Kalziumanstiegs erhält man, wenn nur derjenige Anteil der Zellen, deren Kalziumkonzentration sich weder durch den Einfluss der UV-Belichtung noch des elektrischen Feldes verändert, betrachtet wird. Abb. 5-5.18 zeigt, dass dieser Anteil in Kontrollen und befeldeten Gruppen etwa gleich groß ist. Nur in Anwesenheit von EDTA in der Außenlösung ist dieser Anteil stark erhöht (p< 0.001, U-Test). Das impliziert, dass der UV-abhängige Kalziumanstieg primär durch extrazelluläres Kalzium ausgelöst wird.

Abb. 5-5.19 illustriert noch einmal den ungefähren zeitlichen Verlauf der Feldempfindlichkeit in verschiedenen Versuchsgruppen. Die dabei auftretenden Unterschiede wurden mit dem U-Test getestet und sind statistisch signifikant (Abb. 5-5.17). Es wird deutlich, dass die maximale Empfindlichkeit der Zellen für elektrische Felder an ein bestimmtes spezifisches Zellstadium gebunden ist.


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Abb. 5-19 Zeitlicher Verlauf der Peakhäufigkeit bei Applikation von Feldpulsen. Links: im Vergleich zu Kontrollen, rechts: in Abhängigkeit von extrazellulärem Kalzium.

Um einen Vergleich mit den unsynchronisierten Zellen herzustellen, wurde die dort verwendete Auswertemethode auch auf synchronisierte Zellen angewandt. Abb. 5-5.20 zeigt die resultierenden Verteilungen der intrazellulären Kalziumkonzentration von synchronisierten HOS-Zellen. Obwohl in den befeldeten Gruppen ein signifikanter Anteil von Kalziumpeaks auftrat, manifestiert sich das nicht in einer Verschiebung der Verteilung zu höheren Konzentrationen. Die mittleren Kalziumkonzentrationen sind in den befeldeten Gruppen sogar geringer als in der Kontrollgruppe. Besonders deutlich ist dieser Effekt bei Anwesenheit von EDTA in der Außenlösung zu sehen. Das spricht ebenfalls dafür, dass der Kalziumanstieg in den Kontrollen, der überwiegend UV-bedingt ist, von extrazellulärem Kalzium abhängig ist. Man kann weiterhin ableiten, dass die beobachteten Feldeffekte kaum zu einer langfristigen Erhöhung der Kalziumkonzentration führten wie sie z.B. bei langsamen, anhaltenden Anstiegen aufgetreten wäre. Eventuell wirkt der Feldeffekt sogar schützend für die Zelle, indem z.B. durch Inaktivierung von Kalziumkanälen oder erhöhte Pumpleistung der Ca2+-ATPase ein langsamer Anstieg der intrazellulären Konzentration verhindert wird.

Abb. 5-20 Verteilung der intrazellulären Kalziumkonzentration von synchronisierten HOS TE85 nach der Feldapplikation. Legende siehe Abb. 5-5.16. Die Zellzahlen in jeder Versuchsgruppe (N) und die asymptotische Signifikanz (2-seitig) für Verteilungsunterschiede (U-Test) sind angegeben (p<0.001 ***/+++, p<0.01 **/++, p<0.05 */+), wobei (*) während Feld gegen Kontrolle, (+) nach Feld gegen Kontrolle symbolisiert.


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5.1.5  Elektrische Stimulation von Osteoblasten

Analog zur Stimulation von Osteosarcomazellen wurden sowohl gepulste als auch sinusförmige elektrische Felder an primären Osteoblasten eingesetzt. Da diese Zellen sich aufgrund ihres hohen Polysaccharidgehalts und aufgelagerter extrazellulärer Matrix nur schwer mit Farbstoff beladen lassen, sind in dieser Serie jedoch nur wenige Versuche enthalten. Daher rühren größere Streubreiten und eine geringere statistische Power.

Während bzw. nach der Applikation von gepulsten Feldern wurde nicht in allen Gruppen ein Nettoanstieg der intrazellulären Kalziumkonzentration festgestellt (Abb. 5-5.21). Im mittleren Feldstärkebereich (30 – 300 V/m) ist vor allem während der Befeldung die Verteilung der Kalziumkonzentration verbreitert und gegenüber dem Ausgangszustand erhöht. Das lässt auf heterogene Reaktionen der Zellen schließen. Außer in der Gruppe 100 V/m ist die Kalziumkonzentration nach der Befeldung aber wieder auf das Ausgangsniveau zurückgekehrt und damit geringer als in der Kontrollgruppe. Man kann daher vermuten, dass die Veränderungen in den Verteilungen der Kalziumkonzentration überwiegend durch Kalziumpeaks hervorgerufen wurden.

Abb. 5-21 Verteilung der intrazellulären Kalziumkonzentration von primären Osteoblasten nach der Applikation von PEMF verschiedener Feldstärke. Die asymptotische Signifikanz (2-seitig) für Verteilungsunterschiede (U-Test) sind angegeben (p<0.001 ***/+++, p<0.01 **/++, p<0.05 */+), wobei (*) während Feld gegen Kontrolle, (+) nach Feld gegen Kontrolle symbolisiert.

Aufgrund der experimentellen Schwierigkeiten wurde bei der Untersuchung der Osteoblasten nur mit ausgewählten Frequenzen von Sinusfeldern gearbeitet. Sowohl in der befeldeten als auch in der Kontrollgruppe beobachtet man im Verlauf des Experiments einen Nettoanstieg der intrazellulären Kalziumkonzentration (Abb. 5-5.22). In den befeldeten Gruppen fällt dieser jedoch etwas geringer aus als in den Kontrollen. Möglicherweise sind auch diese Verteilungsunterschiede das Ergebnis eines langsamen Influx-abhängigen Anstieges in den Kontrollen und einem vermehrten Anteil von Kalziumpeaks in der Feldgruppe.


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Abb. 5-22 Verteilung der intrazellulären Kalziumkonzentration von primären Osteoblasten nach der Applikation von (amplitudenmodulierten) Sinusfeldern (durchschnittliche UVA- Dosis 15 kJ/m2). Die asymptotische Signifikanz (2-seitig) für Verteilungsunterschiede (U-Test) sind angegeben (p<0.001 ***/+++, p<0.01 **/++, p<0.05 */+), wobei (*) während Feld gegen Kontrolle, (+) nach Feld gegen Kontrolle symbolisiert.

5.2 Der Redoxstatus

5.2.1 Intrazelluläre Messungen des Redoxstatus an Einzelzellen

5.2.1.1 Der Einfluss gepulster elektrischer Felder auf den Redoxstatus von Osteosarcomazellen

Zeitaufgelöste Messungen des Redoxzustands von HOS TE85 wurden mit Hilfe des Fluoreszenzfarbstoffs CM-H2DCFDA und gleichzeitig zu den Kalziummessungen vorgenommen. Die Fluoreszenzintensität dieses Farbstoffs wird unspezifisch durch reaktionsfreudige Substanzen wie ROS im Zytoplasma erhöht. Die Auswertung der Versuche erfolgte analog zu den Kalziummessungen.

Die Fluoreszenzintensitäten sind – wie auch bei Fura-2 – nicht normalverteilt und oft auch nicht eingipflig. Nach der Befeldung wird vermehrt die Auftrennung in verschiedene Subpopulationen sichtbar. Daher mussten für die statistische Auswertung nichtparametrische Verfahren eingesetzt werden. Trotzdem ist die Methode relativ unempfindlich, da auch durch die bewusste Erhöhung des oxidativen Stresses z.B. durch Zugabe von H2O2 oder Erhöhung des Belichtungstaktes nur geringe Änderung des Fluoreszenzsignals von maximal 10% auftraten.

Unter dem Einfluss niederfrequent gepulster Felder beobachtet man vor allem eine Veränderung der Verteilungsform, d.h. Verschiebung zu einer eher rechtsschiefen Lage. Die Lage des Medians wird dabei kaum beeinflusst. Diese Veränderungen sind jedoch nur in zwei Gruppen schwach signifikant. Unter zusätzlichem oxidativen Stress durch die Zugabe von SIN-1 wird die Fluoreszenzintensität weiter erhöht. Diese Bedingungen lassen sogar einen statistisch signifikanten Feldeinfluss im mittleren Feldstärkebereich erkennen. Die Gruppen 10 V/m und 1 kV/m, die bereits unter normalen oxidativen Bedingungen schwach signifikant waren, wiesen bei erhöhtem oxidativem Stress sehr große [Seite 62↓]Streubreiten auf, so dass keine sichere Aussage zu ihrer Wirkung gemacht werden konnte (Abb. 5-5.23).

Abb. 5-23 Der Redoxzustand von HOS TE85 ohne (-)/mit (+) zusätzlichem oxidativen Stress nach der Applikation von PEMF verschiedener Feldstärke in Relation zur Kontrolle. Aufgetragen sind die Mediane der Verteilungen und deren Standardabweichung. Die Zellzahlen in jeder Versuchsgruppe (N) und die asymptotische Signifikanz (2-seitig) für Verteilungsunterschiede (U-Test) sind angegeben (p<0.001 ***/+++, p<0.01 **/++, p<0.05 */+), wobei (-) ohne zusätzlichen oxidativen Stress gegen Kontrolle, (+) mit zusätzlichem oxidativen Stress gegen Kontrolle symbolisiert.

5.2.1.2 Der Einfluss sinusförmiger elektrischer Felder auf den Redoxstatus von Osteosarcomazellen

Amplitudenmodulierte Sinusfelder bewirkten ähnlich wie bei der Kalziumkonzentration während ihrer Applikation geringere Redox-Werte im Vergleich zur Kontrolle. Nach der Befeldung nimmt die Fluoreszenzintensität stärker zu und ist gegenüber den Kontrollen erhöht. Jedoch ist auch hier die Gesamtänderung der Fluoreszenzintensität gering und die Streubreite in einzelnen Versuchsgruppen groß, so dass die statistischen Ergebnisse nicht immer vertrauenswürdig erscheinen.

Abb. 5-24 Der Redoxzustand von HOS TE85 während und nach der Applikation von amplitudenmodulierten Sinusfeldern verschiedener Frequenz (durchschnittliche UVA- Dosis 30 kJ/m2). Die Zellzahlen in jeder Versuchsgruppe (N) und die asymptotische Signifikanz (2-seitig) für Verteilungsunterschiede (U-Test) sind angegeben (p<0.001 ***/+++, p<0.01 **/++, p<0.05 */+), wobei (*) während Feld gegen Kontrolle, (+) nach Feld gegen Kontrolle symbolisiert.


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Da in diesen Versuchen Redoxstatus und Kalziumkonzentration der Zellen simultan gemessen wurden, kann durch eine Korrelationsanalyse untersucht werden, ob es einen Zusammenhang zwischen beiden Parametern gibt. Niederfrequent gepulste Felder bewirkten eine Erhöhung der intrazellulären Kalziumkonzentration, die abhängig von der elektrischen Feldstärke war. Erhöhter oxidativen Stress verstärkte diesen Effekt, so dass man eine synergistische Wirkung von Feld und ROS vermuten kann. Jedoch sind weder die Einzelwerte noch die Gruppenmittelwerte der Fluoreszenz statistisch signifikant miteinander korreliert.

Modulierte Sinusfelder im höheren Frequenzbereich rufen während ihrer Applikation eine gegenüber der Kontrolle niedrigere Fluoreszenz von sowohl Fura-2 als auch CM-H2DCFDA hervor. Nach der Befeldung sind beide Parameter gegenüber der Kontrolle erhöht. Damit ergibt sich für die Gruppenmittelwerte in der Nachbeobachtungsphase ein Korrelationskoeffizient (nach Spearman) von 0.71, welcher mit p=0.046 sogar schwach signifikant ist.

5.2.2 Bestimmung der H2O2-Produktion durch extrazelluläre Messungen an Zellpopulationen

5.2.2.1 Stimulation von Zellpopulationen durch niederfrequente Felder

Abb. 5-25 Zeitlicher Verlauf der Wasserstoffperoxid-Konzentration im Medium
von primären Osteoblasten nach kapazitiv eingekoppelter Befeldung (16 Hz).

Um den Zusammenhang zwischen Feldwirkung und oxidativem Stress zu untersuchen, wurde die Wasserstoffperoxid-Konzentration im Medium von befeldeten und unbefeldeten Zellen über mehrere Stunden nach der Feldapplikation verfolgt (Abb. 5-5.25). Diese nimmt nach der Befeldung stetig zu und erreicht nach einer Zeit von mehr als 24 Stunden langsam ein Plateau. Das kann aber auch lediglich die abnehmende Vitalität der Zellen widerspiegeln, die sich während des gesamten Versuchs nur in Puffer befanden. Eine allgemeine Intensitätszunahme aller Proben, die beispielsweise durch Oxidation hervorgerufen wird, konnte durch die Verwendung entsprechender mitlaufender Leerwerte und Standards korrigiert werden. Aus dem nahezu linearen Kurvenabschnitt der ersten 6-8 h wurde die Wasserstoffperoxid-Produktion in [µM/h] berechnet, die anschließend auf den Wert der unbefeldeten Zellen normiert wurde.

Abb. 5-26 Relative H2O2-Produktion von HOS TE85 (HOS, n=5) nach Applikation direkt eingekoppelter niederfrequenter Puls- und Sinusfelder. Die Probenzahl in jeder Versuchsgruppe (N) und die asymptotische Signifikanz (2-seitig) für Verteilungsunterschiede (U-Test) sind angegeben (p<0.001 ***, p<0.01 **, p<0.05 *).


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Die Applikation niederfrequenter Felder bewirkt in allen Fällen eine leichte Zunahme der Peroxid-Produktion von Osteosarcomazellen gegenüber unbefeldeten Kontrollen (Abb. 5-5.25). Tendenziell steigt diese Aktivität umso mehr, je niedriger die Frequenz des applizierten Feldes ist. Im Vergleich von sinusförmigen und gepulsten Feldern dergleichen Frequenz ist eine etwas stärkere Wirkung der Sinusfelder festzustellen. Außerdem üben sinusförmige Felder gegenüber unipolar gepulsten Feldern einen stärkeren Effekt aus. Deutlich signifikante Unterschiede zur Kontrolle finden sich jedoch nur in der Gruppe 0.15 Hz.

5.2.2.2 Stimulation von Zellpopulationen durch hochfrequente Wechselfelder

Abb. 5-27 Relative H2O2-Produktion von primären Osteoblasten und HOS TE85 nach Applikation direkt eingekoppelter Sinusfelder. Die Probenzahl in jeder Versuchsgruppe (N) und die asymptotische Signifikanz (2-seitig) für Verteilungsunterschiede (U-Test) sind angegeben (p<0.001 ***, p<0.01 **, p<0.05 *).

Prinzipiell verhalten sich primäre Zellen und Tumorzellen in Bezug auf ihre Peroxidase-Aktivität nach Befeldung sehr ähnlich (Abb. 4-28). In beiden Zelltypen finden sich bei den Kontrollen die höchsten Werte. Obwohl alle befeldeten Gruppen eine gegenüber der Kontrolle verminderte Peroxidase-Aktivität aufweisen, kann man nicht von einem frequenzabhängigen Effekt sprechen. Der Vergleich zwischen amplitudenmoduliertem und unmoduliertem Sinusfeld (3 kHz und 3 kHz Sinus AM) erbringt ebenfalls keinen Unterschied in der Feldwirkung.

Auffällig ist jedoch, dass die Stärke des beschriebenen Effekts bei beiden Zelltypen verschieden ist. Während er bei den Osteosarcomazellen nur wenig ausgeprägt ist (mittlere Differenz zur Kontrolle 9%), ist er bei primären Zellen dreimal stärker (mittlere Differenz zur Kontrolle 27%) vorhanden. Die statistische Analyse liefert für primäre Osteoblasten hochsignifikante Unterschiede zur Kontrolle bei allen applizierten Frequenzen. Die Frequenzen sind jedoch untereinander nicht verschieden. Für HOS-Zellen sind die Ergebnisse weniger signifikant. Herausragend sind vor allem die Gruppen 100 kHz und 10 kHz sowie 3 kHz AM.

5.2.3 Bestimmung der NO-Produktion durch extrazelluläre Messungen an Zellpopulationen

5.2.3.1 Stimulation von HOS- Zellpopulationen durch niederfrequente Felder

Wird Stickoxid (NO), das ein wichtiges Signalmolekül ist, von den Zellen produziert, gelangt es auf Grund seiner geringen Größe und seiner Eigenschaft, passiv die Zellmembran zu durchdringen, sehr schnell in die Umgebung der Zellen. Da dieses Molekül aber außerdem Radikalcharakter hat, ist seine Lebenszeit im Medium mit wenigen Sekunden relativ kurz. Durch chemische Reaktionen wird es im Weiteren zu Nitrit (NO2 -) und schließlich zu Nitrat (NO3 -) umgewandelt. Der Nachweis dieser Endprodukte im Zellkulturmedium unmittelbar nach elektrischer Stimulation erlaubt daher [Seite 65↓]Schlussfolgerungen über die NO-Produktion der Zellen. Diese Messungen erfolgten über eine empfindliche fluorometrische Methode, die Konzentrationen ab 50nM auflösen kann.

Abb. 5-28 Relative Nitritkonzentration im Zellkulturmedium von HOS direkt nach Stimulation mit niederfrequenten Feldern. Die Gruppen mit Zellen enthielten je 32 Proben, die Gruppen ohne Zellen enthielten je 16 Proben. Die Signifikanzen für Verteilungsunterschiede (U-Test) sind angegeben (p<0.001 ***, p<0.01 **, p<0.05 *).

Abb. 5-29 Relative Nitritkonzentration im Zellkulturmedium von HOS in
Abhängigkeit von Frequenz und Amplitude.

Abb. 5-30 Relative Nitritkonzentration im Zellkulturmedium von HOS
in Abhängigkeit von der Befeldungsdauer.

Messungen der Nitritkonzentration im Medium (Abb. 5-5.28) nach Applikation von direkt eingekoppelten niederfrequenten Feldern zeigen einen starken Anstieg im unteren Frequenzbereich. Jedoch besteht kaum ein Unterschied zwischen der Nitritkonzentration in Zellkultur und in reinem Medium. Demzufolge muss es sich um Elektrodeneffekte handeln. Es ist offensichtlich, dass dieser Effekt mit der Frequenz korreliert und außerdem bei Sinuswellen stärker ist als bei unipolaren Pulsen. Deshalb kann die Ladungsbalance als Ursache ausgeschlossen werden und es wird klar, dass die Nitritakkumulation im Medium das Ergebnis irreversibler Prozesse ist. Für diesen Effekt spielt vermutlich eher die Gesamtdauer, in der elektrochemische Reaktionen ablaufen können, eine Rolle. Man erwartet daher, dass die stärkste Wirkung von bipolaren Pulsen verursacht wird, gefolgt von Sinuswellen und monopolaren Pulsen. Diese Annahme wird durch Messungen bestätigt (Abb. 5-5.29). Zusätzlich lässt sich zeigen, dass der Effekt mit der Elektrodenspannung zusammenhängt.

Untersuchungen zur Kinetik der Nitritproduktion im Medium zeigen jedoch Unterschiede zwischen der Zellkultur und dem reinen Medium. Während die Konzentration im Medium langsam und gleichmäßig ansteigt, beobachtet man in Anwesenheit von Zellen einen S-förmigen Verlauf. Die Konzentration wächst nach ca. 15 Minuten plötzlich, erreicht aber gegen Ende des Experiments ein Plateau. Das lässt darauf schließen, dass zelluläre Prozesse am Zustandekommen dieses Ergebnisses beteiligt sind.


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5.2.3.2  Stimulation von Zellpopulationen durch hochfrequente Wechselfelder

Die elektrische Stimulation mit hohen Frequenzen bewirkt über den gesamten Frequenzbereich eine gegenüber den Kontrollen verminderte Nitritkonzentration im Medium. Nahezu übereinstimmendes Verhalten zeigen die Zellen, die sich in der G1- und G2-Phase befinden. Hier wirken fast alle Frequenzen gleichermaßen gut, lediglich im mittleren Frequenzbereich ist der konzentrationsmindernde Einfluss der Befeldung weniger stark ausgeprägt. Zellen der G0- und S-Phase lassen sich in Bezug auf ihre NO-Produktion nach elektrischer Stimulation ebenfalls in eine Gruppe zusammenfassen. Qualitativ sind die Ergebnisse der einzelnen Frequenzen denen der G1- und G2-Phase vergleichbar, der Effekt ist jedoch weniger stark. Auch hier zeigen sich im Bereich um 20 kHz die geringsten Konzentrationseffekte.

Abb. 5-31 Relative NO2-Produktion von HOS TE85 verschiedener Zellzyklusphase nach Applikation hochfrequenter Sinusfelder. Die Signifikanzen für Verteilungsunterschiede (U-Test) sind angegeben (p<0.001 ***, p<0.01 **, p<0.05 *).

Abb. 5-32 Relative NO2-Produktion verschiedener Zelltypen nach Applikation hochfrequenter Sinusfelder. Die Signifikanzen für Verteilungsunterschiede (U-Test) sind angegeben (p<0.001 ***, p<0.01 **, p<0.05 *).

Der Vergleich verschiedener Zelltypen zeigt nur geringe Unterschiede in der Nitritkonzentration nach elektrischer Stimulation. Es findet in den meisten Fällen eine Verminderung gegenüber den Kontrollen statt. Das zeigt, dass es sich hierbei nicht um eine spezifische Reaktion von Knochenzellen, sondern um einen generellen Effekt handelt. Auffällig ist jedoch, dass die Reaktionen innerhalb der Fibroblastenlinie L929 sehr gleichmäßig sind, lediglich amplitudenmodulierte Sinusfelder zeigten gar keine Wirkung. Die Gegenüberstellung der Krebslinie HOS und primärer Osteoblasten erbringt überraschenderweise eine stärkere Beeinflussung von HOS-Zellen durch das applizierte Feld. Für die [Seite 67↓]Knochenzellen tritt der mit Abstand geringste Effekt bei 20 kHz auf. Mit geringem Signifikanzniveau heben sich auch 100 kHz und der Bereich von 3-5 kHz von den anderen Frequenzen ab.

5.2.4 Zellfreie Versuche

Wie sich bereits im letzten Abschnitt angedeutet hat, besitzt die Art der Feldapplikation in das Medium eine entscheidende Bedeutung für die Messergebnisse. Insbesondere die Parameter, die mit oxidativem Stress zusammenhängen wie Nitrit und H2O2, scheinen dafür besonders empfindlich zu sein. Es wurde deshalb im zellfreien System untersucht, ob das elektrische Feld und der damit verbundene Ladungstransfer per se in der Lage sind, derartige Konzentrationen von Nitrit im Medium hervorzurufen.

Abb. 5-33 Relative NO2- Konzentration in Zellkulturmedium (links, DMEM) und Puffer (rechts) nach Applikation direkt eingekoppelter Felder (0.1 Hz bis 100 kHz).

Wie Abb. 5-5.33 zeigt, finden durch den Stromfluss elektrochemische Reaktionen in der Lösung statt, die u.a. zur Zersetzung organischer Lösungsbestandteile führen können. Nachfolgende Redoxreaktionen könnten dann die nachgewiesenen Stickstoffverbindungen bilden. Dieser Effekt hängt sehr stark von der Frequenz und der Wellenform ab; extrem niederfrequente gepulste Felder entsprechen einer unterbrochenen Gleichspannung. Deswegen wurde in der Darstellung die Nitritkonzentration gegen eine effektive Gleichspannungsdauer aufgetragen. Diese ergibt sich für gepulste Felder aus dem Tastverhältnis und für Sinusfelder aus dem Effektivwert ( ) der Elektrodenspannung. Dass dieses Verfahren plausible Werte liefert, zeigt die gute Übereinstimmung von Puls- und Sinusdaten (Abb. 5-5.33, links). Es wird deutlich, dass unterhalb einer Mindestzeit, die der Spannungspuls andauert, keine Stickstoffverbindungen gebildet werden. Die entsprechende Frequenz liegt zwischen 100 Hz und 100 kHz.

Es wird außerdem deutlich, dass der beobachtete Effekt von der Zusammensetzung der Lösung abhängt. In reinem Phosphatpuffer kann man kaum Stickstoffverbindungen nachweisen. Umso größer der Protein- und Aminosäurenanteil in der Lösung wird, umso höher ist die Nitritkonzentration.

Neben der Zersetzung organischer Moleküle könnten durch Elektrolyse auch Gase wie Wasserstoff, Sauerstoff und Chlor entstehen. Die Bildung von Gasblasen an der Elektrodenoberfläche konnte jedoch in keinem Fall beobachtet werden. Verbunden mit der kathodischen Bildung von Wasserstoff ist eine Zunahme der Hydroxidionen-Konzentration. Je nach Pufferkapazität des Mediums könnte das zu einer kathodischen Erhöhung und anodischen Erniedrigung des pH-Werts führen. Daher wurden die Medium-pH-Werte unmittelbar nach der 30minütigen Befeldung gemessen. Diese Messungen sind jedoch nicht so exakt, da das zur Verfügung stehende Probenvolumen in einer 96well-Platte begrenzt ist. Die pH-Differenzen bei verschiedenen Frequenzen waren jedoch alle gering (< 0.05) und sowohl negativ als auch positiv in Bezug auf den Ausgangswert, so dass kein methodischer pH-Effekt zu erkennen war. Es wurde nur in einem Fall eine pH-Änderung von mehr als 0.1 gemessen. Diese Ausnahme – 0.15 Hz bipolarer Puls – verursachte aufgrund ihrer langen Gleichspannungszeit und der asymmetrischen Ladungsbalance auch die größten Nitriteffekte.

Schließlich wurden die Ergebnisse einer nichtparametrischen Korrelationsanalyse nach Kendall-Tau unterzogen. Diese lieferte nur im Fall von Medium (DMEM) und Puffer mit Arginin/Glukose einen [Seite 68↓]Zusammenhang zwischen der Gleichspannungsdauer und der Nitritkonzentration auf dem Signifikanzniveau von 0.05. Ein Zusammenhang zwischen der Gleichspannungsdauer und pH-Änderung konnte nicht gefunden werden.

5.3 Die Konzentration der zyklischen Nukleotide

Die Konzentration von cAMP unmittelbar nach der Stimulation durch hochfrequente elektrische Felder verhält sich in den beiden untersuchten Zelltypen sehr unterschiedlich, eine Übereinstimmung findet sich nur im mittleren Frequenzbereich. Bei Osteosarcomazellen erfolgt außer bei einer Frequenz von 20 kHz im gesamten Frequenzbereich eine Erhöhung, die an den beiden Enden des betrachteten Bereichs am größten ist. Primäre Osteoblasten reagieren nur bei ausgewählten Frequenzen mit einer minimalen Erhöhung der cAMP- Konzentration, die jedoch nicht statistisch signifikant ist. Ein Unterschied in der Wirkung reiner Sinusfelder und amplitudenmodulierter Sinusfelder (AM) konnte nicht festgestellt werden.

Abb. 5-34 Relative Konzentration von cAMP (A, HOS TE85 (n=8) und primäre Osteoblasten (n=20)) und cGMP (B, HOS TE85 (n=10) und primäre Osteoblasten (n=36)) in Zellpopulationen unmittelbar nach Stimulation durch hochfrequente Sinusfelder. Die asymptotische Signifikanz (2-seitig) für Verteilungsunterschiede (U-Test) ist angegeben (p<0.001 ***, p<0.01 **, p<0.05 *).

Die intrazelluläre cGMP- Konzentration scheint einer der empfindlichsten Parameter für die elektrische Stimulation von Zellen zu sein. Wie schon in der cAMP- Konzentration zeigen HOS-Zellen einen stärkeren Effekt als Osteoblasten. Mit Ausnahme des mittleren Frequenzbereichs erfolgt wieder eine Erhöhung der Konzentration im gesamten Frequenzbereich. Diese ist für HOS-Zellen im oberen Frequenzbereich maximal.

5.4 Die Konzentration von Prostaglandin E2

Abb. 5-35 Relative Konzentration von PGE2 in Populationen von HOS-Zellen (n=20) und primären Osteoblasten (n=16) 6 h nach Stimulation durch hochfrequente Sinusfelder. Die asymptotische Signifikanz (2-seitig) für Verteilungsunterschiede (U-Test) ist angegeben (p<0.001 ***, p<0.01 **, p<0.05 *).

Die Konzentration von Prostaglandin E2 im Medium wurde 6h nach der elektrischen Stimulation gemessen. Osteoblasten zeigen über den ganzen Frequenzbereich ein relativ gleichmäßiges Verhalten, das durch eine geringe Stimulation der PGE2- Synthese gekennzeichnet ist. Bei HOS-Zellen ist die PGE2- Konzentration ungleichmäßig über den Frequenzbereich verteilt. Mit Ausnahme [Seite 69↓]von 20 kHz findet aber auch hier eine Nettostimulation statt. Besonders deutlich ist dieser Effekt in beiden Zelltypen für 100 kHz und für amplitudenmodulierte 3 kHz.

5.5 Die Translokation der Mitogen-aktivierten Proteinkinase

Ein wichtiger Aspekt für die Untersuchung des MAPK-Signalwegs ist die subzelluläre Lokalisation der Proteinkinase. Da die MAPK ein Verteilungsaktivator ist, liegt sie sowohl im Zellkern als auch im Zytoplasma in aktiver und inaktiver Form vor. Der verwendete Antikörper bindet jedoch nur an die aktive Form. Normalerweise pendelt diese räumlich zwischen Kern und Plasma. Durch die Erfassung der Translokation in den Zellkern, kann man allgemeine Aussagen über Veränderungen der Genexpression machen.

Abb. 5-36 Zeitliches Verhalten der MAPK-Translokation in HOS TE85 nach Befeldung
mit 3 kHz (Sinus, 16 Hz amplitudenmoduliert) für 10 bzw. 30 min, angegeben in
Fluoreszenzeinheiten. Die Zellzahlen in jeder Versuchgruppe sind angegeben.

Da mit dieser Methode Fluoreszenzinten­sitäten auf Einzelzellniveau gemessen wurden und die Präparation sehr zeitauf­wendig ist, wurden nur ausgewählte Frequenzen bzw. Wellenformen eingesetzt. Besonders aufschlussreich erschienen die bereits verwendeten Rechteckpulse 1.5 Hz, ein sinusförmiges Feld von 16 Hz und 3 kHz sowie ein mit 16 Hz amplitudenmoduliertes Sinusfeld von 3 kHz. Außerdem wurden PMA-stimulierte Kontrollen mitgeführt.

Die ERK-Translokation kann durch die Differenz zwischen zytoplasmatischer und nuklearer Fluoreszenzintensität bestimmt werden. Die quantitative Auswertung erfolgte, indem von den Fluoreszenz-bildern mit dem DNA-Farbstoff Hoechst eine Kernmaske erstellt und durch die dazugehörigen Schwerpunkte horizontale und vertikale Schnitte gemacht wurden. Ausgehend von den Koordinaten des Schwerpunkts wurden die erhaltenen Graustufenprofile mit einem Algorithmus, der nach Plateaus und Intensitätssprüngen sucht, bearbeitet. Die Ergebnisse wurden durch Vergleich der rechtsseitigen und linksseitigen Ergebnisse sowie Größenfilter auf ihre Zuverlässigkeit überprüft. Zweifelhafte Fälle wurden aus der weiteren Auswertung ausgeschlossen.

Zunächst wurde das zeitliche Verhalten der MAPK-Aktivierung untersucht (Abb. 5-5.36). Dazu wurden die Proben 30 Minuten befeldet und nach verschiedenen Zeiten fixiert und gemessen. In der Gruppe 10 min wurde auch nur für diese Zeitdauer befeldet. Anhand der veränderlichen Differenz der Fluoreszenzintensität zwischen Kern und Plasma wird klar, dass es sich bei der MAPK-Aktivierung um ein transientes Signal handelt. Bereits nach 10 Minuten beginnt die Translokation, erreicht nach 30 Minuten ein Maximum und hat nach 2 Stunden das Ausgangsniveau wieder erreicht. Um den experimentellen Aufwand zu begrenzen wurde daher in den folgenden Versuchsreihen nur für 10 min befeldet und die Zellen sofort im Anschluss fixiert. Man findet die Antikörperfluoreszenz sowohl im Zytoplasma als auch im Zellkern. Insbesondere die Osteosarcomazellen zeigen eine hohe Grundaktivität. In nicht aktivierten Zellen bildet die MAPK-Fluoreszenz im Zytoplasma eine körnige Struktur, nach Aktivierung erscheint die Fluoreszenz diffus. Außerdem kann die unspezifische Anfärbung von Polysacchariden, die in kleinen Vesikeln im Zytoplasma bzw. außen auf der Zellmembran vorliegen, beobachtet werden. Besonders deutlich sind solche Matrixvesikel in Präparaten von Osteoblasten zu sehen.

In unbehandelten subkonfluenten Kontrollpopulationen von Osteosarcomazellen treten nur geringe Intensitätsunterschiede auf (Abb. 5-5.37A). Trotzdem gibt es eine „Grundaktivierung“ innerhalb der Population, die mit dem subkonfluenten Status zusammenhängen könnte. Außerdem ist ein deutlicher Anteil von Zellen aktiviert, d.h. zur Mitose stimuliert, was bei einer Krebszelllinie auch zu erwarten ist.


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Abb. 5-37 Verteilung der aktivierten MAPK in humanen Osteosarcomazellen. A: Kontrolle, B: Stimulation durch PMA, 30 min, C: Feld 1.5 Hz Rechteckpulse, D: Feld 3 kHz Sinus, E: 16 Hz Sinus, F: 3 kHz Sinus amplitudenmoduliert mit 16 Hz, Balken 10 µm.

Entsprechend der relativ hohen Grundaktivierung ist die Wirkung des Mitogens PMA nur begrenzt (Abb. 5-5.37B). Man erkennt jedoch bei dem Großteil der Zellen eine Umverteilung der Fluoreszenzintensität. Die Bereiche des Zytoplasmas erscheinen dunkler, im Gegensatz dazu beobachtet man im Zellkern und in den kernnahen Regionen eine Anreicherung der MAPK. Diesen positiv stimulierten Kontrollen qualitativ vergleichbar war die Wirkung einer 10 minütigen Befeldung mit entweder niederfrequenten Feldpulsen (Abb. 5-5.37C, 1.5 Hz) oder hochfrequenten Sinuswellen (Abb. 5-5.37D, 3 kHz). In beiden Fällen kommt es zu einer deutlichen Aktivierung des Zellkerns durch die Translokation der MAPK. Im Gegensatz zur Anreicherung der MAPK, fanden wir bei Befeldung mit entweder 16 Hz Sinuswellen oder 16 Hz amplitudenmodulierten Sinuswellen von 3 kHz eine Verarmung der MAPK im Zellkern (Abb. 5-5.37E, F). Trotzdem gibt es auch in diesen Präparaten aktivierte, hell fluoreszierende Zellen, so dass von einer erfolgreichen Bindung der Antikörper ausgegangen werden kann.

In Populationen von primären Osteoblasten tritt eine stärkere, vermutlich unspezifische Anfärbung des Zytoskeletts und matrixhaltiger Vesikel auf. Diese können die Intensitätsunterschiede zwischen Kern und Zytoplasma verschmieren (Abb. 5-5.38).

In allen untersuchten Präparaten von Osteoblasten fiel der Effekt von Mitogen bzw. Feldapplikation geringer aus als bei Osteosarcomazellen. Im Gegensatz zu den transienten Zellen haben jedoch PMA und alle getesteten Feldformen vergleichbare Wirkungen auf die MAPK-Aktivität. In allen Fällen findet eine Umverteilung der aktivierten MAPK in den Zellkern statt. Geringe Unterschiede finden sich nur in der Art der Ausprägung. Den deutlichsten Effekt zeigen wiederum die Applikation von 3 kHz Sinuswellen und 1.5 Hz Feldpulsen.


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Abb. 5-38 Verteilung der aktivierten MAPK in primären Osteoblasten. A: Kontrolle, B: Stimulation durch PMA, C: Feld 1.5 Hz Rechteckpulse, D: Feld 3 kHz Sinus, E: 16 Hz Sinus, F: 3 kHz Sinus amplitudenmoduliert mit 16 Hz, Balken 10 µm.

In Abb. 5-5.39 sind die Verteilungen der Intensitätsunterschiede, die sich mit der beschriebenen Auswertemethode ergaben, dargestellt. Man erkennt in beiden Zelltypen Verschiebungen der Verteilung im Vergleich zu den unbehandelten Kontrollen. Es war weder eine Abhängigkeit der Aktivierung von der Zelldichte bzw. der Entfernung zu Nachbarzellen, noch von der Zellgröße und Strukturierung nachweisbar. Damit kann nicht von einem Zusammenhang zwischen Zellstatus und Aktivierung ausgegangen werden.

Abb. 5-39 Räumliche Differenz der Fluoreszenzintensität von ERK1/2-Antikörpern zwischen Nukleus und Zytoplasma. Die Zellzahlen in jeder Versuchsgruppe (N) und die asymptotische Signifikanz (2-seitig) für Verteilungsunterschiede (U-Test) sind angegeben mit (p<0.001 ***, p<0.01 **, p<0.05 *).


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5.6  Die Beeinflussung des Proliferationsverhaltens

Das Proliferationsverhalten der Zellpopulation wurde mit Hilfe von fluorometrischen Messungen des DNA-Gehalts der Proben nach (1), 5, 10 und 15 Tagen in Kultur im Anschluss an die elektrische Stimulation bestimmt. Alle Einzelwerte wurden auf parallel geführte Kontrollversuche normiert.

5.6.1 Stimulation von HOS-Zellpopulationen durch niederfrequente Felder

5.6.1.1 Unsynchronisierte Zellpopulationen von HOS TE85

Zunächst wurden alle Messparameter an unsynchronisierten Populationen von HOS aufgenommen, was den Verhältnissen in vivo entspricht. Anschließend wurden die gleichen Parameter an ausgewählten Zellzuständen gemessen. Dieser Vergleich soll ein besseres Verständnis der Sensibilität und der Rekrutierung einzelner Subpopulationen ermöglichen.

Abb. 5-40 Relativer DNA-Gehalt von unsynchronisierten HOS TE85 zu verschiedenen Zeitpunkten nach Applikation von niederfrequenten Sinusfeldern (A) und niederfrequent gepulsten Feldern (B).Die Signifikanzen für Verteilungsunterschiede (U-Test) an jedem Messtag sind angegeben (p<0.001 ***, p<0.01 **, p<0.05 *).

Abb. 5-41 Absoluter DNA-Gehalt von unsynchronisierten HOS TE85 zu verschiedenen
Zeitpunkten nach Applikation von niederfrequenten Sinusfeldern (links) und gepulsten
Feldern (rechts).

Sowohl für die gepulsten Felder als auch für die Sinusfelder beobachtet man in den ersten Tagen nach der elektrischen Stimulation (bis etwa zum 5. Tag) in nahezu allen Fällen eine Hemmung der Proliferation. Diese ist jedoch nicht bei allen Frequenzen gleich stark ausgeprägt. Im weiteren Verlauf wird dieser Unterschied zu den Kontrollen zunehmend kompensiert und kann in einzelnen Fällen sogar zu einer Erhöhung der Proliferationsrate gegenüber den Kontrollen führen. Dieses Verhalten lässt sich nur durch einen veränderten Verlauf der Wachstumskurven erklären (Abb. 5-5.41). Nach einer anfänglichen Hemmung der Proliferation beginnt die log-Phase (exponentielles Wachstum) in den stimulierten Zellen verzögert, verläuft jedoch dafür steiler. Das könnte sich zum einen in einer verkürzten Zyklusdauer manifestieren, oder andererseits bedeuten, dass der Anteil der Zellen, die sich nicht aktiv im Zellteilungszyklus befinden, nämlich die Zellen der G0-Phase, kleiner wird. Wenn ein größerer Prozentsatz von Zellen für die Vermehrung rekrutiert wird, könnte auch bei gleich bleibender Zyklusdauer ein schnelleres Wachstum der Population beobachtet werden. Nach Erreichen der Konfluenz, die um den 10. Tag herum eintritt, nimmt die Wachstumsrate sehr plötzlich ab, was durch ein Plateau in der Wachstumskurve ausgedrückt wird. Dieser Zustand tritt aber sowohl bei Kontrollen als auch bei stimulierten Zellen auf, jedoch zu verschiedenen Zeitpunkten. Das bedeutet aber auch, dass nach Erreichen dieses Plateaus keine Unterschiede zwischen Kontrollen und stimulierten Zellen mehr nachzuweisen sind. Generell verursachen die extrem niedrigen Frequenzen <10 Hz die stärkste Wirkung. Zudem ist der Effekt monopolarer Pulse größer als der symmetrischer Sinuswellen.


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5.6.1.2  In spezifischen Zyklusphasen synchronisierte Zellpopulationen von HOS TE85

Werden HOS-Kulturen durch Serumentzug in der G0-Phase angereichert und in diesem Zustand stimuliert, treten stärkere Effekte als bei unsynchronisierten Zellen auf. Jedoch ist der Vergleich der Wachstumskurven von Kontrollen und befeldeten Zellen nicht so eindeutig wie dort. Dies äußert sich einerseits darin, dass 10 Tage nach der Stimulation die Zellzahl gegenüber den Kontrollen deutlich erhöht ist; andererseits kompensieren die Kontrollen im weiteren Kulturverlauf den Wachstumsvorsprung, so dass nach 15 Tagen der Effekt bei einigen Frequenzen wieder verschwunden ist, bei einigen Frequenzen sich aber auch umgekehrt hat. Insbesondere die extrem niedrigen Frequenzen <10 Hz führen sowohl bei gepulsten als auch bei Sinusfeldern zu langanhaltenden Effekten.

Abb. 5-42 Relativer DNA-Gehalt von HOS TE85 zu verschiedenen Zeitpunkten nach Applikation von niederfrequent gepulsten Feldern während der G0-Phase (A), G1-Phase (B) und S-Phase (C). Die Signifikanzen für Verteilungsunterschiede (U-Test) an jedem Messtag sind angegeben (p<0.001 ***, p<0.01 **, p<0.05 *).

Die beschriebenen Effekte nehmen noch weiter zu, wenn die Zellkultur für die Stimulation in der späten G1-Phase angereichert wird. Wiederum zeigen sich am ersten Kulturtag nach der Stimulation noch im gesamten Frequenzbereich schwache Effekte, die sich bis zum 10. Kulturtag noch verstärken. Fasst man die Ergebnisse der Stimulation in der G0- und der G1-Phase zusammen, kristallisieren sich drei interessante Bereiche heraus: a) die extrem niedrigen Frequenzen (≤ 2 Hz), b) der Bereich um 15 Hz, c) die höheren Frequenzen (75-150 Hz).

Aus den Messungen der intrazellulären Kalziumkonzentration (Kap. 5.1) konnte geschlussfolgert werden, dass Zellen während der S-Phase besonders sensibel für die elektrische Stimulation sind. Dieses Verhalten konnte durch die Proliferationsmessungen über einen längeren Zeitraum nicht bestätigt werden. Effekte finden sich nur unmittelbar am Tag nach der Stimulation und dann auch nur bei einzelnen Frequenzen. Aber auch hier erweisen sich 15 Hz sowohl bei gepulsten als auch bei Sinusfeldern als bedeutsam. Im weiteren Verlauf der Zellkultivierung kann kein signifikanter Unterschied zwischen stimulierten Zellen und Kontrollen mehr nachgewiesen werden.

5.6.1.3 In Gel eingebettete HOS TE85

Die Messungen an dreidimensionalen Strukturen sind gekennzeichnet durch große Streuungen der Einzelwerte. Das erschwert es, signifikante Unterschiede in der Wirkung einzelner Frequenzen herauszufinden. Prinzipiell scheint das Wachstum in diesem System etwas verlangsamt zu sein. Jedoch haben Sinusfelder eine stärkere Wirkung als gepulste Felder.


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Abb. 5-43 Relativer DNA-Gehalt von HOS TE85 in 3D-Struktur zu verschiedenen Zeitpunkten nach Applikation von niederfrequenten Sinusfeldern (A) und niederfrequent gepulsten Feldern (B). Die Signifikanzen für Verteilungsunterschiede (U-Test) an jedem Messtag sind angegeben (p<0.001 ***, p<0.01 **, p<0.05 *).

5.6.2 Stimulation von Zellpopulationen durch hochfrequente Wechselfelder

5.6.2.1  Unsynchronisierte Zellpopulationen von HOS TE85

Abb. 5-44 Relativer DNA-Gehalt von unsynchronisierten HOS TE85 zu verschiedenen Zeitpunkten nach Applikation von hochfrequenten Sinusfeldern. Die Signifikanzen für Verteilungsunterschiede (U-Test) an jedem Messtag sind angegeben (p<0.001 ***, p<0.01 **, p<0.05 *).

Ähnlich wie für die Stimulation durch niederfrequente Felder beobachtet man auch im höheren Frequenzbereich um 3-5 kHz anfänglich eine geringe Wachstumshemmung. Diese ist jedoch nicht signifikant. Während der weiteren Kultivierung wird dieser Unterschied zu den Kontrollen zunehmend kompensiert und führt letztendlich sogar zu einer Erhöhung der Zellzahl gegenüber den Kontrollen. Bei Einsatz noch höherer Frequenzen kommt es von Anfang an zu einer Wachstumssteigerung, die über den gesamten Beobachtungszeitraum anhält. Die absolute Höhe dieses Unterschieds nimmt jedoch durch den bereits oben beschriebenen Verlauf der Wachstumskurven stetig ab. Es muss also auch in diesem Frequenzbereich ein schnelleres Wachstum in den ersten Tagen nach der Stimulation erfolgen. Im Gegensatz zur Wirkung niederfrequenter Felder bleibt jedoch der positive Einfluss auf das Zellwachstum über längere Zeit bestehen. Besonders erwähnenswert scheint das Verhalten im Frequenzbereich 3-5 kHz und 20 kHz. Die Frequenzen oberhalb 20 kHz rufen nahezu identische Wirkungen hervor.

5.6.2.2 In spezifischen Zyklusphasen synchronisierte Zellpopulationen von HOS TE85

Die elektrische Stimulation von Osteosarcomazellen während der G0-Phase ruft nahezu keine Veränderung im Wachstum der Zellen hervor. Die zudem großen Streuungen der Einzelwerte lassen keine Aussagen über eine frequenzabhängige Wirkung zu. Ähnlich der Feldwirkung während der G0-Phase bewirkt die Stimulation während der späten G1-Phase eine nur geringe Erhöhung der Proliferation, die jedoch gegenüber den Kontrollen verzögert einsetzt. Diese ist außerdem nur in einem Fall signifikant. Auch eine Stimulation während der S-Phase kann keine höheren Proliferationseffekte erzielen. Man beobachtet zwar eine geringfügige Erhöhung des Zellwachstums, die jedoch kaum signifikant ist. Im Gegensatz zur Wirkung hochfrequenter elektrischer Felder während [Seite 75↓]der frühen Phasen des Zellzyklus (G0, G1, S), wird die Proliferation bei Stimulation während der G2-Phase kurzfristig, jedoch nur im unteren Frequenzbereich von 1-10 kHz.

Abb. 5-45 Relativer DNA-Gehalt von HOS TE85 zu verschiedenen Zeitpunkten nach Applikation von hochfrequenten Sinusfeldern während der G0-Phase, G1-Phase, S-Phase und G2-Phase. Die Signifikanzen für Verteilungsunterschiede (U-Test) an jedem Messtag sind angegeben (p<0.001 ***, p<0.01 **, p<0.05 *).

5.6.2.3 In Gel eingebettete HOS TE85

Abb. 5-46 Relativer DNA-Gehalt von HOS TE85 in 3D-Struktur zu verschiedenen Zeitpunkten nach Applikation von hochfrequenten Feldern. Die Signifikanzen für Verteilungsunterschiede (U-Test) an jedem Messtag sind angegeben (p<0.001 ***, p<0.01 **, p<0.05 *).

Bei der Applikation von hochfrequenten Feldern in eine 3D-Kultur von HOS TE85 wird im Gegensatz zu den oben beschriebenen 2D-Kulturen die Proliferation der eingebetteten Zellen gehemmt. Das entspricht in der Art der Wirkung eher dem Effekt niederfrequenter Felder.

5.6.2.4 Primäre Osteoblasten in 2D- und 3D-Kultur

Auch bei primären Osteoblasten bewirkt die Applikation hochfrequenter Felder eine Erhöhung der Wachstumsrate. Diese ist schon früh, d.h. bereits am ersten Tag nach Befeldung zu beobachten. Mit zunehmender Kulturdauer nimmt jedoch der Unterschied zu den Kontrollen ab und ist nach 10 Tagen vollständig verschwunden.

Im Gegensatz zum Wachstumsverhalten von Zellen in Monolayerkultur, ruft die Stimulierung von Osteoblasten in einer 3D-Struktur eine Proliferationshemmung hervor. Dieser Effekt wurde sonst nur bei der Applikation niederfrequenter Felder beobachtet. Innerhalb von 10 Tagen nach der Stimulation wird der Wachstumsvorsprung der Kontrollen aber aufgeholt.


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Abb. 5-47 Relativer DNA-Gehalt von primären Osteoblasten in Monolayerkultur (A) und in 3D-Struktur (B) zu verschiedenen Zeitpunkten nach Applikation von hochfrequenten Feldern. Die Signifikanzen für Verteilungsunterschiede (U-Test) an jedem Messtag sind angegeben (p<0.001 ***, p<0.01 **, p<0.05 *).

5.6.2.5 Stimulation von L929 Fibroblasten

Abb. 5-48 Relativer DNA-Gehalt von L929 zu verschiedenen Zeitpunkten nach Applikation von hochfrequenten Feldern. Die Signifikanzen für Verteilungsunterschiede (U-Test) an jedem Messtag sind angegeben (p<0.001 ***, p<0.01 **, p<0.05 *).

Die Applikation hochfrequenter elektrischer Felder führt auch bei der Fibroblastenlinie L929 zu gesteigertem Zellwachstum. Damit stimmt das Verhalten dieser Zellen mit dem der beiden Knochenzellen überein. Die beobachteten Effekte sind jedoch mit einer geringeren Signifikanz ausgezeichnet. Einzige Ausnahme bildet die Gruppe 3 kHz Sinus AM. Offenbar bewirkt der Einsatz eines niederfrequent modulierten Feldes bei L929 einen längerfristigen Effekt.

5.6.3 Behandlung von HOS TE85 mit konditioniertem Medium

In der folgenden Versuchsreihe werden die Zellen im Gegensatz zu den bisher dargestellten Experimenten lediglich mit im zellfreien System befeldeten Medium versorgt. D.h. die Zellen erfahren selbst kein elektrisches Feld, sind aber den elektrolytisch bedingten Veränderungen im Zellkulturmedium ausgesetzt. Dieses Vorgehen soll es ermöglichen, den Einfluss langlebiger Elektrolyseprodukte deutlich zu machen und die Wirkung von elektrischem Feld und elektrochemischer Prozesse zu differenzieren.

Abb. 5-49 Relativer DNA-Gehalt von unsynchronisierten HOS TE85 zu verschiedenen Zeitpunkten nach Behandlung mit niederfrequent bzw. hochfrequent konditioniertem Medium. Die Signifikanzen für Verteilungsunterschiede (U-Test) an jedem Messtag sind angegeben (p<0.001 ***, p<0.01 **, p<0.05 *).


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Abb. 5-5.49 zeigt, dass durch die Kultivierung in konditioniertem Medium das Wachstum von HOS TE85 beschleunigt wird. Dieser Effekt ist nach 5 Tage in Kultur am stärksten ausgeprägt und verschwindet im weiteren Beobachtungszeitraum. Außerdem wird erkennbar, dass der Effekt bei den kleinsten Frequenzen maximal ist und zudem im Fall von Sinusfeldern stärker als bei kurzen Rechteckpulsen. Das weist klar auf einen Zusammenhang zwischen proliferationssteigernder Wirkung und der ins Medium übertragenen Ladungsmenge hin.

Besonders interessant ist der Vergleich mit den Ergebnissen direkt befeldeter Zellen (Abb. 5-5.40). Während dort elektrisches Feld und Redoxprozesse im Medium zusammen zu einer Hemmung der Proliferation führen, bewirken die Veränderungen im Medium allein eine Erhöhung der Wachstumsrate.

Die Kultivierung von HOS TE85 in hochfrequent konditioniertem Medium hat kein verändertes Wachstum zur Folge. Das stimmt mit der Erfahrung überein, dass Elektrolyseprozesse bei Frequenzen oberhalb 1 kHz vernachlässigt werden können. Damit liefert diese Versuchsreihe einen wichtigen Hinweis darauf, dass es sich bei der oben (5.6.2.1) beschriebenen proliferationssteigernden Wirkung wirklich um Feldeffekte handelt.

5.7 Die Beeinflussung der ALP-Aktivität

5.7.1 Stimulation von HOS- Zellpopulationen durch niederfrequente Felder

5.7.1.1 Unsynchronisierte Zellpopulationen von HOS TE85

Abb. 5-50 Relative ALP-Aktivität von unsynchronisierten HOS TE85 zu verschiedenen Zeitpunkten nach Applikation von niederfrequenten Sinusfeldern(A) und niederfrequent gepulsten Feldern (B).Die Signifikanzen für Verteilungsunterschiede (U-Test) an jedem Messtag sind angegeben (p<0.001 ***, p<0.01 **, p<0.05 *).

Der Einfluss der elektrischen Stimulation auf die Aktivität der alkalischen Phosphatase (ALP) verhält sich invers zu ihrer Wirkung auf das Proliferationsverhalten von HOS-Kulturen. Im Fall von Feldpulsen kann zwischen den Tagen 5 und 10 nach der Stimulation eine Erhöhung der Enzymaktivität gegenüber den Kontrollen festgestellt werden. Diese ist jedoch bei den meisten Frequenzen nicht andauernd und verschwindet bis zum 15. Tag. Insbesondere bei 75 Hz ist die ALP-Aktivität anhaltend erhöht, im Gegensatz dazu wird sie durch den Einsatz extrem niedriger Frequenzen sogar herabgesetzt.

Erfolgt die Stimulation durch Sinusfelder, beobachtet man eine andauernde Erhöhung der ALP-Aktivität.

5.7.1.2 In spezifischen Zyklusphasen synchronisierte Zellpopulationen von HOS TE85

Werden in der G0-Phase angereicherte HOS-Populationen durch niederfrequente elektrische Felder stimuliert, sind nur in sehr wenigen Gruppen deutliche Unterschiede in der ALP-Aktivität zu vermerken. Jedoch sind die Streuungen der Einzelwerte sehr hoch, so dass ein geringer Einfluss prinzipiell nicht ausgeschlossen werden kann.


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Abb. 5-51 Relative ALP-Aktivität von HOS TE85 zu verschiedenen Zeitpunkten nach Applikation von niederfrequent gepulsten Feldern während der G0-Phase (A), G1-Phase (B) und S-Phase (C).Die Signifikanzen für Verteilungsunterschiede (U-Test) an jedem Messtag sind angegeben (p<0.001 ***, p<0.01 **, p<0.05 *).

Die elektrische Stimulation von Zellen während der späten G1-Phase liefert in den ersten Tagen ein ähnliches Ergebnis wie die Stimulation von Zellen der G0-Phase. Es können nur sehr geringe Unterschiede zu den Kontrollen beobachtet werden. Am 10. Tag wird dann ein qualitativer Unterschied in der Wirkung von gepulsten und Sinusfeldern deutlich. Während unipolar gepulste Felder eine Nettoladung übertragen und letztendlich die ALP-Aktivität der Zellen herabsetzen, bewirken ausgeglichene Ladungsverhältnisse wie sie bei Sinusfeldern auftreten eher eine Erhöhung der Enzymaktivität.

Ebenso wie die Proliferation kann auch die Enzymaktivität von HOS-Zellen, die während der S-Phase stimuliert werden, nur kurzfristig verändert werden. Anfangs beobachtet man eine verminderte ALP-Aktivität gegenüber den Kontrollen, die jedoch sehr schnell kompensiert wird.

5.7.1.3 In Gel eingebettete HOS TE85

In 3D-Strukturen von HOS-Zellen sind nur kurzfristige Effekte der elektrischen Stimulation auf die Enzymaktivität nachweisbar. Die Streuungen der Einzelwerte sind aber in diesen Proben sehr groß, so dass die Unterschiede zwischen den Versuchsgruppen selten signifikant sind. Jedoch scheinen die gepulsten Felder einen stärkeren Effekt als Sinusfelder zu haben.

Abb. 5-52 Relative ALP-Aktivität von HOS TE85 in 3D-Struktur zu verschiedenen Zeitpunkten nach Applikation von niederfrequenten Sinusfeldern (A) und niederfrequent gepulsten Feldern (B). Die Signifikanzen für Verteilungsunterschiede (U-Test) an jedem Messtag sind angegeben (p<0.001 ***, p<0.01 **, p<0.05 *).


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5.7.2  Stimulation von Zellpopulationen durch hochfrequente Wechselfelder

5.7.2.1 Unsynchronisierte Zellpopulationen von HOS TE85

Abb. 5-53 Relative ALP-Aktivität von unsynchronisierten HOS TE85 zu verschiedenen Zeitpunkten nach Applikation hochfrequenter Sinusfelder.Die Signifikanzen für Verteilungsunterschiede (U-Test) an jedem Messtag sind angegeben (p<0.001 ***, p<0.01 **, p<0.05 *).

Die ALP-Aktivität der HOS-Zellen wird durch die Applikation hochfrequenter Felder nach einer anfänglichen Erhöhung geringfügig gehemmt. Letztendlich bedeutet das ein verzögertes Einsetzen von Differenzierung und Mineralisation.

5.7.2.2 In spezifischen Zyklusphasen synchronisierte Zellpopulationen von HOS TE85

Abb. 5-54 Relative ALP-Aktivität von HOS TE85 zu verschiedenen Zeitpunkten nach Applikation von niederfrequent gepulsten Feldern während der G0-Phase, G1-Phase, S-Phase und G2-Phase. Die Signifikanzen für Verteilungsunterschiede (U-Test) an jedem Messtag sind angegeben (p<0.001 ***, p<0.01 **, p<0.05 *).

Ähnlich wie bei der Proliferation kann auch die ALP-Aktivität von Zellen, die während der G0-Phase stimuliert wurden, nicht dauerhaft verändert werden. Am wahrscheinlichsten ist eine stimulierende Wirkung durch Frequenzen >10 kHz. Werden HOS-Zellen während der späten G1-Phase elektrisch stimuliert, beobachtet man zunächst eine gegenüber den Kontrollen erhöhte ALP-Aktivität. Diese hängt mit einer geringfügigen Wachstumshemmung. Dieser Anfangseffekt wird aber in den folgenden Tagen von den Kontrollen kompensiert und führt eher zu einer gegenüber den Kontrollen verminderten Enzymaktivität. Signifikant ist der Unterschied jedoch nur an den beiden Enden des untersuchten Frequenzbereichs. Ebenso wie die Stimulation während der G1-Phase resultiert die Stimulation in der S-Phase in einer herabgesetzten ALP-Aktivität. Die Höhe dieses Effekts fällt jedoch [Seite 80↓]geringer aus und 10 Tage nach Stimulation kann bei keiner Frequenz ein signifikanter Unterschied zur Kontrolle nachgewiesen werden. Die Stimulation während der G2-Phase ruft den größten Effekt an synchronisierten Zellen hervor. Qualitativ ist der Einfluss auf die ALP-Aktivität vergleichbar mit dem Ergebnis in den anderen Zellzyklusphasen.

5.7.2.3 In Gel eingebettete HOS TE85

Abb. 5-55 Relative ALP-Aktivität von HOS TE85 in 3D-Struktur zu verschiedenen Zeitpunkten nach Applikation von hochfrequenten Feldern. Die Signifikanzen für Verteilungsunterschiede (U-Test) an jedem Messtag sind angegeben (p<0.001 ***, p<0.01 **, p<0.05 *).

Auch an HOS-Zellen in 3D-Kultur kann man nach elektrischer Stimulation einen dem Verhalten von Monolayerkulturen entgegengesetzten Effekt auf die ALP-Aktivität beobachten. Die Enzymaktivität wird leicht erhöht, was aber nur im Fall von gepulstem Feld statistisch signifikant ist.

5.7.2.4 Primäre Osteoblasten in 2D- und 3D-Kultur

Abb. 5-56 Relative ALP-Aktivität von primären Osteoblasten in Monolayerkultur (A) und in 3D-Struktur (B) zu verschiedenen Zeitpunkten nach Applikation von hochfrequenten Feldern. Die Signifikanzen für Verteilungsunterschiede (U-Test) an jedem Messtag sind angegeben (p<0.001 ***, p<0.01 **, p<0.05 *).

Nach der Applikation von elektrischen Feldern auf Kulturen von primären Osteoblasten können nur geringfügige Beeinflussungen der ALP-Aktivität festgestellt werden. Mit Ausnahme der Gruppe 10 kHz wurde im gesamten Frequenzbereich tendenziell eine Herabsetzung der Enzymaktivität beobachtet. Diese sind jedoch nur zwischen 10 kHz und 20 kHz und bei 100 kHz signifikant. Die ALP-Aktivität von Osteoblasten in 3D-Struktur lässt sich durch die Applikation elektrischer Felder nur gering beeinflussen. Nach anfänglicher Erhöhung gegenüber der Kontrolle sinkt die relative Enzymaktivität wieder und ist 10 Tage nach der Stimulation nicht statistisch signifikant.

5.7.3 Behandlung von HOS TE85 mit konditioniertem Medium

Wie auch schon bei der Beeinflussung der Proliferation bewirkt die alleinige Behandlung mit konditioniertem Medium einen ganz anderen Effekt als die direkte Feldapplikation. Die Befeldung der Zellen (Abb. 5-5.50) hatte zur Folge, dass sich die Aktivität der alkalischen Phosphatase gegenüber den Kontrollen erhöhte. Kommen die Zellen jedoch nur mit befeldetem Medium in Berührung, treten nur bei den niedrigsten Frequenzen Effekte in der Enzymaktivität auf. Diese wird durch die Veränderungen im Medium allerdings herabgesetzt und korrespondiert so mit dem stärkeren Wachstum in dieser Versuchsgruppe.


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Abb. 5-57 Relative ALP-Aktivität von HOS TE85 nach Behandlung mit niederfrequent (A) bzw. hochfrequent (B) konditioniertem Medium. Die Signifikanzen für Verteilungsunterschiede (U-Test) an jedem Messtag sind angegeben (p<0.001 ***, p<0.01 **, p<0.05 *).

Neben dem fehlenden Einfluss auf das Zellwachstum hat die Kultivierung von HOS TE85 in hochfrequent konditioniertem Medium auch keine signifikante Wirkung auf die ALP-Aktivität der Zellen. Bei den verwendeten Frequenzen ist von einer elektrolytischen Veränderung des Zellkulturmediums aber auch nicht auszugehen.

5.8 Korrelation von Feldwirkung und Frequenz

In den dargestellten Experimenten wurde die Beeinflussung von Knochenzellen durch elektrische Felder in einem weiten Frequenzbereich untersucht. Im Mittelpunkt stand die Erfassung des Verhaltens von Wachstum und Differenzierung über die zeitabhängige Messung von DNA-Gehalt und ALP-Aktivität. Beide Parameter sind mit der Stimulationsfrequenz korreliert (Abb. 5-5.58), wobei der Effekt zwischen dem 5. und 10. Tag nach der Feldapplikation maximal ist. Für die Proliferation ergibt sich am 5. Tag ein Korrelationskoeffizient von 0.65 bzw. 0.63 für die ALP-Aktivität. Diese Werte sind auf dem Niveau von 0.01 signifikant. Bei niedrigen Frequenzen findet eine Wachstumshemmung statt, gleichzeitig ist die ALP-Aktivität erhöht. Im hochfrequenten Bereich beobachtet man das entgegengesetzte Verhalten. Der Umkehrpunkt, d.h. der Bereich in dem kein Effekt ausgelöst wird, liegt zwischen 100 Hz und 1 kHz. Einzelne herausragende Frequenzen bzw. Fenstereffekte waren nicht nachweisbar.

Bei längerer Kultivierung werden die beobachteten Unterschiede zu den Kontrollen zunehmend kompensiert und sind dann nicht mehr signifikant. Die naheliegendste Erklärung dafür ist eine Veränderung der Wachstumskurven von stimulierten Zellen.

Abb. 5-58 Zusammenhang zwischen Proliferation (links) bzw. ALP-Aktivität (rechts) und Frequenz der elektrischen Stimulation 5 Tage nach Befeldung.

Im Vergleich zu diesen direkt befeldeten Zellen ist das Verhalten von Zellen, die ausschließlich mit befeldetem Medium in Kontakt waren, besonders interessant. Hier hebt sich ganz klar der Frequenzbereich oberhalb 1 kHz heraus, in dem weder auf die Proliferation noch auf die [Seite 82↓]Differenzierung von HOS-Zellen eine Wirkung zu verzeichnen ist. Diese Schwelle stimmt sehr gut mit der oben beschriebenen „Nullstelle“ für die Feldwirkung überein und entspricht außerdem der Frequenz, oberhalb derer erwartungsgemäß keine Elektrolyseprodukte mehr im Medium nachweisbar sind. Im unteren Frequenzbereich verursachen jedoch die chemischen Veränderungen im Medium, welche die direkte Folge des elektrischen Stroms sind, einen der Feldwirkung entgegengesetzten Effekt.

Das spricht zum einen dafür, dass die Produkte der an den Elektroden ablaufenden Reaktionen selbst in der Lage sind, das Verhalten der untersuchten Zellen zu beeinflussen. Andererseits zeigt die gegensätzliche Wirkung von elektrischem Feld und Elektrolyseprodukten, dass es sich bei den beschriebenen Ergebnissen wirklich um feldbedingte Effekte und nicht nur um methodisch verursachte Nebenwirkungen handelt.

Diese Vermutung lag nahe, da auch die Konzentrationen von Nitrit und H2O2 mit der Stimulationsfrequenz korreliert sind (Abb. 5-5.59). Auch hier liegt der Nulldurchgang ungefähr bei 100 Hz. Das Signifikanzniveau für die Korrelation von H2O2 mit der Frequenz beträgt 0.01, für die Korrelation von Nitrit und Frequenz bzw. H2O2 und Nitrit beträgt es 0.05.

Abb. 5-59 Frequenzabhängigkeit der H2O2-Produktion (links) und der Nitritkonzentration (rechts) nach direkt eingekoppelter elektrischer Stimulation.

Im niederfrequenten Bereich müssen daher unbedingt die Artefakte der elektrischen Stimulation durch faradayschen Stromfluss berücksichtigt werden. Elektrolyse von organischen Mediumkomponenten und nachfolgende Redoxreaktionen können zu einer Erhöhung des Nitritgehalts der Proben führen. Dieser Effekt ist zellunabhängig und lediglich von den elektrochemischen Eigenschaften des Systems bestimmt. Ladungsbalancierte Wellenformen können diesen Effekt begrenzen, sind jedoch keine Garantie dafür, dass die Redoxreaktionen reversibel ablaufen. Es besteht daher die Gefahr, dass es besonders in Protein bzw. Aminosäure enthaltenden Medien zu einer Anhäufung von Stickoxiden und anderer hoch reaktiver Verbindungen kommt. Eine gleichzeitige Verschiebung des pH-Werts konnte nicht festgestellt werden. Das liegt sicher an der hohen Pufferkapazität biologischer Medien, die zumindest bei kurzzeitiger Stimulation eine pH-Veränderung verhindert.

5.9 Zusammenfassung der zellbiologischen Ergebnisse

Für die Beurteilung eines Nettoeffekts, der sich aus dem Verhalten aller Einzelparameter zusammensetzt, sollte man Tab. 5-5.1 heranziehen. Diese fasst die Feldeffekte über alle gemessenen Parameter zusammen.

Für den Frequenzbereich über 1 kHz findet man immer eine Erhöhung des Wachstums und der Konzentration der „second messenger“ und einen verzögerten Anstieg der ALP-Aktivität bzw. eine Herabsetzung der Nitrit- und H2O2-Konzentration. Die Frequenzbereiche, in denen man besonders hohe bzw. niedrige Feldeffekte findet, stimmen für alle Parameter ungefähr überein. Besonders die Bereiche 3-5 kHz und 20 kHz heben sich von den anderen Frequenzen ab. Zu erwähnen ist auch der [Seite 83↓]größere Effekt von amplitudenmodulierten Sinusfeldern im Vergleich zu reinen Sinusfeldern. Die Signalwege, die cAMP und PGE2 benutzen, scheinen bei der Stimulation durch hohe Frequenzen keine deutliche Rolle zu spielen. Von einer Beteiligung von cGMP ist jedoch auszugehen.

Tab. 5-1 Zusammenfassung der signifikanten Veränderungen in verschiedenen Messparametern unter dem Einfluss elektrischer Felder. (+) Erhöhung, (-) Hemmung, (0) kein Effekt.

Parameter

Frequenz < 1 kHz

Frequenz > 1 kHz

Kalzium

(+), in S-Phase Peaks

während Feld (-), nach Feld (+)

CM-H 2 DCFDA

(+)

während Feld (-), nach Feld (+)

Nitrit

(+)

(-)

H 2 O 2

(+)

(-)

cAMP

 

0

cGMP

 

(+)

PGE 2

 

(+)/0

MAPK

(+), bei 16 Hz (-)

(+), bei Modulation mit 16 Hz (-)

Proliferation

(-)

(+)

ALP-Aktivität

(+)

(-)


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08.06.2004