Humboldt-Universität zu Berlin

Dissertation

Virologische Untersuchungen an Stieleichen (Quercus robur L.) zum verursachenden Pathogen der pfropfübertragbaren chlorotischen Ringflecken

Zur Erlangung des akademischen Grades Doktor der Landwirtschaft (Dr. rer. agr.)

Landwirtschaftlich-Gärtnerische Fakultät

Sabine Hahn

Gutachter:
1. Prof. Dr. C. Büttner
2. Prof. Dr. H.-P. Mühlbach

eingereicht: 05.09.2005

Datum der Promotion: 05.12.2005

Inhaltsverzeichnis

• 1 Einleitung
• 2 Material und Methoden
  • 2.1  Material
    • 2.1.1  Probenmaterial der Baumgattung Quercus
    • 2.1.2 Indikatorpflanzen für Biotest und Virusvermehrung
    • 2.1.3 Virusisolate
    • 2.1.4 Bakterienstämme
    • 2.1.5 Plasmide
    • 2.1.6 Chemikalien und Enzyme
    • 2.1.7 Polyklonale Antikörper
    • 2.1.8 Nährmedien
    • 2.1.9 Oligonukleotide
  • 2.2 Methoden
    • 2.2.1  Biotest und Übertragungswege
      • 2.2.1.1  Mechanische Übertragung auf krautige Indikatorpflanzen
      • 2.2.1.2 Überprüfung der Bodenübertragbarkeit durch das Fangpflanzenverfahren
      • 2.2.1.3 Mechanische Übertragung auf Eichensämlinge
      • 2.2.1.4 Untersuchungen zur Saatgutübertragbarkeit
    • 2.2.2 Anreicherung putativer viraler Nukleokapside
    • 2.2.3 Isolierung von putativen Viruspartikeln aus Pflanzenmaterial
      • 2.2.3.1  Isolierung von Viruspartikeln aus Gehölzen
      • 2.2.3.2 Isolierung von Viruspartikeln aus krautigen Pflanzen
    • 2.2.4 Transmissionselektronenmikroskopie
    • 2.2.5 Serologische Methoden
      • 2.2.5.1  DAS-ELISA (‘Double Antibody Sandwich-Enzyme Linked-Immunosorbent Assay’)
      • 2.2.5.2 Agargeldoppeldiffusionstest (Ouchterlony-Test)
      • 2.2.5.3 Gelelektrophoretische Auftrennung und Färbung von Proteinen
    • 2.2.6 Präparation von Nukleinsäuren
      • 2.2.6.1  Isolierung von Gesamt-RNA
      • 2.2.6.2 Isolierung von doppelsträngiger (ds)-RNA
      • 2.2.6.3 Eluierung von dsRNA und DNA aus Agarosegelen
      • 2.2.6.4 Isolierung von Gesamt-DNA aus Pflanzen
      • 2.2.6.5 Isolierung von Plasmid-DNA
      • 2.2.6.6 Chloroform-Phenol-Extraktion von Nukleinsäuren
      • 2.2.6.7 Nukleinsäurefällung
      • 2.2.6.8 Konzentrationsbestimmung von Nukleinsäuren
      • 2.2.6.9 Gelelektrophoretische Trennung von Nukleinsäuren
    • 2.2.7 ‘Polymerase-Chain-Reaction’ (PCR)
      • 2.2.7.1  Reverse Transkription
      • 2.2.7.2 IC-RT-PCR
      • 2.2.7.3 Einsatzmengen und PCR-Bedingungen
    • 2.2.8 Klonierung von PCR-Produkten
      • 2.2.8.1  Ligation
      • 2.2.8.2 Herstellung chemisch kompetenter Zellen
      • 2.2.8.3 Transformation von E. coli mit Plasmid-DNA
      • 2.2.8.4 Überprüfung rekombinanter Plasmide mittels Kolonie-PCR
      • 2.2.8.5 Restriktionsanalyse isolierter Plasmid-DNA
      • 2.2.8.6 Sequenzierung rekombinanter Plasmide und Auswertung
    • 2.2.9 Klonierung der dsRNA und Nukleokapsid-assoziierten Nukleinsäure
      • 2.2.9.1  Erststrangsynthese in Anlehnung an Benthack (2001)
      • 2.2.9.2 Erststrangsynthese modifiziert nach Jelkmann et al. (1989)
      • 2.2.9.3 Zweitstrangsynthese und Klonierung der cDNA
      • 2.2.9.4 DOP-PCR modifiziert nach Roche (1999)
    • 2.2.10 Herstellung Digoxigenin (DIG)-markierter Sonden
    • 2.2.11 Spot-Blot
    • 2.2.12 Northern-Blot und-Hybridisierung
    • 2.2.13 Dot-Blot-Hybridiserung in Anlehnung an Sambrook et al. (1989)
• 3 Ergebnisse
  • 3.1  Stieleichen mit virusverdächtigen Symptomen in Nord- und Mittel- deutschland
  • 3.2 Untersuchungen zur Übertragbarkeit des Erregers
  • 3.3 Transmissionselektronenmikroskopische Untersuchungen von Blatthomogenaten erkrankter Stieleichen
  • 3.4 
  • 3.5 Anreicherung viraler Komponenten aus Stieleiche
    • 3.5.1  Anreicherung von Viruspartikeln und Nachweis von Viren in einer RT-PCR
    • 3.5.2 Anreicherung viraler Nukleokapside
    • 3.5.3 Nachweis von Tobamo-Viren in Stieleichen mit chlorotischen Ringflecken
  • 3.6 Nukleinsäureanalysen
    • 3.6.1  Gesamt-RNA-und Gesamtnukleinsäure-Isolierung
    • 3.6.2 Isolierung viraler Replikationsintermediate (dsRNA-Isolierungen)
    • 3.6.3 Partielle Charkterisierung isolierter dsRNA
    • 3.6.4 RT-PCR mit diagnostischen Primern
    • 3.6.5 Sequenzanalyse der klonierten dsRNA
  • 3.7 Northern-Hybridisierung
• 4 Diskussion
• Abkürzungsverzeichnis
• Literatur
• Anhang 1
• Anhang 2
• Anhang 3
• Anhang 4
• Danksagung
• Erklärung

Tabellen

• Tab. 2.1: Darstellung der Probenahmestandorte unter Angabe der Art der Pflanzung, dem Baumalter und des Boniturschemas
• Tab. 2.2: Übersicht der verwendeten Virusisolate unter Angabe der Isolatbezeichnung, der Wirtspflanze und den Lagerungsbedingungen
• Tab. 2.3: Übersicht der verwendeten Primer unter Angabe der jeweiligen Kurzbezeichnung, Sequenz, Lage im Genom und Literaturreferenz (sofern nicht selbst abgeleitet)
• Tab. 2.4: Zusammensetzung der Gellösung (Volumina für zwei Gele)
• Tab. 2.5: Varianten der dsRNA-Isolierung unter Angabe des Arbeitsschrittes und der Modifikation
• Tab. 2.6: Daten der verwendeten PCR-Programme
• Tab. 2.7: DOP-PCR-Ansätze
• Tab. 3.1: Anzahl der erkrankten Stieleichen im Untersuchungszeitraum 2001-2004 an den aus-gewählten Probenahmestandorten unter Angabe der Anzahl der bonitierten Gehölze und der beobachteten Symptombilder
• Tab. A 1: Übersicht über verwendetes Probenmaterial und die Ergebnisse der Untersuchungen unter Angabe des Probenmaterials, der Symptomausprägung der Herkunft, des Teitpunktes der Probenahme sowie der Lagerung

Bilder

• Abb. 2.1
• Abb. 2.2.
• Abb. 2.3.
• Abb. 3.1
• Abb. 3.2.
• Abb. 3.3
• Abb. 3.4
• Abb. 3.5
• Abb. 3.6/Abb.3.7
• Abb. 3.8
• Abb. 3.9
• Abb. 3.10/Abb. 3.11
• Abb. 3.12
• Abb. 3.13
• Abb. 3.14/Abb. 3.15/Abb. 3.16
• Abb. 3.17/Abb. 3.18
• Abb. 3.19
• Abb. 3.20
• Abb. 3.21
• Abb. 3.22/Abb.3.23
• Abb. 3.24
• Abb. 3.25
• Abb. 3.26/Abb. 3.27
• Abb. 3.28
• Abb. 3.29
• Abb. 3.30
• Abb. 3.31
• Abb. 3.32
• Abb. 3.33
• Abb. 3.34/Abb. 3.35
• Abb. 3.36
• Abb. 3.37
• Abb. 3.38
• Abb. 3.39
• Abb. 3.40
• Abb. 3.41
• Abb. 3.42
• Abb. 3.43
• Abb. 3.44-1
• Abb. 3.44-2
• Abb. 3.45