3 Ergebnisse

3.1  Stieleichen mit virusverdächtigen Symptomen in Nord- und Mittel- deutschland

Zu den virusverdächtigen Symptomen an Stieleichen gehören chlorotischen Ringflecken, Scheckungen und mosaikartige Blattverfärbungen, die im Untersuchungszeitraum von 2001 bis 2004 an allen in Kap. 2.1.1 aufgeführten Probenahmestandorten in Nord- und Mitteldeutschland zu beobachten waren. Die Symptome waren ungleichmäßig über die Baumkronen verteilt. In einer Erhaltungssämlingsspenderplantage für Stieleichen in NRW, FA Hilchenbach traten die virusverdächtigen Symptome im Zeitraum der laufenden Untersuchungen von 2001 bis 2003 häufig nur an einzelnen Blättern auf. Die Stieleichen am Standort SN, FA Dresden-Nord zeigten an ganzen Astpartien virusverdächtige Symptome. Die beobachteten Krankheitsbilder, sowie die Anzahl bonitierter und erkrankter Stieleichen sind unter Angabe des Probenahmestandortes in Tab. 3.1 aufgeführt.

Der Beginn und die Intensität der Symptomentwicklung waren witterungsabhängig und veränderten sich im zeitlichen Verlauf der Vegetationsperiode. Nach Bonituren ausgewählter Bäume an den Berliner Standorten (B 1-3) waren die ersten Symptome zum Zeitpunkt des Blattaustriebes Mitte Mai zu beobachten. Hellgrüne, scharf abgegrenzte chlorotische Ringflecken hoben sich nur undeutlich von der Ausfärbung der jungen Eichenblätter ab (Abb. 3.1, Bild 1). Im späteren Verlauf veränderten sich die Ringflecken zu gelben abgegrenzten Chlorosen, deren Gewebe ab Ende Juli verstärkt Nekrosen aufzeigte (Abb. 3.1, Bild 2).

	Abb. 3.1

Tab. 3.1: Anzahl der erkrankten Stieleichen im Untersuchungszeitraum 2001-2004 an den aus-gewählten Probenahmestandorten unter Angabe der Anzahl der bonitierten Gehölze und der beobachteten Symptombilder

(-)= nicht bonitiert, RF=chlorotische Ringflecken, cRF=gelb-chlorotische Ringflecken, S=Scheckung, M=mosaikartige Blattverfärbungen, dL=distinkte, nekrotische Läsionen, RF-C=chlorotische Ringflecken +Chlorosen, cRF-dL=chlorotische Ringflecken+distinkte, nekrotische Läsionen

Wie Tab. 3.1 zeigt, konnten in den jährlichen Bonituren der Stieleichen an den Standorten NRW, FA Arnsberg; SN, FA Dresden-Nord, B1 und B 3 über einen Zeitraum von zwei bzw. drei Jahren eine Zunahme von Gehölzen mit virusverdächtigen Symptomen in den Beständen festgestellt werden. In NDS, RFö Hopels, Abt. 1500 sowie NRW, Hauberg hingegen waren im Jahr 2003 weniger erkrankte Gehölze zu beobachten als im Vorjahr. An den Standorten HH, SF Klövensteen und B 2 blieb die Anzahl der markierten Stieleichen mit virusverdächtigen Blattsymptomen in den Jahren 2002-2003 bzw. 2004 gleich.

Am häufigsten trat das Symptombild der chlorotischen Ringflecken, z.T. auch gemischt mit Chlorosen oder distinkten nekrotischen Läsionen, wie am Standort B3 in Berlin (E 538), in NRW, Hauberg (E 555); in NDS, RFö Hopels (E 1722, E 632-E 634); HH, SF Klövensteen (E 637) und SN, FA Dresden-Nord (E 826, E 878) beobachtet, auf (Tab. 3.1, Tab. A1, Anhang 4). Die Intensität der chlorotischen Ringflecken unterschied sich in Abhängigkeit des Standortes. Am Standort SN, Dresden-Nord wurden gelb-chlorotische, scharf abgegrenzte Ringflecken und distinkte nekrotische Läsionen bereits ab Mai an den Blättern erkrankter Stieleichen erfasst (E 826) (Abb. 3.1, Tab. A1, Anhang 4).

In der Größe der chlorotischen Ringflecken konnten Varianten zwischen 2-3 mm (E 863, E 1181, E 1743, B1; Abb. 3.3, Bild 1) und 4 mm (Baum 66, NRW, Hauberg; Abb. 3.3, Bild 2) beobachtet werden.

	Abb. 3.2.

	Abb. 3.3

Erkrankte Stieleichen traten an verschiedenen Standorten vergesellschaftet mit anderen Forstgehölzen auf, die ebenfalls virusverdächtige Blattsymptome aufwiesen. An den Standorten NRW, Hauberg und SN, FA Dresden-Nord konnten in benachbarten Birken und Holunder chlorotische Linienmustern und Blattflecken beobachtet werden.

Ebereschen, mit chlorotischen Ringflecken und Scheckungen, die dem Symptombild an Stieleichen ähneln, kamen an den Standorten HH, SF Klövensteen und B 1 mit erkrankten Stieleichen vergesellschaftet vor.

Häufig gingen mit den virusverdächtigen Blattsymptomen geringe Jahreszuwächse und Absterbeerscheinungen bis hin zum Totalausfall der Bäume einher. Dieses Krankheitsbild fiel besonders in der Sämlingsspenderplantage in NRW, FA Hilchenbach auf (Tab. 3.1).

Biotest

Durch mechanische Inokulation (Kap. 2.2.1.1) von 20 Homogenaten erkrankter Stieleichen mit verschiedenen Blattsymptomen und durch Trockeninokulation von Blättern, Rinde und Knospen zweier Stieleichen mit chlorotischen Ringflecken (E 1144, E 825) gelang es nicht, den Erreger zu übertragen und virusverdächtige Symptome auf Chenopodium quinoa, Chenopodium amaranthicolor, Nicotiana clevelandii, Nicotiana benthamiana und Nicotiana tabacum zu induzieren. In transmissionselektronenmikroskopischen Untersuchungen von Adsorptionspräparaten der inokulierten Testpflanzen konnten keine Viruspartikeln nachgewiesen werden.

Saatgutübertragbarkeit

Zur Überprüfung der Saatgutübertragbarkeit des ringfleckeninduzierenden Erregers an Stieleichen wurden im Dezember 2001 je 20 Eicheln symptomtragender (E 338-E 341) und symptomloser Stieleichen (E 342, E 343) vom Standort B 3 in einem lockeren Torf- Sandgemisch ausgelegt und im Folienzelt kultiviert (Kap. 2.2.1.4).

Im Vergleich der Keimfähigkeit des Saatgutes von infizierten und gesunden Stieleichen konnten keine Unterschiede festgestellt werden. Unabhängig vom äußeren Erscheinungsbild der Gehölze wurde eine Keimfähigkeit von 85 % ermittelt.

Im September des Versuchsjahres 2002 traten vereinzelt chlorotische Ringflecken an den Blättern eines Sämlings der Probe E 341 auf (Abb. 3.4). In einem Adsorptionspräparat der homogenisierten Gewebebereiche mit den virusverdächtigen Symptomen ließen sich jedoch elektronenoptisch keine Viruspartikeln nachweisen.

	Abb. 3.4

Sechs krautige Testpflanzen der Arten Chenopodium quinoa, Nicotiana glauca und Nicotiana clevelandii sind als Fangpflanzen zur Überprüfung der Bodenübertragbarkeit des Erregers im Juni 2003 in Bodenproben gepflanzt worden, die im Wurzelraum erkrankter Stieleichen am Standort B 1 entnommen worden waren (Kap. 2.2.1.2). 14 Tage später zeigten sich auf den Blättern einer Chenopodium quinoa-Pflanze chlorotische Ringflecken und nekrotische Lokalläsionen (Abb. 3.5). In transmissionselektronenmikroskopischen Untersuchungen von drei angefertigten Adsorptionspräparaten der symptomtragenden Blattausschnitte sowie in Wurzelproben konnten keine Viruspartikeln nachgewiesen werden. Der Erreger ließ sich in wiederholten Übertragungsversuchen nicht weiter auf krautigen Indikatorpflanzen propagieren.

	Abb. 3.5

Transmissionselektronenmikroskopische Untersuchungen sollten Aufschluss über die Partikelmorphologie des bisher unbekannten viralen Erregers in Stieleichen geben, auf deren Grundlage sich Hinweise auf die taxonomische Zuordnung eines Virus ableiten lassen.

Von Eichenblattproben mit unterschiedlicher Symptomausprägung sowie aus Knospen-, Samen- und Rindengewebe erkrankter Stieleichen wurden nach der in Kapitel 2.2.4 beschriebenen Methode Adsorptionspräparate angefertigt und im Elektronenmikroskop untersucht. Als Kontrolle wurden zusätzlich Adsorptionspräparate von Blättern symptomloser Stieleichen hergestellt. In sieben Proben (E 146, E 151, E 340, E 552, E 619, E 1739, E 1743) von 20 bonitierten Adsorptionspräparaten erkrankter Stieleichen mit variierenden Symptombildern und von unterschiedlicher Herkunft konnten im Transmissionselektronenmikroskop isometrische Partikeln nachgewiesen werden. Die Partikeln mit einer Größe von etwa 30 nm bis 40 nm zeigten keine scharfe Begrenzung auf. Als Beispiele sind elektronenmikroskopische Aufnahmen von Blatthomogenaten zweier erkrankter Stieleichen in Abb. 3.6 und 3.8 dargestellt. Ein starres Stäbchen mit einer Größe von ca. 120 nm wurde neben isometrischen Partikeln im Adsorptionspräparat einer Stieleiche mit Mosaiksymptomen (E 619) gefunden (Abb. 3.8, Bild 1). Im Blatthomogenat eines Baumes mit chlorotischen Ringflecken und distinkten Läsionen (E 632) war ein flexibles Partikel mit einer Länge von etwa 450 nm zu beobachten (Abb. 3.7).

Durch verschiedene Virusaufreinigungen (Kap. 2.2.3) konnten isometrische und stäbchenförmige Viruspartikeln angereichert werden (siehe Kap. 3.4.2 und Kap. 3.4.4).

	Abb. 3.6/Abb.3.7

	Abb. 3.8

3.5.1  Anreicherung von Viruspartikeln und Nachweis von Viren in einer RT-PCR

Anreicherung von Viruspartikeln

Aus Pflanzenproben, in denen elektronenmikroskopisch Partikeln nachweisbar waren (Kap. 3.3) wurde versucht, Viruspartikeln durch unterschiedliche Reinigungsverfahren anzureichern (Kap. 2.2.3.1) und auf krautige Indikatoren zu übertragen (Kap. 2.2.1.1). Partikelanreicherungen wurden ebenfalls mit Proben durchgeführt, die durch ausgeprägte Symptomatik auffielen oder vergesellschaftet mit anderen virusinfizierten Forstgehölzen auftraten (Tab. A1, Anhang 4).

Im Adsorptionspräparat vom Blatthomogenat einer infizierten Stieleiche (E 632) mit chlorotischen Ringflecken konnte ein flexibles Partikel detektiert werden (Abb. 3.7), dessen Morphologie denen der Potyviren ähnelte. Mit einem Aufreinigungsverfahren nach Dijkstra et al. (1996) (Kap. 2.2.3.1) wurde geprüft, ob das Symptombild der Ringfleckigkeit möglicherweise durch eine Infektion dieser Virusfamilie hervorgerufen wird. Aus Blättern mit chlorotischen Ringflecken der Probe E 533 konnten mit dieser Methode keine Viruspartikeln angereichert werden.

Für den Versuch der Anreicherung isometrischer Viruspartikeln wurde das Reinigungsverfahren nach Hentsch (1998) (Kap. 2.2.3.1) verwendet, welches für die Isolierung sphärischer Partikeln aus Rosskastanie optimiert worden war. Isometrische Viruspartikeln mit Größen von 30-40 nm konnten in Adsorptionspräparaten von Blättern mit einem Mosaik (E 619, Abb. 3.8) und mit chlorotischen Ringflecken (E 151, E 552) detektiert werden (Kap. 3.3). Um zu testen, ob sich isometrische Partikeln auch aus Blättern mit Chlorosen anreichern ließen, wurden 50 g Blattmaterial der Probe E 153 ebenfalls nach Hentsch (1998) aufgereinigt. Aus Blattmaterial der Proben E 151 und E 152 konnten mit dieser Methode neben isometrischen Partikeln, stäbchenförmige Viruspartikeln mit einer Länge von 350-400 nm isoliert werden (vgl. Kap. 3.4.3). In einem Adsorptionspräparat des aufgereinigten Blattextraktes der Probe E 619 wurden dünne, fadenförmige Partikeln mit Längen von 120 nm bis 400 nm elektronenmikroskopisch nachgewiesen. Aus Blattmaterial der Proben E 153 und E 552 sowie aus zwei Blattproben symptomloser Stieleichen konnten keine Viruspartikeln angereichert werden.

Am Standort NRW, FA Arnsberg traten neben erkrankten Stieleichen Buchen und Weißbuchen mit CLRV-verdächtigen Blattsymptomen auf. Aus 100 g Blattmaterial der Probe E 151 von diesem Standort gelang es mit Hilfe der Schnellreinigung für CLRV, modifiziert nach Rebenstorf (2002) (Kap. 2.2.3.1), isometrische Partikeln von etwa 25 nm und 65 nm anzureichern (Abb. 3.9). Durch die differenzielle Zentrifugation kam es zu einer Zusammenlagerung der 25 nm großen isometrischen Partikeln.

Im Anschluss an die Aufreinigungen wurden alle Überstände und aufgereinigten Präparationen auf krautige Indikatorpflanzen abgerieben (Kap. 2.1.2 und Kap. 2.2.1.1) und anschließend durch Symptombonituren und elektronenmikroskopische Untersuchungen geprüft, ob die Erreger übertragen werden konnten. Durch mechanische Inokulation gelang es nur, die stäbchenförmigen Viruspartikeln der Proben E 151 und E 152 zu übertragen (vgl. Kap. 3.4.3).

	Abb. 3.9

Nachweis bekannter Viren in einer RT-PCR

Isometrische Viruspartikeln, die in geringer Konzentration in elektronenoptischen Untersuchungen erkrankter Stieleichen nachgewiesen und mit Hilfe von zwei Aufreinigungsverfahren angereichert wurden, sollten im PCR-Nachweis unter Verwendung diagnostischer Primer charakterisiert werden.

Sowohl die natürliche Vergesellschaftung von Holunder, Birken und Stieleichen mit virusverdächtigen Symptomen (Kap. 3.1), als auch die morphologischen Ählichkeiten der Viruspartikeln (Kap. 3.3) ließen eine Infektion der Stieleichen mit CLRV vermuten. Mittels RT-PCR sollte daher getestet werden, ob sich die aus Stieleichenblättern mit chlorotischen Ringflecken isolierten, isometrischen Viruspartikeln diesem Virus zuordnen lassen. Dazu wurde Gesamt-RNA aus Blattmaterial der Probe E 1743 und dsRNA der Probe E 878 isoliert (Kap. 2.2.6.1, Kap. 2.2.6.2) und in eine RT-PCR mit CLRV-spezifischen Primern RW 1 und RW 2 eingesetzt. (Kap. 2.2.7). Das CLRV-spezifische Fragment wurde nicht amplifiziert.

Stieleichen am Standort B 1 zeigten chlorotische Ringflecken. Ebereschen mit einem ähnlichen charakteristischen Symptombild traten an diesem Standort vergesellschaftet mit den erkrankten Stieleichen auf (Kap. 3.1). In diesen Gehölzen konnte ein neues Virus, das Mountain AshRingspot Virus nachgewiesen werden (Benthack et al., 2005). Mit Hilfe einer RT-PCR mit den spezifischen Primern 261 RP und 71 FP sollte geprüft werden, ob die Erkrankung in den Stieleichen von demselben Erreger induziert wird. In Gesamt-RNA, isoliert aus Knospenmaterial einer Stieleiche mit chlorotischen Ringflecken (E 808), konnte das für virusinfizierte Ebereschen spezifische Fragment nicht amplifiziert werden.

Im Hinblick auf das vergesellschaftete Vorkommen von erkrankten Stieleichen und Ebereschen sollte durch die Anreicherung viraler Nukleokapside getestet werden, ob sich Nukleokapside ähnlicher Größe wie in Ebereschen mit chlorotischen Ringflecken auch in Stieleichen mit diesem Symptombild anreichern lassen. Dazu wurden 30 g frisches Rindengewebe von Stieleichen mit chlorotischen Ringflecken (E 1584) und als Kontrolle 50 g Blattmaterial einer symptomlosen Stieleiche (E 1724) nach Kellmann et al. (2001) (Kap. 2.2.2) aufgereinigt. Nach der Zentrifugation des Rindenextraktes aus erkrankten Stieleichen bildeten sich im Cäsiumsulfatgradienten drei lichtbrechende Fraktionen aus (Abb. 3.10). Aus dem angereicherten Extrakt des Blattmaterials der symptomlosen Stieleiche wurden vier Fraktionen aufgetrennt. Diese Fraktionen wurden in einem 12,5 %igen Polyacrylamidgel elektrophoretisch aufgetrennt (Kap. 2.2.5.3). Abb. 3.11 zeigt die gelelektrophoretische Trennung nach Silberfärbung der vier Fraktionen aus symptomlosen Stieleichenblättern und der zweiten Fraktion aus Rindengewebe erkrankter Stieleichen. In der zweiten Fraktion beider Proben (Spuren 3 und 5) konnte eine Proteinbande von etwa 54 KDa detektiert werden.

In einem Adsorptionspräparat dieser Fraktion aus dem Rindengewebe der erkrankten Stieleichen ließen sich zudem elektronenoptisch isometrische Partikeln mit einem Durchmesser von ca. 40 nm darstellen (Abb. 3.12).

	Abb. 3.10/Abb. 3.11

	Abb. 3.12

Virusreinigung

Mit Hentsch (1998) (Kap. 2.2.3.1) gelang es, aus zwei Proben von Blattmaterial mit chlorotischen Ringflecken (E 151 und E 152) neben isometrischen, auch stäbchenförmige Partikeln zu isolieren (Kap. 3.4.1). Diese konnten aufgrund ihrer Länge und des leicht erkennbaren Mittelkanals den Tobamoviren zugeordnet werden (Abb. 3.13).

	Abb. 3.13

Biotest

Zur Vermehrung der Viruspartikeln wurden die Überstände der einzelnen Zentrifugationsschritte und aufgereinigten Virussuspensionen unter Verwendung der Puffervarianten 3) und 5) auf krautige Indikatorpflanzen übertragen (Kap. 2.2.1.1). Sechs Tage nach mechanischer Übertragung der aufgereinigten Virussuspension von E 152 waren an Nicotiana clevelandii reproduzierbare Blattdeformationen und Wuchsdepressionen zu beobachten, die auf eine systemische Infektion hindeuteten (Abb. 3.14, Bild 1). Die gleichen Symptome konnten an Nicotiana benthamiana (Abb. 3.14, Bild 3) und Nicotiana tabacum var. ‘Samsun‛ festgestellt werden. Chenopodium quinoa-Pflanzen zeigten chlorotische Lokalläsionen (Abb. 3.14, Bild 2). Mit der Übertragung des Agens der Probe E 151 im ersten und zweiten Überstand (Kap. 2.2.3.1) der Aufreinigung konnten reproduzierbar Chlorosen und Blattdeformationen an Nicotiana benthamiana induziert werden (Abb. 3.15). Die besten Übertragungsergebnisse wurden durch Inokulation mit der Puffervariante 5 (Kap. 2.2.1.1) [Phosphatpuffer versetzt mit 1,5 % (w/v) Bentonitsuspension und 2 % (w/v) Nicotin] erzielt. In Adsorptionspräparaten der infizierten Indikatorpflanzen ließen sich stäbchenförmige Viruspartikeln mit einer Länge von 350 bis 400 nm elektronenoptisch darstellen (Abb. 3.16).

	Abb. 3.14/Abb. 3.15/Abb. 3.16

Serologische Untersuchungen

Unter Verwendung von Antikörpern gegen die Tobamoviren CGMMV, ORSV, PMMoV, ToMV und TMV sollte im DAS-ELISA (Kap. 2.2.5.1) geprüft werden, welcher Spezies sich die aufgereinigten stäbchenförmigen Viruspartikeln aus infizierten Stieleichen zuordnen lassen. Für Isolatvergleiche wurden drei ToMV-Isolate aus krautigen Pflanzen (Kap. 2.3.1) vermehrt und in die serologischen und molekularbiologischen Untersuchungen einbezogen. Der Presssaft aus den krautigen Indikatoren Chenopidium quinoa, Nicotiana tabacum‘Samsun’ und Nicotiana clevelandii, welche mit den Viruspräparationen E 151 und E 152 aus Stieleiche infiziert worden waren, sowie Chenopodium quinoa, infiziert mit den ToMV Isolaten 05/11/1988 und 13/08/1989, reagierten in sechs Wiederholungen mit den Antikörpern gegen ToMV bzw. TMV, nicht jedoch mit den Antikörpern gegen CGMMV, BePMoV, ORSV, PMMOV.

Blatthomogenate von vier Proben aus Stieleichenblättern mit chlorotischen Ringflecken (E 130, E 146, E 149, E 151) sowie Viren vom ToMV-Isolat E 317 reagierten im ELISA-Test weder mit ToMV-noch mit TMV-Antikörpern.

Zum serologischen Vergleich wurden Chenopodium quinoa- Pflanzen mit den Tobamovirusisolaten E 151, E 152, E 317, 05/11/1988 sowie 13/08/1989 inokuliert und nach Gooding & Hebert (1967) (Kap. 2.2.3.2) aufgereinigt. Aus 10 g Blattmaterial konnten so Virussuspensionen mit einer Konzentration von 170 bis 230 µg/ml bei einem Quotienten für die Reinheit von 1,2 bis 1,3, errechnet aus dem Verhältnis Absorption_λ260 / Absorption_λ280 gewonnen werden. Die Suspensionen wurden nachfolgend in einen Agarosedoppeldiffusionstest (Kap. 2.2.5.2) unter Verwendung eines ToMV-Antiserums eingesetzt. Präzipitationslinien bildeten sich nur nach Einsatz des konzentrierten Antiserums mit den ToMV-Isolaten E 317, 05/11/1988 und 13/08/1989. Sie kreuzten sich nicht untereinander.

Rückübertragung auf Eichensämlinge

Jeweils fünf Eichensämlinge wurden im August 2002 durch mechanische Inokulation und mit Hilfe des ‘Stem Slashing’ (Kap. 2.2.1.3) mit einer konzentrierten Virussuspension der Tobamovirusisolate E 152 und 05/11/1988 infiziert. Im Untersuchungszeitraum 2002 bis 2004 konnte jedoch bei den wöchentlichen Symtombonituren im belaubten Zustand keine Symptome an den Blättern der Eichensämlinge beobachtet werden. Auch in den vier hergestellten Adsorptionspräparaten der Blatthomogenate von jeweils zwei Sämlingen wurden keine Tobamoviren nachgewiesen. Im vierfach wiederholten Biotest mit den Indikatoren Chenopodium quinoa, Nicotiana tabacum ‘Samsun‛ und Nicotiana clevelandii ist der positive Beweis für eine Rückübertragung der Tobamoviren auf diese fünf Eichensämlinge nicht erfolgt.

Molekularbiologischer Nachweis

Zur näheren Charakterisierung der Tobamovirusisolate wurde zunächst die IC-RT-PCR unter Verwendung von ToMV-Transportproteingen-spezifischen Primern nach Jacobi et al. (1998) (Kap. 2.2.7.2) mit Blatthomogenaten der infizierten Testpflanzen sowie den nach Gooding & Hebert (1967) (Kap. 2.2.3.2) aufgereinigten Viruspräparationen durchgeführt. Das erwartete DNA-Fragment von 508 bp ließ sich nur in den angereicherten Tobamovirusisolaten E 151, 13/08/1989 sowie5/11/1988 amplifizieren (Abb. 3.17; Spuren 3, 4 und 6), nicht jedoch direkt im Pflanzenhomogenat der krautigen Testpflanzen. Da dieser PCR-Nachweis nicht mit den aufgereinigten Isolaten E 317 und E 152 aus Chenopodium quinoa- Pflanzen gelang, wurde für weitere Untersuchungen ein RT-PCR-Protokoll nach Letschert et al. (2002) verwendet, dessen gruppenspezifische universelle Primer Tob Uni 1 und Tob Uni 2 im Hüllproteingen der Tobamoviren binden (Kap. 2.1.9). Für diesen Virusnachweis wurde Gesamt-RNA aus Blattmaterial infizierter Indikatorpflanzen, isoliert nach Dellaporta et al. (1983) (Kap. 2.2.6.1), eingesetzt. Nach gelelektrophoretischer Trennung der PCR-Fragmente in einem 1 %igen, Ethidiumbromid-gefärbten Agarosegel konnte in Gesamt-RNA der Tobamovirusisolate E 152, E 317 (Abb. 3.18) sowie 5/11/1988 und 13/08/1989 eine Bande der erwartenden Größe von 804 bp visualisiert werden.

	Abb. 3.17/Abb. 3.18

Die gewonnenen PCR-Produkte wurden in den Vektor pGEM®-T Easy (Fa. Promega) ligiert, in kompetenten E. coli-Zellen vermehrt und sequenziert. Nach einem Sequenzvergleich mit verschiedenen Sequenzen des ToMV bzw. TMV aus der Internerdatenbank NCBI ließ sich das Isolat E 152 mit einer Übereinstimmung von 97 % in 795 bp im Bereich des Hüllproteingens dem TMV vulgare-Stamm [Accession (Acc.) Nr.: AJ429078] zuordnen (Abb. A 2.1 im Anhang). Die Übereinstimmung zum TMV-Isolat AJ429085 betrug 72 %. Das Isolat E 151 hingegen erzielte im Sequenzvergleich des Transportproteingens mit dem ToMV-Isolat AF042032 eine Übereinstimmung von 99,8 % über 508 bp und 73 % zum TMV-Isolat AF042033. Es gehört damit zum Genus des ToMV (Abb. A 2.2 im Anhang). In einem Sequenzvergleich beider Tobamovirusisolate aus Stieleiche mit dem Gesamtgenom der Referenzisolate ToMV X02144 und TMV X68110 konnte das Ergebnis bestätigt werden, da für E 152 Identitäten von 97 % mit TMV X68110 und 70,5 % mit ToMV X02144 und für E 151 Übereinstimmungen von 99 % zu ToMV X02144 und 72 % zu TMV X68110 ermittelt werden konnten. Die Tobamovirusisolate ToMV 5/11/1988 und ToMV 13/08/1989 konnten nach dem Sequenzabgleich eindeutig als ToMV identifiziert werden. ToMV 5/11/1988 wies eine Homologie von 98,8 % über 503 bp zum Referenzisolat ToMV X02144 auf, während ToMV 13/08/1989 zu 99,1 % in 575 bp mit diesem Isolat übereinstimmte. Das Isolat ToMV E 317 konnte ebenfalls dem TMV ‘tomato strain’ zugeordnet werden. Die Sequenz zeigte allerdings zu 50 % Fehlstellen (‘N’) auf, so dass kein Sequenzvergleich mit den anderen untersuchten ToMV-Isolaten möglich war.

Für phylogenetische Analysen wurden 25 ToMV bzw. TMV-Isolate im Bereich des Transportproteingens dem Isolat E 151 und 34 ToMV bzw. TMV-Isolate im Bereich des Hüllproteingens dem Isolat E152 gegenübergestellt. Um die beiden Isolate aus Stieleiche miteinander vergleichen zu können, wurden 15 Isolate mit bekannten Nukleinsäuresequenzen im Bereich beider Gene ausgewählt. Dazu gehören: TMV-AJ243571, ToMV-AJ132845, ToMV-AF155507, ToMV-AB083196, TMV-AJ310339, ToMV-AF332868, ToMV-X02144, TMV-Z92909, TMV-AF165190, TMV-AF546184, TMV-AF273221, TMV- AF395129, TMV-V01409, TMV-V01408, TMV-X68110.

Der auf dem Sequenzvergleich des Transportproteingens basierende Stammbaum zeigt für das Isolat E 151 die engste phylogenetische Beziehung zu dem ToMV-Isolat AF062519 sowie den TMV-Isolaten AJ310339, AJ243571 und Z92909 aus Russland. In Sequenzvergleichen stimmten die TMV-Isolate jedoch zu 99 % mit den 10 ToMV-Isolaten aus der Internetatenbank überein und werden daher in der eigenen Arbeit ebenso der ToMV-Gruppe zugeordnet (Abb. 3.19). Für das Isolat E 152 wurde die engste phylogenetische Beziehung zum TMV-Isolat AJ429098 Hamburg-Germany ermittelt (Abb. 3.20).

	Abb. 3.19

	Abb. 3.20

3.6.1  Gesamt-RNA-und Gesamtnukleinsäure-Isolierung

Vorraussetzung für eine diagnostische RT-PCR mit erregerspezifischen Primern ist der Einsatz qualitativ hochwertiger, reiner und nicht degradierter Gesamt-RNA. Die Isolierung von Gesamt-RNA aus Gehölzen, insbesondere aus Stieleiche, ist u. a. wegen des hohen Gehaltes an Tanninen sehr schwierig. Im Rahmen der Arbeit wurden verschiedene Verfahren getestet, um eine geeignetete Methode zur Isolierung von Gesamt-RNA aus Gehölzen zu etablieren. Alle Extraktionsverfahren wurden ebenfalls mit krautigen Pflanzen getestet. Sie werden in Kap. 2.2.6.1 ausführlich beschrieben.

Im Invisorb^® Spin Plant RNA Mini Kit (Fa. Invitek) werden zur Lyse der pflanzlichen Zellen vom Anbieter zwei unterschiedliche Puffer angeboten, die für Pflanzen mit hohem Phenol-bzw. Polysaccharidgehalt optimiert worden sind. Sekundäre Inhaltsstoffe im Probenmaterial von Stieleichen konnten jedoch mit keinem der beiden Lysepuffer entfernt werden, so dass die Säulen verstopften und eine selektive Bindung der Gesamt-RNA an das Membransystem nicht möglich war. Nach Lyse des wässrigen Pflanzenextraktes durch den Puffer RP gelang es hingegen, aus Blättern und Rinde von Holunder (Sambucus nigra L.) Gesamt-RNA zu isolieren.Aus Blättern krautiger Wirtspflanzen konnte unter Verwendung beider Puffer Gesamt-RNA extrahiert werden (Abb. 3.21, Spuren 3+5). Die Ausbeute an Gesamt-RNA war sowohl aus den krautigen Pflanzen (Chenopodium quinoa, Nicotiana clevelandii) als auch aus Holunder geringer als bei anderen angewendeten RNA-Extraktionsverfahren. Aus 100 mg Probenmaterial krautiger und holziger Pflanzen wurden 10-15 µg Gesamt-RNA isoliert. Der Reinheitsgrad (Quotient A 260/A 280, Kap. 2.2.6.8) der Proben lag zwischen 1,3 und 1,7 (Optimum 2,00). Banden >8 kb im Agarosegel (Abb. 3.21, Spuren 2 und 4) deuten darauf hin, dass Gesamt-RNA-Päparationen, die mit dem Kit aufgereinigt wurden, Kontaminationen mit genomischer DNA aufwiesen.

Mit der Extraktionsmethode, modifiziert nach Dellaporta et al. (1983), ließ sich sowohl aus krautigen (Abb. 3.21) als auch aus holzigen Pflanzen Gesamt-RNA isolieren. Je 50 mg Frischmasse konnten 30-40 µg Gesamt-RNA extrahiert werden, was in etwa der siebenfachen Menge der RNA-Isolierung durch das Kit entsprach. In krautigen und holzigen Pflanzen konnte ein Reinheitsgrad von 1,7 bis 1,9 erzielt werden. Die Analyse im 1 %igen Agarosegel war jedoch nicht zufriedenstellend. Distinkte Banden waren nicht zu erkennen (Abb. 3.21).

	Abb. 3.21

Unter Verwendung von Silica-Partikeln bei der Isolierung von Nukleinsäuren, modifiziert nach Boom et al. (1990), konnte sowohl aus Rinde, Knospen und Blättern von Eichen, als auch aus fünf weiteren Gehölzen (Birke, Ulme, Ahorn, Holunder, Eberesche) qualitativ hochwertige und reine Gesamt-RNA erhalten werden (Abb. 3.22 und Abb. 3.23). Der hohe Reinheitsgrad der Proben bestätigte sich in einem errechneten Verhältnis der Absorption bei 260 nm zu 280 nm von 1,8 bis 2,0. Aus Blättern von krautigen Pflanzen konnte mit diesem Verfahren eine Ausbeute von ca. 60 µg Gesamt-RNA je 100 mg Frischmasse erzielt werden. Aus 100 mg Blatt- bzw. Rindengewebe von Stieleichen konnten etwa 20-40 µg und aus Knospenmaterial der gleichen Menge etwa 60 µg Gesamt-RNA extrahiert werden. Genomische DNA-Banden >10 kb zeigten sich nach Auftrennung der Proben im Agarosegel (Abb. 3.23, Spuren 8-11).

Mit dieser Versuchsreihe konnte gezeigt werden, dass die Menge an isolierter Gesamt-RNA aus Blattmaterial holziger Pflanzen, extrahiert nach Boom et al. (1990), etwa doppelt so hoch ist wie bei der RNA-Extraktion mit dem Kit der Fa. Invitek. Die doppelte Menge an Gesamt-RNA, jedoch mit einem geringeren Reinheitsgrad, konnte mit der Methode nach Dellaporta et al. (1983) gewonnen werden.

	Abb. 3.22/Abb.3.23

Die Diagnose von Pflanzenviren kann über den Nachweis hochmolekularer dsRNA erfolgen, da über 90 % aller Pflanzenviren ein Einzelstrang (ss)-RNA-Genom besitzen und diese während der Replikation doppelsträngige Formen und Intermediate ausbilden (Zaitlin & Hull, 1987; Dodds et al., 1984; Valverde et al, 1990). Für die Isolierung von dsRNA aus Stieleichen wurde das Verfahren nach Benthack (2001) angewendet, welches bereits für die Eberesche etabliert worden war. Durch verschiedene Modifikationen des Extraktionspuffers sollten die Schleimstoffe gebunden und entfernt, sowie deren Auswirkung auf die Qualität und Konzentration der dsRNA untersucht werden. Durch die Zugabe von Bentonit zum Extraktionspuffer und die Absenkung des pH-Wertes des Extraktions- und Waschpuffers konnten die Schleimstoffe nicht entfernt werden. Eine Vorbehandlung des Pflanzenmaterials mit Chloroform und Phenol hingegen führte zum vollständigen Abbau der Schleimstoffe und erleichterte damit die Extraktion der dsRNA. Durch große Volumina an Extraktionspuffer konnte die Viskosität der Blattextrakte reduziert und die dsRNA leichter aus der CF11-Cellulosesäule eluiert werden. In einem weiteren Versuchsansatz sollte die störende Schleimschicht quantitativ durch die Aufarbeitung geringerer Blattmaterialmengen reduziert werden. Wie Abb. 3.25 Spur 3 zeigt, konnte dadurch die Menge an isolierter dsRNA, in Abhängigkeit vom Probenmaterial, auf die Nachweisgrenze eines Ethidiumbromid-gefärbten Agarosegels absinken.

DsRNA ließ sich mit Hilfe des ‘Batch’-Verfahrens (CF11-Cellulose mit Waschpuffer versetzen, schütteln, abzentrifugieren des Waschpuffers) aus verstopften Cellulosesäulen eluieren. Dieses Verfahren reduzierte jedoch die Ausbeute an dsRNA um etwa 50 % (Abb. 3.24, Spur 7 und 8). In 39 von 54 dsRNA-Isolierungen nach Benthack (2001) konnte sowohl aus Pflanzenmaterial (Blätter, Knospen, Rinde) von Stieleichen mit virusverdächtigen Blattsymptomen, als auch aus visuell als gesund eingestuften Stieleichen dsRNA isoliert werden. Die Symptomausprägung korrellierte ebenso wenig mit der Konzentration an dsRNA. Es traten grundsätzlich bis zu zwei Doppelbanden mit Größen von etwa 1,5 kb und 1,6 kb bzw. 1,8 kb und 2,0 kb auf. Drei verschiedene Bandenmuster konnten aufgezeigt werden:

Das als Variante 3 bezeichnete Bandenmuster trat bei etwa 80 % aller untersuchten Extrakte auf, das der beiden anderen Varianten zu jeweils 10 %. Eine Korrelation des auftretenden Bandenmusters zum Herkunftsgebiet des Blattmaterials oder zum Zeitpunkt der Probenahme konnte nicht festgestellt werden.

	Abb. 3.24

Um zu testen, ob diese charakteristischen dsRNA-Moleküle spezifisch in der Gehölzgattung Quercus vorkommen, wurde dsRNA aus amerikanischer Roteiche (Quercus rubra L.) isoliert, an deren Blättern keine virusverdächtigen Symptome zu beobachten waren. Nach elektrophoretischer Trennung und Ethidiumbromidfärbung konnte auch hier im nativen Agarosegel die Doppelbande von 1,8 kb und 2,0 kb dargestellt werden (Abb. 3.25).

	Abb. 3.25

dsRNA Isolierung aus Rinde und Knospen

Durch die Isolierung von dsRNA aus Rinden-und Knospengewebe einer infizierten Stieleiche (E 807, E 808) sollte geprüft werden, ob es sich bei dem Agens um einen phloemlimitierten Erreger handelt und ob sich virusspezifische dsRNA auch aus anderen Gewebeteilen isolieren lässt. Aus beiden Geweben konnten die gleichen dsRNA-Fragmente (2,0 kb -1,8 kb und 1,5 kb -1,6 kb) wie aus Blattmaterial von Stieleichen isoliert werden (Abb. 3.26, 3.27). In sehr geringer Konzentration trat im Bandenmuster der dsRNA aus Rindengewebe eine zusätzliche Bande von 3,5 kb auf (Abb. 3.26, Spur 3).

Aus 4,4 g Rindengewebe infizierter Stieleichen (E 814) konnte im Vergleich zu 50 g Blattmaterial (E 878) annähernd die fünffache Menge an dsRNA isoliert werden (Abb. 3.24 und 3.27).

	Abb. 3.26/Abb. 3.27

Einfluss des Probenahmezeitpunktes

Für Untersuchungen zur Abhängigkeit der dsRNA-Konzentration vom jahreszeitlichen Verlauf wurden Blattproben zu unterschiedlichen Zeitpunkten von Mai bis Oktober an den Standorten B 1-3 (Kap. 2.1.1; Tab. A1, Anhang 4) entnommen und für die dsRNA-Isolierung eingesetzt. Es zeigte sich, dass der Gehalt an sekundären Inhaltsstoffen im Verlauf der Vegetationsperiode abnahm, was die Isolierung von dsRNA aus Blattmaterial erleichterte. Die beiden charakteristischen Doppelbanden (2,0/1,8 kb und 1,6/1,5 kb) konnten unabhängig vom Zeitpunkt der Probenahme aus Blättern mit chlorotischen Ringflecken und symptomlosen Blattmaterial isoliert werden. Auch aus Blattmaterial, welches im Oktober entnommen wurde, konnte dsRNA extrahiert werden (Abb. 3.28). Die Konzentration der isolierten dsRNA aus den Blättern war konstant und unterlag keinen jahreszeitlichen Schwankungen.

	Abb. 3.28

Einfluss des Probenahmestandortes

Mit Hilfe der dsRNA-Isolierung aus Blättern erkrankter Stieleichen von unterschiedlicher Herkunft sollte geprüft werden, inwieweit sich die Erkrankung unter Berücksichtigung der Symptomausprägung und der Standortverhältnisse anhand des dsRNA-Musters unterscheiden lässt.

In fast allen Proben traten eine oder beide Doppelbanden von 2,0 kb und 1,8 kb sowie 1,6 kb und 1,5 kb auf. Zusätzliche dsRNA-Fragmente mit einer Größe von 5,0 kb und 1,7 kb ließen sich aus Blattmaterial einer Mischprobe erkrankter Stieleichen vom Standort NDS, RFö Hopels, Abt. 1500 A extrahieren, welche im Juni 2003 entnommen worden waren (Abb. 3.29, Spur 4). In einer Probe aus dem Folgejahr traten diese Banden nicht wieder auf.

	Abb. 3.29

Einfluss der Lagerdauer und Temperatur

Für die Anreicherung von dsRNA aus Stieleichen wurde geprüft, ob die Lagerdauer und -temperatur einen Einfluss auf die Ausbeute an dsRNA hatte. Dazu wurde dsRNA aus acht Eichenblattproben (E 823, E 825, E 886, E 824, E 552, E 534a, E 545a, E 1163), welche bei -20 °C bzw. -80 °C einen Tag bis 17 Monate gelagert worden waren, isoliert (Kap. 2.2.6.2, Tab. A1, Anhang 4).

Lagerdauer und -temperatur übten keinen qualitativen Einfluss auf die Extraktion der charakteristischen dsRNA-Moleküle aus. Die Doppelbanden von 2,0/1,8 kb bzw. 1,6/1,5 kb konnten aus unterschiedlich gelagertem Blattmaterial isoliert werden (Abb. 3.30).

	Abb. 3.30

Überprüfung der Stabilität der dsRNA im RNase A-Verdau

Aus vorangegangen Untersuchungen ist bekannt, dass dsRNA bei einer 300 mM MgCl₂-Konzentration nicht mit RNase A verdaut werden kann, während einzelsträngige RNA vollständig degradiert wird (Benthack, 2001).

Anhand eines RNase A-Verdaus bei unterschiedlichen MgCl₂-Konzentrationen (300 mM, 100 mM, 50 mM, 0 mM) sollte die Stabilität der dsRNA überprüft werden. Dazu wurden 50 ng dsRNA mit 1,0 µl 10 µg/ml RNase für 40 min bei 37 °C inkubiert. Zur Kontrolle der RNase A-Aktivität wurde eine Probe isolierter Gesamt-RNA aus Holunder (E 1200) bei 300 mM MgCl₂ mit RNase A (Fa. Fermentas) verdaut.

DsRNA wurde bei einer 300 mM MgCl₂-Konzentration nicht degradiert (Abb. 3.31, Spur 1). Gesamt-RNA aus Holunder hingegen wurde bei dieser Salzkonzentration vollständig abgebaut (Abb. 3.31, Spur 6). Bei 100 mM MgCl₂-Konzentration wurde die dsRNA durch die RNase A bereits degradiert (Abb. 3.31, Spur 3). Aufgrund dieser Ergebnisse wurde der Verdau einzelsträngiger RNA in folgenden Untersuchungen in einer 300 mM MgCl₂–Lösung unter Verwendung einer RNase A-Konzentration von 10 µg/ml durchgeführt.

	Abb. 3.31

Zur näheren Charakterisierung der detektierten dsRNA-Moleküle wurde mit Hilfe zweier verschiedener molekularbiologischer Ansätze versucht, die Nukleinsäuresequenz der virusspezifischen dsRNA aus Stieleichen zu erhalten. Hierfür wurde die dsRNA zunächst denaturiert und mittels hexamerer Zufallsprimer und Reverser Transkriptase in cDNA umgeschrieben. Zur Amplifizierung der nach der Erststrangsynthese erhaltenen RNA-DNA-Hybriden wurde eine PCR mit degenerierten Oligonukleotid-Primern (DOP-PCR) durchgeführt (Kap. 2.2.9.4). Alternativ erfolgte eine “klassische” Zweitstrangsynthese modifiziert nach Promega (1996) (Kap. 2.2.9.3). Für die Erststrangsynthese wurden jeweils 40-400 ng dsRNA eingesetzt.

Amplifizierung in einer DOP-PCR nach Roche (1999)

Die dsRNA der Proben E 931 und E 828 wurde nach Hitzedenaturierung und Sofortkühlung auf Eis mit einem hexameren Random-Primer im Gesamtansatz von 20 µl revers transkribiert (Kap. 2.2.9.1). 3 µl, 5 µl und 10 µl des cDNA-Ansatzes wurden in einer DOP-PCR mit DOP-Primer 1 in einem Reaktionsvolumen von 50 µl amplifiziert (Kap. 2.2.9.4). Ausreichende PCR-Produktmengen konnten in allen Reaktionsansätzen erst nach Reamplifizierung der DOP-PCR-Produkte in einer weiteren DOP-PCR erzielt werden. Im Ethidiumbromid-gefärbten Agarosegel zeigte sich dann ein “Schmier” mit erkennbaren distinkten Banden (Abb. 3.32, Spur 4). Die Hauptproduktgröße lag bei 250 bp und 400 bp. Durch Reamplifizieung des PCR-Produktes aus dsRNA amerikanischer Roteiche konnten Banden zwischen 1120 bp und 300 bp erzeugt werden (Abb. 3.33, Spur 5).

	Abb. 3.32

Die Verwendung von DEPC-behandeltem, destilliertem Wasser im Mastermix für die DOP-PCR bewirkte eine Anreicherung der PCR-Fragmente von 400-600 bp gegenüber der Variante mit Millipore-Wasser (Abb. 3.35).

In einer DOP-PCR mit dem DOP-Primer Bgl-Eco-RH konnten keine Fragmente amplifiziert werden.

	Abb. 3.33

Aus dsRNA der Probe E 828 konnten sechs Klone und aus dsRNA der Probe E 931 vier Klone mit Insert selektiert werden, die mit bekannten Sequenzen der Internetdatenbanken EMBL und NCBI verglichen wurden. Aus der amplifizierten dsRNA der Probe E 931 konnte Klon 3 FE gewonnen werden, dessen Nukleinsäuresequenz über einen Bereich von 42 bp zu 100 % mit dem Hüllproteingen des Cucumber mosaic virus (CMV) (Acc. Nr.: AF541918.1) übereinstimmte. Alle anderen Klone wiesen keine Übereinstimmungen zu bekannten viralen Erregern auf.

Modifikationen der Erststrangsynthese und DOP-PCR

Da mit dem vorangegangenen Ansatz zur Amplifikation der dsRNA-Moleküle keine eindeutigen Ergebnisse zur Identifizierung der eichenassoziierten dsRNA erzielt werden konnten, wurden zur Verhinderung einer Renaturierung oder Rückfaltung der Einzelstränge zwei dsRNA-Proben erkrankter Stieleichen (Baum A NRW, E 841) im Reaktionsvolumen von 100 µl durch Erhitzen auf 95 °C denaturiert und umgehend mit flüssigem Stickstoff gefroren (Kap. 2.2.9.2). Nach Erststrangsynthese mit dem DOP-Primer Bgl-Eco-RH 2 konnten unter Einsatz von 10 µl cDNA der dsRNA-Probe (Baum A NRW, dsRNA-Fragmente 2,0/1,8 kb und 1,6/1,5 kb) im DOP-PCR-Ansatz 2 (Kap. 2.2.9.4) PCR-Fragmente amplifiziert werden. Nach Auftrennung im 1 %igen nativen Agarosegel zeigte sich ein “Bandenschmier”. Das gewonnene PCR-Produkt wurde zur Konzentrierung der Nukleinsäuren gefällt und in einem Volumen von 10 µl im präparativen Agarosegel aufgetrennt (Abb. 3.34). Die großen (2000 bp bis 1500 bp)- und kleinen PCR-Fragmente (750 bp bis 1400 bp) wurden getrennt aus dem Gel extrahiert und kloniert (Kap. 2.2.6.3 und Kap. 2.2.8). Aus den kleineren Fagmenten konnte Klon 13 gewonnen werden, dessen Sequenz nach einem Abgleich mit der Sequenzdatenbank EMBL in 776 bp zu 64 % mit der RNA abhängigen RNA-Polymerase (RdRp) des Beet Cryptic Virus 3 (BCV 3) (Acc. Nr.: S63913, Xie et al. 1993) übereinstimmte. Der harmonierende Sequenzbereich lag zwischen Position (Pos.) 116 und Pos. 831 der RdRp (Abb. 3.38). Der Sequenzvergleich ist im Anhang in Abb. A 3.3 dargestellt.

Die Verwendung von DEPC-behandeltem, destilliertem Wasser im Mastermix für die DOP-PCR bewirkte eine Anreicherung der PCR-Fragmente von 400-600 bp gegenüber der Variante mit Millipore-Wasser (Abb. 3.35).

In einer DOP-PCR mit dem DOP-Primer Bgl-Eco-RH konnten keine Fragmente amplifiziert werden.

	Abb. 3.34/Abb. 3.35

Alternativ zur Hitzedenaturierung wurde die dsRNA (E 841) bei 65 °C unter Verwendung von Dimethyl-Sulfoxid (DMSO) in einem Gesamtvolumen von 160 µl denaturiert. Nach einer 12-stündigen Fällung bei -80 °C wurde die denaturierte dsRNA in einem Reaktionsvolumen von 20 µl revers transkribiert. In einer RT-DOP-PCR (Kap. 2.2.9.4, Ansatz 2) mit 5 µl cDNA wurden PCR-Fragmente mit Größen von 300 bp-800 bp amplifiziert, die jedoch nicht kloniert werden konnten.

Zweitstrangsynthese

Die nach Jelkmann et al. (1989) erzeugten RNA-DNA-Hybriden (Kap. 2.2.9.2) aus fünf dsRNA-Proben erkrankter Stieleichen (E 545a, E 841, Baum 66, E 1154/55, E 824) und zwei Proben angereicherter Nukleokapside aus Rinde einer symptomtragenden (E 1584) bzw. Blättern einer symptomlosen Stieleiche (E 1724) wurden mit Hilfe der Enzyme RNase H und DNA-Polymerase 1 zu einer dsDNA synthetisiert. Nach einer ‘Blunt End’-Klonierung der DNA-Doppelstränge wurde die Länge der Inserts über eine Amplifizierung mit vektorspezifischen Primern bzw. durch enzymatisches Schneiden des Vektors ermittelt. Die Größe der Inserts variierte zwischen 250 bp und 600 bp. (Abb. 3.36) Es zeigte sich, dass verstärkt kleinere Inserts von 50 bp und 250 bp ligiert wurden.

Durch Zweitstrangsynthese von dsRNA der Stieleiche E 545 a mit chlorotischen Ringflecken (dsRNA-Fragmente 1,6 und 1,5 kb vgl. Abb. 3.30) gelang es, einen 448 Nukleotide langen Abschnitt der dsRNA zu klonieren, dessen Sequenz nach einem Abgleich mit der Sequenzdatenbank EMBL, wie Klon 13 aus der RT-DOP-PCR, eine 61 %ige Übereinstimmung in 436 Nukleotiden mit der RdRp des BCV 3 zeigte (Abb. 3.36, Spur/Klon 12; Sequenzvergleich im Anhang Abb. A 3.2). Der entsprechende Sequenzbereich lag zwischen Pos. 1148 und Pos. 1576 der RdRp (Abb. 3.38). Mit demselben Verfahren wurde aus der dsRNA der Probe E 841 mit abweichendem dsRNA-Muster (Abb. 3.29) Klon 1 (Abb. 3.37) gewonnen, der in 355 Nukleotiden zu 67 % mit der Sequenz der RdRp des BCV 3 übereinstimmte (Sequenzvergleich im Anhang Abb. A 3.1). Die Überlappung der Sequenz lag im gleichen Bereich wie die des Klons 13, bei Pos. 253-615 (Abb. 3.38). Im Sequenzalignment der Klone 1 und 13 wurde eine Übereinstimmung von 61 % in 355 bp ermittelt (Sequenzvergleich im Anhang Abb. A 3.4).

	Abb. 3.36

	Abb. 3.37

RT-PCR zum Nachweis der Sequenz des Klon 13 in dsRNA, Nukleokapsiden und Gesamt-RNA von Stieleichen mit und ohne Symptomen

Auf Basis der erhaltenen Sequenzinformationen konnten spezifische Primerpaare für eine diagnostische RT-PCR abgeleitet werden.

Von Klon 13, Homologien zur RdRp des BCV 3 aufzeigend, wurde das Primerpaar Oak Cryp 1 abgeleitet. Damit ließ sich sowohl in dsRNA, als auch in der zweiten Fraktion der angereicherten Nukleokapside aus Rinde von Stieleichen mit chlorotischen Ringflecken (E 1584) ein Fragment von 654 bp amplifizieren (Abb. 3.39). In Gesamt-RNA erkrankter und symptomloser Stieleichen sowie in gesunden Chenopodium quinoa- und Nicotiana tabacum‘Samsun’-Kontrollpflanzen lagerten sich die Primer unspezifisch an, so dass nach gelelektrophoretischer Trennung ein Bandenmuster zu sehen war. Zur spezifischen Amplifikation des gesuchten Sequenzbereiches wurde im Anschluss eine Nested-PCR mit dem Primerpaar Oak Cryp 3 durchgeführt, welches innerhalb des ersten PCR-Produktes bindet. Die genaue Lage der Primer ist in Abb. 3. 38 dargestellt.Sowohl mit dsRNA als auch mit angereicherten Nukeokapsiden und Gesamt-RNA erkrankter und symptomloser Stieleichen wurde ein 604 bp langes Fragment erzeugt (Abb. 3.40, Bild 2). Das Fragment konnte jedoch ebenso in Gesamt-RNA von Chenopodium quinoa, Nicotiana tabacum var.‘Samsun’ und Sambucus nigra nachgewiesen werden. Um zu prüfen, ob die Oligonukleotide an pflanzliche DNA binden wurde mit jeweils einer Blattprobe versucht, Gesamt-DNA aus Chenopodium quinoa und Quercus robur zu isolieren. Genomische DNA konnte mit Hilfe des NucleoSpin® Plant Kit (Fa. Macherey & Nagel) nur aus Chenopodium quinoa extrahiert werden (Kap. 2.2.6.4). Diese reagierte in der PCR mit anschließender Nested-PCR nicht mit den Oak Cryp 3-Primern. In einer Gesamt-Nukleinsäurepräparation von Blättern einer gesunden Nicotiana tabacum var.‘Samsun’, welche nicht mit RNase A verdaut wurde, konnte ohne Reverse Transkription, demzufolge in genomischer DNA, das Fragment von 604 bp in einer Nested-PCR mit dem Primerpaar Oak Cryp 3 amplifiziert werden. Der Vergleich der Sequenzen aus den Pflanzenarten Nicotiana tabacum var.‘Samsun’, Sambucus nigra und Chenopodium quinoa nach Klonierung und Sequenzierung zeigte, dass die Sequenzen zu 99 % mit der Sequenz der eichenassoziierten dsRNA identisch waren.

	Abb. 3.38

	Abb. 3.39

	Abb. 3.40

RT-PCR zum Erhalt des Zwischenstückes der Klone 12 und 13 auf der RdRp-Sequenz des BCV 3

Klon 13 aus der RT-DOP-PCR wies die Sequenzhomologie nahe des 3´-Endes der RdRp des BCV 3 auf (Abb. 3.38). Die Übereinstimmung der Sequenz des Klons 12 aus der cDNA-Synthese war in der Richtung des 5´-Endes zu finden (Abb. 3.38). Um den fehlenden Sequenzbereich zwischen den beiden Klonen zu erhalten, wurde aus der Sequenz des Klons 12 ein ‘Reverse’-Primer (Oak Cryp 2 rev) und aus der Sequenz des Klons 13 ein ‘Forward’-Primer (Oak Cryp 2 for) abgeleitet (Abb. 3.38). Diese wurden in eine RT-PCR mit dsRNA und der zweiten Fraktion der angereicherten Nukleokapside aus Stieleichen eingesetzt. 500 bp-große Fragmente konnten anschließend im 1 %igen nativen Agarosegel aufgetrennt werden (Abb. 3.41), die in etwa der erwarteten Produktlänge von 532 bp aus der bekannten Sequenz der RdRp des BCV 3 entsprachen (Abb. 3.38). Sequenzdatenbankenanalysen (NCBI, EMBL) zeigten, dass das sequenzierte Zwischenstück zu 60 % mit der RdRp des BCV 3 übereinstimmte. In Gesamt-RNA von Stieleichen konnten mit diesem Primerpaar keine Fragmente erzeugt werden.

	Abb. 3.41

Nach Sequenzvergleichen der RT-DOP-PCR-Produkte und cDNA-Fragmente zeigte sich, dass die drei Fragmente, die in den Klonen 12, 13 und 20 enthalten waren, überlappende Sequenzbereiche aufwiesen. Die Nukleotidsequenz wurde daher zu einem 1499 bp langen Produkt zusammengefügt, dessen Größe der Doppelbande von 1,5/1,6 kb, welche in 90 % aller dsRNA-Extraktionen unabhängig von der Symptomausprägung isoliert werden konnte, entsprach (Kap. 3.5.2). In allen dsRNA-Proben, aus denen die Klone 1, 12, 13, und 20 gewonnen wurden, konnte diese Doppelbande nachgewiesen werden (Kap. 3.5.3). Die von dieser Sequenz abgeleitete Aminosäuresequenz zeigte einen partiellen Leserahmen von insgesamt 479 Aminosäuren (=1437 bp) (Abb. 3.42). Das errechnete Molekulargewicht betrug 54,7 kda. Dies entspricht in etwa der geschätzten Masse der im Polyacrylamidgel aufgetrennten Proteine aus der Nukleokapsidpräparation von Pflanzenmaterial erkrankter und symptomloser Stieleichen (Kap. 3.4.2). Mit Hilfe des BLAST-Programmes wurden verschiedene Sequenzdatenbanken (EMBL, NCBI) nach ähnlichen Sequenzen auf Aminosäureebene durchsucht. Es wurden für die 479 Aminosäuren eine Identität von 56 % zur RdRp des BCV 3 (AAB27624.1) ermittelt. Zudem wurde eine Übereinstimmung von 57 % zur Aminosäuresequenz der dsRNA 1 aus Pyrus (AB012616.1) gefunden. Das Molekulargewicht der beiden kodierten Proteine von 54,9 kDa ist mit dem aus Quercus (54,7 kDa) vergleichbar. In einem Alignment mit Hilfe des Programmes CLUSTAL W (1.82) wurden die drei Aminosäuresequenzen miteinander verglichen (Abb. 3.43). Es zeigte sich, dass die höchsten Identitäten im Bereich von 176 bis 440 Aminosäuren auftraten.

	Abb. 3.42

Die Datenbankenanalysen zeigten, dass die dsRNA aus Stieleiche sicher für eine RdRp kodiert. So wies die dsRNA-Sequenz Motive auf, wie beispielsweise das hochkonservierte GDD-Motiv, die für RdRps typisch sind (Abb. 3.42 und Abb. 3.43). Insgesamt konnten acht Sequenzmotive F(1-3) bis E in der aus dsRNA von Stieleichen erhaltenen Aminosäuresequenz eindeutig identifiziert werden (Abb. 3.44). In die Analyse der Aminosäuresequenzmotive wurden auch RdRp-kodierende Abschnitte von ssRNA- und dsRNA-Viren aufgenommen, um die Homologie der konservierten RdRp-Motive von Pflanzenviren bestimmen zu können. Ebenso wurde die RdRp-Sequenz aus Stieleiche mit RdRps, die aus Pflanzen beschrieben wurden und nicht viralen Ursprungs sind verglichen [Nicotiana tabacum (T30828), Nicotiana benthamiana (AAU21243), Solanum tuberosum Chromosom (AAU90307) Oryza sativa RNA-Replikon, Polyprotein (BAA06862), Vicia faba dsRNA Replikon, Polyprotein (T12117)], da RdRp-spezifische Sequenzabschnitte in einem Nested-PCR-Verfahren mit dem Primerpaar Oak Cryp 3 sowohl in symptomtragenden als auch in symptomlosen Stieleichen nachweisbar waren.

	Abb. 3.43

	Abb. 3.44-1

	Abb. 3.44-2

Auf Grundlage der Sequenzähnlichkeiten innerhalb der acht identifizierten RdRp-Motive wurde ein phylogentischer Stammbaum erstellt, der die dsRNA-Sequenz aus Stieleiche innerhalb der Mitglieder der Familie der Partitiviridae gruppiert, in die auch die dsRNA aus Pyrus und Bryopsis eingeordnet wurde (Abb. 3.45). Pflanzliche RdRps isoliert aus dsRNA von Vicia und Oryza zeigen ebenso eine Verwandtschaft zu den Partitiviren. Höchste Sequenzübereinstimmungen von 57 % wurden innerhalb der konservierten Motive zwischen dsRNA aus Quercus und Pyrus-dsRNA sowie der RdRp von BCV 3 gefunden. Weitere RdRps innerhalb der blau markierten Gruppe der Partitiviridae wiesen Homologien von 23 % (Fusarium solani partitivirus, Cryptosporidium parvum partitivirus) bis 14 % (Atkinsonella hypoxylon 2H partitivirus) zur dsRNA-Sequenz der Stieleiche auf (Abb. 3.45). Aminosäuresequenz-Identitäten zwischen dsRNA aus Stieleiche und Sequenzabschnitten von RdRps, die sich außerhalb der Partitiviridae gruppierten, betrugen zwischen 13 % (Nb-RNA) und 9 % (TSWV-Tospovirus).

	Abb. 3.45

Mit Hilfe der Northern-Hybridisierung sollten die Klone aus der RT-DOP-PCR auf ihre Virusspezifität mit dsRNA aus Stieleiche getestet werden. Von Klon 13 wurde durch PCR-Amplifikation mit dem speziell aus dieser Sequenz abgeleiteten Primerpaar Oak Cryp 1 eine DIG-markierte DNA-Sonde hergestellt.

Die DNA-Sonde hybridisierte weder in der Northern-Hybridiserung (Kap. 2.2.12) noch nach direktem Spotten von denaturierter dsRNA auf die Membran (Kap. 2.2.13) mit dsRNA aus Stieleichen.

Aufgrund dessen erfolgte der spezifische Nachweis in einer RT-PCR. Dazu wurden die dsRNA-Moleküle für die genaue Zuordnung der amplifizierten dsRNA zu den dsRNA-Molekülen aus dem Agarosegel ausgeschnitten und getrennt in eine RT-PCR mit dem Primerpaar Oak Cryp 1 eingesetzt. DsRNA konnte nur mit Hilfe von Methode 2 (Kap. 2.2.6.3) aus Agarosegelen isoliert werden. Obwohl der Verlust an dsRNA durch die Gelextraktion etwa 90 % betrug, konnte das Fragment von 654 bp aus der 1400 bp und 1500 bp Bande amplifiziert werden.