Dissertation

Brk tyrosine kinase signalling in the gastrointestinal tract

zur Erlangung des akademischen Grades
doctor rerum naturalium (Dr. rer. nat.)
im Fach Biologie

eingereicht an der
Mathematisch-Naturwissenschaftlichen Fakultät I
der Humboldt-Universität zu Berlin

von

Dipl. Biol. Andrea Hägebarth
geb. am 11. Oktober 1977 in Mühlhausen, Thüringen

Dekan: Dekan der Mathematisch-Naturwissenschaftlichen Fakultät I
Prof. Thomas Buckhout, Ph.D.

Gutachter:
1. Prof. Dr. Harald Saumweber
2. Prof. Angela L. Tyner, Ph.D.
3. Prof. Dr. Walter Birchmeier

eingereicht: 27. April 2005

Datum der Promotion: 18. August 2005

Zusammenfassung

Für viele entwicklungsbiologische Prozesse ist die Tyrosin Kinase vermittelte Signaltransduktion von entscheidender Bedeutung. Die Tyrosin Kinase Brk (breast tumor kinase) stellt den Prototypen nicht N-terminal myristoylierter, Nicht-Rezeptor Tyrosin Kinasen dar. Die Expression dieser intrazellulären Kinase ist auf epitheliale Gewebe beschränkt und wird während der Entwicklung differentiell reguliert, wobei höchste RNA- und Proteinniveaus im Darmepithel detektiert wurden. In normalen Geweben ist die Brk Expression auf nichtproliferierende, terminal differenzierte Zellen beschränkt. Zusätzlich zu der entwicklungsregulierten und zelltypspezifische Expression in normalen Geweben, wurde eine Überexpression dieser Kinase in einigen epithelialen Tumoren festgestellt. Die genaue biologische Funktion dieser Tyrosin Kinase ist bis heute unbekannt. In der vorliegenden Arbeit wurde der Einfluss von Brk auf die Eigenschaften des murinen Darmepithels untersucht.

Um die regulatorische Funktion von Brk im murinen Darmepithel zu untersuchen, wurde das brk Gen in der Maus mittels homologer Rekombination unterbrochen. Brk knockout Mäuse zeigten keine offensichtlichen Defekte in ihrer Entwicklung jedoch eine erweiterte Proliferationszone in den Krypten des Darmepithels und verlängerte Villi im Bereich des Dünndarms. Eine genauere Untersuchung zeigte, dass die Inaktivierung von Brk zu einer erhöhten Akkummulation von nukleärem β-catenin in den Krypten der knockout Mäuse führte. Ausserdem konnte eine Hochregulierung des β-catenin Zielgens c-myc in den Krypten des Dünn- und Dickdarms festgestellt werden. Zusätzlich zeigten Brk knockout Mäuse eine Aktivierung des Akt-Signaltransduktionswegs und damit eine vermutliche Induktion von Überlebenssignalen in ihrem Darmepithel. Diese Ergebnisse zeigen, dass die Inaktivierung der Brk Tyrosine Kinase zu einer Störung des Fliessgleichgewichts zwischen Zellproliferation und –differenzierung mit aberranter Signaltransduktion im Darmepithel führt.

Weiterhin traten bei Brk knockout Mäuse chronische Entzündungen des Darmepithels sowie eine erhöhte Sensibilität gegenüber dem Reizmittel DSS auf. Im Gegensatz dazu, zeigten Wildtyp Mäuse eine mit der Literatur übereinstimmende Reaktion zu DSS. Interessanterweise wurde zusätzlich eine Induktion der Brk Expression im Darmepithel behandelter Wildtyp Mäuse vorgefunden. Diese Ergebnisse verdeutlichen das durch die Abwesenheit der Brk Tyrosin Kinase verursachte Ungleichgewicht in der Homöostase des Darmepithels. Ausserdem lassen sie eine schützende Funktion dieser Kinase in Entzündungsprozessen vermuten.

Apoptose - programmierter Zelltod - spielt eine grosse Rolle in der Entwicklung und Aufrechterhaltung der Integrität des Darmepithels. Die Deregulation dieses Prozesses hat häufig krankhafte Erscheinungen wie Krebs zur Folge. Trotz einer Aktivierung des Akt-Signaltransduktionswegs in Brk knockout Mäusen wurden keine Unterschiede im Apoptoseniveau unbehandelter Brk knockout und Wildtyp Mäuse gefunden. Die Behandlung dieser Mäuse mit γ-Strahlung resultierte jedoch in einer signifikanten Beeinträchtigung der Apoptosereaktion in knockout Mäusen. Im Gegensatz zu Wildtyp Mäusen waren Brk knockout Mäuse resistent gegenüber Bestrahlung, was die Anhäufung onkogener Mutationen und damit die Entwicklung von Krebs fördert. Ausserdem wurde erneut eine Induktion der Expression des Brk-Proteins im Darmepithel behandelter Wildtyp Mäuse festgestellt, was eine schützende Funtion dieser Kinase im Darmepithel weiter unterstreicht.

Zusammenfassend kann gesagt werden, dass die Brk Tyrosin Kinase eine entscheidende Rolle in der Aufrechterhaltung der Homöstase und Integrität des Darmepithels spielt. Insbesondere scheint Brk als entscheidender Faktor zur Bestimmung der Sensitivität epithelialer Zellen zu genotoxischem Stress zu fungieren. Entgegen der bisher vermuteten onkogenen Funktion in epithelialen Tumoren scheint Brk im normalen murinen Darmepithel “Tumor Suppressor” ähnliche Funtionen innezuhaben.

Eigene Schlagworte: Brk, Sik, PTK6, Tyrosine Kinase, Darmepithel

Abstract

The Breast tumor kinase Brk is a prototypical non-myristoylated, non-receptor tyrosine kinase. Brk expression is epithelial-specific with the highest level of expression in the gastrointestinal tract. In normal tissues, Brk expression is developmentally regulated, and is restricted to cells exiting the cell cycle and undergoing terminal differentiation. Interestingly, Brk expression is upregulated in some epithelial tumors. To date, the biological role of this intracellular tyrosine kinase in differentiation and oncogenesis remains poorly understood. The present study is focused on gaining a better understanding of the physiological role of Brk in the gastrointestinal tract.

To determine the role of Brk in the gastrointestinal tract, we disrupted mouse brk by homologous recombination. Loss of Brk in the mouse resulted in increased intestinal epithelial cell turnover and the appearance of longer small intestinal villi suggesting a role for Brk in the maintenance of intestinal tissue homeostasis. Brk deficient mice displayed enhanced accumulation of nuclear β-catenin and upregulation of the β-catenin target gene c-myc in the crypt compartment of small and large intestine. In addition, Brk deficient mice exhibited increased Akt kinase activity, suggesting an increase in pro-survival signaling. Furthermore, chronic inflammation was observed in Brk deficient mice, and they showed increased susceptibility to a colon injury model utilizing DSS. Interestingly, wild-type mice exhibited a significant upregulation of nuclear Brk protein throughout the intestinal epithelium in response to DSS.

Even though Brk deficient mice showed increased Akt pro-survival signaling, there was no corresponding difference in base-line apoptosis in untreated wild-type and knockout animals. However, subjected to γ-irradiation, Brk deficient animals were significantly impaired in the apoptotic response, a crucial mechanism protecting the stem cells in the small intestinal crypt against the accumulation of oncogenic mutations and the development of cancer. Wild-type mice, however, exhibited normal levels of apoptosis following γ-irradiation accompanied by a rapid induction of Brk expression in crypt cells. The ability of Brk to sensitize cells to apoptotic stimuli was also observed in vitro in Rat1A fibroblasts overexpressing the kinase.

These recent findings suggest that Brk plays a crucial role in the maintenance of intestinal tissue homeostasis and integrity. In addition, Brk may function to protect the intestinal epithelium against DNA-replication-induced errors and hence the development of cancer. Contrary to reported oncogenic properties of Brk in other epithelial tissues, Brk appears to have tumor suppressor-like functions in the mouse gastrointestinal epithelium.

Keywords: Brk, Sik, PTK6, Protein tyrosine kinase, intestine

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08.11.2006