2 Material und Methoden

2.1  Material

2.1.1  Probenmaterial der Baumgattung Quercus

Bonituren und Probenahmen an Eichen wurden einmal jährlich in Nordrhein-Westfalen (NRW), Schleswig-Holstein (SWH), Niedersachsen (NS), Sachsen (SN) und Hamburg (HH) durchgeführt (Abb. 2.1). Um den Einfluss Jahreszeit- und Witterungsbedingter Symptom-veränderungen auf die Übertragbarkeit des Agens und die Isolierung von dsRNA zu testen, wurden in Berlin und Umgebung mehrmals jährlich Blatt-, Knospen- und Rindenproben von Stieleichen mit virusverdächtigen Blattsymptomen (Ringflecken, Scheckung, Mosaik) und optisch gesund erscheinenden Eichen entnommen. Aufgrund der zunehmenden Maskierung der virusverdächtigen Symptome im Verlauf der Vegetationsperiode, wurden die Probenahmen hauptsächlich in den Monaten Mai und Juni durchgeführt. Das Probenmaterial wurde aus verschiedenen Kronenbereichen entnommen. Blattproben von Bäumen eines Standortes, die nur vereinzelt Symptome aufzeigten, wurden als “Sammelprobe” gelagert. Proben eines Baumes, die neben virusverdächtigen Symptomen Saugschäden durch die Eichenzwerglaus (Phylloxera coccinea) bzw. Mehltauinfektionen (Microsphaera alphitoides) aufwiesen, wurden als “Mischinfektionen” bezeichnet.

Rinden- und Knospenmaterial wurde im Februar an den Standorten Berlin-Grunewald (B 1) und Hamburg (HH, SF Klövensteen) entnommen. Für die Aufreinigung von dsRNA und Nukleokapsiden aus Rindengewebe wurde die Rinde mit Siebzellen und Kambium vom Holzteil abgezogen. Das Material wurde frisch eingesetzt oder bis zur Verarbeitung bei -20 °C bzw. -80 °C, oder in flüssigem Stickstoff pulverisiert bei -80 °C gelagert. In die Untersuchungen wurden Eichenblattproben einbezogen, welche in den Jahren 1993-1999 in Nordrhein-Westfalen entnommen und bei -20°C gelagert worden waren.

Die in der Arbeit verwendeten Eichenproben sind mit einer E-Nummer gekennzeichnet und werden in der Tab. A1, Anhang 4 mit Beschreibungen zum Pflanzenmaterial, zum Fundort, zur Symptomausprägung, zu den Lagerungsbedingungen sowie zur Verwendung und zum Ergebnis der Untersuchungen aufgeführt.

Zu den Probenahmestandorten gehörten ausgewählte Forstquartiere und Straßenzüge sowie eine Erhaltungssamenplantage. Tab. 2.1 zeigt die Probenahmestandorte unter Angabe der Art der Pflanzung, des Baumalters und des Boniturschemas. Die Lage der Standorte in Deutschland ist in Abb. 2.1 dargestellt, die bonitierten Flächen sind im Anhang A1, Abb. A1.1- A.1. 11 aufgeführt.

Tab. 2.1: Darstellung der Probenahmestandorte unter Angabe der Art der Pflanzung, dem Baumalter und des Boniturschemas

	Abb. 2.1

Für Untersuchungen zur Pathogenität des unbekannten Erregers der Ringfleckigkeit an Stieleichen wurden Pflanzenpresssäfte sowie teilgereinigte Eichenblatthomogenate mit Hilfe der mechanischen Inokulation auf krautige Testpflanzen übertragen, die für eine Vielzahl bekannter Viren geeignete Wirte darstellen. Diese Übertragungsversuche wurden ebenfalls zur Vermehrung des unbekannten Erregers in krautigen Testpflanzen verwendet. Dazu waren folgende Indikatorpflanzen anzuziehen:

Chenopodium quinoa (Willd.)

Chenopodium amaranticolor (Coste & Reyn)

Lycopersicon esculentum (Mill.)‘Peto’

Nicotiana benthamiana (Domin)

Nicotiana clevelandii (A.Gray)

Nicotiana glauca (Grah.)

Nicotiana tabacum var.‘Samsun’ (L.)

Nicotiana tabacum var. ‘Xanthii’ (L.)

Nicotiana rustica (L.)

Zur Keimung wurde das Saatgut in Einheitserde 0 (Fa. Gramoflor) ausgesät, abgedeckt und bei 20-22 °C kultiviert. Nach dem Auflaufen wurden die Sämlinge in Einzeltöpfe mit einem Gemisch aus abgesiebten Torf aus Eigenherstellung und Einheitserde P (Fa. Gramoflor) pikiert und bei 18-20 °C kultiviert.

Die für die Untersuchungen verwendeten Tobamovirusisolate sind unter Angabe der Bezeichnung, der Wirtspflanze und den Lagerungsbedingungen in Tab. 2.2 aufgeführt. Die Herkünfte der Isolate sind der Fußnote zu entnehmen.

Tab. 2.2: Übersicht der verwendeten Virusisolate unter Angabe der Isolatbezeichnung, der Wirtspflanze und den Lagerungsbedingungen

Für die Klonierung von PCR-Produkten und von cDNA [synthetisiert aus Doppelstrang-RNA (dsRNA)] wurden zur Transformation chemisch kompetente Zellen der Escherichia coli (E. coli) -Stämme DH 5α, XL1 Blue (MRF) und JM 109 (Fa. Promega) verwendet.

Zur Ligation sämtlicher PCR-Produkte wurde der T-Klonierungsvektor pGEM®-T Easy der Fa. Promega eingesetzt. Für die ‘Blunt End’-Klonierung von cDNA wurde der Klonierungsvektor pEZSeq™ der Fa. Lucigen™ Corporation verwendet.

Chemikalien und Enzyme wurden von den Firmen AppliChem (Darmstadt), Carl Roth (Karlsruhe), Difco (Schweiz), Fermentas (St. Leon-Roth), Fluka (Taufkirchen), Merck (Darmstadt), Promega (Mannheim), Roche Molecular Biochemicals (Mannheim) und Sigma-Aldrich (München) bezogen, sofern im Text keine anderen Bezugsquellen vermerkt sind.

Alle Puffer, Lösungen und Nährmedien wurden mit deionisiertem Wasser (ddH₂0) aus der Ionenaustauscheranlage der Fa. SG bzw. mit Reinstwasser (H₂O_Milli) aus der Milli-Q-Academic-Anlage der Fa. Millipor angesetzt und anschließend durch Autoklavieren (120 °C und 1,2 bar, 20 min) oder durch Filtration (0,22 µm Porendurchmesser) sterilisiert. Für die Arbeiten mit dsRNA und Gesamt-RNA wurden Puffer, Lösungen und Wasser mit 0,1 % Diethylpyrocarbonat (DEPC) versetzt, über Nacht gerührt und autoklaviert. Nicht autoklavierbare Chemikalien wurden den Puffern und Lösungen nach dem Autoklavieren zugesetzt bzw. mit autoklaviertem DEPC-Wasser (H₂O_DEPC) angesetzt.

Für den Nachweis von Tobamoviren mit Hilfe des ‘Enzyme-Linked-Immunosorbent-Assay’ (ELISA), des Agargeldoppeldiffussionstests sowie der ‘Imunocapture-Reverse-Transcriptase-Polymerase-Chain-Reaction’ (IC-RT-PCR) wurden nachstehende Antiseren mit polyklonalen Antikörpern der DSMZ (Deutsche Sammlung für Mikroorganismen und Zellkulturen, Braunschweig, Deutschland) verwendet.

Die Nährmedien zur Anzucht und Vermehrung von E.coli-Bakterienstämmen wurden nach Sambrook et al. (1989) hergestellt.

Die nachfolgenden Angaben beziehen sich auf jeweils einen Liter Nährmedium:

Temperaturempfindliche Zusätze wie Ampicillin (Amp 50 mg/ml H₂0), Isopropyl-β-D-thiogalactopyranosid (IPTG 23,83 mg/ml H₂0) 5-Bromo-4-Chloro-3-Indolyl-β-D-Galactopyranosid (X-Gal, 20 mg/ml Dimethylformamid) und Glukose wurden nach dem Autoklavieren zugesetzt.

Die Ableitung sequenzspezifischer Oligonukleotide (Primer) wurde mit Hilfe des Primer- Design-Pogrammes Primer 3 (Whitehead Institute for Biomedical Research) vorgenommen. Die Synthese der Primer erfolgte bei der Fa. Carl Roth (Karlsruhe). Für die jeweiligen PCR-Reaktionen wurden die in Tab. 2.3 mit Angaben zur Bezeichnung, Sequenz und Lage aufgeführten Primer eingesetzt. Dabei wurden die für verschiedene bereits bekannte Viren und Vektoren spezifischen Primer (Nr.: 1-13) nach Literaturangaben synthetisiert. Die Sequenzen der Primer Nr.: 14-19 wurden im Rahmen der vorliegenden Arbeit nach Amplifikation, Klonierung und Sequenzierung von eichenspezifischer dsRNA erhalten.

Tab. 2.3: Übersicht der verwendeten Primer unter Angabe der jeweiligen Kurzbezeichnung, Sequenz, Lage im Genom und Literaturreferenz (sofern nicht selbst abgeleitet)

**B=C,G,T; N=A,T,C,G; R=A,G; *S=G,C; Y=C,T ; Pos.=Position; HPG=Hüllproteingen; TPG= Transport proteingen; NKR=nicht kodierende Region; MCS=Multiple Cloning Site

Modifikationen etablierter Methoden werden in allen Protokollen fettgedruckt hervorgehoben.

2.2.1  Biotest und Übertragungswege

2.2.1.1  Mechanische Übertragung auf krautige Indikatorpflanzen

Virusempfindliche, krautige Testpflanzen wurden im Biotest zum Nachweis der Pathogenität des unbekannten Erregers in Stieleichen eingesetzt (Kap. 2.1.2). Aufgrund der niedrigen Virustiter in holzigen Wirten dient die Übertragung auf krautige Testpflanzen ebenso der Vermehrung phytopathogener Viren (Büttner et al., 1996). Für die Versuche zur mechanischen Übertragung des Erregers aus Stieleichen, welche sich an Arbeiten von Fulton (1966) und Führling (1994) orientierten, wurde als Grundpuffer ein Natriumphosphatpuffer verwendet. Diesem wurden verschiedene Zusätze beigefügt:

Für die Inokulation mit Pflanzenpresssaft wurde etwa 0,1 g Pflanzenmaterial in flüssigem Stickstoff gemörsert und in 1 ml Inokulationspuffer gelöst. Als Schleifmittel wurde eine Spatelspitze Celite zugefügt. Die Inokulation der Testpflanzen erfolgte im 4-5 Blattstadium der Indikatorpflanzen. Kontrollpflanzen wurden nur mit Puffer und Celite inokuliert. Bei der “Trockeninokulation” waren ganze Blätter oder Pflanzenmaterial erkrankter Stieleichen, dass in flüssigem Stickstoff pulverisiert worden war, ohne Zusatz von Puffer auf die Blätter der Indikatorpflanzen abzureiben.

Nach der Inokulation wurden die Testpflanzen bei 20 °C für drei bis vier Wochen im Gewächshaus kultiviert.

Zur Überprüfung der Bodenübertragbarkeit des Agens wurden aus dem Wurzelraum erkrankter Stieleichen am Standort B 1 Bodenproben entnommen und in Töpfe mit einem Durchmesser von 10 cm überführt. In diese Erde wurden Sämlinge der Testpflanzen Chen o podium quinoa, Nicotiana clevelandii und Nicotiana glauca pikiert und für vier Wochen bei 20 °C im Gewächshaus inkubiert.

Zur Erfüllung der Koch´schen Postulate ist eine Vermehrung der potenziellen Erreger aus Stieleichen in krautigen Indikatorpflanzen und die anschließende Rückübertragung auf Stieleichen notwendig. Dazu waren aufgereinigte Virussupensionen aus krautigen Testpflanzen durch mechanische Inokulation unter Verwendung verschiedener Pufferzusätze (Kap. 2.2.1.1) auf symptomfreie, acht Monate alte Eichensämlinge zu übertragen.
Darüber hinaus sind im August 2002 Übertragungsversuche mittels ‘Stem Slashing’ durchgeführt worden. Dazu wurde ein steriles Skalpell in die aufkonzentrierte Virussuspension getaucht und anschließend der verholzte Stengelabschnitt etwa 15-20 cm großer Eichensämlinge dachziegelförmig eingeritzt. Die behandelten Eichensämlinge wurden im Freiland kultiviert und im Folienzelt frostfrei überwintert.

Im Dezember 2001 wurde am Standort Berlin-Spandau, RFö Hakenfelde (B 3) Saatgut unter erkrankten (E 338-E 341) und symptomlosen (E 342, E 343) Stieleichen gesammelt. Die Eicheln wurden in ein Torf-Kultursubstrat : Sand (1:1)- Gemisch ausgesät und zum Schutz vor Pilzkrankheiten mit Previcur® N (Fa. Bayer Cropscience) angegossen. Die Anzucht der Sämlinge erfolgte frostfrei im Folienzelt. Die Eichensämlinge der Probe E 342 dienten später als symptomfreies Testmaterial für die Inokulationen mit Pflanzenpresssaft und zur künstlichen Infektion durch das ‘Stem Slashing’ (Kap. 2.2.1.3).

Die Ergebnisse der Übertragungsversuche mit den krautigen Testpflanzen (Kap. 2.2.1.1, Kap. 2.2.1.2) wurden über einen Zeitraum von einem Monat dreimal pro Woche durch eine visuelle Kontrolle der Pflanzen überprüft. Die Bonitur der Symptome an den Eichensämlingen (Kap. 2.2.1.3, Kap. 2.2.1.4) erfolgte in den Jahren 2002-2004 von Mai bis Oktober einmal im Monat. Blattmaterial mit virusverdächtigen Symptomen wurde geerntet, transmissionselektronenmikroskopisch untersucht (Kap. 2.2.4) und bei -20 °C bzw. -80 °C gelagert.

Für den Versuch des Nachweises möglicher Viren in Stieleichen wurde eine Nukleokapsidaufreinigung modifiziert nach Kellmann et al. (2001) durchgeführt. Um Aussagen über eine mögliche Lokalisierung des putativen Virus treffen zu können, wurden 30 g Rindengewebe symptomtragender Stieleichen und 50 g Blätter einer symptomfreien Stieleiche eingesetzt. Puffer, in denen Sedimente wieder gelöst wurden, werden in diesem und allen weiteren Protokollen als Resuspendierungspuffer bezeichnet. Alle Arbeitsschritte waren auf Eis oder bei 4 °C durchzuführen.

Das Pflanzenmaterial wurde in flüssigem Stickstoff zerkleinert, mit 3 ml Extraktionspuffer je 1 g Pflanzenmaterial versetzt und bei 4 °C im ‘Warring Blendor’ homogenisiert. Zur Abtrennung unlöslicher Pflanzenbestandteile wurde der Pflanzenextrakt durch ein steriles Baumwolltuch gepresst und 10 min bei 8.000 rpm,4 °Csedimentiert (GR 2022, Fa. Jouan). Nachfolgend wurden die Überstände für 45 min bei 28.000 rpm ultrazentrifugiert (Beckman Coulter Optima™ Le 80K Ultrazentrifuge, Rotor SW 28), die Sedimente in 4 ml Resuspendierungspuffer 1 aufgenommen und mit einem Glashandhomogenisator gelöst. Die Suspension wurde mit Resuspendierungspuffer 1 auf 40 ml aufgefüllt, für 1 h bei 4°C gerührt und 10 min bei 8.000 rpm, 4 °C zentrifugiert (GR 2022, Fa. Jouan). Anschließend wurde der Überstand erneut in Ultrazentrifugenröhrchen überführt, mit 10 ml 30 %iger Saccharoselösung unterschichtet und 1 h 20 min bei 31.000 rpm ultrazentrifugiert (Beckman Coulter Optima™ Le 80K Ultrazentrifuge, Rotor Ti 70). Das Lösen der Sedimente erfolgte mit dem Glashandhomogenisator in 700 µl einer 10 mM Na₂SO₃-Lösung. 20 µl Suspension wurden für eine SDS-PAGE abgenommen und bei 4 °C aufbewahrt. Der Rest wurde mit Cs₂SO₄ in einer Konzentration von 0,075 g/ml Suspension versetzt und gut durchmischt. Zur Ultrazentrifugation wurde das Gemisch vorsichtig auf 1,3 ml Cäsiumsulfatlösung pipettiert und 18 h bei 40.000 rpm sedimentiert (Beckman Coulter Optima™ Le 80K Ultrazentrifuge, Rotor SW 60 Ti).Nach der Zentrifugation zeigten sich im Tageslicht absorbierende Zonen, die voneinander getrennt mit der Pipette abgesaugt, in Resuspendierungspuffer 2 aufgenommen und für 2 h bei 26.000 rpm ultrazentrifugiert wurden (Beckman Coulter Optima™ Le 80K Ultrazentrifuge, Rotor SW 60 Ti). Die Sedimente wurden in 30 µl Resupendierungspuffer 2 aufgenommen und über Nacht bei 4 °C gelöst.Nach einem letzten Zentrifugationsschritt für 10 min bei 8.000 rpm, 4 °C (Beckman-Coulter Microfuge® R, Festwinkelrotor F 241,5) wurde der Überstand abgenommen und bei -20 °C gelagert.

Puffer und Lösungen:

Alle Puffer und Lösungen wurden in H₂O_DEPC angesetzt. Puffer und Lösungen mit nicht autoklavierbaren Zusätzen wurden vor dem Gebrauch steril filtriert und bei 4 °C gelagert.

Die angereicherten Nukleokapside wurden elektronenoptisch untersucht (Kap. 2.2.4), in einer ‘SDS-PAGE’ analysiert (Kap. 2.2.5.3) und mit Hilfe der Zweitstrangsynthese kloniert bzw. in die RT-PCR mit den dsRNA spezifischen Oak Cryp-Primern eingesetzt (Kap. 2.2.9.2 und Kap. 2.2.7.3).

2.2.3.1  Isolierung von Viruspartikeln aus Gehölzen

Für den Versuch der Isolierung von Viruspartikeln aus Eichenblattmaterial wurden verschiedene Methoden modifiziert angewendet, die bereits für Gehölze und bekannte Viren etabliert worden sind. Überstände und aufgereinigte Proben sind im Anschluss elektronenoptisch untersucht (Kap. 2.2.4) und auf krautige Testpflanzen übertragen worden (Kap. 2.2.1.1). Für Proben einzelner Pflanzen, von denen nicht genügend Blattmaterial für eine Aufeinigung zur Verfügung stand, wurden Sammelproben desselben Standortes oder Blätter mit gleichen Symptomen eingesetzt. Als Negativkontrollen wurden Stieleichenblätter ohne Symptome verwendet. Proben die zur Anreicherung von Viruspartikeln eingesetzt wurden, waren bei -20 °C gelagert (E 148, E 151-E 153, Baum A B3, E 552, E 619, E 1993, E 1997) oder wurden frisch geerntet (E 533, E 534).

Aufreinigung von Viruspartikeln aus Gehölzen modifiziert nach Hentsch (1998)

Zur Abtrennung sekundärer Pflanzeninhaltsstoffe, insbesondere von Tanninen, wurde das Eichenblatthomogenat zunächst mit einer wässrigen Bentonitsuspension vorgeklärt.

Herstellung einer wässrigen Bentonitsuspension nach Hentsch (1998):

50 g Bentonit wurden in 1000 ml Puffer und 2,46 g MgSO₄ (10 mM) unter kräftigem Rühren ausgeschwemmt. Die groben Bestandteile wurden 2 min bei 2000 rpm sedimentiert (Hettich Universal 16 R, Ausschwingrotor 1624) und verworfen. Nach Zentrifugieren des Überstandes für 16 min bei 16.000 rpm, Raumtemperatur (RT) (GR 2022, Fa. Jouan) wurde das Sediment in 500 ml Puffer aufgenommen, wiederholt niedrig- und hochtourig zentrifugiert und anschließend in 250 ml Puffer gelöst, autoklaviert und bei 4 °C gelagert.

Puffer:Na₂HPO₄ / NaH₂PO₄–Puffer (10 mM, pH 7,4)

Vorklärung:

Zur Extraktion des Blattmaterials wurden in Abweichung vom Standardprotokoll zwei Puffer mit unterschiedlicher Ionenkonzentration eingesetzt. 50 g Eichenblätter mit virusverdächtigen Symptomen wurden in flüssigem Stickstoff pulverisiert, in einer Duranflasche mit 200 ml Extraktionspuffer durch Rühren oder im Mixer homogenisiert. Die Abtrennung der Proteine erfolgte durch den Zusatz von 3 ml wässriger Bentonitsuspension (pH 7,4) und kräftiges Schütteln (TH 25, Edmund Bühler swip). Anschließend wurde das Homogenat durch zwei Lagen autoklaviertes Baumwolltuch gepresst und 15 min bei 4000 rpm, 4 °C zentrifugiert (Hettich Universal 16 R, Ausschwingrotor 1624). 1 ml des Überstandes wurde für die Inokulation und Transmissionselektronenmikroskopie abgenommen. Der Rest wurde durch Watte filtriert.

PEG-Fällung:

Die Fällung der Viruspartikeln erfolgte durch den Zusatz von 10 ml PEG-Lösung je 40 ml Filtrat und 12-15 h Rühren bei 4 °C. Nach 15 min Zentrifugieren bei 4000 rpm, 4 °C (Hettich Universal 16 R, Ausschwingrotor 1624) wurde das Sediment in 40 ml Resuspendierungspuffer 1 gelöst und wiederholt für 15 min bei 4000 rpm, 4 °C zentrifugiert (Hettich Universal 16 R, Ausschwingrotor 1624).

differentielle Zentrifugation:

Der Überstand wurde in Zentrifugenröhrchen überführt und für 3 h bei 28.000 rpm sedimentiert (Beckman Coulter Optima™ Le 80 K Ultrazentrifuge, Rotor SW 28). 1 ml des Überstandes wurde zur Inokulation und Untersuchung im Transmissionselektronenmikroskop abgenommen. Das Sediment wurde in Resuspendierungspuffer (1:5 zum Ausgangsvolumen) aufgenommen und für 10 min bei 12.000 rpm, 4 °C zentrifugiert (GR 2022, Fa. Jouan). Zur Konzentrierung der Viruspartikeln wurde der Überstand für 1,5 h bei 56.000 rpm sedimentiert (Beckman Coulter Optima™ Le 80 K Ultrazentrifuge, Rotor Ti 70). Dieser Ultrazentrifugationsschritt wurde wiederholt, nachdem das Sediment in 2 ml Resuspendierungspuffer gelöst und für 10 min bei 12.000 rpm, 4 °C zentrifugiert worden war (Beckman-Coulter Microfuge® R, Festwinkelrotor F241,5). 1 ml des Überstandes wurde anschließend zur Inokulation und Untersuchung im Transmissionselektronenmikroskop abgenommen, das Sediment in 500 µl Resuspendierungspuffer 2 gelöst und bei 4 °C gelagert.

Puffer:

Schnellaufreinigung von Viruspartikeln in Anlehnung an Rebenstorf (2002)

Für die Aufreinigung von isometrischen Viruspartikeln wurde eine Extraktionsmethode modifiziert nach Rebenstorf (2002) verwendet, die für die Isolierung von CLRV-Patikeln etabliert worden war.

100 g Stieleichenblätter mit chlorotischen Ringflecken wurden in flüssigem Stickstoff zerkleinert, im ‘Warring Blendor’ bei 4 °C in 300 ml Extraktionspuffer homogenisiert und zur Abtrennung grober Pflanzenbestandteile durch zwei Lagen autoklaviertes Baumwolltuch gepresst. Zur Fällung der Proteine wurde der Pflanzenpresssaft mit ¼ Volumen (Vol.) Chloroform angereichert und 30 min bei RT gerührt. Die Abtrennung unlöslicher Bestandteile erfolgte durch 10 min Zentrifugieren bei 5000 rpm, 4 °C (GR 2022, Fa. Jouan).Um die Viruspartikeln aufzureinigen, wurde der Überstand anschließend auf 10 ml eines 40 %igen Zuckerkissens aufgebracht und 1 h bei 60.000 rpm ultrazentrifugiert (Beckman Coulter Optima™ Le 80K Ultrazentrifuge, Rotor Type 70 Ti). Das Sediment wurde in 1 ml Extraktionspuffer resuspendiert, 10 min bei 5000 rpm, 4 °C zentrifugiert (Beckman-Coulter Microfuge® R, Festwinkelrotor F241,5) und bis zur weiteren Verwendung bei 4 °C gelagert.

Puffer:

Aufreinigung von Viruspartikeln nach Dijkstra et al. (1996)

Für die Aufreinigung von fadenförmigen Viruspartikeln wurde die Methode von Dijkstra et al. (1996) angewendet. Dazu wurden 50-70 g Stieleichenblätter mit virusverdächtigen Symptomen in flüssigem Stickstoff pulverisiert, mit 3 ml Puffer/g Blattmaterial extrahiert und 1 h auf Eis gerührt. Der Pflanzenrohextrakt wurde durch zwei Lagen autoklaviertes Baumwollltuch gepresst und für 30 min bei 8000 rpm, 4 °C zentrifugiert (GR 2022, Fa. Jouan). Zum Membranaufschluss wurde der Überstand mit Triton X 100 (Endkonzentration 1 % v/v) versetzt, 1 h auf Eis gerührt und 15 min bei 8000 rpm, 4 °C zentrifugiert (GR 2022, Fa. Jouan). Durch Ultrazentrifugation auf einem 20 %igen Zuckerkissen (3 h, 90.000 rpm, Beckman Coulter Optima™ Le 80K Ultrazentrifuge, Rotor Type 70 Ti) wurden die Viruspartikeln anschließend aufkonzentriert. Das Sediment wurde über Nacht durch Schwenken (Belly Dancer, Fa. Stovall) bei 4 °C in 500 µl Resuspendierungspuffer gelöst und bei 4 °C gelagert.

Puffer:

Die Isolierung von Tobamoviruspartikeln aus krautigen Indikatorpflanzen erfolgte verkürzt nach der Methode von Gooding & Hebert (1967). Dazu wurde 10-20 g frisches Blattmaterial infizierter Chenopodium quinoa-Pflanzen im Extraktionspuffer (1 ml Puffer/1 g Pflanzenmaterial) homogenisiert. Zum Abtrennen grober Pflanzenbestandteile wurde das Homogenat durch zwei Lagen autoklaviertes Baumwolltuch gepresst. Das Aufbrechen der Proteine erfolgte durch Zugabe von 8 ml n-Butanol je 100 ml Pflanzenextrakt und 15 min Rühren bei RT. Nach 30 min Zentrifugieren bei 10.000 rpm, 4 °C (GR 2022, Jouan) wurde der Überstand mit 4 g PEG und 0,4 g NaCl je 100 ml versetzt und unter Rühren bei 4 °C inkubiert. Die gefällten Viruspartikeln wurden 15 min bei 10.000 rpm, 4 °C (GR 2022, Jouan) sedimentiert und anschließend in 2 ml Resuspendierungspuffer je 100 ml Pflanzenextrakt aufgenommen. Nach Reinigung des gelösten Sediments durch wiederholtes Zentrifugieren (5 min, 10.000 rpm, 4 °C; Beckman-Coulter Microfuge® R, Festwinkelrotor F241,5) wurde die Virussupension bei 4 °C gelagert.

Puffer:

Um nach der Charakterisierung des unbekannten Erregers spezifische serologische und molekularbiologische Untersuchungen durchführen zu können, wurden alle aufgereinigten Pflanzenextrakte bei -20°C aufbewahrt.

Aufgereinigte Virusisolate und Pflanzenmaterial mit virusverdächtigen Blattsymptomen wurden in Puffer homogenisiert und im Transmissionselektronenmikroskop ZEISS EM 10 C auf Viruspartikeln untersucht. Für die Probenpräparation wurden Kupfernetze (300-400 mesh, Fa. Plano) verwendet, die mit einem dünnen Pioloformfilm beschichtet und zur Stabilität mit Kohle bedampft worden waren. Die Kupfernetze wurden für 10-60 min auf einem Tropfen Virussuspension inkubiert, mit Filterpapier getrocknet, anschließend 3 x in ddH₂O-Tropfen für jeweils 10 sec gewaschen und erneut getrocknet. Die Negativkontrastierung erfolgte mit Uranylacetat (2 %, w:v) für 10-30 sec. Die Restflüssigkeit wurde mit einem Filterpapier abgesaugt.

Puffer:

2.2.5.1  DAS-ELISA (‘Double Antibody Sandwich-Enzyme Linked-Immunosorbent Assay’)

Eichenblattproben, in denen sich elektronenmikroskopisch stäbchenförmige Viruspartikeln detektieren ließen, wurden im DAS-ELISA mit verschiedenen Antikörpern (Kap. 2.1.7) gegen Tobamo-Viren getestet. Die Durchführung erfolgte nach Clark & Adams (1977).

Hierzu wurden die Kavernen einer ELISA-Platte mit je 200 μl Antikörperlösung [IgG, verdünnt in Beschichtungspuffer im Verhältnis 1:1000 bzw. 1:500 (v/v)] beschichtet. Die Bindung der Antikörper an die Kavernenwandungen erfolgte durch 4 h Inkubation bei 37 °C. Überschüssige Antikörper wurden durch drei Waschschritte (3 min mit Waschpuffer) entfernt, die auch jedem weiteren Inkubationsschritt folgten. Vor dem Probenauftrag wurde das Pflanzenmaterial in 20 μl Probenpuffer je mg Feuchtgewicht homogenisiert und zur Abtrennung von grobem Pflanzenmaterial 1 min bei 12.000 rpm, 4 °C zentrifugiert (Beckman-Coulter Microfuge® R, Festwinkelrotor F241,5). Zur Bindung der Antigene wurden je 200 μl Pflanzenhomogenat pro Kaverne über Nacht bei 4 °C inkubiert. Die Anlagerung des spezifischen enzymkonjugierten Antikörpers [IgG-Ap, verdünnt in Konjugatpuffer 1:1000 bzw. 1:500 (v/v)] erfolgte anschließend für 4 h bei 37 °C. Detektiert wurde mit 200 µl Substratlösung (0,6-1 mg/ml p-Nitrophenylphosphat frisch in Substratpuffer gelöst). Die Extinktionsmessung der Farbreaktion erfolgte bei 405 nm im ELISA-Reader (Fa. TECAN). Als positiv bewertet wurden Proben, deren Werte über dem zweifachen der Negativkontrolle (gesundes Pflanzenmaterial) lagen.

Puffer und Reagenzien:

Für den serologischen Vergleich der Tobamovirusisolate wurde ein Agargeldoppeldiffusionstest nach Ouchertlony (1968) in Plastikpetrischalen durchgeführt. Die Durchmesser der 1 cm voneinander entfernten Vertiefungen im Agar betrugen 4 mm. Auf einer Petrischale wurden vier Tests mit jeweils unterschiedlichen Antikörperkonzentrationen [1:1000, 1:500, 1:100, 1:10, v:v in Konjugatpuffer für ELISA (Kap. 2.2.5.1)] und sechs Pflanzenproben durchgeführt. Als Antigene wurden aufgereinigte Virusisolate (Kap.2.1.3) aus krautigen Testpflanzen eingesetzt.

Sodiumdodecylsulfat-Polyacrylamid-Gelelektrophorese (SDS-PAGE)

Die in der Nukleokapsidaufreinigung angereicherten Proteine (Kap. 2.2.2) wurden mit Hilfe der SDS-PAGE in einer vertikalen Elektrophoresekammer (Mini Protean 3 Cells, Fa. Bio-Rad) nach ihrem Molekulargewicht aufgetrennt. Die Acrylamidkonzentration des Trenngels betrug 12,5 %, diejenige des Sammelgels 4 %. Die Zusammensetzung der Gellösung ist in Tab. 2.4 dargestellt.

Tab. 2.4: Zusammensetzung der Gellösung (Volumina für zwei Gele)

* 25 % (Acrylamid/ Bisacrylamid: 37,5:1; Fa. Roth)

10 µl angereicherter Nukleokapside wurden mit 10 µl 2 x Probenpuffer versetzt, für 5 min bei 95 °C inkubiert und sofort auf Eis gestellt. Als Größenstandard diente ein ungefärbter Protein-Molekulargewichtsmarker der Fa. Fermentas. Dieser wurde 1:5 (v:v) im 2 x Probenpuffer verdünnt und in derselben Weise wie die Proben vorbehandelt. Die elektrophoretische Trennung erfolgte bei 125 Volt für etwa 1,5 h in Elektrophoresepuffer. Die Proteinbanden wurden anschließend mit Hilfe der Silberfärbung visualisiert.

Puffer und Lösungen:

Silberfärbung

Die Färbung der im Polyacrylamid-Gel aufgetrennten Proteine erfolgte durch eine hochempfindliche Silberfärbung, modifiziert nach Blum (1987).

Nach der gelelektrophoretischen Trennung wurde das Gel für 1 h im Fixierbad geschwenkt und anschließend 2 x 20 min zunächst in Waschlösung 1 und dann 1 min in Waschlösung 2 inkubiert. Zur Neutralisierung wurde das Gel 3 x 20 sec in ddH₂O gewaschen, bevor die Proteine durch 20 min Schwenken (Belly Dancer, Fa. Stovall) in einer 0,2 %igen Silbernitratlösung angefärbt wurden. Nach einem weiteren Waschschritt (2 x 20 sec in ddH₂O) wurden die Proteinbanden durch Inkubation in Entwicklerlösung detektiert und die Reaktion durch 2 x 2 min Waschen in ddH₂O gestoppt. Das Gel wurde abschließend 10 min in Fixierlösung geschwenkt und zur Konservierung 30 min in Waschlösung 3 inkubiert. Die Proteinbanden wurden unter Durchlicht ausgewertet und mit Hilfe der Spiegelreflexkamera Canon EOS 300 dokumentiert.

Lösungen:

2.2.6.1  Isolierung von Gesamt-RNA

Nukleinsäureextrakte wurden aus Blatt-, Knospen- und Rindenproben von Gehölzen sowie aus Blattproben von krautigen Indikatorpflanzen hergestellt und zum Virusnachweis mittels RT-PCR mit sequenzspezifischen Primern eingesetzt. Die Bestimmung der Konzentration der isolierten Gesamt-RNA erfolgte durch spektralphotometrische Messungen (Kap. 2.2.6.8). Die Qualität der Gesamt-RNA wurde durch elektrophoretische Trennung im Agarosegel überprüft (Kap. 2.2.6.9). Gesamt-RNA wurde unter Verwendung von vier verschiedenen Extraktionsverfahren isoliert.

Isolierung von Gesamt-RNA mit Hilfe von Invisorb® Nukleo Spin Plant RNA Mini Kit (Invitek)

Die Isolierung von Gesamt-RNA aus Gehölzen und krautigen Pflanzen mit Invisorb® Nukleo Spin Plant RNA Mini Kit (Fa. Invitek) wurde nach Anleitung des Herstellers durchgeführt.

Isolierung von Gesamt-RNA modifiziert nach Dellaporta et al. (1983)

0,5 g Pflanzenmaterial wurden in flüssigem Stickstoff (ohne Quarzsand) pulverisiert und in vorgekühlte 2 ml Eppendorfgefäße überführt. Je 0,5 g Pflanzenmaterial wurden 750 µl Extraktionspuffer sowie 400 µl Chloroform und 400 µl Phenol zugegeben und gut gemischt.

Die Abtrennung unlöslicher Pflanzenbestandteile erfolgte durch 20 min Zentrifugieren bei 15.000 rpm, 4 °C (Beckman-Coulter Microfuge® R Festwinkelrotor F241,5). Zum Aufschluss der Proteine wurde der wässrige Überstand mit 50 µl Natriumdodecylsulfat (SDS, 1/15 Vol.) versetzt, gut gemischt (MS 1 Minishaker, Fa. IKA) und für 10 min bei 65 °C inkubiert.Das Gemisch wurde mit250 µl (0,3125 Vol.) Kaliumacetatlösung versetzt, bevor es für 20 min auf Eis inkubiert und nachfolgend für 20 min bei 15.000 rpm, 4 °C zentrifugiert wurde (Beckman-Coulter Microfuge® R Festwinkelrotor F241,5). Die Nukleinsäuren wurden anschließend unter Zugabe von 650 µl (0,65 Vol.) Isopropanol für 30 min bei -20 °C gefällt und für 20 min bei 15.000 rpm, 4 °C sedimentiert (Beckman-Coulter Microfuge® R Festwinkelrotor F241,5). Nach Lösen des Sedimentes in 100 µl 0,1 x TE-Puffer wurden die Nukleinsäuren über Nacht bei -20 °C erneut gefällt (Kap. 2.2.6.7), in 50 µl 0,1 x TE-Puffer aufgenommen und zur Degradation pflanzlicher DNA 1 h bei 37 °C mit 10 U DNAse1 verdaut. Die Gesamt-RNA wurde bei -20 °C gelagert.

Puffer und Lösungen:

Isolierung von Gesamt-Nukleinsäuren modifiziert nach Boom et al. (1990)

Für die Isolierung von Gesamt-Nukleinsäuren, modifiziert nach Boom et al. (1990), wurden 100 mg Pflanzenmaterial (Rinde, Blätter) in flüssigem Stickstoff pulverisiert und in 1 ml Extraktionspuffer aufgenommen. Jeweils 500 µl des Gemisches wurden in ein steriles 2 ml Eppendorf-Reaktionsgefäß überführt, mit 10 % SDS versetzt und unter zwischenzeitlichem Mischen für 10 min bei 70 °C inkubiert. Der Extrakt wurde für 5 min auf Eis gekühlt und anschließend für 10 min bei 13.000 rpm, 4 °C zentrifugiert (Beckman-Coulter Microfuge® R Festwinkelrotor F241,5). Je 300 µl des nukleinsäurehaltigen Überstandes wurden in ein neues Reaktionsgefäß überführt, und mit 300 µl Natriumiodid-Lösung, 150 µl Ethanol absolut sowie 25 µl Silica-Lösung versetzt. Zur Bindung der Nukleinsäuren an die Silicapartikeln wurde das Gemisch für 10 min bei RT inkubiert und zwischendurch vorsichtig gemischt. Die Sedimentation der gebundenen Nukleinsäuren erfolgte durch 10 min Zentrifugieren bei 6000 rpm, 4 °C (Beckman-Coulter Microfuge® R Festwinkelrotor F241,5). Anschließend wurde das Sediment zweimal mit 500 µl Waschpuffer gewaschen, in 200 µl H₂O_DEPC resuspendiert und für 4 min auf 70 °C erhitzt. Nach 5 min Zentrifugieren bei 13.000 rpm, 4 °C (Beckman-Coulter Microfuge® R Festwinkelrotor F241,5 ) wurde der nukleinsäurehaltige Überstand in ein neues Reaktionsgefäß überführt und mit Chloroform/Phenol extrahiert (Kap. 2.2.6.6). Die Fällung der RNA aus der wässrigen Phase erfolgte über Nacht bei -20 °C (Kap. 2.2.6.7). Die Gesamt-RNA wurde anschließend in 30 µl H₂O_DEPC aufgenommen und bei -20 °C gelagert.

Puffer und Lösungen:

Für die Isolierung von dsRNA wurde die Methode nach Benthack (2001) verwendet, die auf Untersuchungen von Morris & Dodds (1979) zurückgeht und für die Isolierung von dsRNA aus Ebereschen modifiziert worden war. DsRNA-Isolierungen erfolgten aus 50-100 g Blattmaterial, 12-15 g Rindegewebe sowie 8-10 g Knospen erkrankter und symptomloser Stieleichen. Studien zum Einfluss des Probenahmezeitpunktes und -standortes, des Ausgangsmaterials, der Lagertemperatur und -dauer, des Pflanzenmaterials sowie des Extraktionsverfahrens auf die Menge und Qualität der dsRNA sind im Rahmen einer Projektarbeit durchgeführt worden und einem Tagungsbeitrag zu entnehmen (Rott et al., 2004).

Zur Extraktion wurde das Pflanzenmaterial zunächst in flüssigem Stickstoff pulverisiert, mit Extraktionspuffer versetzt und für 3 min mit einem Ultra Turrax (T 25, Fa. Ika) homogenisiert. Anschließend wurde das Homogenat für 30 min bei RT kräftig geschüttelt (TH 25 swip, Fa. Edmund Bühler) und für 10 min bei 37 °C inkubiert. Die Sedimentation grober Pflanzenbestandteile erfolgte durch 20 min Zentrifugieren bei 4000 rpm, 4 °C (Hettich Universal 16 R, Ausschwingrotor 1624). Zur spezifischen Bindung der dsRNA wurde der wässrige Überstand mit 0,2 Vol. 96 %igem Ethanol und 2 g CF11-Cellulose (Fa. Sigma) versetzt und 30 min kräftig geschüttelt (TH 25 swip, Fa. Edmund Bühler). Die an die CF11-Cellulose gebundene dsRNA wurde durch 10 min Zentrifugieren bei 4000 rpm, 4 °C (Hettich Universal 16 R, Ausschwingrotor 1624) sedimentiert und 3 x mit 40 ml Waschpuffer gewaschen. Dazu wurde die Lösung 15 min geschüttelt, 10 min bei 4000 rpm, 4 °C zentrifugiert (Hettich Universal 16 R, Ausschwingrotor 1624), der Überstand abgegossen und neuer Waschpuffer zugesetzt. Nach dem letzten Waschschritt wurde die Cellulose in 20 ml Waschpuffer aufgenommen, in eine 20 ml Kunststoffspritze überführt und mit Pressluft getrocknet. Die gebundenen Nukleinsäuren wurden mit 13 ml Elutionspuffer (5+5+3 ml; dazwischen Pressluft) eluiert und unter Zugabe von 0,2 Vol. 96 %igem Ethanol durch 20 min kräftiges Schütteln (TH 25 swip, Fa. Edmund Bühler) erneut an CF11-Cellulose (0,5 g) gebunden. Das Cellulosegemisch wurde sofort in eine 20 ml Kunststoffspritze überführt und durch Pressluft getrocknet. Die dsRNA wurde mit 2 ml Elutionspuffer (1+1 ml; dazwischen Pressluft) eluiert, zur Beseitigung von Celluloseresten für 3 min bei 13.000 rpm, 4 °C zentrifugiert (Beckman-Coulter Microfuge® R, Festwinkelrotor F241,5) und über Nacht bei -20 °C gefällt (Kap. 2.2.6.7). Zur Stabilisierung der dsRNA wurde das Präzipitat vor dem DNase/RNase-Verdau in 140 µl H₂O_DEPC resusendiert und mit 60 µl 1M MgCl₂ (Endkonzentration: 0,3 M) versetzt. Die Degradation von DNA- und ssRNA-Resten erfolgte unter Zugabe von 1 µl RNase A (100 µg/ml) und 1,4 µl DNase (14 U) und 40 min Inkubieren bei 37 °C. Zur Inaktivierung der Enzyme wurde das Gemisch 2 x mit Phenol/Chloroform und 1 x mit Chloroform extrahiert (Kap. 2.2.6.6). Die dsRNA aus der wässrigen Oberphase wurde durch 12 h Fällung bei -20 °C konzentriert (Kap. 2.2.6.7) und anschließend in 20 µl H₂O_DEPC resuspendiert. Zur Berechnung der Konzentration wurde 1 µl der isolierten dsRNA spektralphotometrisch gemessen (Kap. 2.2.6.8). 8-10 µl dsRNA wurden zur Überprüfung des Bandenmusters im Agarosegel aufgetrennt und der Rest von 10 µl bei -80 °C gelagert.

Puffer und Lösungen:

Waschpuffer: 1 x STE _DEPC, 16 % Ethanol

Elutionspuffer: 1 x STE _DEPC

Zur Optimierung der dsRNA-Isolierung aus Stieleichen wurden die in Tab. 2.5 aufgeführten Modifikationen der angegebenen Arbeitsschritte mit Blattmaterial erkrankter Stieleichen getestet. Für diese Untersuchungen wurde eine Mischprobe infizierter Stieleichenblätter eingesetzt, die im Juni 2003 entnommen und bei -80 °C gelagert worden war (E 878).

Tab. 2.5: Varianten der dsRNA-Isolierung unter Angabe des Arbeitsschrittes und der Modifikation

Hinsichtlich des verwendeten Probenmaterials wurden folgende Einflussfaktoren untersucht:

Um zu prüfen, ob die Lagerungsform und -dauer einen Einfluss auf die Ausbeute an dsRNA hat, wurden von den Standorten B 1-3 (Kap. 2.1.1) im Mai und Juni des Jahres 2003 jeweils vier Proben infizierten und symptomlosen Blattmaterials und im März Rindengewebe sowie Knospen von symptomtragenden Stieleichen entnommen. Die Rinden-und Knospenproben wurden für fünf Tage bei 4 °C aufbewahrt und anschließend bei -80 °C gelagert. Jeweils 50 g gesundes (E 823) und infiziertes Blattmaterial (E 825) wurden in flüssigem Stickstoff zerkleinert und für eine Nacht bei -80 °C gelagert. Die gleiche Menge Blattmaterial symptomtragender (E 886) und symptomloser (E 824) Stieleichen wurde für acht Monate bei -80 °C gelagert. Zum Vergleich wurden Blattproben verwendet, die für sechs (E 551, E 552) bzw. 17 Monate (E 534 a, E 545 a) bei -20 °C gelagert worden waren. Nachfolgend wurden aus jeweils 50 g Blattmaterial sowie 10 g Rinden- und 8 g Knospenmaterial dsRNA nach Benthack (2001) isoliert und die Reinheit und Ausbeute sowohl durch Gelelektrophorese (Kap. 2.2.6.9) als auch durch photometrische Messung (Kap. 2.2.6.8) überprüft.

Für Untersuchungen zur Abhängigkeit der dsRNA-Konzentration vom Zeitpunkt der Probenahme wurden Eichenblattproben einmal Ende Mai, dreimal im Juni, Juli und August und zweimal im Oktober am Standort B 1 entnommen und jeweils 50 g in die dsRNA-Isolierung eingesetzt (Tab. A1, Anhang 4).

Eluierung von dsRNA aus Agarosegelen

Für die Klonierung bzw. Amplifizierung von dsRNA aus Stieleichen wurden die spezifischen Banden unter UV-Licht mit einer sterilen Rasierklinge ausgeschnitten und in ein steriles, RNase-freies 1,5 ml Eppendorf-Gefäß überführt.

Die Isolierung von dsRNA aus Agarosegelen ist mit vier verschiedenen Methoden durchgeführt worden. Methode 1) basiert auf dem Prinzip der Abtrennung der Agarose von den Nukleinsäuren durch Filtration. Mit den Methoden 2) und 4) wurde die dsRNA durch Phenol-Chloroform-Extraktion vom Agarosegel getrennt. Methode 3) beschreibt eine Kombination zwischen Gelfiltration und Chloroform-Phenol-Extraktion. Alle Proben wurden nach der Reinigung bei -20 °C gefällt (Kap. 2.2.6.7), in 5 µl H₂O_DEPC aufgenommen und im 1 % igen Agarosegel überprüft. Zur cDNA-Synthese wurden 5 µl der aus dem Gel eluierten dsRNA-Probe E 841 eingesetzt.

Die dsRNA-Isolierung aus Agarosegelen unter Verwendung des NucleoSpin® Extrakt Kit erfolgte entsprechend den Herstellerangaben der Fa. Macherey & Nagel.

Das ausgeschnittene Gelstück wurde zunächst unter Zugabe von 300 µl/100 mg Agarose NT-Puffer aus dem NucleoSpin® Extrakt Kit (Fa. Macherey & Nagel) bei 65 °C aufgeschmolzen und zwischendurch gut gemischt (MS 1 Minishaker, Fa. IKA ). Danach wurde die dsRNA durch eine Behandlung mit Chloroform und Phenol von der Agarose getrennt (Kap. 2.2.6.6).

Die Extraktion von dsRNA aus 1 %iger ‘Low Melt’-Agarose wurde nach den Angaben im Protokoll durchgeführt. Dazu wurde das Gelstück unter Verwendung einer 300 mM MgCl-Lösung durch 3 mm Whatman-Papier filtriert und anschließend mit Chloroform und Phenol extrahiert (Kap. 2.2.6.6).

Das ausgeschnittene Gelstück wurde mit 5 Vol. Extraktionspuffer (20 mM Tris-HCl, 1 mM EDTA, pH 8,0) versetzt, 5 min bei 65 °C inkubiert und zwischendurch kräftig gemischt (MS 1 Minishaker, Fa. IKA). Die Trennung der Nukleinsäuren vom Agarosegel erfolgte durch eine Chloroform-Phenol-Extraktion (Kap. 2.2.6.6).

Eluierung von DNA-Fragmenten aus Agarosegelen

Präparative DNA-Gelelektrophoresen wurden in Abhängigkeit von der Gelgröße bei 50-80 V, wie in Kap. 2.2.6.9 beschrieben, durchgeführt. Die gewünschten Fragmente wurden unter UV-Licht ausgeschnitten und die Agarose unter Verwendung von QuiAquick Gel Extraction Kit (Fa. Quiagen), NucleoSpin® Extract Kit (Fa. Macherey & Nagel) oder Just Spin® Gel Extraction Kit (Fa. Genaxxon) nach den beiligenden Protokollen entfernt. Anschließend wurde die DNA mit 30-50 µl Eluierungspuffer der jeweiligen Hersteller eluiert, über Nacht gefällt (Kap. 2.2.6.7) und in 3-10 µl H₂O_DEPC resuspendiert. Die gelösten Nukleinsäuren wurden bei -20 °C gelagert oder sofort in den Vektor pGEM® -T Easy (Fa. Promega) ligiert.

Gesamt-DNA wurde aus jeweils einer Blattprobe Chenopodium quinoa (symptomlos) und Quercus robur (mit Symptomen) unter Verwendung des NucleoSpin® Plant Kit (Fa. Macherey & Nagel) nach Angaben des Herstellers extrahiert. Die Qualität der DNA-Präparation wurde anschließend im 1 %igen nativen Agarosegel anhand des Bandenmusters überprüft (Kap. 2.2.6.9).

Schnellisolierung von Plasmid-DNA

Für die Durchführung von Restriktionsanalysen wurde die Plasmid-DNA durch eine Schnellisolierung aus den E.coli-Bakterienzellen gereinigt.

Mit einer über Nacht gewachsenen E. coli-Einzelkolonie wurden 5 ml LB-Medium (Kap. 2.1.8 + Amplizilin, 50 µg/ml) angeimpft und über Nacht bei 37 °C unter Schütteln (TH 25 swip, Fa. Edmund Bühler, 180 rpm) vermehrt. Die Bakterienzellen von 1,5 ml Flüssigkultur wurden durch Zentrifugation sedimentiert (30 sec 12.000 rpm, RT; Beckman-Coulter Microfuge® R, Festwinkelrotor F241,5), das Bakteriensediment in 100 µl eisgekühlter Lösung 1 resuspendiert, mit 200 µl frisch zubereiteter Lösung 2 versetzt, fünfmal invertiert und auf Eis inkubiert. Nach Neutralisation durch Zugabe von 150 µl eisgekühlter Lösung 3, mischen (MS 1 Minishaker, Fa. IKA) und 2 min Inkubieren auf Eis, wurden Proteine und chromosomale Bakterien-DNA durch Zentrifugation (5 min bei 12.000 rpm, 4 °C; Beckman-Coulter Microfuge® R, Festwinkelrotor F241,5) sedimentiert. Die Plasmid-DNA im Überstand wurde in ein neues 1,5 ml-Eppendorf-Gefäß überführt und einmal mit Chloroform und Phenol extrahiert (Kap. 2.2.6.6). Die Fällung der Plasmid-DNA aus dem wässrigen Überstand erfolgte mit 2 Vol. EtOH (96 %) für 2 min bei RT. Durch 5 min Zentrifugieren bei 12.000 rpm, 4 °C (Beckman-Coulter Microfuge® R, Festwinkelrotor F241,5) wurde die Plasmid-DNA sedimentiert, einmal mit 70 % EtOH gewaschen und erneut 5 min bei 12.000 rpm, 4 °C zentrifugiert (Beckman-Coulter Microfuge® R, Festwinkelrotor F 241,5). Das Sediment wurde im Vakuum (Speed Vac SC 100, Fa. Savant) getrocknet, in 50 µl TE-Puffer gelöst und bei 4 °C aufbewahrt.

Puffer und Lösungen:

Isolierung von Plasmid-DNA mit NucleoSpin® Plasmid (Fa. Macherey & Nagel)

Wurden Präparationen von einem hohen Reinheitsgrad benötigt, wie beispielsweise für die Sequenzierung, erfolgte die Isolierung von Plasmid-DNA mit dem NucleoSpin® Plasmid Kit (Fa. Macherey & Nagel) nach den Herstellerangaben.

Um Nukleinsäuren von Proteinen und Lipiden zu reinigen, wurden diese mit 1 Vol. Phenol/Chloroform versetzt und gründlich durchmischt. Anschließend wurden die Phasen durch Zentrifugation (8 min bei 13.000 rpm, 4 °C; Beckman-Coulter Microfuge® R, Fest-winkelrotor F241, 5) voneinander getrennt. Die obere wässrige Phase wurde abgenommen und erneut mit 1 Vol. Phenol/Chloroform extrahiert. Zur Entfernung von Phenolresten wurde die wässrige Phase einmal mit 1 Vol. Chloroform extrahiert. Die so gereinigten Nukleinsäuren konnten anschließend als Natrium- oder Lithiumchloridsalz mit EtOH aus der wässrigen Phase präzipitiert werden.

Gereinigte Nukleinsäuren wurden mit 1/10 Vol. 3 M Natriumacetat (pH 5,2) sowie 2,5 Vol. EtOH (absolut) eiskalt versetzt und über Nacht bei -20 °C oder -80 °C gefällt. Die Fällung von Gesamt-RNA wurde alternativ mit 4 M LiCl durchgeführt.

Im Anschluss an die Fällung wurden die Nukleinsäuren für 40 min bei 13.000 rpm, 4 °C sedimentiert (Beckman-Coulter Microfuge® R, Festwinkelrotor F241, 5). Zum Entfernen der Salze wurden die Präzipitate zweimal mit 70 % EtOH eiskalt gewaschen, je 20 min zentrifugiert (Beckman-Coulter Microfuge® R, Festwinkelrotor F 241,5; 13.000 rpm, 4 °C) und für 5 min unter Vakuum (Speed Vac SC 100, Fa. Savant) getrocknet. Die Nukleinsäuren wurden in 20 µl H₂O_DEPC aufgenommen und bei -20 °C gelagert.

Konzentration und Reinheit von Nukleinsäuren (Gesamt-RNA, dsRNA, Plasmid-DNA) wurde mit Hilfe von vierSpektralphotometern (ND-1000, Fa. Nanodrop; Ultraspec 2000, Fa. Pharmacia Biotech; UV 1202, Shimadzu; Uvikon 930, Fa. Kontron Instruments) bestimmt.

Die Absorption der Nukleinsäuren wurde bei 260 nm gemessen und die Konzentration nach folgender Formel berechnet:

Nukleinsäurekonzentration (µg/ml) = Absorption_λ260 x 40

Der Reinheitsgrad der Nukleinsäuren errechnet sich aus dem Verhältnis Absorption_λ260 / Absorption_λ280. Qualitativ reine RNA weist nach Sambrook et al. (1989) einen Quotienten von 2,000 auf.

Native Gelelektrophorese

Zur Größenbestimmung von Nukleinsäurefragmenten und zur Überprüfung der Reinheit der Nukleinsäuren wurden diese in 1 %igen Agarosegelen elektrophoretisch getrennt. Die Gelelektrophorese erfolgte in einer Standard-Gelkammer (Gelgröße 10 x 10 cm) der Fa. Biometra und in einer Mini-Gelkammer der Fa. Bio-Rad. Gelkammer, Gelträger und Kamm waren für mindestens 30 min in 1 %iger SDS-Lösung zu inkubieren um RNase-frei zu sein. Zur gelelektrophoretischen Trennung wurde die Agarose in 1 x TBE-Puffer durch Kochen gelöst und in den Gelträger gegossen. Die Proben wurden mit 1/5 des Vol. mit Probenpuffer vermischt und in die Geltaschen pipettiert. Als Größenstandards wurden die DNA-Molekulargewichtsmarker 50 bp, 100 bp, 1 kb (Fa. Fermentas) sowie pUC Mix-Marker (Fa. Fermentas) und Lamda-DNA aus eigener Präparation verwendet. Die Trennung erfolgte in einem 1 x TBE-Puffer bei 80-100 V für mindestens 1 h. Nach Ethidiumbromidfärbung wurden die Nukleinsäurebanden auf einem UV-Tisch visualisiert und dokumentiert (BioDocAnalyze, Fa. Biometra).

Puffer:

Denaturierende Gelelektrophorese- Formaldehydgel

Ausgewählte Gesamt-RNA-Präparationen wurden in einem 1,5 %igen denaturierenden Formaldehydgel analysiert. Für ein Minigel (8,0 x 6,5 cm) wurden 0,75 g Agarose in 44 ml H₂O_DEPC und 5 ml 10 x MOPS in einer Mikrowelle aufgeschmolzen. Nach Abkühlung der Lösung auf ca. 68 °C wurden 0,9 ml einer 37 %igen Formaldehydlösung zugesetzt. Das ausgehärtete Gel wurde für 15 min im Laufpuffer äquilibriert. Für die gelelektrophoretische Trennung wurden 2 µl Gesamt-RNA in 2 µl H₂O_DEPC verdünnt, mit 1 µl 5 x Probenpuffer versetzt, 15 min bei 65 °C denaturiert und bis zum Probenauftrag auf Eis zwischengelagert. Die Gelelektrophorese erfolgte in einer Mini-Gelkammer (Fa. Bio-Rad) bei einer Spannung von 50 V für 2 h. Das Gel wurde anschließend mit Ethidiumbromid gefärbt und unter UV- Licht mit Hilfe der Fotodokumentationsanlage GelValue UV Transilluminator (Fa. Syngene) ausgewertet und dokumentiert.

Puffer:

Probenpuffer (10 ml):

Denaturierende Gelelektrophorese- Glyoxal/ Dimethyl-Sulfoxid (DMSO)-Gel

DsRNA wurde in Verbindung mit Northern-Blot-Analysen in einem Glyoxal/DMSO-Gel aufgetrennt. Für ein Minigel wurden 0,5 g Agarose in 50 ml Laufpuffer aufgeschmolzen und in den Gelträger gegossen. Gelkammer, Gelträger und Kamm wurden zuvor in 1 % SDS RNase-frei gemacht.

Zur Probenvorbereitung wurden folgende Reagenzien ad 30 µl pipettiert:

Das Gemisch wurde für 1 h bei 50 °C inkubiert und danach sofort auf Eis gestellt. Nach dem Zusatz von 3 µl 10 x Ladepuffer wurden die Proben in die Geltaschen pipettiert. Die Trennung erfolgt für 2 h bei 60 V. Das Gel wurde anschließend sofort auf eine Nylon-Membran geblottet (Kap. 2.2.12).

Puffer:

Für den Nachweis bekannter Krankheitserreger/Sequenzen wurden zwei verschiedene PCR-Verfahren angewendet:

-RT-PCR (CLRV/Ebereschenringfleckigkeit/dsRNA Stieleiche)

-IC-RT-PCR (TMV/ToMV)

2.2.7.1  Reverse Transkription

Die Reverse Transkription wurde mit RNA-komplementären Primern in einem 20 µl-Ansatz durchgeführt. Zunächst wurden 2-5 µg Gesamt-RNA mit 100 pmol Erststrangprimer in dem entsprechenden Volumen H₂O_DEPC für 5 min bei 70 °C (Gesamt-RNA) bzw. 95 °C (dsRNA) denaturiert. Danach wurde der Reaktionsansatz sofort auf Eis gestellt und unter Zusatz folgender Reagenzien für 1 h bei 42 °C inkubiert.

Die Reaktion wurde durch 10 min Erhitzen bei 70 °C beendet.

Die Erststrangsynthese aus dsRNA mit sequenzspezifischen Primern wurde in einem 100 µl Ansatz analog den Angaben in Kap. 2.2.9.2 durchgeführt. Im Anschluss an die Erststrangsynthese erfolgte die PCR (Kap. 2.2.7.3).

Als Probenmaterial für die IC-RT-PCR wurden aufgereinigte Viruspartikeln und Rohpresssaft aus krautigen und holzigen Pflanzen verwendet. Die Reaktionsgefäße wurden zunächst mit Antikörpern beschichtet (3 h bei 37 °C mit 50 µl Antikörperlösung 1:1000 verdünnt in Beschichtungspuffer). Vor dem Probenauftrag wurden die Gefäße dreimal mit 80 µl Waschpuffer gewaschen. Als Antigen wurden 50 µl des homogenisierten Probenmaterials 1:10 oder 1:5 (w/v) in Probenpuffer in den beschichteten Eppendorfgefäßen über Nacht bei 4 °C inkubiert. Für die anschließende RT-PCR (Kap. 2.2.7.1) wurden die Gefäße dreimal mit 80 µl Waschpuffer gewaschen.

Standardgemäß wurden für alle PCR-Reaktionen 5-10 µl cDNA bzw. Bakterienmaterial einer Einzelkolonie sofern im Text nicht anders vermerkt in folgendem Reaktionsansatz amplifiziert:

In Tab. 2.6 sind alle PCR-Programme unter Angabe der Zeitdauer und Temperatur der Initialen Denaturierung, Denaturierung, Anlagerung, Elongation sowie der Anzahl der Zyklen aufgeführt, die für die Amplifizierung mit sequenzspezifischen Primern verwendet wurden. Die Abschlusselongation erfolgte einheitlich für 5 min bei 72 °C.

Nach dem jeweils letzten PCR-Zyklus wurden die Proben sofort ligiert oder bis zu einer Woche bei 4 °C bzw. für einen Monat bei -20 °C gelagert.

Tab. 2.6: Daten der verwendeten PCR-Programme

*Denat.=Denaturierung; Init. Denat.=initiale Denaturierung

2.2.8.1  Ligation

PCR-Produkte wurden über ein ‘TA-Cloning’ unter Verwendung des Kits pGEM®-T Easy Vector System kloniert. Die Ligation erfolgte nach Herstellerangaben der Fa. Promega. Es wurden 0,5 µl Vektor eingesetzt. Die Transformation der rekombinanten Plasmide erfolgte in jeweils 200 µl chemisch kompetenten Zellen der E. coli- Stämme DH 5α, XL1 Blue oder JM 109 (Kap. 2.1.4).

Für die Erzeugung chemisch kompetenter Zellen wurden die Bakteriensuspensionen einer Glyzerin-Stammlösung von DH 5α und XL1 Blue (-80 °C) mit einer Impföse auf eine LB-Agarplatte (Kap. 2.1.8) ausgestrichen und über Nacht bei 37 °C inkubiert. Zwei Einzelkolonien wurden zur Herstellung von chemisch kompetenten Zellen, die analog nach Hanahan (1983) erfolgte, weiterverwendet.

Vor dem Einsatz wurde eine Testtransformation durchgeführt, um die Transformationseffizienz zu bestimmen. Diese sollte bei den selbst hergestellten kompetenten Zellen 1 x 106/µg Plasmid-DNA betragen.

Für die Transformation rekombinanter Plasmide wurden 200 µl kompetente Zellen (bei -80 °C gelagert) für 10 min auf Eis aufgetaut, vorsichtig mit 5-10 µl Ligationsansatz versetzt und für 20 min auf Eis inkubiert. Es folgte eine Hitzeschockbehandlung für 50 sec bei 42 °C. Anschließend waren die Zellen erneut für 5 min auf Eis zu inkubieren. Nach der Zugabe von 950 µl SOC-Medium (Kap. 2.1.8) wurden die transformierten Bakterienzellen durch kräftiges Schütteln (TH 25, Edmund Bühler, swip) für 90 min bei 37 °C zur Resistenzausbildung angeregt, anschließend in einer Verdünnungsreihe (z.B. 50, 100, 200, 500 µl) auf LB-AIX-Agar (Kap. 2.1.8) ausplattiert und über Nacht bei 37 °C inkubiert. Die rekombinanten Klone wurden zunächst mittels ‘Blue-White Screening’ vorselektiert und anschließend mit Hilfe einer Kolonie-PCR überprüft (Kap. 2.2.7.3, Kap. 2.2.8.4).

Zur Kontrolle der Länge der klonierten Fragmente wurden die Klone in eine PCR mit vektorspezifischen M13-Primern eingesetzt. Dazu wurden die nach der Transformation gewachsenen weißen Einzelkolonien gepickt, auf eine LB-AIX-Platte (Kap. 2.1.8) überimpft und anschließend in einen 50 µl PCR-Ansatz (Kap. 2.2.7.3) suspendiert. Die Amplifikation erfolgte nach den in Kap. 2.2.7.3 angegebenen PCR-Programmen je nach eingesetztem Klonierungsvektor M13, pGEM®- T Easy oder M13, pEZSeq™. 10 µl des Reaktionsansatzes wurden in einem nativen Agarosegel überprüft (Kap. 2.2.6.9).

Zur Identifizierung und Mengenabschätzung der isolierten Plasmid-DNA (Kap. 2.2.6.5) wurde eine Restriktionsanalyse in folgendem Ansatz durchgeführt:

Der Restriktionsansatz wurde bei dem vom Hersteller angegebenen Temperaturoptimum für 1 h inkubiert und zur Analyse in einem 1 %igen nativen Agarosegel aufgetrennt (Kap. 2.2.6.9). Der Vektor pEZSeq™ wurde mit den Enzymen ECO RI und Hind III (Fa. Fermentas; Fa. Promega) linearisiert. Rekombinante Plasmide des Vektors pGEM®-T Esay wurden mit dem Enzym ECO RI restringiert.

Die Sequenzierung der rekombinanten Plasmide wurde vom Institut für Zellbiochemie und Klinische Neurologie der Universität Hamburg, der Landwirtschaftlich-Gärtnerischen Fakultät der Humboldt-Universität zu Berlin oder dem Institut für Biologie, Molekulare Biotechnologie, RWTH Aachen durchgeführt. Die Sequenzvergleiche erfolgten unter Verwendung der Programme BLAST (Altschul et al., 1997), Clustal W (Higgins et al., 1994) und den Sequenzdatenbanken EMBL und NCBI. Phylogenetische Analysen wurden mit Hilfe der Programme Clustal X (Thompson et al., 1997) und TreeView 1.6.6 (Page, 1996) durchgeführt. Die Bestimmung des Molekulargewichtes von abgeleiteten Proteinen erfolgte auf Basis des Programmes PeptidMass (Wilkins et al., 1997; Gasteiger et al., 2005).

Zur Charakterisierung des unbekannten Agens aus Stieleichen wurde eine Erststrangsynthese der dsRNA und der angereicherten Nukleokapsid-Nukleinsäure mit hexameren Zufallsprimern bzw. DOP-Primern vorgenommen. Die cDNA wurde als Template in eine DOP-PCR eingesetzt (Kap. 2.2.9.4) oder nach der Zweitstrangsynthese direkt in einen ‘Blunt End’-Vektor kloniert (Kap. 2.2.9.3).

2.2.9.1  Erststrangsynthese in Anlehnung an Benthack (2001)

Für die Erststrangsynthese wurden 15 ng dsRNA und 0,4 µg Zufalls-Primer für 5 min bei 95 °C denaturiert und anschließend sofort auf Eis gestellt. Nach der Primerbindung an die dsRNA erfolgte die Reverse Transkription in folgendem Ansatz:

Die Reverse-Transkriptase-Reaktion wurde wie folgt durchgeführt (Mastercycler Gradient, Fa. Eppendorf):

Anschließend wurden die Proben auf Eis gekühlt und 5-10 µl des Ansatzes in eine DOP-PCR eingesetzt (Kap. 2.2.9.4).

Die Erststrangsynthese von dsRNA erfolgte in einem Reaktionsansatz von 100 µl (Abb. 2.2). Als Erststrangprimer wurden DOP-Primer bzw. hexamere Zufalls-Primer eingesetzt. Die dsRNA wurde entweder unter Verwendung von DMSO oder durch Hitze denaturiert.

Denaturierung unter Verwendung von DMSO

Zur Denaturierung mit DMSO wurden etwa 30 ng dsRNA mit 0,8 µg DOP-Primer und 144 µl DMSO für 30 min bei 65 °C inkubiert und danach sofort auf Eis gestellt. Nach einer Fällung des Reaktionsansatzes über Nacht bei -80 °C (Kap. 2.2.6.7) wurde das Präzipitat mit folgenden Reagenzien ad 20 µl H₂O_DEPC versetzt:

Hitzedenaturierung

330 ng dsRNA bzw. 10 µl aufgereinigte Nukleokapsid-Fraktion wurden mit 0,8 µg DOP-Primer oder 0,9 µg hexamerem Zufalls-Primer in einem Reaktionsvolumen ad 100 µl H₂O_DEPC für 5 min bei 95 °C denaturiert.

Nach der Denaturierung wurde der Reaktionsansatz sofort auf flüssigem Stickstoff gefroren und mit folgenden Reagenzien versetzt:

Die Reverse Transkription wurde nach folgendem Schema durchgeführt:

Die Inaktivierung des Enzyms erfolgte durch 10 min Erhitzen bei 70 °C. Die cDNA wurde über Nacht bei -80 °C gefällt (Kap. 2.2.6.7) und in der DOP-PCR partiell amplifiziert. In einem alternativen Versuchsansatz wurde die cDNA zur Zweitstrangsynthese eingesetzt.

Die Zweitstrangsynthese und Klonierung der cDNA erfolgte nach Herstellerangaben des Universal RiboClone® cDNA Synthesis Kit, Fa. Promega.

Zweitrangsynthese

Die cDNA wurde nach der Ethanolfällung in 100 µl Zweitstrang-Mix gelöst.

* Tris-HCl (100 mM); KCl (225 mM); MgCl₂ (7,5 mM); DTT (7,5 mM); BSA (125 µl/ 10 ml Puffer)

Der Reaktionsansatz wurde für 2 h bei 14 °C inkubiert. Die Inaktivierung der Enzyme erfolgte für 10 min bei 70 °C. Die Proben wurden danach sofort auf Eis gestellt.

Blunt End Polishing’

Vor der ‘Blunt End’-Klonierung wurde die durch Zweitstrangsynthese entstandene dsDNA für 10 min bei 37 °C mit 2,5 U T4-DNA-Polymerase inkubiert. Die Inaktivierung des Enzyms erfolgte für 10 min bei 70 °C. Anschließend wurden 10 U T4-Polynukleotidkinase und 2,5 µl ATP (40 µM) zugesetzt und eine Inkubation von 30 min bei 37 °C durchgeführt. Die Probe wurde auf Eis überführt und nach Herstellerangaben mit dem NukleoSpin ® Extract Kit (Fa. Macherey & Nagel) aufgereinigt (Kap. 2.2.6.3). Die Eluierung erfolgte mit 50 µl Eluierungspuffer. Zur Aufkonzentrierung der dsDNA wurde die Probe erneut über Nacht bei -80 °C gefällt (Kap. 2.2.6.7). Das Sediment wurde in 6,5 µl H₂O_DEPC gelöst und nach Herstellerangaben in den ‘Blunt End’-Vektor pEZSEq™ (Fa. Lucigen) ligiert. Die Transformation der rekombinanten Plasmide erfolgte wie in Kap. 2.2.8.3 beschrieben.

Alternativ zur Zweitstrang-Synthese wurde der RNA-DNA-Hybrid in einer DOP-PCR amplifiziert (Abb. 2.3). Dafür wurden zwei verschiedene Reaktionsansätze verwendet, die in Tab. 2.7 dargestellt sind.

Tab. 2.7: DOP-PCR-Ansätze

Die DOP-PCR wurde mit zwei verschiedenen Programmen im Mastercycler Personal (Fa. Eppendorf) und im Robocycler (Fa. Stratagene) durchgeführt.

10 µl des Ansatzes wurden im Agarosegel überprüft (Kap. 2.2.6.9). Das PCR-Produkt wurde vor der Klonierung in den Vektor pGEM®-T Easy in einem präparativen Agaroselgel getrennt und aufgereinigt (Kap. 2.2.6.3) oder durch Fällung aufkonzentriert (Kap. 2.2.6.7).

dsDNA Synthese nach Promega(1996)

	Abb. 2.2.

RT-DOP-PCR modifiziert nach Roche (1999)

	Abb. 2.3.

Dig-markierte DNA-Sonden ausgewählter Klone wurden unter Verwendung isolierter Plasmid-DNA in einer PCR-Reaktion mit klonspezifischen oder vektorspezifischen M13-Primern gewonnen. Die Markierung erfolgte mit dem PCR-DIG-Probe Synthesis Kit (Fa. Boehringer Mannheim).

Für die PCR wurde folgender Reaktionsansatz verwendet:

Zur Überprüfung der Sonde wurden 10 µl des Ansatzes in einem 1 %igen Agarosegel aufgetrennt (Kap. 2.2.6.9).

Zur Konzentrationsbestimmung der DIG-markierten Sonden, wurde jeweils 1 µl der DIG- markierten DNA in einer Verdünnungsreihe (100 pg/µl; 10 pg/µl; 1 pg/µl; 0,1 pg/µl; 0,01 pg/µl) auf eine Nylon-Membran vom Typ Nytran® 0,2 (Fa. Schleicher & Schuell) pipettiert. Die Membran wurde zur Fixierung der markierten DNA für 30 min bei 120 °C gebacken und anschließend detektiert (Kap. 2.2.12).

Mittels Northern-Hybridisierung sollte überprüft werden, ob die DIG-markierten Sonden aus Klonen einer RT-DOP-PCR mit der dsRNA hybridisierten. Dazu wurde dsRNA im 1 %igen Agarosegel oder im Glyoxalgel aufgetrennt (Kap. 2.2.6.9). Der ‘Northern Blot’ erfolgte unter RNase-freien Bedingungen.

Gelvorbereitung

Für den ‘Northern Blot’ wurde die dsRNA für drei Stunden in einem Agarose-Minigel (8,0 x 6,5 cm) bei 50 V in 1 x TBE aufgetrennt (Kap. 2.2.6.9), zur Denaturierung der dsRNA für 15 min in 0,05 N NaOH geschwenkt und anschließend für 15 min in 20 x SSC-Puffer neutralisiert.

Da die dsRNA im Glyoxalgel bereits während des Gellaufs durch DMSO denaturiert wurde, konnte das Gel ohne weitere Behandlung für den ‘Northern Blot’ eingesetzt werden.

Vorbereitung der Membran

Vor dem Transfer wurde eine Nylon-Membran (Nytran® 0,2 Fa. Schleicher & Schuell) auf die Gelgröße zugeschnitten, kurz in Wasser gelegt und 5 min in Transferpuffer inkubiert.

Kapillarblot

Der Transfer der Nukleinsäuren vom Gel auf die Membran erfolgte über Nacht in einem Kapillarblot. Dazu wurden 500 ml Transferpuffer eingesetzt. Als Transferpuffer für Agarosegele wurde 20 x SSC-Puffer (Sambrook et al., 1989) verwendet. Für den ‘Northern Blot’ mit Glyoxalgelen wurde eine 7,5 mM NaOH-Lösung (Vrati et al., 1987) eingesetzt. Anschließend wurde die Membran für 1-2 min in Waschlösung 1 gewaschen. Die Fixierung von dsRNA aus Agarosegelen an die Membran erfolgte für 2 h bei 80 °C. Beim Transfer vom Glyoxalgel ist die dsRNA bereits durch die Verwendung eines alkalischen Puffers an die Membran gebunden worden.

Hybridisierung:

DieMembran wurde für 30 min im vorgewärmten Hybridisierungspuffer bei 55 °C drehend inkubiert (Herahybrid 12, Fa.Heraeus). Anschließend wurde die markierte DNA-Sonde für 5 min bei 95 °C denaturiert, sofort für 5 min auf Eis gestellt und dem Hybridiserungspuffer zugesetzt. Um eine Bindung der Sonde an die dsRNA zu erreichen, wurde die Membran über Nacht in der Hybridisierungslösung bei 50 °C drehend inkubiert.

Detektion:

Vor der Detektion wurde die Membran 2 x 5 min bei RT in Waschlösung 2 und 2 x 15 min bei 55 °C in Waschlösung 3 schwenkend inkubiert (Belly Dancer, Fa. Stovall; Herahybrid 12, Fa. Heraeus). Anschließend wurde die Membran für 1-5 min in 50 ml Maleinsäurepuffer und für 30 min in Blocklösunggeschwenkt (Belly Dancer, Fa. Stovall). Der Blocklösung wurde nachfolgend das Anti-DIG AP-Konjugat (1:5000) zugesetzt und die Membran erneut für 30 min darin geschwenkt (Belly Dancer, Fa. Stovall). Es folgte ein Waschschritt (2 x 15 min in Maleinsäurepuffer), bevor die Membran für 2-5 min in Detektionspuffer äquilibriert und in 10 ml Färbelösung abgedeckt inkubiert wurde bis die Banden sichtbar wurden. Das Stoppen der Reaktion erfolgte durch 5-20 min Spülung in Wasser. Zur Dokumentation wurde die Membran mit einer Spiegelreflexkamera (EOS 300, Fa. Canon) fotografiert, anschließend in Folie eingeschweißt und bei 4 °C gelagert.

Puffer und Lösungen:

⁴ NBT: Nitroblautetrazolium
⁵ BCIP: 5-Brom-4-Chlor-3-Indolyl-Phosphat

10 µl dsRNA wurden mit 20 µl Formamid, 7 µl Formaldehyd (37 %, v/v), 2 µl 2 x SSC und 1 µl H₂O_DEPC versetzt, für 15 min bei 68 °C denaturiert, sofort auf Eis gestellt und mit der doppelten Menge 20 x SSC-Puffer gemischt. Die denaturierte dsRNA wurde in 2 µl Tropfen schrittweise auf die trockene Nylon-Membran (Nytran® 0,2 Fa. Schleicher & Schuell) pipettiert und durch 2 h Erhitzen auf 80 °C an der Membran fixiert. Hybridisierung und Detektion erfolgten wie in Kap. 2.2.12 angegeben.