Elektrische Stimulation von Zellen und Geweben am besonderen Beispiel von Knochenzellen

Dissertation

zur Erlangung des akademischen Grades
doctor rerum naturalium
(Dr. rer. nat.)

im Fach Biophysik

eingereicht an der
Mathematisch-Naturwissenschaftlichen Fakultät I
der Humboldt-Universität zu Berlin

von Diplom-Biophysikerin Beate Habel

geboren am 10.8.1971 in Gera

Präsident der Humboldt-Universität zu Berlin:
Prof. Dr. Jürgen Mlynek

Dekan: Prof. Dr. Michael Linscheid

Gutachter:
1. Prof. Dr. R. Glaser
2. Prof. Dr. A. Herrmann
3. Prof. Dr. U. Zimmermann

Tag der mündlichen Prüfung: 1. April 2004

Bibliografische Beschreibung und Referat

Elektrische Stimulation von Zellen und Geweben am besonderen Beispiel von Knochenzellen

124 Seiten, 100 Abbildungen und 13 Tabellen

Beate Habel, 2004, Berlin, Humboldt-Universität zu Berlin, Dissertation

Abstract – Deutsch

Die Basis für den therapeutischen Einsatz elektrischer Felder bei der Behandlung von Knochenbrüchen liegt in der Existenz von belastungsabhängigen elektrischen Potentialen im Knochen. Die zellulären Wirkungsmechanismen sind jedoch unverstanden. Um zu untersuchen, ob und wie elektrische Felder Wachstum und Differenzierung von Knochenzellen beeinflussen, wurden humane Osteosarcomazellen (HOS TE85) und aus Minischweinen isolierte primäre Osteoblasten mit elektrischen Feldern im Frequenzbereich von 0.1 Hz bis 100 kHz befeldet und verschiedene zelluläre Parameter zeitabhängig gemessen.

Das elektrische Feld wurde mittels platinierten Platinelektroden appliziert, um ausreichend hohe Feldstärken bei gleichzeitig guter Kontrolle über die im Gewebe erzeugte Wellenform zu gewährleisten. Beim Einsatz von Elektroden müssen jedoch elektrochemische Reaktionen an der Elektrodenoberfläche berücksichtigt werden. Daher wurden verschiedene Elektroden für die in vivo- und in vitro-Stimulation mit elektrischen und numerischen Methoden untersucht und verglichen. Das führte einerseits zur Erarbeitung verschiedener Kriterien zur Auswahl geeigneter Elektrodenmaterialien und –geometrien. Andererseits konnten detaillierte Angaben zur effektiven Feldstärke und Feldverlauf in der Zellebene sowie zu elektrochemisch bedingten Nebenwirkungen gemacht werden.

Es konnte gezeigt werden, dass elektrische Felder das Signalsystem und den Stoffwechsel von Knochenzellen im gesamten untersuchten Frequenzbereich beeinflussen. Die Richtung des Nettoeffekts war jedoch im oberen und im unteren Frequenzbereich unterschiedlich. Im Frequenzbereich über 1 kHz fanden wir immer eine Erhöhung des Wachstums und der Konzentration der „second messenger“ und eine Herabsetzung der Konzentration der reaktiven Sauerstoffverbindungen (ROS). Bei Frequenzen unter 1 kHz wurde dagegen eine Erhöhung der Aktivität der alkalischen Phosphatase und des oxidativen Stress beobachtet. Signifikante Effekte traten jedoch nur bei Feldstärken oberhalb 100 V/m auf. Hinweise auf bevorzugte Frequenzen oder Wellenformen, die für „Fenstereffekte“ sprechen würden, konnten nicht gefunden werden.

Da alle zellulären Parameter an einem einheitlichen System gemessen wurden, ließen sich die Ergebnisse in ein Modell der feldinduzierten Signaltransduktion integrieren. Prinzipiell muss man von einem gemeinsamen Effekt mehrerer Signalwege ausgehen. Dabei kann die Erhöhung der intrazellulären Kalziumkonzentration als ein genereller Mechanismus der Feldwirkung angesehen werden. Dafür sind sowohl der Influx als auch die Freisetzung von Kalzium aus intrazellulären Speichern verantwortlich. Es konnte weiterhin gezeigt werden, dass auch cGMP und Prostaglandin E 2, jedoch nicht cAMP an der Vermittlung der Feldwirkung beteiligt ist. Außerdem wurde die Translokation der mitogen-aktivierten Proteinkinase (MAPK) beeinflusst.

Trotzdem sind die beobachteten Effekte relativ schwach im Vergleich zu publizierten klinischen Erfolgen. Es muss daher in vivo Verstärkungsmechanismen geben, die durch Untersuchungen an Zellkulturen nicht erfasst werden können.

Eigene Schlagworte: Elektrische Stimulation, Knochen, Osteoblasten, Kalzium, Proliferation, Signaltransduktion, Elektroden, Alkalische Phosphatase, MAPK

Abstract – Englisch

The therapeutic use of electric fields in the treatment bone fracture healing is based on the existence of different load dependent electric potentials in bone. However, the cellular mechanisms of field action are still not understood. We investigated the effect of electric fields on proliferation and differentiation of human osteosarcoma cells (HOS TE85) and primary osteoblasts isolated from mini pigs. The cells were exposed to electric fields (0.1 Hz - 100 kHz) and various cellular parameters were measured.

The field was applied using platinized platinum electrodes ensuring sufficiently strong electric fields and a well controlled wave form in the tissue. Nevertheless, in this case electrochemical reactions which occur at the electrode surface have to be taken into account. That’s why various electrodes for in vivo and in vitro stimulation are characterized by electrical and numerical methods leading not only to criteria for choosing electrode materials and geometries, but also providing detailed knowledge about the electric field induced in the tissue and electrochemically induced side effects.

We found that cellular signaling as well as proliferation and differentiation of bone cells are influenced by electric fields in the whole investigated frequency range. Proliferation and the second messenger concentrations are increased at frequencies above 1 kHz, whereas below 1 kHz the alkaline phosphatase activity is increased. Significant effects were found only for electric fields above 100 V/m, but we could not find any hints on preferred frequencies or wave forms ruling out “window effects”.

Because all cellular parameters were measured within one experimental system, the results can be summarized in a signal transduction model for the action of electric fields. Generally, a common action of multiple signaling pathways has to be assumed. The increase of the intracellular calcium concentration can be considered as a general mechanism of field action. This increase is caused by calcium release from intracellular calcium stores as well as influx of extracellular calcium. Additionally, the concentration of cGMP and prostaglandin E2, but not that of cAMP is increased by the electric field. Furthermore, the translocation of the mitogen activated protein kinase (MAPK) is influenced.

Nevertheless, the field effects found are weak compared to those published in clinical studies. We suppose that there are amplifying mechanisms in vivo which could not be seen during in vitro investigations.

Keywords: Electric stimulation, bone, osteoblasts, calcium, proliferation, signal transduction, electrodes, alkaline Phosphatase, MAPK

[Seite 1↓]Zusammenfassung

Ausreichend hohe Feldstärken für die elektrische Stimulation und eine gute Kontrolle über die Wellenform können nur durch die direkte Feldapplikation mit Hilfe von Elektroden erzielt werden, deren Einsatz jedoch mit elektrochemisch bedingten Nebenwirkungen verbunden ist. Diese sind insbesondere während der elektrischen Stimulation von neuronalem Gewebe problematisch. Man muss daher einen Kompromiss zwischen positiven Heilungserfolgen und den unvermeidlichen Nebenwirkungen finden und das für die Stimulation eingesetzte Elektrodensystem charakterisieren.

Kommerziell erhältliche Mikroelektroden für die tiefe Hirnstimulation und in unserem Labor präparierte Platinelektroden für die Stimulation von Zellkulturen wurden mit verschiedenen elektrischen und numerischen Methoden untersucht und verglichen. Das ermöglichte, Ursache und Größenordnung von bekannten, aber unerwünschten Nebeneffekten wie Nekrosen in Elektrodennähe zu klären sowie detaillierte Angaben zur effektiven Feldstärke und Feldverlauf in der Zellebene zu machen. Verschiedene Kriterien zur Auswahl geeigneter Elektrodenmaterialien und Elektrodengeometrien wurden diskutiert. Außerdem konnte erstmalig gezeigt werden, dass insbesondere das Verhalten von Mikroelektroden durch Alterung und Korrosion beeinflusst wird. Diese Tatsache kann das in der Praxis der Langzeitstimulation notwendige Anpassen der Stimulationsparameter erklären.

Die längste Geschichte in der klinischen Anwendung der Elekrostimulation hat die Behandlung von Knochenbrüchen. Die Basis dafür liegt in der Existenz von belastungsabhängigen elektrischen Potentialen im Knochen. Die zellulären Wirkungsmechanismen sind jedoch unverstanden.

Um zu untersuchen, ob und wie elektrische Felder Wachstum und Differenzierung von Knochenzellen beeinflussen, wurden humane Osteosarcomazellen (HOS TE85) und aus Minischweinen isolierte primäre Osteoblasten mit elektrischen Feldern im Frequenzbereich von 0.1 Hz bis 100 kHz befeldet und verschiedene zelluläre Parameter wie die Konzentration von intrazellulärem Kalzium, der zyklischen Nukleotide cAMP und cGMP, der Redoxzustand der Zelle, die Freisetzung von Prostaglandin E2 (PGE 2 ), die Translokation der mitogen-aktivierten Proteinkinase (MAPK) sowie Wachstum und Differenzierung zeitabhängig gemessen.

Es konnte gezeigt werden, dass elektrische Felder das Signalsystem und den Stoffwechsel von Knochenzellen im gesamten untersuchten Frequenzbereich beeinflussen. Die Richtung des Nettoeffekts war jedoch im oberen und im unteren Frequenzbereich unterschiedlich. Im Frequenzbereich über 1 kHz fanden wir immer eine Erhöhung des Wachstums und der Konzentration der „second messenger“ und einen verzögerten Anstieg der Aktivität der alkalischen Phosphatase (ALP) bzw. eine Herabsetzung der Nitrit- und H2O2-Konzentration. Bei Frequenzen unter 1 kHz wurde dagegen Hemmung des Wachstums bei gleichzeitiger Erhöhung der ALP-Aktivität und des oxidativen Stress beobachtet. Da alle zellulären Parameter an einem einheitlichen System gemessen wurden, ließen sich die Ergebnisse in ein Schema zur Wirkungsweise elektrischer Felder integrieren.

Die Untersuchungen zeigten, dass die Erhöhung der intrazellulären Kalziumkonzentration ein genereller Mechanismus der Feldwirkung ist. Dafür ist sowohl der Influx als auch die Freisetzung von Kalzium aus intrazellulären Speichern verantwortlich. Es konnte weiterhin gezeigt werden, dass auch cGMP, jedoch nicht cAMP an der Vermittlung der Feldwirkung beteiligt ist. Außerdem wurde die PGE 2 -Freisetzung geringfügig erhöht und die Translokation der MAPK sowohl positiv als auch negativ beeinflusst. Prinzipiell muss man von einem gemeinsamen Effekt mehrerer Signalwege ausgehen.

Die Feldwirkung auf Osteosarcomazellen ist grundsätzlich stärker ausgeprägt als auf primäre Osteoblasten. Vergleichsmessungen an der Fibroblasten-Zelllinie L929 demonstrierten, dass die beobachteten Effekte nicht spezifisch für Knochenzellen sind. Nach elektrischer Stimulation dreidimensionaler Zellverbände, die als Osteocytenmodell dienen können, wurden gegenüber der Monolayerkultur geringere Effekte auf die Proliferation und stärkere Effekte auf die Differenzierung beobachtet. Das lässt darauf schließen, dass durch die Feldwirkung undifferenzierte Zellen bevorzugt zur Teilung stimuliert werden, bei differenzierten Zellen wird jedoch die Matrixbildung gefördert.

Durch den Einsatz verschiedener Synchronisationsmethoden konnten HOS TE85 in einzelnen Zellzyklusphasen gezielt angereichert werden und die Abhängigkeit der Zellreaktion vom Zellstatus untersucht werden. Wir fanden, dass intrazelluläre Kalziumsignale bevorzugt während der frühen S-Phase als Reaktion auf ein äußeres Feld ausgelöst werden. Ein verstärkter Einfluss auf die [Seite 2↓]Proliferation trat jedoch nur auf, wenn Zellen der G0-Phase stimuliert und dadurch für den Wiedereintritt in den Zellzyklus rekrutiert wurden. Für einen an Zellpopulationen messbaren und anhaltenden Stimulationseffekt scheinen daher das Zusammenspiel von Zellen verschiedener Phasen und die Verstärkung des Signals durch parakrine Mechanismen notwendig zu sein. Der Effekt könnte überdies durch wiederholte Stimulation verstärkt werden. Für eine optimale Wirkung müsste einmal pro Zellzyklus, d.h. täglich, stimuliert werden. Außerdem erschließt die gegensätzliche Wirkung von Feldern oberhalb bzw. unterhalb 1 kHz in der therapeutischen Anwendung die Möglichkeit, die Richtung, in der das Knochengewebe beeinflusst wird, zu kontrollieren.

Aufgrund der ausgeprägten Gemeinsamkeiten zwischen den hier vorliegenden Ergebnissen der Wirkung elektrischer Felder und in der Literatur beschriebenen Wirkungen der mechanischen Stimulation könnten diese Ergebnisse die elektrokinetische Hypothese zur Feldwirkung unterstützen.

Inhaltsverzeichnis

Tabellen

Bilder



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08.06.2004