1 Einleitung

Die Stieleiche (Quercus robur L.) gehört mit mehr als 200 weiteren Eichenarten zur Familie der Fagaceae. Ihr natürliches Verbreitungsgebiet umfasst den überwiegenden Teil Europas. Sie fehlt nur im Norden Schottlands, Russlands und Skandinaviens sowie in den sommertrockenen Gebieten des Südens (Erlbeck et al., 2002). Die Eiche zählt zu den besonders widerstandsfähigen Baumarten und kann unter natürlichen Verhältnissen in gutem Gesundheitszustand sehr alt werden.

Seit Beginn der achtziger Jahre werden jedoch zunehmend Schäden an europäischen Eichenbeständen beobachtet (Schlag, 1994). Im vergangenen Jahr lag der Anteil Eichen mit deutlichen Schäden im Kronenbereich bei 45 % (BMVEL, 2004). Neben klassischen Waldschadenssymptomen, wie der Kronenverlichtung und dem Abwerfen belaubter Astsprünge, wird zunehmend von stamm- und astbürtigen Angsttrieben, Blattverfärbungen, Vergilbungen, Kleinblättrigkeit sowie lokalen Rinden- und Kambiumnekrosen an Stamm und Ästen berichtet (Thomas et al., 2002). Umfangreiche Untersuchungen zu den jeweiligen Schadursachen zeigen, dass die beobachteten Eichenschäden nicht monokausal bedingt sind, sondern durch einen Ursachenkomplex abiotischer und biotischer Einflussfaktoren hervorgerufen werden (Führer, 1987; Marcu, 1987; Lentovyc & Capek, 1987; Varga, 1987; Eckstein & Dujesiefken, 1993; Hager, 1993; Hartmann et al., 1989; Kowalski, 1991; Schlag, 1994). Neben nicht parasitären Stressoren wie Luftschadstoffen, Klimaextrema und Stickstoffeutrophierung, sowie bedeutenden parasitären Schaderregern wie dem Eichenprachtkäfer (Agrillus biguttatus) und dem Eichenmehltau (Microsphaera alphitoides) sind Viren als prädisponierender Einflussfaktor anzunehmen (Butin, 1985; Schlag, 1994).

Die Bedeutung der Viren wird von Nienhaus (1985a) in der Verfallsspirale der Gehölze dargestellt. Die äußerlich sichtbaren Symptome von Viruserkrankungen, wie Blattscheckungen, Mosaik und Ringflecken, werden vermutlich durch die Schädigung der Chloroplasten verursacht (Quadt, 1994). Chlorophylldefekte führen zu einer verminderten Photosyntheseleistung, die Wuchsdepressionen und eine verstärkte Anfälligkeit gegenüber anderen Stressoren zur Folge haben. Demzufolge werden Viren als eine primäre Ursache für die Degeneration von Forstgehölzen angesehen, die meist erst dann krankheitsmitbestimmend werden, wenn die von ihnen ausgehende Prädisposition durch den Einfluss anderer biotischer und insbesondere abiotischer Stressoren verstärkt wird (Quadt, 1994; Führling & Büttner, 1998). So konnten Kontzog et al. (1990) am Wirt-Virusmodell Betula pendula (Roth.) infiziert mit Kirschenblattrollvirus (CLRV) zeigen, dass die zusätzliche Belastung durch Luftschadstoffe (Ozon und Schwefeldioxid) im Vergleich zu virusfreien Pflanzen zu einem signifikant geringerem Zuwachs führt. In ihren Untersuchungen zu stoffwechselphysiologischen Veränderungen durch abiotische Stressoren an Forstgehölzen konnte Führling (1994) nachweisen, dass Stieleichen mit chlorotischen Ringflecken und Scheckungen unter Ozoneinfluss oder bei Hitzeeinwirkung verstärkt zur Bildung von Nekrosen neigen.

Von virusverdächtigen Blattsymptomen an Eichen wird seit den 60er Jahren regelmäßig berichtet. Kirstensen (1963) beschrieb erstmals Blattscheckungen an Quercus rubra (L.) in Dänemark. Diese Symptombild soll ebenfalls in Eichenbeständen Schwedens und Südenglands verbreitet sein (Copper, 1979). Schmelzer et al. (1966) berichteten wenig später von Fleckung und Blattdeformationen an Quercus spp. Blattny & Prochazkova (1966) beobachteten das gleiche Symptombild an Eichen in der Tschechoslowakei und stellten fest, dass sich das symptomverursachende Agens durch Pfropfung, Aphiden und Samen auf gesunde Eichensämlinge übertragen lässt. Chlorosen und nekrotische Läsionen zeigten Yarwood & Hecht-Poiner (1970) an Kalifornischen Steineichen (Quercus agrifolia Neé) und Weideneichen (Quercus phellos L.). Chlorotische Ringflecken wurden von Barnett (1971) sowie Kim & Fulton (1973) an der Schwarzeiche (Quercus marilandica Muenchh.) in den USAbeschrieben. Wenig später beobachtete Nienhaus (1975) dieses charakteristische Symptombild an Traubeneichen (Quercus petrea Liebl.) im Rheinischen Schiefergebirge. Büttner & Führling (1993) publizierten erstmals das Auftreten chlorotischer Ringflecken an Stieleichen (Quercus robur L.) in Norddeutschland. Eine Übertragung der Symptome war ausschließlich durch Pfropfung auf gesunde Eichensämlinge möglich. Die mechanische Übertragung auf krautige Indikatoren gelang nicht (Nienhaus, 1975; Büttner & Führling, 1993; Führling, 1994; Büttner & Führling, 1996).

In Eichen mit den charakteristischen Blattsymptomen wurden bisher Viren verschiedener Morphologie beschrieben. Kim & Fulton (1973) konnten anhand elektronenoptischer Untersuchungen von Ultradünnschnitten flexible Partikeln mit einem Durchmesser von 13 nm in Zellen von Eichen mit chlorotischen Ringflecken zeigen. Nienhaus (1985 b) beobachtete isometrische Viruspartikeln, ähnlich der von Nepoviren, in Blättern symptomtragender Stieleichen konnte diese jedoch nicht durch mechanische Inokulation übertragen. Am häufigsten wurden bisher Tobacco mosaic virus (TMV) bzw. TMV-ähnliche Partikeln in Eichen mit virusverdächtigen Symptomen beschrieben. Schmelzer et al. (1966) wiesen TMV-ähnliche Viruspartikeln in symptomtragenden Eichen in Ostdeutschland nach, konnten diese jedoch nicht mechanisch übertragen. Yarwood & Hecht-Poinar (1970), Horváth et al. (1975) sowie Nienhaus (1975) konnten TMV aus Eichenblättern mit Scheckung, Fleckung, Mosaik und Deformationen isolieren. Überdies gelang es Nienhaus & Yarwood (1972) TMV in Knospen und jungen Blättern symptomloser Quercus ssp. und Lithocarpus nachzuweisen. Die mechanische Übertragung von TMV-Partikeln im Anschluss an eine Sephadexgel-Ausschlusschromatographie auf verschiedene krautige Indikatoren beschreiben Nienhaus & Yarwood (1972) sowie Nienhaus (1975). Polák et al. (1990) gelang die mechanische Übertragung von TMV aus Eichen auf Nicotiana tabacum var. ‘Samsun’. Die Übertragung von Tobamoviren durch den amerikanischen Eichenmehltau (Sphaerotheca lanestris) zeigten Yarwood & Hecht-Poinar (1970, 1973) sowie Nienhaus (1971). Der in Deutschland vorkommende Mehltau der Gattung Microsphaera scheint keine Vektorfunktion zu haben (Nienhaus, 1975).

Das Symptombild der chlorotischen Ringflecken wurde bisher nicht mit TMV in Verbindung gebracht (Kim & Fulton, 1973; Nienhaus, 1975; Führling, 1994). Es wird mit einer weiten Verbreitung von Tobamoviren in deutschen Eichenbeständen gerechnet, deren Konzentration in den Einzelproben allerdings gering zu sein scheint (Nienhaus, 1975).

Da der Versuch der Charakterisierung des Erregers der Ringfleckigkeit mit serologischen und elektronenmikroskopischen Verfahren nicht gelungen ist, wird seit Mitte der 90er Jahre versucht, die Natur des Agens mit Hilfe von molekularbiologischen Techniken aufzuklären. Molekularbiologische Methoden bieten häufig die einzige Möglichkeit, einer Virusinfektion nachzugehen (Dodds et al., 1984; Valverde et al., 1990b; Jelkmann et al., 1992; Keim-Konrad & Jelkmann, 1996).

Können keine Viruspartikeln isoliert werden, kann möglicherweise ein Nachweis auf Basis von viraler Doppelstrang-(ds)RNA erfolgen (Morris & Dodds, 1979; Dodds & Bar-Joseph, 1983; Maiss et al., 1987; Jelkmann et al., 1989; German et al., 1992; Führling, 1994; Choi & Randles, 1997). Doppelstrang-RNA entsteht während der Replikation eines RNA-Genoms (Matthews, 1991). Etwa 90 % aller Pflanzenviren besitzen ein Einzelstrang-(ss)RNA-Genom. Diese bilden während ihrer Replikation genomische und subgenomische dsRNAs (Zaitlin & Hull, 1987). Man unterscheidet dabei zwischen vollständig doppelsträngigen Formen und replikativen Intermediaten, die nur teilweise doppelhelikale Strukturen aufweisen (Matthews, 1991). Isolierte dsRNA kann daher auf das Vorliegen einer Virusinfektion hinweisen (Jordan et al., 1983; Dodds et al., 1984; Valverde et al., 1986; Valverde et al., 1990b). DsRNA beschränkt sich jedoch nicht allein auf die replikativen Zwischenformen von ssRNA-Viren. Es sind sowohl dsRNA-Viren als auch doppelsträngige Ribonukleinsäuren bekannt, die z.T. keine Symptome in ihrer Wirtspflanze verursachen. Seit 20 Jahren wird verstärkt über das Vorliegen von dsRNA-Molekülen in symptomlosen Pflanzen, wie Bohnen (Wakarchuk & Hamilton, 1985), Maniok (Gabriel et al., 1987), Luzerne (Fairbanks et al., 1988), Erbsen (Grill & Garger, 1988; Lefebre et. al., 1990; Pfeiffer et al., 1993; Pfeiffer, 1998), Pfeffer (Valverde & Fontenot, 1990; Valverde et al., 1990a), Gerste (Zabalgogeazcoa & Gildow, 1992), Reis (Wang et al., 1990; Fukuhara, 1999; Fukuhara et al., 1993, 1995; Moriyama, 1995, 1999 a, b; Gibbs et al., 2000), Avocado (Cook et al., 1994) und Algen (Ishihara et al., 1992; Koga et al., 1998, 2003) berichtet. Diese dsRNAs werden als endogene dsRNAs bezeichnet (Moriyama et al., 1996, 1999a, b). Sie liegen in niedriger Konzentration im pflanzlichen Gewebe vor, werden nicht von der Wirtspflanze kodiert und replizieren über ihre eigene RdRp. Ihre Verbreitung erfolgt ausschließlich vertikal und sie können nicht durch mechanische Inokulation übertragen werden (Moriyama et al., 1999 a, b; Gibbs et al., 2000). In ihrer Übertragungs- und Vermehrungsform sind sie den Plasmiden ähnlich und werden als dsRNA-Replikons bezeichnet. In jüngeren Untersuchungen wird auf Basis der Struktur und Morphologie zwischen verschiedenen Gruppen endogener dsRNA unterschieden. Hochmolekulargewichts-dsRNA >10 kb, wie in Reis und Erbsen beschrieben, werden den Endoviridae zugeordnet (Moriyama et al., 1999a, b; Gibbs et al., 2000; Horiuchi et al., 2001; Horiuchi & Fukuhara, 2004). Phylogenetisch weisen sie die engste Verwandtschaft zu den +ssRNA-Alphaviren auf (Pfeiffer et al., 1993; Pfeiffer, 1998; Gibbs et al., 2000). Ghabrial et al. (1994) sowie Koga et al. (2003) beschreiben darüber hinaus dsRNA-Replikons in höheren Pflanzen, die im Gegensatz zu den Endornaviren ein wesentlich kleineres segmentiertes Genom von 1,4-3,0 kb besitzen und zudem isometrische Partikeln ausbilden. Die Autoren ordnen diese den Partitiviren zu.

DsRNA mit großer Ähnlichkeit zu den pflanzlichen dsRNA-Replikons auf genetischer und morphologischer Ebene wurden ebenso in Pilzen (Nuss & Koltin, 1990, Ghabrial, 1994, Osaki et al., 2002), Protozoen (Wang & Wang, 1991) und Insekten (Miyazaki et al., 1996) beschrieben. Dieser Aspekt macht die dsRNA-Replikons besonders für die evolutionäre Untersuchung von Viren interessant. Londsdale (1986) vermutet, dass endogene dsRNAs von RNA-Viren abstammen. Nicht nur der Ursprung, auch die Funktion dieser endogenen dsRNAs sind bisher völlig unklar.

Neben den endogenen dsRNAs können in symptomlosen Pflanzen, wie Hopfen, Klee, Luzerne, Rüben und Senf kleinere dsRNA-Moleküle von kryptischen Viren vorliegen (Accotto & Boccardo, 1986; Antoniw et al., 1986; Accotto et al., 1987, 1990; Louisoni et al., 1987; Boccardo et al., 1985, 1987; Kühne et al., 1986, 1987; Xie et al., 1989, 1993; Lukács, 1994). Diese sind nur in geringer Konzentration in den Wirtszellen zu finden und können weder durch Pfropfung noch durch mechanische Inokulation übertragen werden (Dodds et al., 1984). Es sind isometrische Partikeln von 25-35 nm, deren dsRNA in Fragmente von 1,5-3,0 kb segmentiert ist (Boccardo et al., 1987; Gibbs et al., 2000).

Führling (1994) vermutet eine Kontamination der Stieleichen mit kryptischen Viren, da die Autorin dsRNA der Größen 1,5-2,0 kb in Bäumen mit und ohne Symptomen nachwies, die als Doppelbanden auftraten. Diese dsRNA-Moleküle lagen in gleichmäßiger Konzentration in verschiedenen Pflanzenteilen vor, was für eine Vielzahl von Viren in Gehölzen untypisch ist (Büttner & Führling, 1996; Büttner et al., 1996). Kryptische Viren alleine kommen jedoch nicht als Erreger der Ringfleckigkeit in Frage. Auch wenn die Anwesenheit von dsRNA in symptomlosen Pflanzen den dsRNA-Nachweis erschweren kann, ist es durch den Vergleich der dsRNA-Muster aus symptomlosen und symptomtragenden Pflanzen möglich, Hinweise auf ein infektiöses Virus zu erhalten. So konnten Führling (1994) sowie Büttner et al. (1996) aus vereinzelten Blattproben erkrankter Stieleichen dsRNA-Moleküle mit Segmentlängen > 3,4 kb isolieren und nehmen daher eine Mischinfektion mit einem viralen, bisher unbekannten Krankheitserreger an. Steinmöller et al. (2004) gelang es, isometrische Partikeln von 30-40 nm aus Blättern von Stieleichen mit Symptomen zu isolieren und bringen diese aufgrund ihrer Morphologie mit den vermuteten kryptischen Viren in Verbindung, ein Nachweis in symptomlosen Stieleichen gelang den Autoren nicht.

Die erkrankten Eichen kommen im Forst oft vergesellschaftet mit Ebereschen (Sorbus aucuparia) vor, die ähnliche Symptome, chlorotischen Ringflecken und Scheckungen, zeigen. Da die Übertragung von Viren durch Vektoren, sowie über Böden und Gewässer im Waldökosystem möglich ist, stellt sich die Frage, ob die virusverdächtigen Symptome an beiden Baumarten durch den gleichen Erreger verursacht werden. Steinmöller et al. (2004) konnte mit spezifischen Primern für die Ringfleckigkeit der Eberesche in einer RT-PCR DNA-Fragmente aus Gesamt-RNA erkrankter Stieleichenblätter amplifizieren, deren Länge jedoch nicht mit den erwarteten Fragmenten übereinstimmten. Die Autoren vermuten, dass im Genom des bisher unbekannten Erregers der Ringfleckigkeit in Stieleichen Basensequenzen vorliegen, die denen des Erregers aus Ebereschen ähnlich sind. Eine unspezifische Bindung an pflanzliche RNA schloss die Autorin aus, da in symptomlosem Blattmaterial keine Fragmente amplifiziert wurden.

Die Charakterisierung des bisher unbekannten viralen Erregers in Stieleichen ist im Hinblick auf den ökonomischen Wert und die zunehmende ökologische Bedeutung dieser Baumart in unseren Wäldern von großem Interesse.

In der multifunktionalen Forstwirtschaft nimmt die Eiche betriebswirtschaftlich als Nutzholz einen hohen Stellenwert ein. Mit ihrem vielseitig verwendbaren Nutzholz bildet sie eine wichtige wirtschaftliche Grundlage für die holzverarbeitende Industrie. Mit einem Flächenanteil von 10 % stellen Stiel- und Traubeneichen die vierthäufigste Baumgruppe in Deutschland dar (BMVEL, 2004). Für die Umwelt ist die Eiche von großer ökologischer Bedeutung. Sie trägt mit ihrer Sturmfestigkeit vor allem auf schwer kultivierbaren Böden zur Bestandesstabilisierung bei. Im Rahmen des von der Bundesregierung geforderten Waldumbaus zu standortgerechten Laub- und Laubmischwäldern werden die heimischen Eichenarten auch in Zukunft an Bedeutung gewinnen. Als Hauptbaumart im öffentlichen Grün besitzt die Eiche Wert für die Gesundheit und das Wohlbefinden der Menschen. Ihre Langlebigkeit und ihr charakteristischer Habitus machen sie zu einem wertvollen Landschaftselement.

Viruserkrankungen beeinträchtigen die Vitalität und setzen die Widerstandskraft der Gehölze herab. Aufgrund der verringerten Photosyntheseleistung reicht die Regenerationsfähigkeit virusinfizierter Bäume oftmals nicht aus, um zusätzlich einwirkende Stressoren zu kompensieren, was sichtbare Schäden und Degenerationserscheinungen zur Folge hat (Büttner et al., 1996). Virusinfizierte Gehölze stellen als vereinzelte Infektionsquellen im Forst langfristig ein sich ausbreitendes Virusreservoir dar. Untersuchungen von Büttner (1993), Führling & Büttner (1995) sowie Büttner & Führling (1996) haben gezeigt, dass junges Pflanzenmaterial in Baumschulen bereits virusinfiziert sein kann. Dieses kann später nach Auspflanzung am Bestimmungsort im öffentlichen Grün gesunde Pflanzen über verschiedenste Wege infizieren. In diesem Zusammenhang ist der positive Befund der stabilen Tobamoviren, in Gewässern und Böden zahlreicher Ökosysteme für die Eichen von großer Bedeutung (Büttner et al., 1996).

Strategien zur Sicherung der genetischen Vielfalt der Waldbäume und Sträucher zielen auf den Erhalt und die nachhaltige Nutzung der bestehenden genetischen Ressourcen. Die wichtigsten Maßnahmen zur Sicherung forstlicher Genressourcen sind Naturverjüngungen geeigneter Bestände sowie die Verwendung von geeignetem Vermehrungsgut für Pflanzungen (BMVEL, 2003; nationales Waldprogramm). Für die Lagerung und Vermehrung von Standort angepasstem Saatgut in Genbanken ist der Aspekt der Samenübertragbarkeit von Viren besonders zu berücksichtigen.

Im Hinblick auf die lange Kultivierung der Eichen müssen gesunde Pflanzenbestände angelegt werden. Voraussetzung dafür ist die Selektion auf virusfreies bzw. virusgetestetes Pflanzenmaterial in Baumschulen und Genbanken. Diese kann jedoch nur durch spezifische Testverfahren gelingen, für die die Charakterisierung des Erregers erforderlich ist. Diese kann speziell bei Gehölzen oft Jahre intensiver Forschung benötigen. Die Instabilität der Viruspartikeln, der geringe Virustiter und der hohe Gehalt an pflanzlichen Sekundärstoffen erschweren nicht nur die konventionelle Isolierung von Viruspartikeln und Übertragungsverfahren sondern beeinträchtigen ebenso die Isolierung von viraler dsRNA (Dodds et al., 1984; Maiss et al., 1987; Rezaian et al., 1991; Büttner et al., 1996; Werner et al., 1997). Diese Arbeiten sind jedoch grundlegend für die Charakterisierung neuer bisher unbekannter Viren.

Ziel dieser Arbeit war es zunächst, die Verbreitung der Ringfleckigkeit an Stieleichen in Deutschland weiter zu dokumentieren. Mit Hilfe von serologischen, elektronenmikroskopischen und molekularbiologischen Methoden sollten zunächst die in den Voruntersuchungen beschriebenen Viruspartikeln unterschiedlicher Morphologie näher charakterisiert werden. Dazu waren Viruspartikeln durch unterschiedliche z. T. modifizierte Aufreinigungsverfahren aus Blattmaterial mit verschiedenen Symptombildern anzureichern. Die Zugehörigkeit der von Nienhaus (1985 b) und Steinmöller et al. (2004) beobachteten isometrischen Partikeln aus Eichen zu CLRV bzw. die Verwandtschaft zum Erreger der Ebereschenringfleckigkeit sollte im RT-PCR-Verfahren mit spezifischen Primern für diese Viren getestet werden. Der Nachweis von Tobamoviren, die von Schmelzer et al. (1966), Yarwood & Hecht-Poinar (1970), Horváth et al. (1975) sowie Nienhaus (1975) in Eichen beschrieben worden sind, sollte sowohl auf serologischer als auch auf molekularbiologischer Basis erfolgen.

Für die nähere Beschreibung des unbekannten putativen Agens in Stieleichen mit virusverdächtigen Symptomen war die dsRNA-Isolierung für die Extraktion aus unterschiedlichen Geweben von Stieleichen zu optimieren. Diese sollte mit Hilfe der DOP-PCR bzw. der “klassischen” Klonierung von cDNA charakterisiert werden. Auf Basis der erhaltenen Sequenzinformationen sollten anschließende Genomanalysen und Verwandtschaftsstudien unter Anwendung geeigneter Software zur Identifizierung der dsRNA führen.

Ausgehend von den bereits von Führling (1994) beschriebenen hauptsächlich auftretenden dsRNA-Fragmenten von 1,5 kb bis 2,0 kb, ihrem Auftreten als Doppelbande sowie dem Vorkommen in symptomtragenden und symptomlosen Eichen war der Verdacht einer Kontamination mit kryptischen Viren aufzuklären.