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Diskussion

6.1  Eigenschaften der Stimulationselektroden

Während kommerziell erhältliche Elektroden, die klinisch eingesetzt werden, gut standardisiert sind, gibt es relativ wenige Informationen über die Eigenschaften von Elektroden, die für Tierversuche oder in vitro-Untersuchungen verwendet werden. Ohne dieses Wissen ist jedoch die Auswahl der für einen bestimmten Zweck geeigneten Elektrode schwierig. Dessen ungeachtet gibt es über die Eigenschaften spezieller Elektroden, insbesondere der Mikroelektroden kaum Publikationen. Die Modellierung von Elektrodenimpedanz und räumlicher Verteilung der Feldstärke erforderte jedoch die genaue Kenntnis bestimmter Parameter, die nur durch eigene Messungen zugänglich waren. Darum war das erste Ziel dieser Untersuchungen, Informationen über die Eigenschaften verschiedener zur Elektrostimulation eingesetzter Elektroden in echten physiologischen Lösungen zu gewinnen. Verschiedene Elektrodengeometrien und -materialien wurden verglichen und hinsichtlich ihrer Eignung für die elektrische Stimulation bewertet.

Die Fourieranalyse der verwendeten Signale ergab, dass man zur Beschreibung eines rechteckigen Elektrodensignals das Impedanzverhalten in einem umso größeren Frequenzbereich berücksichtigen muss, je kleiner das verwendete Tastverhältnis ist. Daher wurde die Charakterisierung der Elektroden in der Frequenzdomäne vorgenommen, wobei elektrochemische Methoden zum Einsatz kamen, die sehr gut geeignet sind, sowohl die Eigenschaften als auch die Änderungen der Elektrode-Elektrolyt-Grenzfläche zu untersuchen.

Der Vergleich der Elektroden für die Stimulation von Zellkulturen und der Mikroelektroden für die tiefe Hirnstimulation zeigte, dass erstere hinsichtlich ihrer elektrischen, elektrochemischen und mechanischen Eigenschaften deutlich besser abschneiden. Jedoch ist ihr Einsatz aufgrund ihrer Größe bei kleinen Gewebestrukturen nicht möglich. Die elektrischen Eigenschaften der Mikroelektroden erfahren eine zusätzliche Einschränkung durch die Anforderung der gleichzeitigen Ableitung und Stimulation, die während der Implantation der Elektroden notwendig ist. Da die Größe des stimulierten Gewebebereichs bei Mikroelektroden extrem stark von der Elektrodengeometrie abhängt, muss die Auswahl der geeigneten Geometrie nach der Größe des zu stimulierenden Areals getroffen werden. Wenn verschiedene Möglichkeiten in Betracht kommen, sollte immer die Elektrode mit der größten Oberfläche gewählt werden.

6.1.1 Die Strom-Spannungs-Kennlinie ist nicht-linear

Alle untersuchten Elektroden besitzen eine nicht-lineare Strom-Spannungskennlinie, deren Anstieg frequenzabhängig ist. Die Ursache dafür liegt in der Frequenzabhängigkeit der Konzentrationspolarisation. Das Elektrodenmaterial spielt für den Verlauf dieser Kurve eine entscheidende Rolle, was einen weiteren Hinweis darauf gibt, dass elektrochemische Reaktionen beteiligt sind. Die Strom-Spannungskennlinie wird außer durch das Material auch durch die Oberflächenbeschaffenheit und den Abstand der Elektroden sowie die Zusammensetzung des Elektrolyts bestimmt [153]. Dieses nichtlineare Verhalten verursacht außerdem im unteren Frequenzbereich eine Verzerrung des Eingangssignals, wenn Spannungen oberhalb einer bestimmten Schwelle angelegt werden. Deswegen wurden in den durchgeführten Versuchen zur elektrischen Stimulation von Zellkulturen nur Spannungen unterhalb dieses Schwellenpotentials verwendet. Lokale pH-Veränderungen waren bei dieser Spannung nicht nachweisbar.

Die Frequenzabhängigkeit der Strom-Spannungskennlinie war bei Mikroelektroden (DBS) stärker ausgebildet als bei platinisierten Platinelektroden. Letztere zeigten bei der DBS-Stimulationsfrequenz von 130 Hz bereits lineares Verhalten während die Mikroelektroden noch deutlich nicht-linear waren. Grund dafür ist vermutlich die vergleichsweise geringe Stromdichte, die durch die fraktale Oberflächenbeschichtung der Platinelektroden erzielt wurde. Demzufolge sind platinisierte Platinelektroden in einem größeren Frequenzbereich einsetzbbar und daher besonders für die Anwendung im niederfrequenten Bereich geeignet. Mikroelektroden sollten entweder nur für die [Seite 85↓]Stimulation mit Frequenzen oberhalb 1 kHz eingesetzt werden oder nur im linearen Strom-Spannungs-Bereich, d.h. mit kleinen Signalamplituden angesteuert werden.

Da innerer und äußerer Pol der Mikroelektroden aus unterschiedlichem Material gefertigt sind und verschieden große Oberflächen haben, war die Elektrodenkennlinie zudem asymmetrisch, d.h. es spielte eine Rolle, welcher Pol als Anode und welcher als Kathode geschaltet wurde. Diffusionsbegrenzte Prozesse und Adsorption könnten diese Differenz zwischen beiden Modi verursachen. Damit wird für den zeitlichen Verlauf des Feldes im Medium die Vorgeschichte der Elektrode bedeutsam.

Unter der Annahme der Linearität des Systems kann mit Hilfe der inversen Fouriertransformation aus dem Verhalten im Frequenzbereich auf dasjenige im Zeitbereich geschlossen werden. Diese Übertragung des Verhaltens zwischen Zeit- und Frequenzdomäne war jedoch problematisch und lieferte keine zufriedenstellenden Ergebnisse, da das elektrochemische System über einen großen Bereich von Überspannungswerten nicht linear ist. Das ergibt sich aus der Tatsache, dass Strom und Spannung der Butler-Volmer-Gleichung folgen, welche zwei exponentielle Terme enthält [187].

6.1.2 Das Verhalten der Elektroden in der Frequenzdomäne

Die Impedanzspektroskopie liefert wichtige Informationen über das Verhalten der Elektrode-Elektrolyt-Grenzfläche im Frequenzbereich. Dazu gehören u.a. die Doppelschichtkapazität (Adsorption, Filmbildung, Rauheit) und der Polarisationswiderstand (Ladungstransfer, Diffusion, metallische Auflösung). Vergleicht man die Impedanzspektren verschiedener Elektrodentypen und Elektrolyte zeigte sich, dass diese unterschiedlich stark von Grenzflächenprozessen dominiert werden. Mikroelektroden zeigten in allen Elektrolyten einen starken Einfluss von diffusionsabhängigen Prozessen, der bis zu einer Frequenz von 100 kHz überwog. Das weist darauf hin, dass im gesamten, für die Neurostimulation relevanten Frequenzbereich eine maximale Stromdichte existiert, die die Gesamtmenge, der ins Gewebe übertragbaren Ladung begrenzt.

Im Gegensatz dazu war der Kurvenverlauf von Pt/schwarz- bzw. besputterten Elektroden von der Leitfähigkeit und der Zusammensetzung der Lösung abhängig. Die günstigsten Eigenschaften besitzen Pt/schwarz-Elektroden, die aufgrund ihrer großen Oberfläche geringere Stromdichten erzeugen und elektrochemische Reaktionen somit länger im reversiblen Bereich ablaufen. Der lineare Abschnitt im unteren Frequenzbereich des Spektrums bildet sich zudem erst bei zunehmender Leitfähigkeit heraus. In Lösungen physiologischer Leitfähigkeit ist er jedoch vorhanden und spielt bis etwa 40 kHz eine Rolle. Bei kleineren Leitfähigkeiten befindet sich dieser Spektrumsanteil vermutlich unterhalb des gemessenen Frequenzbereichs. Besputterte Elektroden sind in ihrem Verhalten sehr uneinheitlich. Teilweise veränderten sich die Spektren innerhalb mehrerer Messwiederholungen, was auf eine zunehmende Adsorption von Reaktionsprodukten und/oder organischen Makromolekülen hindeutet. D.h., dass besputterte Elektroden weniger gute Eigenschaften für die Übertragung der Signal in Medium oder Gewebe besitzen, da Adsorption immer mit einer Verstärkung des kapazitiven Verhaltens verbunden ist. Letzteres bewirkt jedoch die Deformation von Spannungspulsen. Da es aber keine Alternative gab, durch die mit geringer Elektrodenspannung hohe Feldstärken im Medium erzeugt werden konnten, wurden diese Elektroden trotzdem für einige Versuche verwendet.

Die Elektrodenimpedanz ist ferner von der Stromdichte abhängig. Mit zunehmender Stromdichte nahmen sowohl Betrag als auch Phasenwinkel der Impedanz ab. Das bedeutet, das der Ladungstransfer durch die Grenzfläche Elektrode-Elektrolyt effektiver verläuft. Die untersuchten Pt/schwarz-Elektroden können dann im Frequenzbereich bis zu 100 kHz als ohmscher Widerstand betrachtet werden, was Fragen der Feldapplikation und Kontrolle erheblich erleichtert. So wird z.B. das durch die Eingangsspannung im Gewebe erzeugte Feld nicht frequenzabhängig verändert, wie es durch Kapazitäten der Fall wäre. Insbesondere beim Einsatz verschiedener Pulsformen oder Pulslängen ist diese Eigenschaft von Vorteil. Das Verhalten der Mikroelektroden lässt sich jedoch nicht auf diese Weise vereinfachen und man muss davon ausgehen, dass die ins Gewebe übertragene Wellenform vom Eingangssignal abweicht.

Dass die Impedanz von der Stromdichte abhängt, bedeutet auch, dass die Wellenform, die ins Gewebe übertragen wird, mit der Signalamplitude variiert. Das zieht eine ungleichmäßige Stimulation der Zellen in unmittelbarer Nähe der Elektrode nach sich.


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Mikroskopische Ansichten der Elektrodenoberfläche zeigten, dass diese nicht glatt und gleichmäßig ist, sondern Fehler wie Risse und Kanten enthält. Diese können zu lokalen Inhomogenitäten der Ladungsdichte führen bzw. die Adsorption fremder Moleküle beeinflussen [165]. Um diese nicht-idealen Eigenschaften des Systems in einem Äquivalentschaltkreis korrekt wiederzugeben, ist daher die Einführung nicht-linearer Elemente notwendig. Im Fall der untersuchten Elektroden wurde ein modifiziertes CPE verwendet, das die nicht-linearen Eigenschaften sowohl der kapazitiven als auch der ohmschen Grenzflächenelemente berücksichtigt. Beide Anteile werden als kontinuierlich verteilt und frequenzabhängig vorausgesetzt. Die physikalische Bedeutung des CPE wurde in der Literatur vielfach diskutiert [188,189]. Der verwendete Äquivalentschaltkreis entspricht einem modifizierten Schaltkreises nach Randles, dem Standardmodell elektrochemischer Systeme, und liefert sehr gute Übereinstimmung mit den experimentellen Daten, was die Verwendung dieses Modells zur Beschreibung des Systems Elektrode-Elektrolyt rechtfertigt. Modelle für Elektroden bzw. einen Vergleich der Elektrodenimpedanzen finden sich auch bei Hitz und Lasia [190], Bott [157] und Gielen und Bergveld [191]. Die Parameter der dort verwendeten Äquivalentschaltkreise konnten jedoch nicht zufriedenstellend an unsere experimentellen Daten angepasst werden. Daher wurde abweichend von diesen Modellen der Grenzflächenwiderstand frequenzabhängig betrachtet. Das ermöglichte, den in irreversible elektrochemische Reaktionen und Wärme umgesetzten Anteil der Eingangsspannung in das Systemverhalten einzubeziehen.

Der fraktale Exponent des CPE der untersuchten Elektroden hängt in erster Linie von der Geometrie und der Oberflächenbeschaffenheit ab. Dadurch besteht die Möglichkeit, Veränderungen der Elektrodenoberfläche über den Wert des fraktalen Exponenten zu verfolgen. Diese Erkenntnis konnte bereits in der Untersuchung der Elektrodenalterung ausgenutzt werden (Kap. 6.1.4). Ausschließlich im Fall der Mikroelektroden ist der fraktale Exponent außerdem deutlich von der Leitfähigkeit des Elektrolyten abhängig. Diese Tatsache bestätigt ebenfalls den starken Einfluss der Konzentrationspolarisation auf das Verhalten der Mikroelektroden. Vergleiche von Leitfähigkeit und Kapazität des CPE, die den Eigenschaften der Grenzfläche entsprechen, zeigten ferner, dass der Ladungstransfer bei platinisierten Platinelektroden deutlich effektiver ablaufen kann, was sie für die Anwendung in der elektrischen Stimulation prädestiniert.

6.1.3 Räumliche Verteilung des Feldes

Mit Hilfe finiter Integrationstechnik wurden dreidimensionale Modelle verschiedener Elektroden in wässrigem Medium berechnet. Die Anwendung numerischer Simulationsmethoden birgt jedoch einige Einschränkungen. Als erstes wurde eine lineare Strom-Spannungscharakteristik vorausgesetzt, d.h. während der Stimulation soll an der Grenzfläche Elektrode-Elektrolyt keine Polarisation auftreten. Eine weitere Einschränkung des Modells ergibt sich aus der Annahme, dass die Oberfläche der Elektrode perfekt glatt ist. Damit konnte wiederum vorausgesetzt werden, dass die elektrochemisch aktive Oberfläche der geometrischen Oberfläche entspricht. Rasterelektronenmikroskopische Abbildungen zeigten jedoch, dass die Elektrodenoberfläche nicht absolut glatt, sondern, abhängig von Material und Verarbeitung mehr oder weniger rau ist. Die höhere effektive Oberfläche verursacht eine geringere Ladungsdichte auf der Elektrode. Diese ist aber nicht proportional zur absoluten Vergrößerung der Oberfläche, da innerhalb enger Poren die Diffusion begrenzend wirkt [192]. Überdies können Fehler in der Kalkulation dadurch verursacht werden, dass, um die Anzahl der Gitterpunkte zu begrenzen, mit einem ungleichmäßigen Gitter gearbeitet wurde.

Um verschiedene Applikationsanordnungen zu vergleichen, muss man die lokale und die mittlere Feldstärke im Medium und die Orientierung des Feldvektors heranziehen. Bei der von uns gewählten Anordnung für die Stimulation von Zellkulturen ist der Feldvektor parallel zum Boden der Messkammer orientiert. Da die Zellkulturen adhärent und flach ausgebreitet sind, haben die Zellen in Feldrichtung den größten Radius, was einen maximalen Effekt auf das Transmembranpotential zur Folge hat. Die Elektrodenanordnung zur Stimulation und Beobachtung auf Einzelzellniveau erzeugt eine nahezu homogene Feldverteilung, so dass alle Zellen vergleichbaren elektrischen Feldstärken ausgesetzt waren. Das war für die Auswertung von Einzelereignissen und dem Vergleich verschiedener Feldstärken auch unerlässlich. Im Gegensatz dazu liefert die Elektrodenanordnung zur Befeldung von Multiwellplatten eine inhomogene Feldverteilung, deren Unterschied zwischen dem Mittelwert und [Seite 87↓]dem Maximalwert Faktor 6 beträgt. Da bei diesen Messungen jedoch grundsätzlich Populationsmittelwerte erfasst wurden, kann diese Feldverteilung als zufriedenstellend gelten. Feldstärkemaxima, die direkt an den Elektroden auftreten, können aber zur lokalen Anhäufung von Elektrolyseprodukten beitragen und unerwünschte methodische Nebeneffekte verstärken.

Zur in vivo oder in vitro Befeldung von neuronalen Geweben kommen in der Praxis koaxiale Mikroelektroden zum Einsatz. Die Berechnungen zeigten aber, dass durch die koaxiale Geometrie die räumliche Verteilung der Feldstärke immer inhomogen ist. Der Grad dieser Inhomogenität ist jedoch u.a. abhängig von der Geometrie der Elektrodenspitze und der Entfernung zwischen beiden Polen. Lokale Maxima traten an der Elektrodenspitze und an der Grenzfläche Elektrode-Isolation auf. Mit zunehmender Entfernung von der differenten Elektrode nahm die Feldstärke ab, so dass je nach Geometrie und appliziertem Potential eine maximale Reichweite für die Stimulation vorgegeben ist. Diese wird natürlich auch von der Erregungsschwelle des spezifischen Zelltyps bestimmt [193].

Da die Feldverteilung in der Umgebung von Mikroelektroden durch unterschiedliche Geometrieparameter beeinflusst wird, wurde versucht, diese Faktoren in einem einheitlichen und vergleichbaren Geometriefaktorγ zusammenzufassen. Dieser verbindet die Stromstärke im Gewebe unabhängig von der Elektrolytleitfähigkeit mit der Elektrodenspannung und kann als Auswahlkriterium verwendet werden. Abhängig von der Form der Elektrodenspitze fanden wir einen sehr starken Einfluss auf die Reichweite, Stärke und Gradienten des elektrischen Felds. Gleiche Stimulationsparameter (Stromstärke bei „Constant Current“-Stimulation) erzeugen im Gewebe stark verschiedene elektrische Feldstärken. Die Elektrodengeometrie spielt auch bei der Spannungsversorgung eine große Rolle. Um einheitliche Stromstärken im Gewebe zu erzeugen, muss für die berechneten Elektrodengeometrien die applizierte Spannung bis zu Faktor 15 variiert werden. Das impliziert, dass der Anteil irreversibler Redoxreaktionen und die Korrosionsgeschwindigkeit ebenfalls deutlich verschieden sind. Daher können elektrochemisch bedingte Nebeneffekte der Stimulation und die Veränderung der Elektrodeneigenschaften während der Alterung für verschiedene Geometrien nicht einheitlich beschrieben werden.

Besondere Bedeutung kommt der Größe der Elektrodenoberfläche zu, da durch deren Vergrößerung eine homogenere Feldverteilung erreicht werden kann. Die maximale Größe der Elektrode ist allerdings von vornherein durch die Größe des zu stimulierenden Gewebebereichs begrenzt. Durch kleine Entfernungen zwischen den beiden Polen der Elektrode lässt sich der stimulierte Gewebebereich außerdem gut eingrenzen. Daraus lässt sich zusammenfassend schliessen, dass es für die Stimulation von Gewebe keine ideale Elektrodenform gibt, die für alle Anwendungszwecke geeignet ist. Der Experimentator muss vielmehr die Elektrode entsprechend der Größe des zu stimulierenden Gewebebereichs auswählen.

Da die Stromdichte die Raten der in der Elektrode-Elektrolyt-Grenzfläche ablaufenden elektrochemischen Reaktionen widerspiegelt (H2-Entwicklung, O2-Entwicklung und Auflösung des Metalls), ist sie direkt mit der Korrosionskinetik verbunden. Daher kommt nicht nur der lokalen Feldverteilung in der Umgebung der Elektrode, sondern auch direkt auf ihrer Oberfläche eine besondere Bedeutung zu. Dabei zeigte sich, dass Elektrodenanordnungen zur Befeldung von Zellkulturen, die symmetrisch und mit relativ großem Elektrodenabstand aufgebaut sind, die Verteilung der Stromdichte auf der Elektrodenoberfläche gleichmäßig ist. Daher laufen elektrochemische Effekte und Korrosion räumlich gesehen ebenfalls gleichmäßig ab. Trotz intensiver Nutzung war optisch keinerlei Verschleiß, der auf eine ungleichmäßige Abtragung des Elektrodenmetalls schließen lässt, festzustellen. Im Gegensatz dazu war die räumliche Verteilung der Stromdichte bei allen Mikroelektroden stark inhomogen. Das äußert sich in der ungleichmäßigen Verteilung der Stromdichte im umgebenden Gewebe, aber auch direkt auf der Oberfläche des inneren Pols der Elektrode. Es konnte gezeigt werden, dass die Orte erhöhter Stromdichte auch Orte verstärkter Korrosion sind. Da der Spannungsabfall in der Grenzfläche von der lokalen Stromdichte abhängt, ist die Elektrode-Elektrolyt-Grenzfläche somit keine Äquipotentialoberfläche. Das wird hinsichtlich der Effektivität der Stimulation zu verschieden starken Erregungszuständen in der behandelten Gehirnregion führen.

Da die Impedanz von der Stromdichte abhängig ist, wird das nach inverser Fouriertransformation resultierende Signal durch die ungleichmäßige Zusammensetzung der harmonischen Frequenzen verformt werden. Das bedeutet, dass die im Gewebe induzierte Wellenform von dem rechteckförmigen [Seite 88↓]Eingangssignal abweicht. Das impliziert außerdem, dass Orte unterschiedlicher Stromdichte auch durch unterschiedliche Signalformen und -amplituden stimuliert werden.

6.1.4  Der Einfluss von Alterung und Korrosion auf das Elektrodenverhalten

Korrosion tritt auf, wenn mindestens eine anodische und kathodische Reaktion gemeinsam stattfinden. Da diese Reaktion mit dem Transfer von Ladungen verbunden ist, sind Korrosionsphänomene elektrochemischer Natur und werden daher Metallelektroden während der Elektrostimulation immer betreffen. Das kann zur Ablagerung von Elektrodenelementen im Gewebe sowie zur Auflösung des Elektrodenmaterials und dem Verlust der mechanischen Stabilität führen. Schlussendlich kann das zum Verlust des elektrischen Kontakts und damit zum Versagen des Stimulationssystems führen. Die Freisetzung von Metall ist außerdem eine potentielle Quelle für Proteindenaturierung und Apoptose [162].

Aus diesem Grund wird es als sicher angesehen, dass die Löslichkeit von Korrosionsprodukten und die Korrosionsresistenz von Metallelektroden sehr große Bedeutung für die Biokompatibilität und die Langzeitstabilität haben und Elektrodenmaterialien daher sorgfältig ausgewählt werden sollten [194]. Pt and Pt/Ir-Legierungen gehören daher zu den am weitesten verbreiteten Elektrodenmaterialien, da sie biokompatibel sind und gute elektrische, mechanische und chemische Eigenschaften besitzen. Ein weniger edles Metall ist normalerweise nicht so korrosionsbeständig. Dementsprechend fanden wir die stärksten Korrosionseffekte bei Edelstahlelektroden. Sowohl das Elektrodenmetall als auch die Epoxyisolation waren teilweise aufgelöst und die Oberfläche durch die Bildung kleiner Vertiefungen aufgeraut worden. Daher sollten an Stelle der Edelstahlelektroden auf jeden Fall Elektroden aus einem reinen Edelmetall oder einer Edelmetalllegierung eingesetzt werden. Als Folge solcher Korrosionsvorgänge sollten z.B. Dünnfilm-Elektroden nur kurze Lebensdauern haben und daher für Implantationszwecke ungeeignet sein. Nach McCreery empfiehlt sich für die Langzeitstimulation eher die Verwendung von Metalloxid-Elektroden, die die Korrosion einschränken, oder dickerer Platinelektroden [162]. Außerdem sollte regelmäßig überprüft werden, ob der elektrische Kontakt der Elektroden in Ordnung ist, da durch Veränderungen der Oberfläche, z.B. durch Bildung einer Oxidschicht, und Materialbrüche die Elektrodeneigenschaften beeinträchtigt werden können.

Die Verwendung des anorganischen Elektrolyten (ACSF) im Vergleich zu komplettem Zellkulturmedium erlaubte es, den Einfluss (geladener) organischer Moleküle auf das elektrochemische Verhalten der Elektrode einzuschätzen. Die meisten Arbeiten, die bisher über das elektrochemische Verhalten von Elektroden veröffentlicht wurden, behandeln nur Messungen in anorganischen Lösungen oder repräsentativen physiologischen Puffern wie PBS. Es gibt aber nahezu keine Daten, die in echten physiologischen Medien, die verschiedene und z.T. komplexe organische Bestandteile enthalten, aufgenommen wurden.

Polarisierbare Makromoleküle im Elektrolyten senkten den Einfluss der Konzentrationspolarisation und es wurde bereits bei niedrigeren Frequenzen ein lineares Strom-Spannungs-Verhalten beobachtet. Eine denkbare Erklärung ist die Bildung eines Proteinfilms auf der Elektrodenoberfläche, die den Aufbau oder Abbau einer Oxidschicht und damit das Entstehen einer entsprechenden Reaktionsüberspannung behindert [194].

Beim Eintauchen der Elektroden in Zellkulturmedium, veränderte sich die Metall-Elektrolyt Grenzfläche, da organische Moleküle an der Elektrodenoberfläche adsorbiert wurden. Messungen des Phasenwinkels wiesen ebenfalls auf eine zusätzliche Kapazität im System hin. Die Anpassung der Daten an den Äquivalentschaltkreis erforderte dementsprechend die Einführung einer weiteren Kapazität, um die Bedeckung der Oberfläche zu berücksichtigen [194]. Nach längerer Inkubation in Elektrolyt hatten die Parameter des Äquivalentschaltkreises ein Plateau erreicht. Das deutet darauf hin, dass zu diesem Zeitpunkt die Oberfläche der Elektrode vollständig von Oxid oder Protein bedeckt war, was eine weitere Korrosion verhinderte [154]. Die beobachtete Alterung der Elektroden bietet eine mögliche Erklärung für die Notwendigkeit, die Stimulationsparameter während einer therapeutischen Langzeitstimulation nachzuregeln.


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6.2  Der Einfluss elektrischer Stimulation auf das Signalsystem von Knochenzellen – Integration der Ergebnisse in ein Modell

PEMF werden derzeitig in der Behandlung von Pseudoarthrose [195], Frakturen [196] und Mineralisationsstörungen eingesetzt. Auf zellulärer Ebene können sie direkt Osteoklasten [197], Osteoblasten [123,198,107] und Osteocyten [151] beeinflussen.

Die vorliegenden Untersuchungen zur Beeinflussung von Knochenzellen durch elektrische Felder beinhalten nahezu alle Ebenen der zellulären Reaktionskette. Um den Wirkungsmechanismus zu verstehen, wurden alle Parameter an einem Zell- und Befeldungssystem gemessen. Dadurch können Setup, Zelllinie und Befeldungsprotokoll direkt verglichen und die Ergebnisse in einem Modell zusammengefasst werden können. In der Literatur gibt es bisher keine derartig umfassende Studie. Selten wurden mehr als 2-3 verschiedene Parameter erfasst. Außerdem wurde ein breiter Frequenzbereich mit z.T. verschiedenen Wellenformen gescannt, was in der Literatur ebenfalls noch nicht zu finden ist.

Vergleicht man die experimentellen Ergebnisse der verschiedenen Zelltypen muss man feststellen, dass sich die Osteosarcomazellen (HOS TE85) in fast allen gemessenen Parametern stärker durch die Anwendung elektrischer Felder beeinflussen lassen als primäre Osteoblasten. Da es sich bei ersteren um humane, bei letzteren jedoch um Schweinezellen handelt, ist nicht auszuschließen, dass dieser Unterschied artbedingt ist. Außerdem scheint für Osteoblasten das Vorliegen von Wachstumsfaktoren im Zellkulturmedium notwendig zu sein, um eine feldvermittelte Proliferation zu induzieren [199]. Für die humanen Osteosarcomazellen MG-63 [111] und TE85 [112] wurde hingegen gefunden, dass sie auch unter serumfreien Bedingungen positiv stimuliert werden. Dieses scheinbar unterschiedliche Verhalten von normalen und transformierten Knochenzellen könnte mit der Fähigkeit transformierter Zellen zusammenhängen, unter Feldexposition verstärkt Wachstumsfaktoren freizusetzen. Dieser autokrine und/oder parakrine Mechanismus kann dann wiederum zur erhöhten Proliferation führen.

Für Kulturen von HOS TE 85 wurde gezeigt, dass sie in vitro differenzieren und mineralisieren und daher gut als Modell geeignet sind [200]. Vergleicht man HOS TE85 mit den Eigenschaften primärer Osteoblasten, zeigt sich jedoch, dass Effekte, die an Osteosarcomazellen gefunden wurden, nicht unbedingt auf primäre Osteoblasten übertragen werden können. Ursache dafür ist zum einen, dass die Osteosarcomazellen aufgrund ihrer malignen Transformation ein verändertes Wachstumsverhalten zeigen und sich andererseits Osteoblastenkulturen aus Zellen verschiedener Differenzierungsstadien zusammensetzen und daher sehr heterogen sein können [201]. Trotz dieser Einschränkungen können Osteosarcomazellen dazu beitragen, die Funktion und Regulation von Osteoblasten besser zu verstehen. Experimente, die für ausgewählte Parameter an der Fibroblastenlinie L929 durchgeführt wurden, zeigen außerdem, dass die beobachteten Effekte nicht spezifisch für Knochenzellen sind.

Über den Nachweis verschiedener „second messenger“, parakriner Faktoren, des Redoxstatus der Zelle, die Aktivierung des Zellkerns sowie Veränderungen in Wachstum und Differenzierung konnte gezeigt werden, dass elektrische Felder das Signalsystem und den Stoffwechsel von Knochenzellen beeinflussen können. Dabei konnten im gesamten untersuchten Frequenzbereich Feldeffekte gefunden werden, die Richtung des Nettoeffekts war jedoch im oberen und im unteren Frequenzbereich unterschiedlich. Unterschiede in der Wirkung gepulster und sinusförmiger Felder wurden ebenso wenig wie Frequenzfenster festgestellt. Ob die eingesetzte elektrische Stimulation die Fähigkeit besitzt, Matrixbildung und Mineralisation zu modifizieren, wurde jedoch nicht überprüft.

Bei Feldstärken unter 30 V/m traten kaum Feldeffekte auf, im mittleren Feldstärkebereich von 30 V/m, bis 300 V/m waren die beobachteten Effekte maximal. D.h., dass durch induktive und kapazitive Feldapplikationen die nötigen Feldstärken im Medium kaum erreicht werden können. Ausreichende Feldstärken können also nur mittels Elektroden erreicht werden.

Da alle Ergebnisse an einem einheitlichen System erhalten wurden, lassen sie sich in ein Schema zur Wirkungsweise elektrischer Felder integrieren (Abb. 6-6.1). Der einzige bereits existierende Vorschlag zum Mechanismus der zellulären Wirkung von kapazitiv und induktiv eingekoppelten Feldern stammt [Seite 90↓]aus der Gruppe von Brighton et al. [137,29]. Dieses Modell sieht prinzipiell die Erhöhung der intrazellulären Kalziumkonzentration vor, die im kapazitiven Fall über spannungsabhängige Kanäle und im induktiven Fall durch Freisetzung aus intrazellulären Speichern erfolgen soll. Kalzium kann dann die Ausschüttung von PGE2 stimulieren und über Calmodulin die Proliferation beeinflussen. Das Modell könnte somit eine Analogie zwischen elektromagnetischer und mechanischer Stimulation herstellen, da alle Prozesse in der Erhöhung der intrazellulären Kalziumkonzentration münden.

Unsere Ergebnisse befinden sich in guter Übereinstimmung mit dem von Brighton vorgeschlagenen Signalweg. Das Modell, das hier vorgestellt werden soll, geht jedoch noch etwas weiter, da es neben dem „second messenger“ Kalzium auch die Beteiligung anderer Signalwege aufzeigt.

Da die hohe Impedanz der Zellmembran und die hohe Leitfähigkeit im Zytoplasma verhindern, dass elektrische Felder mit Frequenzen unter 1 MHz in das Zellinnere eindringen können, müssen Prozesse an der Zellmembran für das Entstehen von Feldeffekten verantwortlich sein. Dazu gehören die Aktivierung von Membranrezeptoren sowie die Beteiligung von Ionenkanälen und Membranproteinen. Aufgrund der Ergebnisse der Kalziummessungen ist allerdings nicht anzunehmen, dass die Wirkung elektromagnetischer Felder durch einen spezifischen Rezeptor vermittelt wird. Thermische Effekte werden ebenfalls ausgeschlossen, da der Effekt frequenzabhängig und die Temperaturänderung in der Messkammer vernachlässigbar ist.

Abb. 6-1 Schema zur Signaltransduktion, die durch die Wirkung elektrischer Felder hervorgerufen wird. Der Kalziuminflux über spannungs- und dehnungsabhängige Kanäle und die Freisetzung von Kalzium aus intrazellulären Speichern führt zur Erhöhung der intrazellulären Kalziumkonzentration. Außerdem sind cGMP, PGE2 und die MAPK an der Signaltransduktion beteiligt, die wiederum durch den Redoxzustand moduliert werden können. Durch die Translokation aktivierter MAPK können Informationen an den Zellkern weitergeleitet und in Signale umgewandelt werden, die Wachstum und Genexpression regulieren.

Wahrscheinlicher ist die Beeinflussung spannungs- und dehnungsabhängiger Ionenkanäle, da durch das elektrische Feld bzw. die damit verbundene elektroosmotische Strömung das Transmembranpotential der Zelle beeinflusst bzw. die Zellmembran mechanisch verformt wird. Die Aktivierung spannungs- und dehnungsabhängiger Kalziumkanäle führt nachfolgend zu einem verstärkten Influx extrazellulären Kalziums. Außerdem wird Kalzium aus intrazellulären Speichern [Seite 91↓]freigesetzt. Beide Prozesse führen zu einer Erhöhung der intrazellulären Kalziumkonzentration. Die Beeinflussung der Transportraten von ATP-abhängigen Ionenpumpen, wie sie durch höherfrequente Felder möglich ist, kann die intrazelluläre Ionenkonzentration zusätzlich modulieren.

Kalzium kann nachfolgend verschiedene Proteine wie PKC, NOS und MAPK aktivieren. Durch die Translokation aktivierter MAPK können Informationen an den Zellkern weitergeleitet und in Signale umgewandelt werden, die Wachstum und Genexpression regulieren. Außerdem sind auch cGMP und PGE2 an der Signaltransduktion beteiligt. Letzteres kann über parakrine Mechanismen zur Stimulation weiterer Zellen führen und so die primäre Feldwirkung verstärken. Alle diese Prozesse können wiederum durch den Redoxzustand moduliert werden.

Die verschiedenen Elemente der Signalübertragung sollen im Folgenden diskutiert werden.

6.2.1 Elektrisches Feld bewirkt Erhöhung der intrazellulären Kalziumkonzentration

Als Reaktion auf ein externes elektrisches Feld konnten wir verschiedenartige Veränderungen der internen Kalziumkonzentration beobachten. Dazu gehörten sowohl transiente als auch dauerhafte Veränderungen sowie Oszillationen. Damit unterschied sich die Kinetik der intrazellulären Kalziumkonzentration unter dem Einfluss der elektrischen Stimulation prinzipiell von anderen, rezeptorvermittelten Zellprozessen. In letzterem Fall wird durch die spezifische Bindung des Agonisten an den Rezeptor eine Signalkaskade in Gang gesetzt, die einen eindeutigen und dosisabhängigen zellulären Effekt vermittelt. Als Bestandteil der Signalkaskade trägt Kalzium vorrangig durch schnelle, transiente Konzentrationsveränderungen zur Weiterleitung externer Stimuli bei. Die Reaktionen auf die Applikation elektrischer Felder waren jedoch sehr heterogen und ähneln darin den UVA-bedingten Zellreaktionen. Das könnte ein Hinweis darauf sein, dass keiner der beiden Effekte durch einen spezifischen Rezeptor vermittelt wird.

Da die Kalziumkonzentration der Kontrollen und der befeldeten Zellen mit der Zeit und der damit zunehmend akkumulierten Gesamtstrahlungsdosis ansteigt, andererseits durch vermutlich einsetzende Regulationsmechanismen der Zelle nach endlicher Zeit ein Konzentrationsplateau erreicht ist, ist es vorstellbar, dass Differenzen der Kalziummittelwerte nur temporär sind. Für ein derartiges Plateau der Kalziumkonzentration spricht auch, dass nur wenige Einzelwerte das Dreifache der Ausgangskonzentration übersteigen. Außerdem würde ein dramatischer Anstieg der Kalziumkonzentration zur Apoptose führen.

Die Applikation niederfrequent gepulster elektrischer Felder bewirkt allgemein einen Anstieg der intrazellulären Kalziumkonzentration. Dieser war jedoch zeitlich nicht auf die Dauer der Feldapplikation begrenzt. Die Verteilung der Intervallmedianwerte war in allen Versuchsgruppen linksschief. D.h. viele Zellen hatten einen überdurchschnittlich hohen Kalziumgehalt. Bei Feldexperimenten erhöhte sich außerdem die Spannweite der Verteilung und verschob sich zu höheren Konzentrationen. Veränderungen in der Verteilungsform waren jedoch nicht zwangsläufig mit einer Verschiebung des Medians verbunden. Teilweise war die Herauslösung einer Subpopulation mit erhöhter mittlerer Kalziumkonzentration zu beobachten. Das impliziert, das ein Teil der Zellen sensibler für das elektrische Feld war und mit einem Kalziumsignal reagiert hat. Bezogen auf den Knochen heißt das auch, dass nicht alle Zellen durch das elektrische Feld stimuliert werden, sondern nur solche Zellen, die sich in einer bestimmten Zellzyklusphase befinden.

Die stärksten Effekte traten im mittleren Feldstärkebereich von 30 V/m bis 300 V/m und in der Nachbeobachtungszeit auf. Daher sind überwiegend langsame, andauernde Anstiege der Kalziumkonzentration durch Kalziuminflux oder Peaks mit nachfolgend erhöhter Konzentration zu vermuten. Diese Schlussfolgerungen sind in guter Übereinstimmung mit in der Literatur dargestellten Wirkungen auf den Kalziuminflux [202,107]. Letztendlich wird die zytosolische Kalziumkonzentration der Zellen durch die Feldwirkung längerfristig erhöht.

Unter zusätzlichem oxidativen Stress traten die beschriebenen Verteilungsunterschiede stärker hervor. Die Effekte waren dann in einem größeren Feldstärkebereich zu beobachten und manifestierten sich in einer echten Verschiebung des Medians. Das weist auf eine synergistische Wirkung niederfrequenter Felder und oxidativem Stress hin [203].


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Wurden amplitudenmodulierte elektrische Wechselfelder eingesetzt, traten im Vergleich zu niederfrequenten Pulsen nur geringe Veränderungen der mittleren intrazellulären Kalziumkonzentration auf. Der Anstieg der Kalziumkonzentration setzte meist verzögert, d.h. nach der Feldapplikation ein. Auch hier war die Verteilung der Intervallmedianwerte linksschief. Unterschiede in der Verteilung zeigten sich vor allem in deren Breite und der Schiefe sowie dem Auftreten von lokalen Dichtemitteln in den befeldeten Gruppen. Letztere sind charakteristisch für Subpopulationen und traten bei Frequenzen größer als 1 kHz, jedoch nicht bei 3 kHz auf. Diese Subpopulationen enthielten Zellen mit erhöhter Kalziumkonzentration; die mittlere Konzentration der Hauptpopulation wurde dadurch kaum verändert. Die Ergebnisse sprechen ferner für eine geringfügig stärkere Wirkung der mit 16 Hz modulierten Felder. Verweise auf die besondere Wirksamkeit von 16 Hz bzw. eine Amplitudenmodulation mit dieser Frequenz finden sich in der Literatur seit langer Zeit [186,109,115,116].

6.2.2 Feldeffekt beteiligt Influx extrazellulären Kalziums und Kalziumfreisetzung aus intrazellulären Speichern

Im Gegensatz zu unsynchronisierten Zellpopulationen waren bei synchronisierten Zellen in der S-Phase deutlichere Veränderungen der internen Kalziumkonzentration als Reaktion auf ein externes elektrisches Feld zu beobachten. Die Zellreaktionen waren nach wie vor heterogen, enthielten aber einen deutlich erhöhten Prozentsatz an Peaks. Diese waren verschieden lang und traten z.T. wiederholt und zu verschiedenen Zeitpunkten in Bezug auf die Feldapplikation auf. Daher scheint es keine einheitliche Latenzzeit bzw. Mindestdauer für die Feldeinwirkung für HOS TE85 zu geben.

Wenn Kalziumpeaks beobachtet wurden, dann reagierten benachbarte Zellen oft gleichzeitig oder in kurzer Folge. Die Ausbreitung von Kalziumpeaks zwischen Osteoblasten mittels Kalziumabhängiger Kalzium-Freisetzung (CICR) wurde bereits früher beschrieben [204]. Da Gap Junctions in HOS-Kulturen von uns nachgewiesen wurden (Kap. 3.1.1.6), weist dieser Fakt auf eine mögliche Übertragung und Weiterleitung der Zellreaktion durch interzelluläre Kommunikation hin.

Der hohe Anteil an Kalziumpeaks bei synchronisierten Zellen legt außerdem den Schluss nahe, dass sich Zellen während der frühen S-Phase in jenem bevorzugten Zellzustand befinden, der sie für die elektrische Stimulation sensibilisiert.

Da hier relativ starke und eindeutige Reaktionen der Zellen auf das eingestrahlte Feld auftraten, sind diese Experimente geeignet, Hypothesen über den zugrundeliegenden Mechanismus und das zeitliche Verhalten aufzustellen. Es gibt prinzipiell zwei Signalwege, die zu einer Erhöhung der intrazellulären Kalziumkonzentration führen. Einerseits kann der Anstieg durch einen verstärkten Influx über die Zellmembran vermittelt werden oder andererseits durch die Freisetzung von Kalzium aus intrazellulären Speichern. Um die Beteiligung des Kalziuminflux zu überprüfen, wurde der Einfluss des elektrischen Feldes in Abwesenheit von extrazellulärem Kalzium durchgeführt.

Die Anwesenheit des Kalziumchelators EDTA in der Außenlösung verringerte v.a. die Intensität der beobachteten Reaktionen. D.h., dass für die beobachteten Effekte zumindest teilweise extrazelluläres Kalzium verantwortlich ist. Jedoch konnten auch in EDTA-haltigem Puffer immer noch intrazelluläre Kalziumpeaks ausgelöst werden. Auch langsamere Veränderungen, die sowohl zur Erhöhung der Konzentration als auch zu deren Erniedrigung führen können, traten auf. Lediglich sehr schnelle, sprungartige Erhöhungen der internen Kalziumkonzentration konnten bei Anwesenheit von EDTA nicht beobachtet werden. Das deutet darauf hin, dass diese langfristigen und auch sehr starken Effekte durch verstärkten Influx extrazellulären Kalziums hervorgerufen werden.

Insbesondere bei niedrigen Frequenzen wird durch das externe elektrische Feld das Membranpotential der Zelle verändert. Z.B. beträgt das induzierte Membranpotential 3 mV bei einer mittleren Feldstärke von 200 V/m und einem Zellradius von 10 µm (Gleichung 2). Die minimal bzw. maximal in den Versuchen eingesetzte Feldstärke von 10 V/m bzw. 3 kV/m würde das Membranpotential um 0.1 mV bzw. 45 mV verändern. Im Vergleich dazu beträgt die Rauschspannung der Membran ca. 25 µV. Das zeigt, dass mittlere und hohe Feldstärken in der Lage sind, das Membranpotential von Einzelzellen signifikant zu verändern, so dass spannungsabhängige Ionenkanäle beeinflusst werden können. Da die untersuchten Zellen durch Gap Junctions chemisch und elektrisch verbunden sind, erhöht sich der effektive Radius für die Berechnung des induzierten [Seite 93↓]Membranpotentials. D.h., dass das Membranpotential von Zellverbänden, wie sie in unseren Versuchen verwendet wurden, durch das elektrische Feld stärker beeinflusst wird und die Zellen daher in der Lage sein sollten, auch Felder geringer Stärke wahrzunehmen kann [147].

Daher könnte der beschriebene Influx durch spannungsabhängige Kalziumkanäle vermittelt werden, deren Existenz an Osteoblasten und Osteosarcomazellen nachgewiesen ist [205,206,207,208]. Übereinstimmend damit finden sich in der Literatur weitere Arbeiten, die als Reaktion auf eine niederfrequente Befeldung einen erhöhten Kalziuminflux über spannungsabhängige Kanäle beschreiben [107,117,105,202,209]. Außerdem fanden Meszaros et al. [206], dass der spannungsabhängige Kalziumkanal von HOS TE85 vom L-Typ ist, d.h. er bewirkt langsame Veränderungen der Konzentration und könnte daher für die beobachteten Kalziumeffekte mitverantwortlich sein.

Andererseits wäre auch die Beteiligung dehnungsabhängiger Kalziumkanäle vorstellbar [202], da ein elektrisches Feld entlang einer geladenen Oberfläche, wie sie das Substrat oder der Zellrasen darstellt, eine elektroosmotische Strömung hervorruft, die eine Scherkraft auf die Zelle ausüben kann. Dieser Mechanismus wäre jedoch durch die Viskosität des Mediums, die eine Zeitkonstante im Bereich von Millisekunden für das Einsetzen einer Strömung mit sich bringt, auf den niederfrequenten Bereich beschränkt. Außerdem ist nicht klar, wie sich eine solche Strömung in der Messkammer ausbildet. In einem geschlossenen System, wie es im Knochen vorliegt, ist die Beteiligung mechanosensitiver Elemente jedoch wahrscheinlich.

Im Gegensatz dazu bewirkte das Fehlen extrazellulären Kalziums in unseren Experimenten jedoch nicht, dass der interne Kalziumanstieg komplett verschwand. In geringerem Ausmaß traten immer noch Veränderungen der intrazellulären Konzentration auf. Das weist darauf hin, dass auch die Freisetzung von Kalzium aus intrazellulären Speichern eine Rolle bei der Vermittlung des Feldeffekts spielt. Dies gilt insbesondere für das Entstehen von Peaks bzw. Oszillationen. Die Kalziumfreisetzung aus intrazellulären Speichern könnte durch den Influx von extrazellulärem Kalzium getriggert sein und der Influx damit einen zellulären Verstärkungsmechanismus darstellen [121].

Da besonders unter dem Einfluss höherfrequenter Felder sowohl Anstiege als auch Verminderungen der intrazellulären Kalziumkonzentration auftraten, ist anzunehmen, dass durch die Feldwirkung v.a. die Transportrate für Kalzium verändert wird. Solche Effekte wurden in Zusammenhang mit der Theorie des „Electroconformational Coupling“ beschrieben [210,211]. Das kann zum einen durch Aktivierung/Inaktivierung von bestimmten Ionenkanälen und zum anderen durch Veränderung der Aktivität der Ca2+-ATPasen erfolgen. Das würde in Abhängigkeit vom Verhältnis intrazellulärer zu extrazellulärer Kalziumkonzentration bereits zu zwei verschiedenen Effekten führen. Bei hohem bzw. normalem extrazellulärem Kalziumspiegel würde Kalzium über geöffnete Kanäle verstärkt in die Zelle einströmen. Wenn extrazelluläres Kalzium fehlt, würde aus intrazellulären Reservoirs Kalzium in das Zytosol freigesetzt werden bzw. aus der Zelle ausströmen.

Wenn die beobachteten Kalziumsignale zu den primären Ereignissen als Antwort auf ein externes elektrisches Feld gehören, dann müsste das intrazelluläre Kalzium nachfolgende Prozesse aktivieren, die zur Beeinflussung der Genexpression und zur Aktivierung benachbarter Zellen führen. Das könnte z.B. über Calmodulin, cAMP, NO oder PGE2 erfolgen. Zusammenhänge zwischen den genannten Komponenten wurden in der Literatur beschrieben.

6.2.3  Durch die Fluoreszenzanregung von Fura-2 werden die beladenen Zellen einer relevanten UVA-Strahlungsdosis ausgesetzt

Unsere Ergebnisse zeigen, dass zumindest bei Verwendung des Attofluor-Messplatzes und des Farbstoffs Fura-2 die beladenen Zellen einer nicht zu unterschätzenden UVA-Strahlungsdosis ausgesetzt sind. Die Strahlungsdosis und die Dosisleistung konnten mit Hilfe einer kalibrierten Photozelle für jeden Versuch individuell bestimmt werden. Durch Variation des Messtaktes konnten verschiedene Strahlungsdosen eingestellt werden. Durch dieses Vorgehen lies sich jedoch nur die Dosis, nicht die Dosisleistung verändern.

Als Reaktion auf die applizierte UVA-Dosis beobachteten wir ein sehr heterogenes Verhalten der intrazellulären Kalziumkonzentration. Das beinhaltete sowohl transiente Veränderungen als auch andauernde Konzentrationsanstiege. Der prozentuale Anteil erhöhter Kalziumkonzentration korreliert [Seite 94↓]vor allem mit der Strahlungsdosis, weniger mit der Strahlungsdosisleistung. Da aber beide Parameter mit zunehmendem Lampenalter abnehmen, konnten sie nicht unabhängig voneinander verändert werden. Es ist daher unmöglich zu entscheiden, ob der beobachtete Effekt primär von der Dosis oder der Dosisleistung oder von beiden Parametern abhängt. Dieses Verhalten wurde sowohl für Osteosarcomazellen als auch für primäre Osteoblasten festgestellt. Letztere verfügen jedoch über eine weitaus höhere Empfindlichkeit gegenüber UVA-Strahlung (Faktor 2-3).

In Versuchen, die in Anwesenheit von EDTA in der Außenlösung durchgeführt wurden, nimmt der Anteil des UV-bedingten Konzentrationsanstiegs stark ab. Das lässt darauf schließen, dass dieser Prozess vor allem durch den Influx extrazellulären Kalziums getragen wird. Nachfolgende kalziuminduzierte intrazelluläre Kalziumausschüttungen, die als Verstärkungsmechanismus dienen könnten, sind jedoch nicht auszuschließen. Entsprechende Ergebnisse fanden auch Goren et al. [212], Sakai et al. [213] und Kikuyama et al. [214]. Hohe intrazelluläre Kalziumkonzentrationen, aber auch die entstehenden Radikale können zytotoxisch wirken, was in den Versuchen z.T. auch morphologisch erkennbar war.

Der UV-Effekt trat bei sehr geringen Dosen nicht auf, bei hohen Dosen reagierten jedoch alle Zellen. Das deutet darauf hin, dass es keinen Zellzustand gibt, der vollständig resistent gegen UV-Strahlung ist. Es ist eher von zellzyklusabhängigen Halbwertsdosen auszugehen. Diese Vermutung konnte durch die gefundene Abhängigkeit der UV-Empfindlichkeit vom Zellstadium experimentell bestätigt werden. Besonders sensibel zeigten sich die G2-Phase und der G1/S-Übergang. Das lässt sich durch die Zellzyklus-Kontrollpunkte in diesen Phasen erklären, die absichern müssen, dass die äußeren und inneren Bedingungen der Zelle für die Replikaktion der DNA und die Mitose geeignet sind. Insbesondere der G2-Kontrollpunkt wird als UV-Kontrollpunkt angesehen [215]. Ähnliche Zusammenhänge zwischen Zellzyklus und UV-Sensibilität wurden bereits von Cooke et al. [216], Orren et al. [217], De Laat et al. [218], Yamamoto et al. [219], Petersen et al. [220] berichtet. Außerdem fanden Naderi et al. [221], dass Zellen im Ruhezustand (G0) resistent gegen oxidativen Stress (durch 250 µM H2O2) sind. Diese Wirkung ist zumindest partiell auf einen erhöhten Glutathion-Spiegel zurückzuführen.

Die experimentellen Bedingungen wie Serumgehalt der Lösung und Begasung mit CO2 können den oxidativen Stress auf die Zellen zusätzlich erhöhen und diese so für weitere physikalische oder chemische Reize sensibilisieren. Im Gegenzug kann die Anwesenheit von Serum bzw. verschiedenen Radikalfängern im Medium UV-bedingte Effekte reduzieren [119,222,223].

Da der UV-Effekt methodisch bedingt ist, war es notwendig bei Messungen mit dem Farbstoff Fura-2 die Strahlungsdosis zu berücksichtigen. Insbesondere für längere Messungen zur Erfassung der Kalziumkinetik können die UV-bedingten Effekte nicht vernachlässigt werden. Die Tatsache, dass die Beleuchtungsstärke innerhalb des Gesichtsfeldes nicht homogen ist, kann ebenfalls zu heterogenen Ergebnissen beitragen. Für eine bessere Vergleichbarkeit wurden daher innerhalb einer Versuchsreihe identische Belichtungsprotokolle mit gleichbleibendem Messintervall verwendet.

Unterschiedliche Belichtungsverhältnisse könnten heterogene Ergebnisse innerhalb des Gesichtsfeldes aber auch zwischen verschiedenen Arbeitsgruppen erklären. Es gibt nicht wenige Arbeitsgruppen, die die Fura-2-Methode für Kalziummessungen nutzen [224,225,226] und daher von ähnlichen Artefakten betroffen sein müssten. Publikationen finden sich zu diesem Thema jedoch nicht.

Allerdings findet man in der Literatur eine Vielzahl von Arbeiten, die die Wirkung von UVA-Strahlung auf einzelne Zellen und Zellpopulationen untersuchen. Für verschiedene Zelltypen wurden im selben Dosisbereich wie bei unseren Messungen Wirkungen beschrieben. Diese beinhalten die Aktivierung der Proteinsynthese [227,23,228], Veränderung der Proteinkinaseaktivität [229], Veränderung der Membraneigenschaften [230,231,232] und des Zytoskeletts [233] sowie die Aktivierung von Zellzyklus-Kontrollgenen [234,235,218] und die Stimulation der Proliferation [212,236].

Prinzipiell muss man davon ausgehen, dass die Möglichkeit von Artefakten in allen Fluoreszenzmethoden besteht, insbesondere bei ultravioletter Fluoreszenzanregung und bei der Fluoreszenzmikroskopie, da dort höhere Strahlungsleistungen verwendet werden. Die Kenntnis der wirklichen Strahlungsdosis und –leistung eröffnet die Möglichkeit, die eigentliche UV-Wirkung einzuschätzen und Ergebnisse unterschiedlicher Setups zu vergleichen.


[Seite 95↓]

6.2.4  Feldeinfluss reduziert UV-bedingten Anstieg der intrazellulären Kalziumkonzentration

Versuche zur Stimulation mit höherfrequenten Wechselfeldern, die unter geringer UVA-Belastung durchgeführt wurden, zeigten während und nach der Befeldung immer niedrigere mittlere Kalziumkonzentrationen als die entsprechenden Kontrollen. Das könnte ein Hinweis darauf sein, dass der UV-bedingte Kalziuminflux durch die Feldwirkung reduziert wird. Unter erhöhter UVA-Belastung traten Verteilungsunterschiede schon eher auf, jedoch sind die mittleren Kalziumkonzentrationen nicht in allen Feldgruppen niedriger als in den Kontrollen. Insbesondere in der Gruppe 30 kHz findet man deutliche Erhöhungen gegenüber der Kontrollgruppe. Das spricht dafür, dass der dosisabhängige UV-Effekt in diesen Versuchen so groß ist, dass er durch die Feldwirkung nicht mehr ausreichend unterdrückt werden kann. Unter normaler UVA-Belastung bzw. in frühen Phasen des Experiments kann daher vermutet werden, dass das Feld die Zelle vor weiterer oxidativer Schädigung schützen kann [237,238,239,240,234]. Diese Wirkung könnte z.B. durch Inaktivierung von Kalziumkanälen oder eine erhöhte Pumpleistung der Ca2+-ATPase zum Tragen kommen.

6.2.5 ROS-Konzentrationen sind mit Frequenz korreliert

Man muss davon ausgehen, dass das Gleichgewicht reaktiver Stickstoff- und Sauerstoffspezies extrem wichtig für die normale Zellfunktion ist. Das schließt die Kontrolle des Redoxstatus und zellulärer Signale ebenso ein wie die Aktivierung von Transkription und Genexpression.

Intrazelluläre Messungen mit dem Fluoreszenzfarbstoffs CM-H2DCFDA ergaben, dass sich die intrazelluläre Kalziumkonzentration und der Redoxstatus der Zellen tendenziell ähnlich verhalten.Niederfrequente Felder bewirken eine Erhöhung beider Fluoreszenzintensitäten, insbesondere im mittleren Feldstärkebereich. Höherfrequente modulierte Felder hemmen den Anstieg während der Feldapplikation und erhöhen ihn nach der Applikation. Im höheren Frequenzbereich konnten wir eine schwach signifikante Korrelation von intrazellulärer Kalziumkonzentration und Redoxstatus nachweisen, die aber im niederfrequenten Bereich noch nicht signifikant ist. Die Methode erwies sich jedoch als relativ unsicher, da die Veränderungen in der Fluoreszenzintensität nur gering waren. Selbst bei positiven Kontrollen, denen H2O2 im Medium zugesetzt wurde, stieg die Intensität nur um 10%. Änderungen, die durch das applizierte Feld verursacht wurden, erreichten selten 5%. Gleichzeitig war die Streubreite aller Einzelzellen recht groß. Daher sind aus diesen Versuchen kaum vertrauenswürdigen Aussagen zu erhalten, obwohl der U-Test teilweise statistisch signifikante Effekte bescheinigt.

Auch die extrazellulären Messungen von Nitrit und H2O2 waren mit gewissen methodischen Schwierigkeiten behaftet. Durch die Bestimmung der Nitritkonzentration, die direkt mit der NO-Produktion verknüpft ist, sollten Aussagen zur Aktivität der zellulären NO-Synthase ermöglicht werden. Unsere Messungen ergaben sowohl für die Nitrit- als auch für die H2O2-Konzentration eine Korrelation mit der Frequenz. Für die Nitritkonzentration konnte ferner ein Zusammenhang mit der angelegten Elektrodenspannung und der Pulsdauer nachgewiesen werden. Im Frequenzbereich oberhalb 1 kHz werden an den Elektroden keine reaktiven Stickstoffverbindungen mehr gebildet. Trotzdem beobachtet man gegenüber der Kontrolle geringere Konzentrationen, die mit Ausnahme von 20 kHz im gesamten Frequenzbereich relativ gleichmäßig ist. Das deutet darauf hin, dass entweder die NO-Produktion unter Feldeinfluss vermindert wird oder Nitrit/Nitrat in die Zelle transportiert wird. Ähnliche Ergebnisse fanden auch Lohmann et al. [151]. Die Abnahme der Nitritkonzentration könnte durch die Beeinflussung von Anionentransportern oder der Enzymkinetik hervorgerufen werden. So würde z.B. die Hemmung der NO-Synthase das intrazelluläre Gleichgewicht der ROS stören.

Untersuchungen an synchronisierten Zellen zeigten, dass die stärksten Effekte in der G1- und G2-Phase auftraten. Dieses Ergebnis passt gut zur gefundenen zellzyklusabhängigen UV-Empfindlichkeit, die ebenfalls in diesen Phasen maximal war. Durch den Vergleich verschiedener Zelltypen konnte gezeigt werden, dass der Effekt auf die Nitritkonzentration nicht zellspezifisch ist, sondern in Qualität und Intensität gleichwertige Ergebnisse liefert.

Im Bereich unterhalb 1 kHz zeigte sich allerdings, dass nach 30-minütiger Befeldung die Nitritkonzentration in reinem Medium und in der Zellkultur etwa gleich groß und gegenüber der [Seite 96↓]Kontrolle erhöht ist. Bei den meisten Frequenzen ist aber die Konzentration in der Zellkultur geringfügig höher als in reinem Medium. Das impliziert, dass dieser Effekt eher auf Elektrodenprozesse als auf zelluläre Reaktionen zurückzuführen ist. Jedoch ist die Kinetik der Konzentrationsänderung in diesen beiden Ansätzen verschieden. In reinem Medium nimmt mit zunehmender Befeldungsdauer die Nitritkonzentration gleichmäßig zu, in der Zellkultur misst man einen S-förmigen Verlauf. Das könnte darauf hindeuten, dass es einen zellulären Verstärkungsmechanismus gibt, der bei geringfügig erhöhter Konzentration eine verstärkte NO-Synthese initiiert.

Messungen der H2O2-Konzentration ergaben ein ähnliches Verhalten. Im unteren Frequenzbereich wurde die Konzentration durch das Feld frequenzabhängig erhöht, im oberen Bereich gleichmäßig vermindert. Jedoch war hier der Effekt an primären Osteoblasten stärker als bei Osteosarcomazellen. Die Richtung dieses Effekts und die Tatsache, dass H2O2 die Membran nicht permeieren kann, weist darauf hin, dass unter dem Einfluss höherfrequenter Wechselfelder die H2O2-Produktion gegenüber der Kontrolle abnimmt. D.h. das Feld hätte eine gewisse Schutzfunktion gegen ROS und dieser Mechanismus würde auch unabhängig von der in Kap. 6.2.4 erwähnten UV-Belichtung stattfinden, da in diesen Versuchen kein UV-Licht verwendet wurde.

Diese protektive Wirkung höherfrequenter Wechselfelder hatte sich in den vorgestellten Kalziummessungen bereits angedeutet und wird nun durch die Ergebnisse zur ROS-Konzentration bestätigt. Da die NO-Produktion von Osteoblasten durch PKC moduliert werden kann [241], welche wiederum durch intrazelluläres Kalzium aktiviert wird, lassen sich die gefundenen Kalzium-Effekte mit der veränderten Nitritkonzentration verbinden.

Im Zusammenhang mit einer kurzen Gleichstrom-Stimulation berichteten Sauer et al. auch von einer erhöhten Superoxidproduktion [242]. Andererseits fand Sontag [243] keinen Einfluss niederfrequenter elektrischer Felder auf die ROS-Produktion. Daher kann zumindest für die niederfrequente Stimulation nicht eindeutig entschieden werden, ob es sich bei den beobachteten ROS-Effekten um primäre Feldwirkungen handelt, oder um die Wirkung von Elektrolyseprodukten, die über einen zellulären Verstärkungsmechanismus zur weiteren ROS-Produktion führt.

6.2.6 ROS-Artefakte durch Elektroden im ELF-Bereich

Die Bewertung der Ergebnisse zum Redoxstatus der Zelle ist jedoch schwierig, da im niederfrequenten Bereich Elektrodenprozesse sehr stark an deren Zustandekommen beteiligt waren. Dies gilt aber nicht im hochfrequenten Bereich und selbst dort wurden Effekte auf die Konzentration von Nitrit und H2O2 gefunden. Obwohl auch von Jacobson-Kram et al. [244] berichtet wurde, dass PEMF, welche zur Knochenstimulation genutzt werden, weder zytotoxisch, noch mutagen oder transformierend sind, sollten die Artefakte der elektrischen Stimulation im ELF-Bereich nicht unterschätzt werden. Redoxreaktionen an den Elektroden können dazu führen, dass es besonders in Protein bzw. Aminosäuren enthaltenden Elektrolyten zu einer Anhäufung von Stickoxiden und anderer reaktionsfreudiger Verbindungen kommt, die den Stoffwechsel und die Signalübertragung der Zelle beeinflussen können.

Die Nitrit- und H2O2-Messungen demonstrieren, dass die Gesamtkonzentration an ROS durch die niederfrequente Feldapplikation mittels Elektroden signifikant erhöht sein kann. Es ist jedoch anzunehmen, dass die lokalen Konzentrationen direkt an den Elektroden noch höher liegen. Da die Wirkung der Elektrolyseprodukte in der unmittelbaren Nähe der Elektroden proliferationshemmend bzw. apoptotisch sein kann, lassen sich auf diese Weise auch Nekrosen und andere unerwünschte Nebenwirkungen erklären wie sie u.a. bei Langzeitstimulationen im Gehirn auftreten [163,164].

Durch Abschätzung der Diffusionsstrecken einzelner, leicht diffusibler Reaktionsprodukte (Kap. 1.2.3) lässt sich – zumindest für die hier vorgestellten Versuche an Einzelzellen – ein Einfluss der Elektrolyseprodukte als wenig wahrscheinlich ausschließen. Für die Versuche an Zellpopulationen, die in kleineren Kammern und mit einer längeren Befeldungsdauer durchgeführt wurden, lässt sich das leider nicht sagen. Zudem wird man hier, durch die Messung der Gesamtpopulation, einen Nettoeffekt erfassen, der sich aus den Extremwerten direkt an den Elektroden und moderaten Werten zwischen den Elektroden zusammensetzt.


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6.2.7  Feldeffekt auf cGMP und PGE2, jedoch nicht auf cAMP

Unsere Experimente zeigen, dass neben Kalzium mindestens ein weiterer „second messenger“ an der Vermittlung der Feldwirkung beteiligt ist. Es existiert also eine Verknüpfung zwischen verschiedenen Signalwegen.

Wir fanden, dass nach hochfrequenter elektrischer Stimulation von Osteosarcomazellen nahezu im gesamten Frequenzbereich eine geringe Erhöhung der cAMP-Konzentration auftrat, die jedoch auf grund großer Varianzen kaum statistisch signifikant war. Primäre Osteoblasten waren prinzipiell schlechter stimulierbar und reagierten nur bei ausgewählten Frequenzen mit einer minimalen Erhöhung der cAMP-Konzentration, die jedoch nicht statistisch signifikant war. Ein Unterschied in der Wirkung reiner Sinusfelder und amplitudenmodulierter Sinusfelder konnte nicht festgestellt werden.

Jedoch variieren die publizierten Ergebnisse in Bezug auf eine feldinduzierte Beeinflussung der cAMP-Konzentration. Einige Studien fanden eine leichte Erhöhung [245,122,246], andere Arbeitsgruppen fanden dagegen keinen Effekt [123].

Im Gegensatz zu unseren Ergebnissen wurde von Long et al. [136] eine positive Wirkung elektromagnetischer Felder auf die cAMP-Konzentration von Osteoblasten (UMR-106) festgestellt.Die unter Feldeinfluss erhöhte Nukleotidkonzentration führte in verschiedenen Zelltypen zur Aktivierung der cAMP-abhängigen Proteinkinase A [247]. Abhängig von der Modulationsfrequenz fanden auch Sontag et al. [248] Veränderungen der Konzentration von cAMP und cGMP, jedoch wurden weder die Kalziumkonzentration noch der Redoxstatus beeinflusst. Dagegen zeigten Chiono et al. [249], dass in nicht erregbaren Zellen die cAMP-Synthese durch den Kalziuminflux reguliert wird. Diffuse Erhöhungen der intrazellulären Kalziumkonzentration haben diese Wirkung allerdings nicht. Das deutet darauf hin, dass spezielle Kalziumkanäle mit der Kalzium-abhängigen Adenylatcyclase verknüpft sein könnten. Dass der Effekt auf die cAMP-Synthese abhängig von der Kinetik der intrazellulären Kalziumkonzentration ist, lässt folgende Vermutung zu. Vorausgesetzt, die Erhöhung der intrazellulären Kalziumkonzentration wäre das primäre Ereignis, könnte Kalzium die cAMP-Produktion aktivieren. Jedoch wären vermutlich nur Kalziumpeaks in der Lage, eine Erhöhung der Nukleotidkonzentration hervorzurufen. Diese treten v.a. in der S-Phase auf. Da der Anteil der S-Phasen in einer normalen Population nur 20-30% beträgt, und demzufolge nur in dieser Subpopulation die Adenylatcyclase aktiviert wird, könnte das erklären, das in der cAMP-Konzentration kein messbarer Effekt auftritt. Da die Proliferation durch cAMP gehemmt würde [93], sind die Messungen von cAMP und Proliferation konsistent. Es wäre aber möglich, dass sich die cAMP-Konzentration im niederfrequenten Bereich anders verhält, da dort keine Stimulation der Proliferation gefunden wurde.

Anders als cAMP scheint die intrazelluläre cGMP-Konzentration einer der empfindlichsten Parameter für die elektrische Stimulation von Zellen zu sein. Auch hier ist die Wirkung auf Osteosarcomazellen stärker als auf Osteoblasten. Man beobachtet ein ähnliches Verhalten über den Frequenzbereich wie in der cAMP-Konzentration. Mit Ausnahme des mittleren Frequenzbereichs erfolgt eine Erhöhung der Konzentration. Diese ist für HOS-Zellen im oberen Frequenzbereich maximal.

Die erhöhte cGMP-Konzentration könnte verschiedene NO-induzierte Effekte vermitteln und so für eine langandauernde Wirkung dieses kurzlebigen Moleküls sorgen. Dazu zählt u.a. die Modulation der Aktivität von Proteinkinase B (Akt) und ERK1/2 bzw. die Freisetzung von PGE2[250]. Über die Freisetzung von NO und PGE2 können auch benachbarte Zellen stimuliert werden und zu einer Verstärkung des Effektes beitragen.

In einzelnen Versuchsgruppen und auch nur mit geringer Signifikanz konnten wir die Beteiligung von PGE2 ebenfalls nachweisen. Die Prostaglandinkonzentration wurde 6 Stunden nach elektrischer Stimulation gemessen. Dieses Zeitschema orientiert sich an den Ergebnissen von Nauman et al. [185], die 6 Stunden nach mechanischer Stimulation ein Maximum in der PGE2-Synthese fanden. Aussagen über die Kinetik der PGE2-Synthese können aufgrund dieser Messungen nicht gemacht werden. Daher ist es nicht sicher, ob das gewählte Zeitfenster wirklich optimal war, um mögliche Feldeffekte zu erfassen.

Nach hochfrequenter elektrischer Stimulation wurde sowohl an Osteosarcomazellen als auch an Osteoblasten eine leichte Erhöhung der PGE2-Freisetzung beobachtet. Signifikant ist dieses Ergebnis für 100 kHz und für amplitudenmodulierte 3 kHz. Entsprechende Ergebnisse wurden unter PEMF-[Seite 98↓]Einfluss bereits für Osteoblasten-Vorläuferzellen [141,125] und die Osteoblasten-ähnlichen Zelllinien MG-63 [135] und TE 85 [115,112] gefunden. Das beinhaltete Experimente mit direkter [245], induktiver und kapazitver Stimulation [137]. Jedoch wurde in diesen Experimenten ausschießlich mit niederfrequenten Feldern gearbeitet, so dass ein direkter Vergleich der Wirkung auf PGE2 nicht möglich ist. Außerdem muss man davon ausgehen, dass die Wirkungsmechanismen im niederfrequenten und höherfrequenten Bereich verschieden sind.

Obwohl von Lohmann et al. [151] angenommen wird, dass die PLA2 ein Angriffspunkt der PEMF-Wirkung ist, da sie das Substrat für die Cyclooxygenase und damit die Prostaglandinsynthese bereitstellt, lassen unsere Ergebnisse aufgrund der geringen Signifikanz nicht auf eine herausragende Bedeutung von PGE2 bei der Vermittlung der Wirkung höherfrequenter Felder schließen.

Insgesamt finden sich in der Literatur nur relativ wenige Arbeiten, in denen die Prostaglandinsynthese in Zusammenhang mit der Feldapplikation untersucht wurde [135]. Ergebnisse existieren v.a. in Verbindung mit einer mechanischen Stimulation. Letztere kann über den ERK1/2 Signalweg eine erhöhte PGE2-Produktion hervorrufen [99]. Die Prostaglandinsynthese kann auch durch PKC aktiviert werden, welche wiederum ein Target der Kalziumkaskade ist. Damit besteht eine Verbindung zwischen den hier beobachteten Kalziumeffekten und der PGE2-Konzentration.

6.2.8 Transiente Aktivierung der MAPK

Die Untersuchungen zeigten, dass die elektrische Stimulation durch verschiene Feldformen und Frequenzen den Aktivierungsstatus der MAPK beeinflusst. Das zeitliche Verhalten der MAPK-Aktivierung ist schnell und transient; die Aktivierung war nach etwa 30 Minuten maximal und nach 2 Stunden war sie auf das Ausgangsniveau zurückgekehrt. Ähnliche Ergebnisse fanden auch Katz et al. [251], die im Anschluss an Verletzungen von Knochen in Osteoblasten die transiente Aktivierung von ERK1/2 beobachteten. Das Signal konnte auch durch konditioniertes Medium weitergegeben werden, d.h. autokrine und parakrine Mechanismen waren an der Verletzungsreaktion beteiligt. Passend zu diesen Ergebnissen fanden Hatton et al. [252], dass auch ein mechanischer Puls über die Aktivierung von ERK1/2 zu Wachstum und Genexpression in Osteoblasten führen kann. Der Effekt auf die MAPK wurde auch von diesen Autoren als kurzzeitig beschrieben.

Die aktivierte Form der MAPK fand sich auch in den unbehandelten Kontrollen sowohl im Zytoplasma als auch im Zellkern, was auf eine hohe Grundaktivität hinweist. In ruhenden Zellen (G0) als auch in stimulierten Zellen existiert ein konstanter Austausch von MAPK zwischen Zytoplasma und Zellkern [253]. Außerdem gibt es auch in den Kontrollen einen Anteil aktivierter Zellen. Das gilt besonders für die Osteosarcomazellen, ist jedoch bei Tumorzellen auch zu erwarten. Diese normale Aktivität könnte erklären, warum die Ergebnisse für HOS TE85 mehr variieren als für Osteoblasten.

In allen untersuchten Präparaten von Osteoblasten war die Wirkung von Mitogen bzw. Feldapplikation geringer als bei Osteosarcomazellen. Außerdem war weder eine Abhängigkeit der Aktivierung von der Zelldichte bzw. der Entfernung zu Nachbarzellen, noch von der Zellgröße und Strukturierung nachweisbar. Damit kann kein Zusammenhang zum Zellstatus hergestellt werden.

Die hohe Grundaktivität der Osteosarcomazellen ist auch die Ursache für die geringe Stimulation durch PMA, die darum weniger in einer Verschiebung der Gesamtverteilung als in einer qualitativen Veränderung der Fluoreszenz sichtbar wurde. In der Mehrheit der Zellen erfolgt eine Umverteilung der Fluoreszenzintensität. In nicht aktivierten Zellen bildet die MAPK-Fluoreszenz im Zytoplasma eine körnige Struktur, nach Aktivierung erscheint die Fluoreszenz diffus. Das spricht dafür, dass sich die Verteilung der aktivierten MAPK im Zytoplasma geändert hat und diese zunehmend in den Zellkern transportiert wird.

Im Fall von Osteosarcomazellen bewirkt die Befeldung heterogene Ergebnisse in Bezug auf die MAPK. Die Applikation von niederfrequenten Feldpulsen (1.5 Hz) und hochfrequenten Sinuswellen (3 kHz) führt zu einer Aktivierung des Zellkerns durch die Translokation der MAPK. Im Gegensatz dazu bewirkte die Befeldung mit 16 Hz Sinuswellen oder 16 Hz amplitudenmodulierten Sinuswellen von 3 kHz eine Verarmung der MAPK im Zellkern. Letzteres spricht für eine verstärkte Inaktivierung von MAPK im Zellkern, was zu einer Hemmung von Proliferation und/oder Differenzierung führen könnte. Obwohl solch ein Effekt in den Kalziumergebnissen nicht sichtbar ist, wurde bereits auf Literatur, die der Frequenz 16Hz eine besondere Bedeutung zuspricht, verwiesen. Higuchi et al. [104] fanden, dass [Seite 99↓]bei kontinuierlicher Hemmung der MAPK die Differenzierung von Osteoblasten und die Matrixmineralisation gefördert wird. Außerdem ist bekannt, dass die MAPK nach Aktivierung und Translokation in den Zellkern dort inaktiviert oder sequestriert und somit beendet wird [253]. Jedoch benötigt die Stimulation der Proliferation eine langdauernde Akkumulation von aktiver MAPK im Zellkern, die bis zu 6 Stunden während der Progression durch die G1-Phase anhalten muss. Nur die Stimulation durch Mitogene kann solche Langzeitaktivierung auslösen, bei nicht mitogener Stimulation nimmt das Kernsignal nach 10-15min wieder ab [253].

Bei primären Osteoblasten wird die Auswertung oft durch eine unspezifische Anfärbung des Zytoskeletts und matrixhaltiger Vesikel erschwert, die Intensitätsunterschiede zwischen Kern und Zytoplasma verschmieren können. In allen Feldgruppen und nach Stimulation durch PMA erhöht sich die MAPK-Aktivität der Zellen. Der Effekt ist in den Gruppen 3 kHz Sinuswellen und 1.5 Hz Feldpulsen am stärksten ausgeprägt.

Die ERK1/2-Kaskade kann u.a. die ALP-Aktivität und die Mineralisation negativ regulieren [254]. Das deckt sich mit der Beobachtung von Kozawa et al. [255], dass ERK1/2 die Osteocalcinsynthese, die charakteristisch für die Mineralisation ist, negativ reguliert. Diese Ergebnisse konnten durch unsere eigenen Messungen der ALP-Aktivität bestätigt werden.

6.3  Der Einfluss elektrischer Stimulation auf Proliferation und Differenzierung

6.3.1 Proliferation und ALP-Aktivität sind mit Stimulationsfrequenz korreliert

Der Einfluss elektrischer Stimulation auf das Wachstums- und Differenzierungsverhalten von Knochenzellen wurde über die zeitabhängige Messung von DNA-Gehalt und ALP-Aktivität untersucht. Die ALP-Aktivität ist invers mit dem Zellwachstum korreliert. In früheren Studien konnte gezeigt werden, dass die ALP-Aktivität im Knochen ein Maß für die Knochenbildungsrate darstellt [103,104]. Farley et al. [61] fanden, dass sich die ALP Aktivität umgekehrt proportional zur extrazellulären Kalziumkonzentration verhält. Auch zwischen der intrazellulären Kalziumkonzentration bzw. dem Kalziumflux und der Proliferation wird in der Literatur relativ oft eine Verbindung gezogen [105,106,107]. Z.B. sollen nach Cai et al. [108] Veränderungen in der intrazellulären Kalziumkonzentration als Reaktion auf eine veränderte extrazelluläre Konzentration die Ursache für Veränderungen in Zellzyklus und Proliferation sein.

In der umfangreichen Literatur zur Feldwirkung auf Wachstum und Differenzierung von Osteoblasten finden sich jedoch widersprüchliche Ergebnisse. So fanden Wiesmann et al., dass ein kapazitiv eingekoppeltes elektrisches Feld von 16 Hz die Proliferation erhöht und die Mineralisation beschleunigt [134,139,110]. Mit einer ähnlichen Applikationseinrichtung konnte sowohl die DNA-Synthese, als auch die Konzentration von cAMP erhöht werden [256,257]. Dieser Effekt war von einem erhöhten Kalziuminflux begleitet [258]. Die Gruppe um Lohmann beschrieb jedoch für eine induktive Einkopplung Wachstumshemmung und Erhöhung der ALP-Aktivität [135,125]. McLeod et al. [144] berichteten dagegen von einer Förderung der Proliferation und Herabsetzung der ALP-Aktivität. Ähnliche Ergebnisse wurden im Zusammenhang mit mechanischer Stimulation gefunden [259].

Aus den hier durchgeführten Experimenten ergibt sich, dass sowohl die Proliferation als auch die ALP-Aktivität mit der Stimulationsfrequenz korreliert sind. Dabei ist der beobachtete Effekt zwischen dem 5. und 10. Tag nach der Feldapplikation maximal. Bei niedrigen Frequenzen findet eine Wachstumshemmung statt, gleichzeitig ist die ALP-Aktivität erhöht. Im hochfrequenten Bereich beobachtet man das entgegengesetzte Verhalten. Der Umkehrpunkt, d.h. der Bereich in dem kein Effekt ausgelöst wird, liegt zwischen 100 Hz und 1 kHz. Einzelne herausragende Frequenzen bzw. Fenstereffekte waren nicht nachweisbar.

Bei längerer Kultivierung werden die beobachteten Unterschiede zu den Kontrollen zunehmend kompensiert und sind dann nicht mehr signifikant. Offensichtlich wird die Wachstumskurve der stimulierten Zellen dahingehend verändert, dass der Anteil der Zellen, die sich aktiv vermehren, [Seite 100↓]moduliert wird. Das kann durch zusätzliche Aktivierung von Zellen der G0-Phase oder Verzögerung beim Passieren der Zellzyklus-Kontrollpunkte erfolgen.

Prinzipiell wurde ein ähnliches Verhalten der verschiedenen Zelltypen nach der Feldapplikation festgestellt. Bestehende Unterschiede können durch die verschiedenen Arten und Zelltypen verursacht sein. Jedoch waren an Osteosarcomazellen stärkere Effekte zu verzeichnen als an primären Osteoblasten. Diese verschieden starken Feldeffekte können durch unterschiedlich lange Verdopplungszeiten der beiden Zelltypen begünstigt werden. Angenommen das elektrische Feld übt in erster Linie einen kurzfristigen Effekt aus, könnte sich dieser bei schnell proliferierenden Zellen deutlicher durchsetzen. Es wäre auch vorstellbar, dass bei einem zu lang dauernden Zellzyklus kurzfristige Änderungen verschmiert werden.

Da die Kulturen primärer Osteoblasten nur sehr langsam wachsen, kann man weiterhin vermuten, dass innerhalb der Beobachtungsdauer der Einschaltzeitpunkt für die Differenzierung noch nicht erreicht wurde. Darauf deuten gleichmässige und immer gleichgerichtete Unterschiede zur Kontrolle hin.

Unseren Ergebnissen im niederfrequenten Bereich vergleichbar sind die Arbeiten von Lohmann et al. [135,125]. Ähnliche Ergebnisse unter dem Einfluss hochfrequenter Stimulation fanden Lorich et al. [137]. Ein Sinusfeld von 60 kHz induzierte eine verstärkte Proliferation von Osteoblasten. Die Wirkung wurde über spannungsabhängige Kalziumkanäle, die Aktivierung von PLA2 und Calmodulin sowie die Freisetzung von PGE2 vermittelt. Da die Zellproliferation durch cAMP gehemmt würde [93], jedoch kein cAMP-Effekt, aber erhöhte Proliferation gefunden wurde, befinden sich die Ergebnisse von cAMP und Proliferation in guter Übereinstimmung.

Die gegensätzliche Wirkung von hoch- und niederfrequenter Befeldung auf Proliferation und Differenzierung eröffnet in der therapeutischen Anwendung die Möglichkeit, die Richtung, in der das Knochengewebe beeinflusst wird, zu kontrollieren.

6.3.2 Konditioniertes Medium wirkt entgegengesetzt zu elektrischem Feld

Das Verhalten von Zellen, die ausschließlich mit befeldetem Medium in Kontakt waren, steht im Kontrast zu dem direkt befeldeter Zellen und ermöglicht es, den Einfluss langlebiger Elektrolyseprodukte von der Wirkung des elektrischen Feldes zu trennen. Im Frequenzbereich oberhalb 1 kHz, wo erwartungsgemäß keine Elektrolyseprodukte mehr im Medium nachweisbar sind, ist weder auf die Proliferation noch auf die Differenzierung von HOS-Zellen eine Wirkung zu verzeichnen. Diese Schwelle entspricht aber auch der oben beschriebenen „Nullstelle“ für die Feldwirkung. Im unteren Frequenzbereich <1 kHz verursachen jedoch die chemischen Veränderungen im Medium, welche die direkte Folge des elektrischen Stroms sind, einen der Feldwirkung entgegengesetzten Effekt. Die Proliferation wird gefördert, die ALP-Aktivität herabgesetzt. Das spricht zum einen dafür, dass die Produkte der an den Elektroden ablaufenden Reaktionen selbst in der Lage sind, das Verhalten der untersuchten Zellen zu beeinflussen. Andererseits zeigt die gegensätzliche Wirkung von elektrischem Feld und Elektrolyseprodukten, dass es sich bei den beschriebenen Ergebnissen wirklich um feldbedingte Effekte und nicht nur um methodisch verursachte Nebenwirkungen handelt. Von einer Beteiligung elektrochemischer Reaktionsprodukte am Zustandekommen der Gesamtwirkung ist im niederfrequenten Bereich jedoch auszugehen. Dafür spricht auch die Korrelation von Nitrit und H2O2 mit der Stimulationsfrequenz.

Außerdem könnte die ungleiche Wirkung von elektrischem Feld und konditioniertem Medium durch Unterschiede in der lokalen und Gesamtkonzentration von elektrolytisch entstandenem NO oder anderen ROS verursacht sein. In konditioniertem Medium sollte die NO-Konzentration geringer sein, da das Medium durchmischt wurde bzw. vorhandenes NO z.B. zu Nitrit/Nitrat weiterreagiert. Direkt an den Elektroden können jedoch hohe lokale Konzentrationen entstehen, die die Zellen lokal beeinflussen können. Durch Diffusion würden sich die Reaktionsprodukte in der gesamten Kammer ausbreiten, allerdings würde die Konzentration dort nur langsam zunehmen und insgesamt gering bleiben, so dass lokal gegensätzliche Effekte auftreten könnten. Die Gesamtwirkung sollte dann abhängig davon sein, welcher Effekt überwiegt. Da insbesondere die Wirkung von NO auf die Proliferation konzentrationsabhängig und biphasisch ist, d.h. langsame, geringe NO-Freisetzung stimuliert Wachstum und ALP-Aktivität, wogegen schnelle, extreme Freisetzung die Proliferation [Seite 101↓]hemmt und Apoptose bewirkt, könnten unterschiedliche Konzentrationen eine plausible Erklärung für den oben beschriebenen Effekt liefern.

Da der Einsatz von Elektroden für die niederfrequente elektrische Stimulation mit elektrochemisch bedingten Nebenwirkungen verbunden ist, sind die Wahl der Applikationsanordnung und der eingesetzten Stromdichte von großer Bedeutung. Eine mit unserem Setup vergleichbare Elektrodenanordnung wurde von Tang et al. benutzt. Sie fanden zwischen 1 und 1000 Hz eine Proliferationssteigerung mit einem Maximum bei ca. 10 Hz. Nach Exposition gab es einen erhöhten Anteil an S-Phasen und eine Erhöhung der intrazellulären Kalziumkonzentration [260]. Auch unter dem Einfluss von Gleichspannung wurden solche Effekte beschrieben [106,261]. Selbst bei sehr hohen elektrischen Feldstärken (3.2 kV/m) konnte von Ozawa et al. [107] ein positiver Effekt auf Kalziuminflux und Proliferation festgestellt werden. Entsprechende Resultate konnten von uns nur bei der Behandlung der Zellen mit konditioniertem Medium beobachtet werden. Ähnliche Ergebnisse wurden auch häufig nach kapazitiver oder induktiver Stimulation gefunden. Jedoch sind dort die verwendeten Feldstärken wesentlich niedriger und ein direkter Vergleich daher nicht möglich.

6.4 Abhängigkeit der Feldwirkung vom Zellstadium

Bereits seit einiger Zeit ist bekannt, dass bei der Steuerung von Zellzyklus und Wachstum Kalzium eine wichtige Rolle spielt. Insbesondere die Übergange G1/S und G2/M benötigen hohe intrazelluläre Kalziumkonzentrationen [65]. Aber auch andere Zelleigenschaften sind von der individuellen Phase des Zellzyklus bzw. dem Entwicklungsstand abhängig. Dazu zählen die Expression von ALP [54], spannungsabhängigen Ionenkanälen [57] bzw. Kalziumkanälen [58], die zelluläre Reaktion auf Vitamin D, Glucocorticoide [56,262], PGE2 und Parathyroidhormon [263], die Expression des Vitamin D Rezeptors [264] sowie die intrazelluläre Kalziumkonzentration [65] und die Aktivität der Kalziumfreisetzung [69].

Diese zellzyklusabhängigen Eigenschaften tragen dazu bei, dass man in unsynchronisierten Kulturen, insbesondere bei Messungen auf Einzelzellniveau, zu heterogenen Ergebnissen gelangt. Außerdem legt es nahe, dass nur bestimmte Zellzustände sensibel für externe Reize sind. Daher ist es wahrscheinlich, dass nur ein geringer Anteil der Zellen auf ein elektrisches Feld reagiert. Um Veränderungen innerhalb von Subpopulationen zu erfassen, ist eine Analyse der Verteilung aufschlussreich wie sie im Fall von Kalzium, Redoxstatus und MAPK-Aktivität vorgenommen wurde. Um eine bessere Vergleichbarkeit zu erzielen, wurden daher in unseren Versuchen alle bekannten Einflussfaktoren konstant gehalten. Unterschiede in Zelldichte- und zustand sowie Zusammensetzung der Lösung können aber eine mögliche Ursache für verschiedene Ergebnisse aus unterschiedlichen Arbeitsgruppen darstellen.

Auch in den umstrittenen Arbeiten von Lindström et al. [265,266] konnten die Autoren nur an morphologisch vorausgewählten Zellen Kalziumpeaks als Antwort auf ein externes Feld nachweisen. Diese Ergebnisse konnten von anderen Gruppen, die beliebige Zellen auswählten und über große Zellzahlen mittelten, nicht reproduziert werden. Sontag [243] erklärt die z.T. widersprüchlichen Effekte, die in verschiedenen Labors gefunden wurden, ebenfalls mit den speziellen zellulären Bedingungen. Die Zelle kann entweder aktiviert oder im Ruhezustand vorliegen und ein möglicher Effekt an einen bestimmten Status und eine bestimmte Zelllinie gebunden sein [267,268]. So soll die Feldapplikation in früheren Stadien effektiver sein [130,141]. Das steht eventuell im Zusammenhang mit dem zeitlichen Muster der Kollagenexpression, welche während der Proliferation hochgeregelt und während der nachfolgenden Differenzierung heruntergeregelt wird. Das könnte auch erklären, weshalb der stimulatorische Effekt unabhängig von der Stimulationsdauer ist.

Unsere Messungen zeigten, dass insbesondere Kalziumsignale stark vom Zellzyklus abhängen, was die große Heterogenität in den beobachteten Zellreaktionen erklären kann. Während in unsynchronisierten Zellen nur wenige und heterogene Reaktionen auf ein äußeres Feld beobachtet wurden, traten während der frühen S-Phase überwiegend intrazelluläre Kalziumpeaks auf. Außerdem war der Anteil reagierender Zellen in dieser Phase viel höher. Proliferation und ALP-Aktivität werden jedoch durch Stimulation während der S-Phase nicht nachhaltig beeinflusst. Es ist daher anzunehmen, dass die Feldwirkung auf die Kalziumkonzentration während der S-Phase nur kurzfristig [Seite 102↓]ist und spätestens nach erfolgter Mitose wieder verschwindet. Stärkere Effekte in Proliferation und ALP-Aktivität findet man bei Stimulation während der G0/G1-Phase. Ähnliche Ergebnisse an HOS TE85 fanden auch Kenny et al. [105], die nachwiesen, dass, unabhängig vom Kalziuminflux, nur dann eine Erhöhung der Proliferation stattfindet, wenn die Zellen in G0/G1 synchronisiert sind bzw. sich die Mehrzahl der Zellen in dieser Phase befindet.

Zudem erscheint es nicht plausibel, dass allein die Stimulation der Zellen während der S-Phase (ohne parakrine Mechanismen) in der Lage ist, das Wachstum der Population zu verändern. Es ist nicht anzunehmen, dass sich die Verdopplungsdauer der Zellen (Zeit für einen Zyklus) durch äußere Einflüsse verkürzt [53]. Vielmehr wird die Wachstumsgeschwindigkeit der Population dadurch bestimmt, wie groß der Prozentsatz der aktiv proliferierenden Zellen ist. In einer normalen Population befindet sich immer ein Teil der Zellen in der Ruhephase (G0), d.h. diese Zellen sind durch die äußeren (Nährstoffangebot, Temperatur, Kontakt) und/oder inneren (DNA-Schaden, Differenzierung) Bedingungen vom aktiven Zellzyklus ausgeschlossen. Nur dadurch, dass sich eine größere Anzahl Zellen periodisch verdoppelt, kann die Wachstumsgeschwindigkeit der Population zunehmen. Dafür ist es notwendig, dass die Zellen, die sich in der Ruhephase befinden, aktiviert werden. Ein Kennzeichen für diesen Ausgang aus der G0-Phase ist die Expression des Transkriptionsfaktors c-myc. Ein erhöhtes Transkriptionslevel wurde im Zusammenhang mit der Wirkung elektromagnetischer Felder [127,269,270] aber auch durch Vibrationskräfte [271] bereits gefunden.

Eine verstärkte Aktivierung von Zellen der G0-Phase lässt sich auch aufgrund der hier beobachteten Veränderung in den Wachstumskurven vermuten. Ein entsprechender Hinweis auf die feldinduzierte Rekrutierung von G0-Zellen findet sich auch bei Pezzetti et al. [138].Damit korrespondieren auch die guten Stimulationsergebnisse während der G0- und der G1-Phase, die in einer verstärkten Proliferation sichtbar wurden. Jedoch konnte durch die Untersuchung von Proliferation und ALP-Aktivität synchronisierter Zellen keine Phase des Zellzyklus als besonders empfindlich für die elektrische Stimulation herausgestellt werden. Für kurzfristige Effekte deuten die Ergebnisse zwar in Richtung S- und G2-Phase, aber nach längerer Kultivierung ist in diesen Fällen jeder Effekt verschwunden. Im hochfrequenten Bereich ist der Einfluss auf einzelne Zellzyklusphasen noch weniger nachweisbar. Das impliziert, dass das Zusammenspiel aller Zellzyklusphasen für eine messbare Wachstumsänderung notwendig ist, da erst durch Zell-Zell-Kommunikation (Gap Junctions und parakrine Substanzen) große Teile der Gesamtpopulation rekrutiert bzw. aktiviert werden können. Erst dann lässt sich in Parametern, die über die gesamte Population gemittelt werden, ein Effekt nachweisen.

Bei den Untersuchungen von Proliferation und ALP-Aktivität zeigte sich, dass durch die einmalige Feldapplikation keine langfristige Wirkung hervorgerufen wurde. Die kurzfristige Wirkung des elektrischen Feldes lässt sich dadurch erklären, dass die Entscheidung für eine Zelle, ob sie sich weiter teilt oder in die Ruhephase übergeht, abhängig von den aktuellen Bedingungen (s.o.) bei jedem Zyklusdurchlauf neu getroffen wird. Damit wird klar, dass der primäre Effekt nur für einen oder wenige Zyklen anhalten kann. Die Weitergabe der feldinduzierten Aktivierung über mehrere Zyklen ist nur vorstellbar, wenn dadurch dauerhafte Prozesse, wie die Expression bestimmter regulatorischer Proteine, angeschaltet werden. Das bedeutet, dass die Wirkung der elektrischen Stimulation durch wiederholte Anwendungen verstärkt werden könnte. Für eine optimale Wirkung müsste dann einmal pro Zyklus stimuliert werden. Das wäre z.B. durch tägliche Stimulation wie sie im klinischen Bereich eingesetzt wird, zu erreichen. Für die größere Wirksamkeit mehrmaliger Feldapplikation spricht außerdem, dass der Effekt auf Proliferation und Differenzierung nach einmaliger Feldapplikation relativ gering im Vergleich zu publizierten klinischen Erfolgen ist. Es muss daher einen Verstärkungsmechanismen geben, der bei wiederholter elektrischer Stimulation einsetzt.

Für unbefeldete Osteoblasten wurde gefunden, dass die Bindung an die extrazelluläre Matrix das Wachstum hemmt und die Differenzierung der Zellen fördert [272]. Dementsprechend beobachteten wir nach der elektrischen Stimulation dreidimensionaler Zellverbände, die als Osteocytenmodell dienen können, geringere Effekte auf die Proliferation. Gleichzeitig war die ALP-Aktivität gegenüber der 2D-Kultur und gegenüber den unbefeldeten Kontrollen erhöht. Das lässt darauf schliessen, dass durch die Feldwirkung undifferenzierte Zellen bevorzugt zur Teilung stimuliert werden, bei differenzierten Zellen wird jedoch die Matrixbildung gefördert.


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6.5  Mögliche Mechanismen der Feldwirkung

Es gibt eine Reihe von mehr oder weniger plausiblen Mechanismen, die für die Erklärung der Effekte elektrischer Feldern auf Zellen und Gewebe herangezogen werden. Bislang hat sich jedoch keine dieser Hypothesen als besonders wahrscheinlich durchgesetzt [273]. Aufgrund der dielektrischen Eigenschaften von Zellmembran und Zytoplasma ist das elektrische Feld im untersuchten Frequenzbereich nicht in der Lage, in die Zelle einzudringen. Deshalb muss die Feldwirkung primär durch Membranprozesse vermittelt werden.

Die vorliegenden Daten an Osteosarcomazellen zeigen, dass es unter dem Einfluss elektrischer Felder zu verstärktem Kalziuminflux kommt. Dadurch erhöht sich die intrazelluläre Konzentration. Zusätzlich wird Kalzium aus intrazellulären Speichern freigesetzt, was zu einer sehr plötzlichen und starken Erhöhung der Konzentration (Peaks) führt. Dieser Vorgang könnte durch den Influx von extrazellulärem Kalzium getriggert sein und einen zellulären Verstärkungsmechanismus darstellen. Insbesondere bei niedrigen Frequenzen würden durch die Einwirkung von Dehnung oder Scherstress mechanosensitive Ionenkanäle aktiviert werden; außerdem bewirkt das elektrische Feld eine Änderung des Transmembranpotentials, die spannungsabhängige Ionenkanäle aktivieren kann. Dabei sind insbesondere Kalziumkanäle interessant, da in der Literatur sowohl im Zusammenhang mit der Wirkung elektrischer Felder als auch bei der Vermittlung mechanischer Belastung von verstärktem Kalziuminflux berichtet wurde [274].

Für die Bewertung der elektrischen Stimulation des Knochens ist im Besonderen der Vergleich zu den physiologischen Vorgängen des „Bone Remodeling“ bedeutsam. Demzufolge stellt die feldbedingte Erzeugung einer elektroosmotischen Strömung eine mögliche Erklärung für die Wirkung niederfrequenter Felder dar. Da diese Strömung nur in der elektrischen Doppelschicht auftritt, wäre sie in der Lage, an der Zellmembran einen erheblichen Scherstress zu erzeugen. Dieser könnte wiederum durch mechanosensitive Elemente der Zelle wie Integrine und/oder mechanosensitive Ionenkanäle detektiert werden. Solch ein Mechanismus würde außerdem eine mögliche Verbindung zwischen mechanischer und elektrischer Stimulation, d.h. zwischen natürlichem und artifiziellem „Bone Remodeling“ herstellen. Zudem gibt es einige Gemeinsamkeiten zwischen den in der Literatur beschriebenen Wirkungen mechanischer Stimulation und den hier gefundenen Feldeffekten. Dazu gehören der Anstieg der intrazellulären Kalziumkonzentration [18], die Ausschüttung von PGE2 [185], die Aktivierung von PKC, NO-Synthase [275,276,277,278,279] und MAPK [252], sowie die verstärkte Proliferation und herabgesetzte ALP-Aktivität [185]. Aufgrund dieser Ähnlichkeiten wäre auch eine Übereinstimmung in Teilen der Signaltransduktion denkbar.

Eine ähnliche Theorie wurde von Pilla unterbreitet. Er geht davon aus, dass die elektromagnetische und mechanische Stimulation sowie Ultraschall einen einheitlichen Wirkmechanismus besitzen, da sie alle vergleichbare Größenordnungen und Zeitverläufe der elektrischen Feldstärke im Gewebe erzeugen [280].

Entsprechend diesem elektrokinetischen Ansatz würde ein elektrisches Wechselfeld vor allem die lokale Dichte von Ionen und Dipolen in der elektrischen Doppelschicht beeinflussen. So könnte die Verfügbarkeit der Ionen für Transportprozesse durch die Membran und somit diese Transportprozesse selbst verändert werden [281]. Besonderes Augenmerk liegt auf den Frequenzen < 120 Hz [32], die entweder direkt oder in Form von Wellenpaketen appliziert werden.

Die gegensätzliche Wirkung von hoch- und niederfrequenter Befeldung auf Proliferation und Differenzierung weist darauf hin, dass in den entsprechenden Frequenzbereichen verschiedene Mechanismen der Feldwirkung überwiegen. Man sollte jedoch grundsätzlich von einem gemeinsamen Effekt mehrerer Signalwege ausgehen. Dafür spricht auch, dass im höherfrequenten Bereich sowohl reine Sinusfelder als auch amplitudenmodulierte Felder eine Wirkung auf die gemessenen Parameter haben. Außerdem können die als Modulationsfrequenz benutzten 16 Hz auch selbst einen Feldeffekt auslösen. Um die Modulationsfrequenz wahrzunehmen, müsste die Zelle die Fähigkeit zur Signaldemodulation besitzen. Eine mögliche biologische Struktur, die zur Demodulation führt, müsste durch ein nicht-lineares Verhalten mit einer Geschwindigkeitskonstante im Bereich der Trägerfrequenz des Feldes charakterisiert sein. So könnte z.B. die Geschwindigkeit molekularer und supramolekularer chemischer Reaktionen beeinflusst werden. Theoretisch könnte dieser Mechanismus bis zu einer Frequenz von maximal 10 MHz effektiv funktionieren. Jedoch sind die Effekte im unteren [Seite 104↓]Frequenzbereich nicht prinzipiell auf amplitudenmodulierte höherfrequente Signale übertragbar [282,283,284].

Im oberen Frequenzbereich ist die Beeinflussung der Transportrate von Ionenpumpen und –austauschern zu vermuten. Z.B. kann der Cl-/HCO3 -/OH--Anionenaustauscher durch Kalzium/Calmodulin aktiviert und durch cAMP gehemmt werden [285]. Diese Annahme wird ferner durch feldinduzierte Aktivitätsänderungen der Na+/K+- und Ca2+- ATPase gestützt [210,211]. Zur Erklärung dieses Effekts wurde das „electroconformational coupling“-Modell (ECC) entwickelt, das die Verwendung harmonischer Felder im kHz-Bereich präferiert, in dem sich auch die Geschwindigkeitskonstanten zellulärer Transporter befinden.


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08.06.2004