Elektrische Stimulation von Zellen und Geweben am besonderen Beispiel von Knochenzellen

Dissertation

zur Erlangung des akademischen Grades
doctor rerum naturalium
(Dr. rer. nat.)

im Fach Biophysik

eingereicht an der
Mathematisch-Naturwissenschaftlichen Fakultät I
der Humboldt-Universität zu Berlin

von Diplom-Biophysikerin Beate Habel

geboren am 10.8.1971 in Gera

Präsident der Humboldt-Universität zu Berlin:
Prof. Dr. Jürgen Mlynek

Dekan: Prof. Dr. Michael Linscheid

Gutachter:
1. Prof. Dr. R. Glaser
2. Prof. Dr. A. Herrmann
3. Prof. Dr. U. Zimmermann

Tag der mündlichen Prüfung: 1. April 2004

Bibliografische Beschreibung und Referat

Elektrische Stimulation von Zellen und Geweben am besonderen Beispiel von Knochenzellen

124 Seiten, 100 Abbildungen und 13 Tabellen

Beate Habel, 2004, Berlin, Humboldt-Universität zu Berlin, Dissertation

Abstract – Deutsch

Die Basis für den therapeutischen Einsatz elektrischer Felder bei der Behandlung von Knochenbrüchen liegt in der Existenz von belastungsabhängigen elektrischen Potentialen im Knochen. Die zellulären Wirkungsmechanismen sind jedoch unverstanden. Um zu untersuchen, ob und wie elektrische Felder Wachstum und Differenzierung von Knochenzellen beeinflussen, wurden humane Osteosarcomazellen (HOS TE85) und aus Minischweinen isolierte primäre Osteoblasten mit elektrischen Feldern im Frequenzbereich von 0.1 Hz bis 100 kHz befeldet und verschiedene zelluläre Parameter zeitabhängig gemessen.

Das elektrische Feld wurde mittels platinierten Platinelektroden appliziert, um ausreichend hohe Feldstärken bei gleichzeitig guter Kontrolle über die im Gewebe erzeugte Wellenform zu gewährleisten. Beim Einsatz von Elektroden müssen jedoch elektrochemische Reaktionen an der Elektrodenoberfläche berücksichtigt werden. Daher wurden verschiedene Elektroden für die in vivo- und in vitro-Stimulation mit elektrischen und numerischen Methoden untersucht und verglichen. Das führte einerseits zur Erarbeitung verschiedener Kriterien zur Auswahl geeigneter Elektrodenmaterialien und –geometrien. Andererseits konnten detaillierte Angaben zur effektiven Feldstärke und Feldverlauf in der Zellebene sowie zu elektrochemisch bedingten Nebenwirkungen gemacht werden.

Es konnte gezeigt werden, dass elektrische Felder das Signalsystem und den Stoffwechsel von Knochenzellen im gesamten untersuchten Frequenzbereich beeinflussen. Die Richtung des Nettoeffekts war jedoch im oberen und im unteren Frequenzbereich unterschiedlich. Im Frequenzbereich über 1 kHz fanden wir immer eine Erhöhung des Wachstums und der Konzentration der „second messenger“ und eine Herabsetzung der Konzentration der reaktiven Sauerstoffverbindungen (ROS). Bei Frequenzen unter 1 kHz wurde dagegen eine Erhöhung der Aktivität der alkalischen Phosphatase und des oxidativen Stress beobachtet. Signifikante Effekte traten jedoch nur bei Feldstärken oberhalb 100 V/m auf. Hinweise auf bevorzugte Frequenzen oder Wellenformen, die für „Fenstereffekte“ sprechen würden, konnten nicht gefunden werden.

Da alle zellulären Parameter an einem einheitlichen System gemessen wurden, ließen sich die Ergebnisse in ein Modell der feldinduzierten Signaltransduktion integrieren. Prinzipiell muss man von einem gemeinsamen Effekt mehrerer Signalwege ausgehen. Dabei kann die Erhöhung der intrazellulären Kalziumkonzentration als ein genereller Mechanismus der Feldwirkung angesehen werden. Dafür sind sowohl der Influx als auch die Freisetzung von Kalzium aus intrazellulären Speichern verantwortlich. Es konnte weiterhin gezeigt werden, dass auch cGMP und Prostaglandin E ₂, jedoch nicht cAMP an der Vermittlung der Feldwirkung beteiligt ist. Außerdem wurde die Translokation der mitogen-aktivierten Proteinkinase (MAPK) beeinflusst.

Trotzdem sind die beobachteten Effekte relativ schwach im Vergleich zu publizierten klinischen Erfolgen. Es muss daher in vivo Verstärkungsmechanismen geben, die durch Untersuchungen an Zellkulturen nicht erfasst werden können.

Eigene Schlagworte: Elektrische Stimulation, Knochen, Osteoblasten, Kalzium, Proliferation, Signaltransduktion, Elektroden, Alkalische Phosphatase, MAPK

Abstract – Englisch

The therapeutic use of electric fields in the treatment bone fracture healing is based on the existence of different load dependent electric potentials in bone. However, the cellular mechanisms of field action are still not understood. We investigated the effect of electric fields on proliferation and differentiation of human osteosarcoma cells (HOS TE85) and primary osteoblasts isolated from mini pigs. The cells were exposed to electric fields (0.1 Hz - 100 kHz) and various cellular parameters were measured.

The field was applied using platinized platinum electrodes ensuring sufficiently strong electric fields and a well controlled wave form in the tissue. Nevertheless, in this case electrochemical reactions which occur at the electrode surface have to be taken into account. That’s why various electrodes for in vivo and in vitro stimulation are characterized by electrical and numerical methods leading not only to criteria for choosing electrode materials and geometries, but also providing detailed knowledge about the electric field induced in the tissue and electrochemically induced side effects.

We found that cellular signaling as well as proliferation and differentiation of bone cells are influenced by electric fields in the whole investigated frequency range. Proliferation and the second messenger concentrations are increased at frequencies above 1 kHz, whereas below 1 kHz the alkaline phosphatase activity is increased. Significant effects were found only for electric fields above 100 V/m, but we could not find any hints on preferred frequencies or wave forms ruling out “window effects”.

Because all cellular parameters were measured within one experimental system, the results can be summarized in a signal transduction model for the action of electric fields. Generally, a common action of multiple signaling pathways has to be assumed. The increase of the intracellular calcium concentration can be considered as a general mechanism of field action. This increase is caused by calcium release from intracellular calcium stores as well as influx of extracellular calcium. Additionally, the concentration of cGMP and prostaglandin E2, but not that of cAMP is increased by the electric field. Furthermore, the translocation of the mitogen activated protein kinase (MAPK) is influenced.

Nevertheless, the field effects found are weak compared to those published in clinical studies. We suppose that there are amplifying mechanisms in vivo which could not be seen during in vitro investigations.

Keywords: Electric stimulation, bone, osteoblasts, calcium, proliferation, signal transduction, electrodes, alkaline Phosphatase, MAPK

[Seite 1↓]Zusammenfassung

Ausreichend hohe Feldstärken für die elektrische Stimulation und eine gute Kontrolle über die Wellenform können nur durch die direkte Feldapplikation mit Hilfe von Elektroden erzielt werden, deren Einsatz jedoch mit elektrochemisch bedingten Nebenwirkungen verbunden ist. Diese sind insbesondere während der elektrischen Stimulation von neuronalem Gewebe problematisch. Man muss daher einen Kompromiss zwischen positiven Heilungserfolgen und den unvermeidlichen Nebenwirkungen finden und das für die Stimulation eingesetzte Elektrodensystem charakterisieren.

Kommerziell erhältliche Mikroelektroden für die tiefe Hirnstimulation und in unserem Labor präparierte Platinelektroden für die Stimulation von Zellkulturen wurden mit verschiedenen elektrischen und numerischen Methoden untersucht und verglichen. Das ermöglichte, Ursache und Größenordnung von bekannten, aber unerwünschten Nebeneffekten wie Nekrosen in Elektrodennähe zu klären sowie detaillierte Angaben zur effektiven Feldstärke und Feldverlauf in der Zellebene zu machen. Verschiedene Kriterien zur Auswahl geeigneter Elektrodenmaterialien und Elektrodengeometrien wurden diskutiert. Außerdem konnte erstmalig gezeigt werden, dass insbesondere das Verhalten von Mikroelektroden durch Alterung und Korrosion beeinflusst wird. Diese Tatsache kann das in der Praxis der Langzeitstimulation notwendige Anpassen der Stimulationsparameter erklären.

Die längste Geschichte in der klinischen Anwendung der Elekrostimulation hat die Behandlung von Knochenbrüchen. Die Basis dafür liegt in der Existenz von belastungsabhängigen elektrischen Potentialen im Knochen. Die zellulären Wirkungsmechanismen sind jedoch unverstanden.

Um zu untersuchen, ob und wie elektrische Felder Wachstum und Differenzierung von Knochenzellen beeinflussen, wurden humane Osteosarcomazellen (HOS TE85) und aus Minischweinen isolierte primäre Osteoblasten mit elektrischen Feldern im Frequenzbereich von 0.1 Hz bis 100 kHz befeldet und verschiedene zelluläre Parameter wie die Konzentration von intrazellulärem Kalzium, der zyklischen Nukleotide cAMP und cGMP, der Redoxzustand der Zelle, die Freisetzung von Prostaglandin E_{2 (PGE 2 )}, die Translokation der mitogen-aktivierten Proteinkinase (MAPK) sowie Wachstum und Differenzierung zeitabhängig gemessen.

Es konnte gezeigt werden, dass elektrische Felder das Signalsystem und den Stoffwechsel von Knochenzellen im gesamten untersuchten Frequenzbereich beeinflussen. Die Richtung des Nettoeffekts war jedoch im oberen und im unteren Frequenzbereich unterschiedlich. Im Frequenzbereich über 1 kHz fanden wir immer eine Erhöhung des Wachstums und der Konzentration der „second messenger“ und einen verzögerten Anstieg der Aktivität der alkalischen Phosphatase (ALP) bzw. eine Herabsetzung der Nitrit- und H₂O₂-Konzentration. Bei Frequenzen unter 1 kHz wurde dagegen Hemmung des Wachstums bei gleichzeitiger Erhöhung der ALP-Aktivität und des oxidativen Stress beobachtet. Da alle zellulären Parameter an einem einheitlichen System gemessen wurden, ließen sich die Ergebnisse in ein Schema zur Wirkungsweise elektrischer Felder integrieren.

Die Untersuchungen zeigten, dass die Erhöhung der intrazellulären Kalziumkonzentration ein genereller Mechanismus der Feldwirkung ist. Dafür ist sowohl der Influx als auch die Freisetzung von Kalzium aus intrazellulären Speichern verantwortlich. Es konnte weiterhin gezeigt werden, dass auch cGMP, jedoch nicht cAMP an der Vermittlung der Feldwirkung beteiligt ist. Außerdem wurde die PGE ₂ -Freisetzung geringfügig erhöht und die Translokation der MAPK sowohl positiv als auch negativ beeinflusst. Prinzipiell muss man von einem gemeinsamen Effekt mehrerer Signalwege ausgehen.

Die Feldwirkung auf Osteosarcomazellen ist grundsätzlich stärker ausgeprägt als auf primäre Osteoblasten. Vergleichsmessungen an der Fibroblasten-Zelllinie L929 demonstrierten, dass die beobachteten Effekte nicht spezifisch für Knochenzellen sind. Nach elektrischer Stimulation dreidimensionaler Zellverbände, die als Osteocytenmodell dienen können, wurden gegenüber der Monolayerkultur geringere Effekte auf die Proliferation und stärkere Effekte auf die Differenzierung beobachtet. Das lässt darauf schließen, dass durch die Feldwirkung undifferenzierte Zellen bevorzugt zur Teilung stimuliert werden, bei differenzierten Zellen wird jedoch die Matrixbildung gefördert.

Durch den Einsatz verschiedener Synchronisationsmethoden konnten HOS TE85 in einzelnen Zellzyklusphasen gezielt angereichert werden und die Abhängigkeit der Zellreaktion vom Zellstatus untersucht werden. Wir fanden, dass intrazelluläre Kalziumsignale bevorzugt während der frühen S-Phase als Reaktion auf ein äußeres Feld ausgelöst werden. Ein verstärkter Einfluss auf die [Seite 2↓]Proliferation trat jedoch nur auf, wenn Zellen der G₀-Phase stimuliert und dadurch für den Wiedereintritt in den Zellzyklus rekrutiert wurden. Für einen an Zellpopulationen messbaren und anhaltenden Stimulationseffekt scheinen daher das Zusammenspiel von Zellen verschiedener Phasen und die Verstärkung des Signals durch parakrine Mechanismen notwendig zu sein. Der Effekt könnte überdies durch wiederholte Stimulation verstärkt werden. Für eine optimale Wirkung müsste einmal pro Zellzyklus, d.h. täglich, stimuliert werden. Außerdem erschließt die gegensätzliche Wirkung von Feldern oberhalb bzw. unterhalb 1 kHz in der therapeutischen Anwendung die Möglichkeit, die Richtung, in der das Knochengewebe beeinflusst wird, zu kontrollieren.

Aufgrund der ausgeprägten Gemeinsamkeiten zwischen den hier vorliegenden Ergebnissen der Wirkung elektrischer Felder und in der Literatur beschriebenen Wirkungen der mechanischen Stimulation könnten diese Ergebnisse die elektrokinetische Hypothese zur Feldwirkung unterstützen.

Inhaltsverzeichnis

• 1  Einleitung
  • 1.1 Das Knochengewebe
    • 1.1.1  Knochenstruktur und „Bone Remodeling“
    • 1.1.2 Existenz und Charakteristik von Potentialdifferenzen im Knochen
    • 1.1.3  Mögliche Mechanismen des „Bone Remodeling“
    • 1.1.4 Therapeutische Anwendung elektromagnetischer Stimulation
    • 1.1.5 Signalwege im Knochen
    • 1.1.6 Stand der Forschung zur Elektrostimulation von Knochen
  • 1.2 Praktische Probleme bei der Elektrostimulation
    • 1.2.1  Applikationsart und Wellenform
    • 1.2.2 Polarisation an den Elektroden
    • 1.2.3  Elektrochemische Reaktionen an der Grenzfläche Elektrode-Elektrolyt
    • 1.2.4 Elektrostimulation von neuronalem Gewebe
  • 1.3 Wirkungsweise von Feldern im biologischen Material
    • 1.3.1 Elektrisches und magnetisches Feld
    • 1.3.2 Energetische Überlegungen
• 2  Zielstellung
• 3  Material und Methoden
  • 3.1 Zellbiologische Methoden
    • 3.1.1 Zellkultur
      • 3.1.1.1 Das Zellmaterial
      • 3.1.1.2 3D-Kultur (Eingebettete Zellen)
      • 3.1.1.3 Synchronisation der Zellen
      • 3.1.1.4  Zellzyklus-Analyse mittels Durchflusszytometrie (FACS)
      • 3.1.1.5  Untersuchung der Zellgröße
      • 3.1.1.6  Untersuchung der interzellulären Kopplung mittels Farbstofftransfer
    • 3.1.2 Einzelzell- Fluoreszenzmikroskopie
      • 3.1.2.1 ATTOFLUOR
      • 3.1.2.2  UV-Dosimetrie
      • 3.1.2.3 Untersuchung der Mitogen aktivierten Proteinkinase
    • 3.1.3 Fluorometrische und spektrometrische Untersuchungen von Zellpopulationen
      • 3.1.3.1 Vorbereitung der Zellen
      • 3.1.3.2 Bestimmung der Aktivität der Alkalischen Phosphatase (ALP)
      • 3.1.3.3 Untersuchung des Proliferationsverhaltens
      • 3.1.3.4 Extrazelluläre Bestimmung der Nitrit/Nitrat-Konzentration
      • 3.1.3.5 Extrazelluläre Bestimmung der Wasserstoffperoxid-Konzentration
      • 3.1.3.6 Immunometrische Bestimmung der Konzentration von cAMP, cGMP und PGE2
  • 3.2 Applikation der elektrischen Felder
    • 3.2.1 Platinisieren der Elektroden
    • 3.2.2  Messkammern und Elektrodensysteme
      • 3.2.2.1  Elektroden zur Stimulation von Zellkulturen
      • 3.2.2.2 Mikroelektroden für die tiefe Hirnstimulation
    • 3.2.3 Untersuchung der Elektrodeneigenschaften
      • 3.2.3.1 Rasterelektronenmikroskopische Untersuchungen
      • 3.2.3.2 Strom-Spannungskennlinie
      • 3.2.3.3 Impedanzspektroskopie
      • 3.2.3.4 Numerische Modellierung des Feldverlaufs
    • 3.2.4 Befeldungsprotokoll
      • 3.2.4.1  Beobachtung auf Einzelzellniveau
      • 3.2.4.2 Untersuchung von Zellpopulationen
  • 3.3 Versuchsplanung und Auswertung
• 4  Technische Ergebnisse – Eigenschaften der Elektroden
  • 4.1  Charakterisierung von Elektroden für die Stimulation von Zellkulturen
    • 4.1.1 Strom-Spannungskurve der Elektroden
    • 4.1.2 Analyse des Eingangssignals
    • 4.1.3  Impedanzspektroskopie zur Untersuchung des frequenzabhängigen Verhaltens der Elektroden
    • 4.1.4  Modellierung der räumlichen Feldverteilung
    • 4.1.5 Strom-Spannungskurve der Mikroelektroden
    • 4.1.6  Analyse des Eingangssignals
    • 4.1.7 Impedanzspektroskopie zur Untersuchung des frequenzabhängigen Verhaltens der Mikroelektroden
    • 4.1.8  Modellierung der räumlichen Feldverteilung
    • 4.1.9  Alterung und Korrosion von Elektroden
• 5  Zellbiologische Ergebnisse – Wirkung elektrischer Felder auf zelluläre Parameter von Knochenzellen
  • 5.1  Die intrazelluläre Kalziumkonzentration
    • 5.1.1  Beeinflussung der Messung durch die UV-Empfindlichkeit der Zellen
      • 5.1.1.1  UV-Empfindlichkeit von Osteosarcoma- Zellen
      • 5.1.1.2 UV-Empfindlichkeit von Osteoblasten
      • 5.1.1.3 Abhängigkeit der UV-Empfindlichkeit vom individuellen Zustand der Zellen
    • 5.1.2  Wirkung niederfrequenter gepulster elektrischer Felder auf Osteosarcomazellen
    • 5.1.3 Wirkung niederfrequent modulierter, elektrischer Hochfrequenzfelder auf Osteosarcomazellen
    • 5.1.4  Elektrische Stimulation von synchronisierten Osteosarcomazellen
    • 5.1.5  Elektrische Stimulation von Osteoblasten
  • 5.2 Der Redoxstatus
    • 5.2.1 Intrazelluläre Messungen des Redoxstatus an Einzelzellen
      • 5.2.1.1 Der Einfluss gepulster elektrischer Felder auf den Redoxstatus von Osteosarcomazellen
      • 5.2.1.2 Der Einfluss sinusförmiger elektrischer Felder auf den Redoxstatus von Osteosarcomazellen
    • 5.2.2 Bestimmung der H2O2-Produktion durch extrazelluläre Messungen an Zellpopulationen
      • 5.2.2.1 Stimulation von Zellpopulationen durch niederfrequente Felder
      • 5.2.2.2 Stimulation von Zellpopulationen durch hochfrequente Wechselfelder
    • 5.2.3 Bestimmung der NO-Produktion durch extrazelluläre Messungen an Zellpopulationen
      • 5.2.3.1 Stimulation von HOS- Zellpopulationen durch niederfrequente Felder
      • 5.2.3.2  Stimulation von Zellpopulationen durch hochfrequente Wechselfelder
    • 5.2.4 Zellfreie Versuche
  • 5.3 Die Konzentration der zyklischen Nukleotide
  • 5.4 Die Konzentration von Prostaglandin E2
  • 5.5 Die Translokation der Mitogen-aktivierten Proteinkinase
  • 5.6  Die Beeinflussung des Proliferationsverhaltens
    • 5.6.1 Stimulation von HOS-Zellpopulationen durch niederfrequente Felder
      • 5.6.1.1 Unsynchronisierte Zellpopulationen von HOS TE85
      • 5.6.1.2  In spezifischen Zyklusphasen synchronisierte Zellpopulationen von HOS TE85
      • 5.6.1.3 In Gel eingebettete HOS TE85
    • 5.6.2 Stimulation von Zellpopulationen durch hochfrequente Wechselfelder
      • 5.6.2.1  Unsynchronisierte Zellpopulationen von HOS TE85
      • 5.6.2.2 In spezifischen Zyklusphasen synchronisierte Zellpopulationen von HOS TE85
      • 5.6.2.3 In Gel eingebettete HOS TE85
      • 5.6.2.4 Primäre Osteoblasten in 2D- und 3D-Kultur
      • 5.6.2.5 Stimulation von L929 Fibroblasten
    • 5.6.3 Behandlung von HOS TE85 mit konditioniertem Medium
  • 5.7 Die Beeinflussung der ALP-Aktivität
    • 5.7.1 Stimulation von HOS- Zellpopulationen durch niederfrequente Felder
      • 5.7.1.1 Unsynchronisierte Zellpopulationen von HOS TE85
      • 5.7.1.2 In spezifischen Zyklusphasen synchronisierte Zellpopulationen von HOS TE85
      • 5.7.1.3 In Gel eingebettete HOS TE85
    • 5.7.2  Stimulation von Zellpopulationen durch hochfrequente Wechselfelder
      • 5.7.2.1 Unsynchronisierte Zellpopulationen von HOS TE85
      • 5.7.2.2 In spezifischen Zyklusphasen synchronisierte Zellpopulationen von HOS TE85
      • 5.7.2.3 In Gel eingebettete HOS TE85
      • 5.7.2.4 Primäre Osteoblasten in 2D- und 3D-Kultur
    • 5.7.3 Behandlung von HOS TE85 mit konditioniertem Medium
  • 5.8 Korrelation von Feldwirkung und Frequenz
  • 5.9 Zusammenfassung der zellbiologischen Ergebnisse
• 6  Diskussion
  • 6.1  Eigenschaften der Stimulationselektroden
    • 6.1.1 Die Strom-Spannungs-Kennlinie ist nicht-linear
    • 6.1.2 Das Verhalten der Elektroden in der Frequenzdomäne
    • 6.1.3 Räumliche Verteilung des Feldes
    • 6.1.4  Der Einfluss von Alterung und Korrosion auf das Elektrodenverhalten
  • 6.2  Der Einfluss elektrischer Stimulation auf das Signalsystem von Knochenzellen – Integration der Ergebnisse in ein Modell
    • 6.2.1 Elektrisches Feld bewirkt Erhöhung der intrazellulären Kalziumkonzentration
    • 6.2.2 Feldeffekt beteiligt Influx extrazellulären Kalziums und Kalziumfreisetzung aus intrazellulären Speichern
    • 6.2.3  Durch die Fluoreszenzanregung von Fura-2 werden die beladenen Zellen einer relevanten UVA-Strahlungsdosis ausgesetzt
    • 6.2.4  Feldeinfluss reduziert UV-bedingten Anstieg der intrazellulären Kalziumkonzentration
    • 6.2.5 ROS-Konzentrationen sind mit Frequenz korreliert
    • 6.2.6 ROS-Artefakte durch Elektroden im ELF-Bereich
    • 6.2.7  Feldeffekt auf cGMP und PGE2, jedoch nicht auf cAMP
    • 6.2.8 Transiente Aktivierung der MAPK
  • 6.3  Der Einfluss elektrischer Stimulation auf Proliferation und Differenzierung
    • 6.3.1 Proliferation und ALP-Aktivität sind mit Stimulationsfrequenz korreliert
    • 6.3.2 Konditioniertes Medium wirkt entgegengesetzt zu elektrischem Feld
  • 6.4 Abhängigkeit der Feldwirkung vom Zellstadium
  • 6.5  Mögliche Mechanismen der Feldwirkung
• Literaturverzeichnis
• Anhang
• Danksagung
• Lebenslauf
• Publikationen und Tagungsbeiträge
• Eidesstattliche Erklärung

Tabellen

• Tab. 1-1 Vor- und Nachteile der verschiedenen Methoden, ein elektrisches Feld im Gewebe zu erzeugen
• Tab. 1-2 Gleichgewichtspotentiale für ausgewählte Elektrodenreaktionen bei pH 7.0, 25°C. (↑) bedeutet Gasentwicklung [153].
• Tab. 1-3 Maximale Umsatzrate für die Entwicklung von Gas bzw. H+/OH- an Pt/schwarz-Elektroden, Annahme Cl2-Ausbeute 50%, O2-Ausbeute 50%, Frequenz 1 Hz, Stromstärke wie im Experiment.
• Tab. 3-1 Relative Variationskoeffizienten für die Messungen in Multiwellplatten. Angegeben sind systematische Abweichungen CVsyst (Mehrfachbestimmung an einer Probe), methodische Abweichungen CVmeth (zwischen verschiedenen Proben identischer Konzentration) und eine mittlere Abweichung CVmittel , die sich aus den beiden ersten Werten zusammensetzt.
• Tab. 4-1 Anpassung der Parameter des CPE für verschiedene Mikroelektroden und für Pt/schwarz-Elektroden.
• Tab. 4-2 Elektrische Feldstärke in der Messkammer von Pt/schwarz-Elektroden (Elektroden Ø 0.5 mm, Leitfähigkeit des Mediums 1.5 S/m, Elektrodenpotential wie im Experiment).
• Tab. 4-3 Einzelwerte für Geometriefaktor und Elektrodenparameter.
• Tab. 5-1 Zusammenfassung der signifikanten Veränderungen in verschiedenen Messparametern unter dem Einfluss elektrischer Felder. (+) Erhöhung, (-) Hemmung, (0) kein Effekt.
• Tab. 6-1 Schema zu Feld- und Messparametern für Untersuchungen an Einzelzellen in Monolayerkultur.
• Tab. 6-2 Schema zu Feld- und Messparametern für Untersuchungen an Zellpopulationen von HOS TE85 in Monolayerkultur.
• Tab. 6-3 Schema zu Feld- und Messparametern für Untersuchungen an Zellpopulationen von HOS TE85 in dreidimensionaler Kultur.
• Tab. 6-4 Schema zu Feld- und Messparametern für Untersuchungen an Zellpopulationen von primären OB in dreidimensionaler Kultur.
• Tab. 6-5 Schema zu Feld- und Messparametern für Untersuchungen an Zellpopulationen von primären OB in Monolayerkultur.

Bilder

• Abb. 1-2 Elektrische Stimulation durch Konstantspannung bzw. durch Konstantstrom bewirken verschiedene Verläufe der elektrischen Feldstärke im Gewebe.
• Abb. 1-3 Ersatzschaltbild der Phasengrenze Elektrode/Elektrolyt
• Abb. 1-4 Modifiziertes CPE.
• Abb. 1-5 Abschätzung der chemischen Arbeit an Anode (links) und Kathode (rechts). Umsatz nach Faraday-Gesetz, Annahme Cl2-Ausbeute 50%, O2-Ausbeute 50%, Frequenz 1 Hz für 30 min. Schwarzer Pfeil markiert verwendete Stromstärke bei U=1.5V an Pt/schwarz-Elektroden.
• Abb. 1-6 Röntgenaufnahme eines menschlichen Kopfes mitbilateral implantierten Mikroelektroden
• Abb. 3-1 Rasterelektronenmikroskopische Abbildungen von HOS TE85 (oben) und primären Osteoblasten aus dem Mini-Schwein (unten) in Monolayerkultur, Balken 10 µm.
• Abb. 3-2 Wachstumsverhalten von HOS nach 3, 5 und 7 Tagen, eingebettet in Collagengel. (Balken entspricht 50 µm)
• Abb. 3-3 Durchlicht- und Fluoreszenzaufnahmen von HOS. Links: im Gel, rechts: in Monolayer. (Balken entspricht 50 µm)
• Abb. 3-4 Verteilungen der Propidiumiodid-Fluoreszenz in Populationen von HOS-TE85 nach Synchronisation
• Abb. 3-5 Beispielkurven zur DNA- Analyse: (A) FSC- SSC- Plot, im Zentrum die normale Zellpopulation; (B) Histogramm- Plot für die beobachtete Propidiumiodid-Fluoreszenzintensität, dargestellt ist die Lage der Subpopulationen
• Abb. 3-6 Nachweis von Zell-Zell-Kontakten durch Calceintransfer aus einer Donorzelle (jeweils die hellste Zelle ungefähr im Zentrum des Bildes) in benachbarte Zellen. Nach 1 h beginnen die Anheftung der Zellen und die Ausbreitung des Farbstoffs (A), nach 6h hat der Farbstoff auch entfernt liegende Zellen erreicht (B, Bilder aus verschiedenen Ausschnitten). Dynamik des Calceintransfers in identischem Ausschnitt nach 2 h (C) und nach 2.5h (D). Die Pfeile weisen auf Zellen, die im 30-minütigen Beobachtungszeitraum zunehmend angefärbt wurden.
• Abb. 3-7 Schematische Darstellung des Attofluor- Messplatzes.
• Abb. 3-8 Rasterelektronenmikroskopische Aufnahmen der Platinbeschichtung. A: unbeschichtetes Platin (Balken 20 µm), B-D: Platinbeschichtung (Balken 10 µm, 2µm bzw. 1 µm).
• Abb. 3-9 Elektrodensysteme für die Stimulation von Zellkulturen. Für die Einzelzell-Fluoreszenzmikroskopie (a, b) und die Anwendung in Multiwellplatten (c) kamen verschiedene Anordnungen zum Einsatz (Erläuterungen im Text).
• Abb. 3-10 Schematische Darstellung verschiedener Geometrien von Mikroelektroden. (S – stacked, F – flat, E- extended, R – round, P – pencil)
• Abb. 3-11 Grafische Übersicht der verwendeten Befeldungsprotokolle für Messungen an Einzelzellen (links) und Zellpopulationen (rechts).
• Abb. 4-1 Strom-Spannungskennlinie (DC) von Pt/schwarz-Elektroden in PBS.
• Abb. 4-2 Frequenzabhängige Strom-Spannungskennlinien von Elektroden. Oben: verschiedene Elektroden in PBS + 10% FKS. A: besputterte Ti/Pt-Elektroden, Elektrodenabstand 0.5mm, B: Pt/schwarz-Elektroden, Elektrodenabstand 1cm. Unten: Pt/schwarz-Elektroden in verschiedenen Lösungen, Elektrodenabstand 0.5cm. C: in DMEM, D: in Zellkulturmedium (DMEM:HAM's F12 1:1, 10% FKS, Penicillin/Streptomycin).
• Abb. 4-3 Frequenzabhängigkeit der Konzentrationspolarisation, bestimmt aus dem Anfangsanstieg der Strom-Spannungskennlinien aus Abb. 4-4.2. Links: Pt/schwarz-Elektroden, Elektrodenabstand 0.5 cm in DMEM und Zellkulturmedium (DMEM:HAM's F12 1:1, 10% FKS, Penicillin/Streptomycin), rechts: Pt/schwarz-Elektroden, Elektrodenabstand 1 cm und besputterte Ti/Pt-Elektroden, Elektrodenabstand 0.5 mm in PBS + 10% FKS.
• Abb. 4-4 Amplitudenspektrum des für die Stimulation von Knochenzellkulturen verwendeten Rechteckpulses nach Fouriertransformation.
• Abb. 4-5 Impedanzspektren der verwendeten Elektroden. A: Pt/schwarz in NaCl-Lösung verschiedener Leitfähigkeit (A: 185.7 µS/cm, B: 510 µS/cm, C: 1.856 mS/cm, D: 32.9 mS/cm), B: Pt/schwarz in PBS+10%FKS, C: Ti/Pt, besputtert in PBS+10%FKS.
• Abb. 4-6 Gefittete Werte für den fraktalen Exponenten des CPE. Vergleich von kommerziellen Mikroelektroden (∅ 25 µm, 75 µm und 100 µm) und der verwendeten Pt/schwarz-Elektrode (∅ 0.5 mm).
• Abb. 4-7 Gefittete Werte für den fraktalen Exponenten des CPE in Abhängigkeit von der Leitfähigkeit einer NaCl-Lösung. Vergleich von kommerziellen Mikroelektroden (s.o.) und der verwendeten Pt/schwarz-Elektroden.
• Abb. 4-8 Spektren für Betrag und Phase der Impedanz von Pt/schwarz-Elektroden bei unterschiedlichen Offsetspannungen.
• Abb. 4-9 Gefittete Werte für Leitfähigkeit (G) und Kapazität (Q) des CPE der Pt/schwarz-Elektrode in Abhängigkeit von der Offsetspannung in Aqua dest.
• Abb. 4-10 Pulsform die von Pt/schwarz-Elektroden im Medium bei Anlegen einer rechteckförmigen Spannung erzeugt wird.
• Abb. 4-11 Räumliche Verteilung (Aufsicht) der elektrischen Feldstärke in der Messkammer (Elektroden Ø 0.5 mm, Leitfähigkeit des Mediums 1.5 S/m, Elektrodenpotential 1 V). Links: Messkammer für Beobachtungen auf Einzelzellniveau, Elektrodenabstand 1 cm. Rechts: Kavität einer 96well-Platte für Messungen von Zellpopulationen, Elektrodenabstand 5 mm.
• Abb. 4-12Strom-Spannungskennlinie von Pt/Ir Mikroelektroden in verschiedenen Elektrolyten.
• Abb. 4-13 Amplitudenspektrum des für die tiefe Hirnstimulation verwendeten Rechteckpulses nach Fouriertransformation.
• Abb. 4-14 Nyquistplot typischer Impedanzspektren in Abhängigkeit von der Elektrolytleitfähigkeit (Pt/Ir Elektrode, ø 75 µm; A: 115.8 µS/cm, B: 185.7 µS/cm, C: 510 µS/cm, D: 1.856 mS/cm, E: 32.9 mS/cm NaCl-Lösung)
• Abb. 4-15 Phasenwinkel und Betrag der Impedanz (Bodeplot) von Mikroelektroden (Pt/Ir-Elektrode, ø 75 µm) gemessen mit verschiedenen Offsetspannungen (DC Bias).
• Abb. 4-16 Vektorplot und Isolinien von elektrischer Feldstärke (Reihe A), elektrischem Potential (Reihe B) und Stromdichte (Reihe C) berechnet für die Elektrodengeometrie S75.
• Abb. 4-17 Zusammenhang zwischen Geometriefaktor und Elektrodenparametern.
• Abb. 4-18 Räumliche Verteilung der elektrischen Feldstärke in der Nähe von Elektroden verschiedener Geometrie. Die Linien entsprechen dem Bereich von 1 kV/m bzw. 5 kV/m im Medium (A und B haben verschiedene Maßstäbe, Balken 100 µm).
• Abb. 4-19Phasenwinkel der Impedanz in Abhängigkeit von der Eintauchzeit der Elektrode in Elektrolyt (A, B: Pt/Ir-Elektrode, C: Edelstahlelektrode). Erklärungen siehe Text.
• Abb. 4-20 Gefittete Werte für den fraktalen Exponenten und die Leitfähigkeit des CPE von verschiedenen Mikroelektroden (Ø 75 µm) in Abhängigkeit von der Inkubationszeit in Zellkulturmedium.
• Abb. 4-21 Räumliche Verteilung der Stromdichte direkt auf der Elektrodenoberfläche als Ergebnis der numerischen Modellierung (FIT).
• Abb. 4-22 Rasterelektronenmikroskopische Aufnahme einer neuen (obere Reihe) und gebrauchten (untere Reihe) Edelstahl-Mikroelektrode (Ø 100 µm). Die korrodierte Elektrode befand sich zuvor ca. 8h in ununterbrochener Benutzung. (A: Übersicht, Balken 300 µm, B: Elektrodenspitze, Balken 70 µm, C: metallische Oberfläche der Spitze, Balken, 5 µm, D: Oberfläche der Epoxy-Isolation, Balken, 20 µm)
• Abb. 5-1 Mikroskopische Durchlichtbilder von HOS TE85 während längerer Belichtung mit 334/380 nm.
• Abb. 5-2 Exemplarisches Verhalten der intrazellulären Kalziumkonzentration während der Versuchszeit. Man findet Peaks, Oszillationen, langsame und schnelle Anstiege mit anschließend erhöhter Kalziumkonzentration (von oben nach unten).
• Abb. 5-3 Prozentualer Anteil der reagierenden HOS TE85-Zellen an der Gesamtzellzahl in Abhängigkeit von der gesamten mittleren Strahlungsdosis während eines Versuches. Die durchgezogene Linie zeigt die sigmoide Kurvenanpassung mit dem dazugehörigen 95%-Vertrauensbereich (gestrichelte Linie, schwarz) und den 95%-Bereich der Gesamtpopulation (gestrichelte Linie, grau).
• Abb. 5-4 Prozentualer Anteil der reagierenden primären OB an der Gesamtzellzahl in Abhängigkeit von der gesamten mittleren Strahlungsdosis während eines Versuches. Die durchgezogene Linie zeigt die sigmoide Kurvenanpassung mit dem dazugehörigen 95%-Vertrauensbereich (gestrichelte Linie, schwarz) und den 95%-Bereich der Gesamtpopulation (gestrichelte Linie, grau).
• Abb. 5-5 Zeitlicher Verlauf der Stimulierbarkeit von synchronisierten HOS TE85 durch UVA (● 60kJ/m2), relativer Anteil an G2- (○) und G1-Phasen (Δ).
• Abb. 5-6 UV-Dosisabhängigkeit der Zellreaktion von synchronisierten HOS TE85 am G1/S-Übergang (● 0:00h) und nach Wiedereintritt in den Zellzyklus (○ 2:30h, S-Phase).
• Abb. 5-7 Auswertung der Kalziumkinetik von Einzelzellen. Links: Die Mediane der Zeitintervalle vor, während und nach Feldapplikation werden bestimmt; alle Einzelwerte liefern die oben gezeigten Histogramme. Rechts: Vergleich der Verteilungsform über Histogrammdarstellungen (oben) und Boxplots (unten). Der Boxplot ist ein Diagramm auf der Grundlage des Medians, der Quartile und der Extremwerte. Die Box stellt den Interquartilbereich (25-75%) mit 50% der Werte dar. Die von der Box ausgehenden Linien führen jeweils bis zum höchsten und niedrigsten Wert, ohne Ausreißer zu berücksichtigen. Die quer über die Box gelegte Linie gibt die Lage des Medians wieder.
• Abb. 5-8 Verteilung der intrazellulären Kalziumkonzentration von HOS TE85 nach der Applikation von PEMF verschiedener Feldstärke. Die Zellzahlen in jeder Versuchsgruppe (N) und die asymptotische Signifikanz (2-seitig) für Verteilungsunterschiede (U-Test) sind angegeben (p≶0.001 ***/+++, p≶0.01 **/++, p≶0.05 */+), wobei (*) während Feld gegen Kontrolle, (+) nach Feld gegen Kontrolle symbolisiert.
• Abb. 5-9 Verteilung der intrazellulären Kalziumkonzentration von HOS TE85 nach der Applikation von PEMF verschiedener Feldstärke und zusätzlichem oxidativen Stress. Die Zellzahlen in jeder Versuchsgruppe (N) und die asymptotische Signifikanz (2-seitig) für Verteilungsunterschiede (U-Test) sind angegeben (p<0.001 ***/+++, p<0.01 **/++, p<0.05 */+), wobei (*) während Feld gegen Kontrolle, (+) nach Feld gegen Kontrolle symbolisiert.
• Abb. 5-10 Die intrazelluläre Kalziumkonzentration von HOS TE85 ohne (-)/mit (+) zusätzlichem oxidativen Stress nach der Applikation von PEMF verschiedener Feldstärke in Relation zur Kontrolle. Aufgetragen sind die Mediane der Verteilungen aus Abb. 5-5.9 bzw. Abb. 5-5.8.
• Abb. 5-11 Verteilung der intrazellulären Kalziumkonzentration von HOS TE85 nach der Applikation von amplitudenmodulierten Sinusfeldern verschiedener Frequenz (durchschnittliche UVA- Dosis 15 kJ/m2). Die Zellzahlen in jeder Versuchsgruppe (N) und die asymptotische Signifikanz (2-seitig) für Verteilungsunterschiede (U-Test) sind angegeben (p<0.001 ***/+++, p<0.01 **/++, p<0.05 */+), wobei (*) während Feld gegen Kontrolle, (+) nach Feld gegen Kontrolle symbolisiert.
• Abb. 5-12 Verteilung der intrazellulären Kalziumkonzentration von HOS TE85 nach der Applikation von amplitudenmodulierten Sinusfeldern verschiedener Frequenz und erhöhter UVA- Belastung (durchschnittliche UVA- Dosis 30 kJ/m2). Die Zellzahlen in jeder Versuchsgruppe (N) und die asymptotische Signifikanz (2-seitig) für Verteilungsunterschiede (U-Test) sind angegeben (p<0.001 ***/+++, p<0.01 **/++, p<0.05 */+), wobei (*) während Feld gegen Kontrolle, (+) nach Feld gegen Kontrolle symbolisiert.
• Abb. 5-13 Die intrazelluläre Kalziumkonzentration von HOS TE85 mit normaler und erhöhter UVA-Belastung nach der Applikation von amplitudenmodulierten Sinusfeldern verschiedener Frequenz in Relation zur Kontrolle. Aufgetragen sind die Mediane der Verteilungen aus Abb. 5-5.12 bzw. Abb. 5-5.11.
• Abb. 5-14 Beispiele für Reaktionen synchronisierter Zellen auf Feldapplikation. Der Balken kennzeichnet das Befeldungsintervall. (D), (H), (L) in HANKS-Puffer mit 1mM EDTA, alle anderen in HANKS-Puffer mit 1mM CaCl2.
• Abb. 5-15 Zeitlicher Verlauf der Peakhäufigkeit und des S-Phasenanteils der Zellpopulation.
• Abb. 5-16 Zeitpunkt der maximalen Peakhäufigkeit in den verschiedenen Versuchsgruppen. K: Kontrolle, P10/100/200: unipolare Rechteckpulse mit 10/100/200V/m, Sin: unmodulierter Sinus 200V/m, Sin AM: amplitudenmodulierter Sinus 200V/m.
• Abb. 5-17 Mittlere maximale Peakhäufigkeit synchronisierter und unsynchronisierter Zellkulturen. Abkürzungen siehe Abb. 5-5.16.
• Abb. 5-18 Relative Häufigkeit von Zellen mit während des Versuchs unveränderter Kalziumkonzentration innerhalb einer Population von synchronisierten HOS-Zellen. Abkürzungen siehe Abb. 5-5.16.
• Abb. 5-19 Zeitlicher Verlauf der Peakhäufigkeit bei Applikation von Feldpulsen. Links: im Vergleich zu Kontrollen, rechts: in Abhängigkeit von extrazellulärem Kalzium.
• Abb. 5-20 Verteilung der intrazellulären Kalziumkonzentration von synchronisierten HOS TE85 nach der Feldapplikation. Legende siehe Abb. 5-5.16. Die Zellzahlen in jeder Versuchsgruppe (N) und die asymptotische Signifikanz (2-seitig) für Verteilungsunterschiede (U-Test) sind angegeben (p<0.001 ***/+++, p<0.01 **/++, p<0.05 */+), wobei (*) während Feld gegen Kontrolle, (+) nach Feld gegen Kontrolle symbolisiert.
• Abb. 5-21 Verteilung der intrazellulären Kalziumkonzentration von primären Osteoblasten nach der Applikation von PEMF verschiedener Feldstärke. Die asymptotische Signifikanz (2-seitig) für Verteilungsunterschiede (U-Test) sind angegeben (p<0.001 ***/+++, p<0.01 **/++, p<0.05 */+), wobei (*) während Feld gegen Kontrolle, (+) nach Feld gegen Kontrolle symbolisiert.
• Abb. 5-22 Verteilung der intrazellulären Kalziumkonzentration von primären Osteoblasten nach der Applikation von (amplitudenmodulierten) Sinusfeldern (durchschnittliche UVA- Dosis 15 kJ/m2). Die asymptotische Signifikanz (2-seitig) für Verteilungsunterschiede (U-Test) sind angegeben (p<0.001 ***/+++, p<0.01 **/++, p<0.05 */+), wobei (*) während Feld gegen Kontrolle, (+) nach Feld gegen Kontrolle symbolisiert.
• Abb. 5-23 Der Redoxzustand von HOS TE85 ohne (-)/mit (+) zusätzlichem oxidativen Stress nach der Applikation von PEMF verschiedener Feldstärke in Relation zur Kontrolle. Aufgetragen sind die Mediane der Verteilungen und deren Standardabweichung. Die Zellzahlen in jeder Versuchsgruppe (N) und die asymptotische Signifikanz (2-seitig) für Verteilungsunterschiede (U-Test) sind angegeben (p<0.001 ***/+++, p<0.01 **/++, p<0.05 */+), wobei (-) ohne zusätzlichen oxidativen Stress gegen Kontrolle, (+) mit zusätzlichem oxidativen Stress gegen Kontrolle symbolisiert.
• Abb. 5-24 Der Redoxzustand von HOS TE85 während und nach der Applikation von amplitudenmodulierten Sinusfeldern verschiedener Frequenz (durchschnittliche UVA- Dosis 30 kJ/m2). Die Zellzahlen in jeder Versuchsgruppe (N) und die asymptotische Signifikanz (2-seitig) für Verteilungsunterschiede (U-Test) sind angegeben (p<0.001 ***/+++, p<0.01 **/++, p<0.05 */+), wobei (*) während Feld gegen Kontrolle, (+) nach Feld gegen Kontrolle symbolisiert.
• Abb. 5-25 Zeitlicher Verlauf der Wasserstoffperoxid-Konzentration im Medium von primären Osteoblasten nach kapazitiv eingekoppelter Befeldung (16 Hz).
• Abb. 5-26 Relative H2O2-Produktion von HOS TE85 (HOS, n=5) nach Applikation direkt eingekoppelter niederfrequenter Puls- und Sinusfelder. Die Probenzahl in jeder Versuchsgruppe (N) und die asymptotische Signifikanz (2-seitig) für Verteilungsunterschiede (U-Test) sind angegeben (p<0.001 ***, p<0.01 **, p<0.05 *).
• Abb. 5-27 Relative H2O2-Produktion von primären Osteoblasten und HOS TE85 nach Applikation direkt eingekoppelter Sinusfelder. Die Probenzahl in jeder Versuchsgruppe (N) und die asymptotische Signifikanz (2-seitig) für Verteilungsunterschiede (U-Test) sind angegeben (p<0.001 ***, p<0.01 **, p<0.05 *).
• Abb. 5-28 Relative Nitritkonzentration im Zellkulturmedium von HOS direkt nach Stimulation mit niederfrequenten Feldern. Die Gruppen mit Zellen enthielten je 32 Proben, die Gruppen ohne Zellen enthielten je 16 Proben. Die Signifikanzen für Verteilungsunterschiede (U-Test) sind angegeben (p<0.001 ***, p<0.01 **, p<0.05 *).
• Abb. 5-29 Relative Nitritkonzentration im Zellkulturmedium von HOS in Abhängigkeit von Frequenz und Amplitude.
• Abb. 5-30 Relative Nitritkonzentration im Zellkulturmedium von HOS in Abhängigkeit von der Befeldungsdauer.
• Abb. 5-31 Relative NO2-Produktion von HOS TE85 verschiedener Zellzyklusphase nach Applikation hochfrequenter Sinusfelder. Die Signifikanzen für Verteilungsunterschiede (U-Test) sind angegeben (p<0.001 ***, p<0.01 **, p<0.05 *).
• Abb. 5-32 Relative NO2-Produktion verschiedener Zelltypen nach Applikation hochfrequenter Sinusfelder. Die Signifikanzen für Verteilungsunterschiede (U-Test) sind angegeben (p<0.001 ***, p<0.01 **, p<0.05 *).
• Abb. 5-33 Relative NO2- Konzentration in Zellkulturmedium (links, DMEM) und Puffer (rechts) nach Applikation direkt eingekoppelter Felder (0.1 Hz bis 100 kHz).
• Abb. 5-34 Relative Konzentration von cAMP (A, HOS TE85 (n=8) und primäre Osteoblasten (n=20)) und cGMP (B, HOS TE85 (n=10) und primäre Osteoblasten (n=36)) in Zellpopulationen unmittelbar nach Stimulation durch hochfrequente Sinusfelder. Die asymptotische Signifikanz (2-seitig) für Verteilungsunterschiede (U-Test) ist angegeben (p<0.001 ***, p<0.01 **, p<0.05 *).
• Abb. 5-35 Relative Konzentration von PGE2 in Populationen von HOS-Zellen (n=20) und primären Osteoblasten (n=16) 6 h nach Stimulation durch hochfrequente Sinusfelder. Die asymptotische Signifikanz (2-seitig) für Verteilungsunterschiede (U-Test) ist angegeben (p<0.001 ***, p<0.01 **, p<0.05 *).
• Abb. 5-36 Zeitliches Verhalten der MAPK-Translokation in HOS TE85 nach Befeldung mit 3 kHz (Sinus, 16 Hz amplitudenmoduliert) für 10 bzw. 30 min, angegeben in Fluoreszenzeinheiten. Die Zellzahlen in jeder Versuchgruppe sind angegeben.
• Abb. 5-37 Verteilung der aktivierten MAPK in humanen Osteosarcomazellen. A: Kontrolle, B: Stimulation durch PMA, 30 min, C: Feld 1.5 Hz Rechteckpulse, D: Feld 3 kHz Sinus, E: 16 Hz Sinus, F: 3 kHz Sinus amplitudenmoduliert mit 16 Hz, Balken 10 µm.
• Abb. 5-38 Verteilung der aktivierten MAPK in primären Osteoblasten. A: Kontrolle, B: Stimulation durch PMA, C: Feld 1.5 Hz Rechteckpulse, D: Feld 3 kHz Sinus, E: 16 Hz Sinus, F: 3 kHz Sinus amplitudenmoduliert mit 16 Hz, Balken 10 µm.
• Abb. 5-39 Räumliche Differenz der Fluoreszenzintensität von ERK1/2-Antikörpern zwischen Nukleus und Zytoplasma. Die Zellzahlen in jeder Versuchsgruppe (N) und die asymptotische Signifikanz (2-seitig) für Verteilungsunterschiede (U-Test) sind angegeben mit (p<0.001 ***, p<0.01 **, p<0.05 *).
• Abb. 5-40 Relativer DNA-Gehalt von unsynchronisierten HOS TE85 zu verschiedenen Zeitpunkten nach Applikation von niederfrequenten Sinusfeldern (A) und niederfrequent gepulsten Feldern (B).Die Signifikanzen für Verteilungsunterschiede (U-Test) an jedem Messtag sind angegeben (p<0.001 ***, p<0.01 **, p<0.05 *).
• Abb. 5-41 Absoluter DNA-Gehalt von unsynchronisierten HOS TE85 zu verschiedenen Zeitpunkten nach Applikation von niederfrequenten Sinusfeldern (links) und gepulsten Feldern (rechts).
• Abb. 5-42 Relativer DNA-Gehalt von HOS TE85 zu verschiedenen Zeitpunkten nach Applikation von niederfrequent gepulsten Feldern während der G0-Phase (A), G1-Phase (B) und S-Phase (C). Die Signifikanzen für Verteilungsunterschiede (U-Test) an jedem Messtag sind angegeben (p<0.001 ***, p<0.01 **, p<0.05 *).
• Abb. 5-43 Relativer DNA-Gehalt von HOS TE85 in 3D-Struktur zu verschiedenen Zeitpunkten nach Applikation von niederfrequenten Sinusfeldern (A) und niederfrequent gepulsten Feldern (B). Die Signifikanzen für Verteilungsunterschiede (U-Test) an jedem Messtag sind angegeben (p<0.001 ***, p<0.01 **, p<0.05 *).
• Abb. 5-44 Relativer DNA-Gehalt von unsynchronisierten HOS TE85 zu verschiedenen Zeitpunkten nach Applikation von hochfrequenten Sinusfeldern. Die Signifikanzen für Verteilungsunterschiede (U-Test) an jedem Messtag sind angegeben (p<0.001 ***, p<0.01 **, p<0.05 *).
• Abb. 5-45 Relativer DNA-Gehalt von HOS TE85 zu verschiedenen Zeitpunkten nach Applikation von hochfrequenten Sinusfeldern während der G0-Phase, G1-Phase, S-Phase und G2-Phase. Die Signifikanzen für Verteilungsunterschiede (U-Test) an jedem Messtag sind angegeben (p<0.001 ***, p<0.01 **, p<0.05 *).
• Abb. 5-46 Relativer DNA-Gehalt von HOS TE85 in 3D-Struktur zu verschiedenen Zeitpunkten nach Applikation von hochfrequenten Feldern. Die Signifikanzen für Verteilungsunterschiede (U-Test) an jedem Messtag sind angegeben (p<0.001 ***, p<0.01 **, p<0.05 *).
• Abb. 5-47 Relativer DNA-Gehalt von primären Osteoblasten in Monolayerkultur (A) und in 3D-Struktur (B) zu verschiedenen Zeitpunkten nach Applikation von hochfrequenten Feldern. Die Signifikanzen für Verteilungsunterschiede (U-Test) an jedem Messtag sind angegeben (p<0.001 ***, p<0.01 **, p<0.05 *).
• Abb. 5-48 Relativer DNA-Gehalt von L929 zu verschiedenen Zeitpunkten nach Applikation von hochfrequenten Feldern. Die Signifikanzen für Verteilungsunterschiede (U-Test) an jedem Messtag sind angegeben (p<0.001 ***, p<0.01 **, p<0.05 *).
• Abb. 5-49 Relativer DNA-Gehalt von unsynchronisierten HOS TE85 zu verschiedenen Zeitpunkten nach Behandlung mit niederfrequent bzw. hochfrequent konditioniertem Medium. Die Signifikanzen für Verteilungsunterschiede (U-Test) an jedem Messtag sind angegeben (p<0.001 ***, p<0.01 **, p<0.05 *).
• Abb. 5-50 Relative ALP-Aktivität von unsynchronisierten HOS TE85 zu verschiedenen Zeitpunkten nach Applikation von niederfrequenten Sinusfeldern(A) und niederfrequent gepulsten Feldern (B).Die Signifikanzen für Verteilungsunterschiede (U-Test) an jedem Messtag sind angegeben (p<0.001 ***, p<0.01 **, p<0.05 *).
• Abb. 5-51 Relative ALP-Aktivität von HOS TE85 zu verschiedenen Zeitpunkten nach Applikation von niederfrequent gepulsten Feldern während der G0-Phase (A), G1-Phase (B) und S-Phase (C).Die Signifikanzen für Verteilungsunterschiede (U-Test) an jedem Messtag sind angegeben (p<0.001 ***, p<0.01 **, p<0.05 *).
• Abb. 5-52 Relative ALP-Aktivität von HOS TE85 in 3D-Struktur zu verschiedenen Zeitpunkten nach Applikation von niederfrequenten Sinusfeldern (A) und niederfrequent gepulsten Feldern (B). Die Signifikanzen für Verteilungsunterschiede (U-Test) an jedem Messtag sind angegeben (p<0.001 ***, p<0.01 **, p<0.05 *).
• Abb. 5-53 Relative ALP-Aktivität von unsynchronisierten HOS TE85 zu verschiedenen Zeitpunkten nach Applikation hochfrequenter Sinusfelder.Die Signifikanzen für Verteilungsunterschiede (U-Test) an jedem Messtag sind angegeben (p<0.001 ***, p<0.01 **, p<0.05 *).
• Abb. 5-54 Relative ALP-Aktivität von HOS TE85 zu verschiedenen Zeitpunkten nach Applikation von niederfrequent gepulsten Feldern während der G0-Phase, G1-Phase, S-Phase und G2-Phase. Die Signifikanzen für Verteilungsunterschiede (U-Test) an jedem Messtag sind angegeben (p<0.001 ***, p<0.01 **, p<0.05 *).
• Abb. 5-55 Relative ALP-Aktivität von HOS TE85 in 3D-Struktur zu verschiedenen Zeitpunkten nach Applikation von hochfrequenten Feldern. Die Signifikanzen für Verteilungsunterschiede (U-Test) an jedem Messtag sind angegeben (p<0.001 ***, p<0.01 **, p<0.05 *).
• Abb. 5-56 Relative ALP-Aktivität von primären Osteoblasten in Monolayerkultur (A) und in 3D-Struktur (B) zu verschiedenen Zeitpunkten nach Applikation von hochfrequenten Feldern. Die Signifikanzen für Verteilungsunterschiede (U-Test) an jedem Messtag sind angegeben (p<0.001 ***, p<0.01 **, p<0.05 *).
• Abb. 5-57 Relative ALP-Aktivität von HOS TE85 nach Behandlung mit niederfrequent (A) bzw. hochfrequent (B) konditioniertem Medium. Die Signifikanzen für Verteilungsunterschiede (U-Test) an jedem Messtag sind angegeben (p<0.001 ***, p<0.01 **, p<0.05 *).
• Abb. 5-58 Zusammenhang zwischen Proliferation (links) bzw. ALP-Aktivität (rechts) und Frequenz der elektrischen Stimulation 5 Tage nach Befeldung.
• Abb. 5-59 Frequenzabhängigkeit der H2O2-Produktion (links) und der Nitritkonzentration (rechts) nach direkt eingekoppelter elektrischer Stimulation.
• Abb. 6-1 Schema zur Signaltransduktion, die durch die Wirkung elektrischer Felder hervorgerufen wird. Der Kalziuminflux über spannungs- und dehnungsabhängige Kanäle und die Freisetzung von Kalzium aus intrazellulären Speichern führt zur Erhöhung der intrazellulären Kalziumkonzentration. Außerdem sind cGMP, PGE2 und die MAPK an der Signaltransduktion beteiligt, die wiederum durch den Redoxzustand moduliert werden können. Durch die Translokation aktivierter MAPK können Informationen an den Zellkern weitergeleitet und in Signale umgewandelt werden, die Wachstum und Genexpression regulieren.