MATERIAL UND METHODEN

Patientenkollektiv

Von 1990 bis 1992 wurde bei 252 Patienten ein umfassendes kulturelles und serologisches Monitoring zur Erfassung von Lokal- und Systemmykosen durchgeführt.

Die 252 Patienten stammen aus zwei verschiedenen Hochrisikobereichen, die für das Auftreten von Systemmykosen prädisponiert sind (Abbildung 1)

Abb. 1: Aufteilung der Patienten nach einer KMT- und der ITS-Patienten entsprechend ihrer Grundkrankheit

Die erste Gruppe umfaßt 17 Patienten aus der Haematologischen Abteilung der Klinik für Innere Medizin der Charité Berlin nach Knochenmarktransplantationen. Es handelt sich um 9 Frauen, 8 Männer (mittleres Alter 33±15 Jahre) mit folgenden Grunderkrankungen:

12 Patienten mit akuter Leukämie:

4 Patienten mit myeloischer Leukämie

8 Patienten mit lymphatischer Leukämie

2 Patienten mit chronisch myeloischer Leukämie

2 Patienten mit Lymphogranulomatose

1 Patient mit M. Hodgkin

Die Verweildauer der Patienten auf der Station betrug durchschnittlich 52 Tage.

Ein anderer Risikobereich für systemische Mykosen ergibt sich für Patienten aus unterschiedlichen Intensivtherapiebereichen. Untersucht wurden 235 Patienten der Charité Berlin nach chirurgischen Eingriffen, die auf Grund schwerwiegender Erkrankungen notwendig waren, darunter 59 nach Polytrauma, Leber- bzw. Herztransplantation (49), abdominellen (40 Patienten) und kardiologischen (25 Patienten) Operationen sowie 62 Patienten mit anderen unterschiedlichen Grunderkrankungen. Die stationäre Verweildauer der Patienten betrug mindestens eine Woche.

Beide Patientengruppen unterlagen einem umfassenden Monitoring zur Erfassung von Systemmykosen. Von den jeweiligen Stationen wurden bei der Aufnahme und weiterhin 1-3 mal/ Woche Proben zur kulturellen und serologischen Diagnostik auf Pilze (Candida, Aspergillus, Cryptococcus) an das Mykologische Labor der Hautklinink der Charité Berlin eingesandt.

Im Rahmen der eigenen Laborarbeit wurden Antigennachweisverfahren durchgeführt. Der Candida-Antigen-Nachweis in den Seren erfolgte mittels zweier verschiedenerNachweisverfahren, zum einen mit dem Candida-Ramco^®- und zum anderen mit den Candida-Pastorex^®-Verfahren. Parallel zu den vorgenannten Verfahren wurden die selben Seren mit dem neu eingeführten Aspergillus-Pastorex^®-Test simultan untersucht.

Zunächst wurden durch das Labor folgende Daten handschriftlich erfaßt:

Patientenname
Geburtsdatum
Grunddiagnose
kulturelle- und serologische mykologische Ergebnisse.

Ab 1992 wurde das EDV-Programm „MYKODAT“ zur Datenerfassung eingesetzt, was die Datenverwaltung und -auswertung wesentlich erleichterte.

Alle bakteriologischen und immunologischen Daten wurden freundlicherweise im Rahmen der Routineüberwachung der Patienten vom Institut für Mikrobiologie und Hygiene und dem Institut für Medizinische Immunologie der Charité Berlin bereitgestellt.

Zusätzlich wurden eigens die o. g. Patientenakten der 17 KMT-Patienten umfassend ausgewertet. Retrospektiv erfolgte die Sichtung der Krankenunterlagen aller ITS-Patienten, bei denen gesicherte Erkenntnisse auf eine Aspergillusinfektion vorlagen.

Labortechnische Methoden Kulturelle Verfahren

Für die kulturelle Diagnostik wurden Untersuchungsmaterialien, wie Stuhl-, Urin- und Sputumproben, Rachenabstriche, Bronchial- und Trachealsekret, Vaginalabstriche oder auch Biopsiematerial, ins mykologische Labor der Dermatologischen Klinik eingesandt.

Die Auswertung der Materialien erfolgte mit den in der mykologischen Diagnostik üblichen Verfahren: Mikroskopie, Erregeranzucht, Keimzahlbestimmung und der biochemischen Differenzierung (Blaschke-Hellmessen 1990, Müller 1990, Rieth 1987, Rieth 1986).

Bei der Hefe-Differenzierung ist die alleinige Anzucht auf Sabaraud- oder Kimmig-Agar nicht ausreichend. Die Koloniekonfiguration auf diesen Nährböden ist meist uncharakteristisch. Den Schlüssel zur Differenzierung stellen Reiskulturen und biochemische Prüfungen dar. Die Identifizierung der Hefe-Spezies erfolgt im ersten Schritt durch Überimpfung der Hefekolonien auf Reisagar, bei dem es sich um ein Mangelmedium handelt, das die Ausbildung von Pseudomycel und Chlamydosporen fördert. Anhand der Mycelausbildung gelingt eine Vordifferenzierung, die dokumentiert wird. Candida albicans bildet als einzige Spezies Chlamy-dosporen aus und ist diesbezüglich von allen anderen Hefen abgrenzbar.

In einem zweiten Schritt kann man die Nicht-Candida-albicans-Hefen mit Hilfe des API-ID 32 C (biomerieux) und anderen vergleichbaren Systemen (auxacolor, sanofi Pasteur) anhand von standardisierten und miniaturisierten Assimilations- und Fermentationsreaktionen und einer speziellen Datenbasis verifizieren. Das API-System 32 C bietet das derzeit größtmögliche Spektrum an Differenzierungsmöglichkeiten innerhalb der Gattungen Candida, Cryptococcus und Trichosporon. Die Beurteilung der Ergebnisse des API-Systems erfolgt unter Berücksichtigung der vorherigen morphologischen Begutachtung des Mycels. In Zweifelsfällen kann die Diagnosefindung durch Einsatz der PCR-Technik ergänzt werden (Kostiala et al. 1986, Schönian et al. 1993, Tietz et al. 1994). Ein Beispiel ist die mangelnde Differenzierungsfähigkeit der biochemischen Verfahren im Falle von C. famata und C. guillermondii.

Mittels PCR erhobene DNA-Polymorphismen werden zur Differenzierung von klinischen Candida-Isolaten eingesetzt. Die PCR ist in den meisten Fällen leichter und schneller durchführbar als andere bereits etablierte genetische Verfahren für die Typisierung von Krankheiterregern.

Serologische Verfahren

Bei der serologischen Diagnostik nutzt man die Möglichkeit des Nachweises von zirkulierenden Antigenen oder Antikörpern im Serum, Liquor cerebrospinalis und Urin. Der Wert dieser Verfahren liegt in der Schnelligkeit dieser Bestimmungsmethode und einer höheren Empfindlichkeit gegenüber kulturellen Nachweisver-fahren. Die Möglichkeit der Quantifizierung bei den serologischen Tests ist ein weiterer Vorteil, da sie somit auch als Therapieverlaufsparameter genutzt werden können.

Candida-Antigen-Nachweisverfahren

Zum Nachweis zirkulierender Antigene haben sich zwei verschiedene Nachweisverfahren etabliert:

Cand-Tec (Ramco Laboratories Inc., MT. Vernon, Houston, Texas, USA)
Beim Ramco^®-Test ist das nachzuweisende Antigen ein unbekannter, thermolabiler, Candidose assoziierter Komplex (Jandrlic et al. 1995). Beim Vorliegen dieses Antigens reagiert es mit Latex-Partikeln, die mit spezifischen Anti-Candida-Antikörpern beladen sind (Müller 1990, Philips et al. 1990, Wegmann 1988). Das Ergebnis ist eine gut sichtbare Agglutinationsreaktion zwischen Antigen und Antikörper.

Testdurchführung:

Herstellen einer 1:2 Verdünnung von jedem Patientenserum durch Mischen von 50 µl Patientenserum und 50 µl Verdünnungspuffer;
Auf die Agglutinationsplatte werden jeweils 20 µl der Positiv- und Negativkontrolle und des verdünnten Patientenserums gegeben;
Zugabe von jeweils 20 µl der candidaempfindlichen Latexsuspension und mischen mit je einem Stäbchen;
Schütteln der Agglutinationsplatten 10 min mittels Horizontalschüttler;
Ablesen der Ergebnisse;
Proben, die eine Agglutination herbeiführen, werden als positiv bewertet und sollten geometrisch weiterverdünnt werden, um den höchsten Titer zu bestimmen, der eine Agglutination bewirkt.
Bei der Interpretation der Ergebnisse wird der Titer angegeben, bei dem eine Agglutinationsreaktion noch gut sichtbar ist (entspricht höchster Serumverdünnung).

Bewertung der Ergebnisse:

Positiv: Deutlich sichtbare Agglutination;

1:2 -Testung weiterer Verdünnung sollte erfolgen
1:4 oder höher- vereinbar mit systemischer Candidose

Negativ: Keine sichtbare Agglutination der Latexpartikel.

Pastorex ® Candida (Diagnostics Pasteur, Marnes-La-Coguette, France)
Der Pastorex^®-Test basiert ebenfalls auf einer Agglutinationsreaktion. Das nachzuweisende Antigen ist Mannan, ein Polysaccharid, welches von der Candida-Zelloberfläche, beim Vorliegen einer systemischen Mykose, in erheblichem Maße freigesetzt wird (van Cutsem et al. 1990, Kostiala et al. 1986, Müller 1978, Tietz et al. 1994).

Testdurchführung:

Vorbehandlung der Seren:

300 µl Serum in ein Eppendorf-Röhrchen pipettieren;
100 µl Behandlungslösung zugeben;
3 min im Wasserbad bei 100 °C erhitzen;
10 min bei 1000 g zentrifugieren;
weitere Testung nur des Überstandes;

Agglutinationsreaktion

je 40 µl Überstand, Positiv-und Negativkontrolle (Puffer) auf dieAgglutinationskarte geben;
je 10 µl der aufgeschüttelten Latexsuspension hinzugeben;
mit jeweils einem neuen Stäbchen verrühren;
10 min mittels Horizontalschüttler schütteln;
Ablesen der Ergebnisse;
Proben, die eine Agglutination herbeiführen, werden als positiv bewertet und sollten geometrisch weiterverdünnt werden um den höchsten Titer zu bestimmen, der eine Agglutination bewirkt.

Bewertung der Ergebnisse:

Positiv: Agglutination der Latexpartikel
Negativ: Keine Agglutination sichtbar

Aspergillus-Antigen-Nachweisverfahren

Pastorex ® Aspergillus (Diagnostics Pasteur, Marnes-La-Coquette, France)
Die Durchführung des Tests entspricht den Erläuterterungen zum o. g. Nachweis von Candida-Antigen.

Antikörper-Nachweisverfahren

Candida-HAT von LD Labor Diagnostica
Candida-ELISA von Virion Institut Würzburg
Aspergillus-HAT von LD Labor Diagnostica

Auf die Erläuterung der Tests soll hier verzichtet werden. Bei der Ausführung der Tests wurde sich im Wesentlichen an die Vorgabe der Hersteller, unter Berücksichtigung der Erfahrungen anderer Anwender, gehalten. Die Darstellung der Vor- und Nachteile, sowie die Zuverlässigkeit der einzelnen Tests wird in der Diskussion näher betrachtet.

Methodenmanagement

Die Gefahr falsch positiver Ergebnisse durch Kontamination der Patientenproben besteht auf allen Ebenen der Diagnostik: Von der Probenentnahme auf der Station bis zur Verarbeitung im mykologischen Labor. Um Fehlerquellen diesbezüglich auszuschalten, werden im Pilzlabor der Charité alle benötigten Geräte sterilisiert und die Antigentests unter sterilen Kautelen durchgeführt.

Es sind kurze Transportwege der Materialien insbesondere bei den Mannanantigentests zu sichern, weil diese Moleküle eine starke Bindungsaktivität an Lektinrezeptoren der Zelloberflächen und an Transportgefäßen besitzen. Weiterhin haben diese Mannanantigenmoleküle eine geringe HWZ von 2-4 Stunden. Die Nichtbeachtung der vorgenannten Bedingung kann zu falsch negativen Ergebnissen führen. Eingetroffenes Material für die Antigentestung muß unverzüglich verarbeitet und ausgewertet werden.

Soll die Auswertung zu einem späteren Zeitpunkt erfolgen, insbesondere ist dies bei differenzierenden Antikörpertests möglich, so kann das entsprechende Patientenserum bei 2-8 °C für 14 Tage, bzw. tiefgefroren für acht Monate, aufbewahrt werden.