In dieser Arbeit wurde mit serologischen und molekularbiologischen Methoden die eingangs gestellte These, dass es sich bei der Ringfleckigkeit der Stieleiche um einen viralen Krankheitserreger handelt, überprüft und versucht, dieses Pathogen näher zu charakterisieren. Im Hinblick auf die Gesunderhaltung der Stieleiche mit ihrem hohen ökologischen und ökonomischen Wert ist die Kenntnis des Pathogens Grundlage zur Entwicklung erregerspezifischer Diagnoseverfahren. Diese ermöglichen einen schnellen und sicheren Nachweis in Saatgut und Baumschulmaterial und lassen damit eine Selektion auf gesundes, virusfreies Pflanzenmaterial zu. Diagnoseverfahren können darüber hinaus helfen, die Übertragungswege und Ausbreitung des Erregers im Bestand aufzuklären, sowie dessen Bedeutung in einer multifunktionalen Landschaftsnutzung abzuschätzen.

Bei der jährlichen Erfassung der Ausbreitung des Erregers in Forstabteilungen und einer Erhaltungssamenplantage im nord- und mitteldeutschen Raum wurden folgende Symptome an Stieleichen beobachtet:

• chlorotische Ringflecken, im Verlauf der Vegetationsperiode von innen her
  nekrotisierend

• distinkte chlorotische Läsionen

• Scheckung

• mosaikartige Blattverfärbungen

Diese Blattsymptome grenzen sich deutlich von anderen Schadbildern, verursacht durch phytopathogene Pilze, Schädlinge und abiotische Faktoren, ab. Wie Büttner & Führling (1993) bereits beobachteten, ging in Einzelfällen mit den Blattsymptomen ein gestauchtes Wachstum, geringe Jahreszuwächse und ein hoher Anteil an Totholz einher (Kap. 3.1).

Chlorotische Ringflecken wurden bereits von Barnett (1971) sowie Kim & Fulton (1973) an Schwarzeichen, von Nienhaus (1975) an Traubeneichen und von Büttner & Führling (1993) an Stieleichen beschrieben. Von mosaikartigen Blattverfärbungen an Eichenblättern berichteten Blattny & Prochazkova (1966), Schmelzer et al. (1966), Yarwood & Hecht-Poiner (1970), Nienhaus (1975) und Polák et al. (1990). Distinkte, chlorotische Läsionen wurden von Büttner & Führling (1993) in Stieleichen nachgewiesen.

Mosaikartige Blattverfärbungen sowie chlorotische Ringflecken und Scheckungen sind Farbveränderungen, die auf eine Virusinfektion hindeuten. Quadt (1994) vermutet, dass diese durch Schädigung der Chloroplasten hervorgerufen werden, deren Ursache ein osmotisches Ungleichgewicht und der durch Virusbefall veränderte Proteinstoffwechsel sein kann. Distinkte nekrotische Läsionen können durch den programmierten Zelltod (Apoptose) hervorgerufen werden (Mittler et al., 1997), der durch das Kontrollgen Beclin-1 geregelt wird (Liu et al., 2005).

Die Mechanismen, durch welche ein Virus Symptome in seiner Wirtspflanze induziert, sind weitestgehend unbekannt. Fest steht, dass Interaktionen zwischen genetischen Determinanten des Virus und dem biochemisch-physiologischen System der Pflanze sowie die Expression von pflanzlichen Genen eine bedeutende Rolle spielen (Zaitlin & Hull, 1987; Yu et al., 2003, Decroocq et al., 2004). Quadt (1994) konnte anhand virusinfizierter Buchen ebenfalls zeigen, dass die Ausprägung der virusverdächtigen Blattsymptome auf Wechselwirkungen zwischen Wirtspflanze und Virus zurückzuführen sind.

Durch die Möglichkeit spezifische Sequenzbereiche des viralen Genoms zu modifizieren, wurden die Effekte von Genmutationen auf die Infektiösität und Pathogenität des Virus und die daraus resultierende Symptomausprägung untersucht. So zeigte sich, dass Mutationen von Genombereichen, die für die Replikation, Umhüllung und Ausbreitung des Virus in der Pflanze verantwortlich sind, die Symptomausprägung maßgeblich beeinflussen (Van Loon, 1987; Daubert, 1988; Desbiez et al., 2003). Rodríguez-Cerezo et al. (1991) fanden durch Inokulation von Nicotiana tabacum mit einem modifizierten Vollängenklon von Tobacco vein mottling potyvirus (TVMV) bzw. dessen Wildtyps heraus, dass durch einen 58 Nukleotide langen nicht kodierenden Bereich eine Abschwächung der Symptomausprägung im Gegensatz zum Wildtyp hervorgerufen wird. Die Autoren vermuten dass Veränderungen in der Sekundärstruktur und die veränderte Sequenzabfolge die Symptomausprägung beeinflussten.

Mischinfektionen von verschiedenen Viren können synergistische Effekte auslösen. Bei Mischinfektionen mit Potyviren beispielsweise wird häufig eine Verstärkung der Virussymptome beobachtet (Wang et al., 2002). Subvirale Komponenten in den Wirtspflanzen, wie Satelliten-RNA und Viroide können ebenfalls die Symptomausprägung beeinflussen. Die An- bzw. Abwesenheit bestimmter Sekundärstrukturtypen werden dafür verantwortlich gemacht (Masuta et al., 1989; Devic et al., 1990).

Die äußerlich erkennbaren Schadbilder können in Abhängigkeit standortspezifischer Faktoren (z. B. Immission, Strahlung, Geländeexposition, Nährstoff- und Wasserversorgung der Böden) und deren Wechselwirkungen (Büttner & Führling, 1993) variieren. Am Standort SN, FA Dresden-Nord waren im Unterschied zu den anderen Probenahmestandorten deutlich abgegrenzte, hellgelbe, distinkte Chlorosen auf den Blättern erkrankter Stieleichen zu beobachten (Kap. 3.1). Im Norddeutschen Raum konnte dieses Symptombild bisher nicht nachgewiesen werden (Büttner & Führling, 1993). Der Standort in Dresden zeichnet sich durch trockene Bodenverhältnisse, bedingt durch einen niedrigen Grundwasserstand aus. Zudem liegen als Hauptbodengesellschaften im Norden der Stadt sandige Lockersedimente vor (Landeshauptstadt Dresden, Amt für Umweltschutz, 1995). Beste Wuchsbedingungen findet die Stieleiche jedoch auf mineralhaltigen, tiefgründigen, lehmigen bis tonigen, nicht austrocknenden Böden vor (Erlbeck et al., 2002). Thomas et al. (2002) beschreiben einen ungünstigen Einfluss von Trockenstress, der zur Abnahme sekundärer Pflanzeninhaltsstoffe führen kann und diese Baumart somit anfällig für biotische Schaderreger macht.

In Abhängigkeit des Standortes waren zudem verstärkt Infektionen mit dem echten Eichenmehltau (Microsphaera alphitoides) an Blättern von Stieleichen mit Symptomen zu beobachten. Für Viren ist bekannt, dass diese als prädisponierende Faktoren die Bäume anfällig für anthropogene Einflüsse und abiotische Stressfaktoren machen (Büttner et al., 1993).

Die Erfüllung der Koch´schen Postulate schreibt die Vermehrung des krankheitsauslösenden Agens außerhalb des Wirtes in Nährmedien bzw. in Testpflanzen vor. Die Übertragung dient damit dem Nachweis der Pathogenität des Erregers. Anhand der Symptomausprägung auf den Indikatorpflanzen kann bereits in einigen Fällen die Zuordnung eines viralen Erregers in eine Virusgruppe erfolgen (Führling, 1994). In der Diagnostik ist es üblich, mechanisch übertragbare Viren, zu denen auch die in Gewässern und Böden von Waldökosystemen vorkommenden Tobamo-, Potex- und Potyviren gehören, zunächst auf krautige Testpflanzen zu übertragen, um mit den aus diesen Pflanzen leichter zu isolierenden und vermehrenden Viren arbeiten zu können. Aufgrund von Inhibitoren wie phenolischen Verbindungen (z. B. Tannine) und der ungleichmäßigen Verteilung der Viren im Gehölz ist die Virusübertragung aus Blatthomogenaten von Laubgehölzen besonders schwierig und gelingt nur selten (Fulton, 1966; Büttner et al., 1996).

In der eigenen Arbeit wurde versucht, das symptominduzierende Agens aus erkrankten Stieleichen mittels mechanischer Inokulation auf krautige Testpflanzen zu übertragen und dort zu vermehren. Zur Inaktivierung der störenden Pflanzeninhaltsstoffe und Fraktionierung der Blatthomogenate wurde die Eignung von Zusätzen wie Nikotin, EDTA, Bentonit, Na₂SO₃ und Na-DIECA zum Homogenisierungspuffer getestet. Nikotin reduziert Tannine, während EDTA als Chelatbildner die Polyphenoloxidase aktivierenden Kupferionen bindet und somit eine virusstabilisierende Wirkung erreicht (Fulton, 1966). Durch den Einsatz einer magnesiumhaltigen Bentonitsuspension sollten die Viruspartikeln von pflanzlichen Proteinen, Ribosomen und chlorophyllhaltigen Partikeln abgetrennt werden, um die Übertragung von Viruspartikeln auf krautige Pflanzen zu erleichtern (Dunn & Hitchborn, 1965). Na₂SO₃ und Na-DIECA werden aufgrund ihrer antioxidativen Wirkung zur Stabilisierung der Viruspartikeln in Verbindung mit Phosphatpuffer zur mechanischen Inokulation eingesetzt (Mijatowic et al., 2002). Die Untersuchungen von Nienhaus (1975), Führling (1994), Büttner & Führling (1996) sowie Steinmöller et al. (2004) bestätigend, führte die mechanische Inokulation der Blatthomogenate erkrankter Stieleichen auf krautige Indikatorpflanzen unter Verwendung der beschriebenen Pufferzusätze nicht zur Symptomausprägung. Viruspartikeln konnten in Adsorptionspräparaten der inokulierten Testpflanzen ebenfalls nicht nachgewiesen werden (Kap. 3.2). In noch anzustellenden Übertragungsversuchen sollten daher weitere Pufferlösungen und die Kombination von Zusatzstoffen zum Inokulationspuffer getestet werden. Ein weiteres Verfahren zur Abtrennung von Virusinhibitoren stellt z. B. die Sephadexgel- Ausschlusschromatographie dar. Führling (1994) gelang es jedoch nicht im Anschluss an die Fraktionierung von Blattpresssäften erkrankter Stieleichen über ein Gelbett (Sephadex G-100) die Erreger durch Inokulation auf krautige Indikatorpflanzen zu übertragen. Als mögliche Ursache führt die Autorin die Inaktivierung der Viren durch phenolische Inhaltsstoffe, die unter Sauerstoffeinfluss zu Quinonen oxidieren, an.

Aufgrund der ungleichmäßigen Verteilung der Erreger sowie der Witterungs- und Jahreszeitbedingten Schwankung der Erregerkonzentration im Gehölz, beeinflusst die Probenentnahme das Testergebnis genauso nachhaltig, wie die Sensitivität der Methode (Garret et al., 1985; Fuchs & Grüntzig, 1994; Büttner et al., 1996). Obwohl Mischproben aus unterschiedlichen Kronenbereichen zu unterschiedlichen Zeitpunkten entnommen worden waren, kann nicht ausgeschlossen werden, dass trotz der Symptomausprägung nur virusfreies Gewebe erfasst wurde. So beschreiben Nienhaus & Castello (1989) Viren in Gehölzen, deren höchste Titer in Wurzelgewebe festgestellt wurden.

Als phloemlimitierte Viren an Gehölzen sind das Citrus tristeza virus (CTV) in Citruspflanzensowie das Grapevine fleck virus (GfkV) und Rupestris stem pitting associated Virus-1 (RSPaV-1) in Weinreben bekannt (Brunt et al., 1996; Meng et al., 1998; Vives et al., 1999; Sabanadzovic et al., 2000; Martelli et al., 2002). Durch Abrieb von Rindengewebe symptomtragender Stieleichen auf krautige Indikatorpflanzen wurde geprüft, ob der Erreger der Eichenringfleckigkeit möglicherweise phloemlimitiert ist oder im Leitgewebe der Rinde in höherer Konzentration vorliegt und damit aus diesem Gewebe evtl. leichter zu übertragen ist als aus Blättern. Aus Rindenstücken gelang die Übertragung des Erregers jedoch ebenfalls nicht (Kap. 3.2).

Bei der mechanischen Aufbereitung des Pflanzenmaterials können die Viruspartikeln durch das Einwirken physikalischer Kräfte beschädigt werden und ihre Infektiösität verlieren. Es wurden jedoch weder durch direktes Abreiben von Blättern mit chlorotischen Ringflecken noch durch Trockeninokulation mit Rinde erkrankter Stieleichen Symptome auf krautigen Testpflanzen erzeugt. Auch aus pulversiertem Pflanzenmaterial konnte der Erreger nicht übertragen werden (Kap. 3.2).

Die im Biotest verwendeten Pflanzenarten haben sich für eine Vielzahl von Viren als geeignete Wirte erwiesen (Fulton, 1966). Dennoch ist es möglich, dass diese keine Wirtspflanzen für den bisher unbekannten Erreger aus Stieleichen darstellen. In weiteren Untersuchungen zur mechanischen Übertragung des symptominduzierenden Agens müssen alternative Testpflanzen hinsichtlich ihrer Eignung als Wirte überprüft werden. Als Testpflanzen wurden Solanaceae, Chenopodiaceae und andere Pflanzenfamilien mit kurzer Lebensdauer verwendet. Möglicherweise reichte die maximal mögliche Inkubationszeit von 4-6 Wochen nicht aus, um Symptome an den Indikatorpflanzen zu erzeugen. In zukünftigen Untersuchungen sollte durch die mechanische Übertragung auf mehrjährige Kulturpflanzenarten getestet werden, ob diese als Wirte des Erregers der Ringfleckigkeit an Stieleichen geeignet sind. Ihre Langlebigkeit sichert ein Wachstum über mehrere Monate nach der Inokulation und ist daher besonders für Viren mit langen Inkubationszeiten oder langsamer Ausbreitung geeignet und darüber hinaus ein Reservoir für frisches, infiziertes Pflanzenmaterial. Dieses ist besonders für Viren erforderlich, die ihre Infektiösität durch Lagerung verlieren (Adkins et al., 2002). Die Autoren empfehlen z. B. Solanum bahamense zur Vermehrung von Viren in einjährig fruktifizierenden Gehölzen wie in Citrus. Auch die Wirtsspezifität der Viren spielt bei der mechanischen Übertragung des Erregers eine entscheidende Rolle. Sie wird durch genetische Faktoren und die Morphologie der Pflanze beeinflusst und basiert auf Wechselwirkungen zwischen Virus und Wirt (Power & Flecker, 2005). Für ihre Replikation sind Viren auf die Enzyme und den Syntheseapparat des Wirtes angewiesen (Balter, 1998; Wise et al., 2005). Viren mit einer geringen Spezifität besitzen einen weiten Wirtskreis, wie z. B. das Cucumber mosaic virus (CMV) (Ryu et al., 1998). Viren mit einer hohen Spezifität hingegen weisen einen engen Wirtskreis auf, wie beispielsweise das CTV, das nur in Vertretern der Passifloraceae und Rutaceae vermehrt werden kann (Dallwitz, 1980; Dallwitz et al., 1993; Brunt et al., 1996). Durch die Inaktivierung von Fremdgenen (‘Gene Silencing’) sind Pflanzen in der Lage, Virusinfektionen abzuwehren (Snehasis et al., 2004).

Die unterschiedlichen Entwicklungsstadien und Organe der Pflanzen können die Aufnahme und optimale Vermehrung der Erreger ebenso beeinflussen. So stellten Ber et al. (1990) nach künstlicher Infektion von Tomatenpflanzen mit Tomato yellow leaf curl virus (TYLCV) fest, dass die höchste Viruskonzentration in schnell wüchsigem Gewebe (junge Blätter, Wurzeln, Spross Apex) zu beobachten war. Sehr geringe Konzentrationen hingegen wurden in älteren Blättern und den Kotyledonen gemessen.

Es ist nicht auszuschließen, dass eine Symptomausprägung auf den Blättern der Indikatorpflanzen unter anderen Kulturbedingungen nach mechanischer Inokulation gelungen wäre. Valat et al. (2003) untersuchten eine künstliche Infektion von Reben mit Grapevine fanleaf virus (GFLV) durch Beschuss mit Viruspartikeln oder RNA-Extrakten und weisen darauf hin, dass die Inkubation der infizierten Reben in Dunkelheit zur Ausprägung von Symptomen beitragen kann. In noch anzustellenden Untersuchungen zur Übertragung des symptomverursachenden Agens aus Stieleiche sollten die Indikatoren unter verschiedenen Licht- und Temperaturverhältnissen kultiviert werden.

Darüber hinaus muss berücksichtigt werden, dass eine erfolgreiche Übertragung der Erreger mit Hilfe der mechanischen Inokulation auf Viren beschränkt ist, die auch mechanisch übertragbar sind (Führling, 1994; Büttner et al., 1996). Viren, die ausschließlich über Vektoren wie Nematoden, Milben und Insekten sowie Pilze übertragen werden, können mit dieser Methode nicht erfasst werden.

Erst die Charakterisierung des Pathogens, seine Zuordnung zu einer Virusgruppe und die Entwicklung einer sicheren hochsensitiven Nachweismethode ermöglichen aufwendige Studien zur Übertragung des Erregers. Verschiedene moderne Inokulationstechniken könnten dann zur Aufklärung der Übertragungswege beitragen. Werden die virusverdächtigen Symptome durch (+)RNA-Viren hervorgerufen, wäre beispielsweise die Entwicklung eines geeigneten Modellsystems mittels in vitro transkribierter infektiöser Volllängen-Klone denkbar. Virale RNA und DNA kann ebenso durch Gefäßpunktierung übertragen werden. So gelang es Redinbough et al. (2001) Maize dwarf mosaic virus (MDMV), Foxtail mosaic virus (FoMV) und Maize streak virus (MSV) ohne den Einsatz von biologischen Vektoren auf Mais zu propagieren. Bei erfolgreicher Isolierung von Viruspartikeln wäre darüber hinaus eine Infektion durch Partikelbeschuss der Pflanzen alternativ zu viralen Genomextrakten möglich (Gal-On et al., 1995, 1997; Valat et al., 2003). Eine andere Möglichkeit stellt die Agroinfektion dar. Leiser et al. (1992) gelang es hiermit das Beet western yellows virus (BWYV), welches nicht mechanisch übertragbar ist, auf krautige Testpflanzen zu übertragen.

In Nord- und Mitteldeutschland wurde eine weite Verbreitung der vermutlich durch Viren induzierten Ringfleckigkeit der Stieleichen beobachtet. Besonders auffallend war das nesterweise Auftreten der Symptome in den Stieleichenbeständen (Kap. 3.1).

Böden sind als Virusreservoir stabiler Viren zu berücksichtigen (Büttner & Nienhaus, 1989b; Kegler, et al., 1995; Führling & Büttner, 1998). In Bodenproben wurden bereits Potex- und Tobamoviren, sowie ein Isolat das Tobacco necrosis virus (TNV) und Potato virus Y (PVY) nachgewiesen (Nienhaus, 1989). Viren können über absterbende Wurzelzellen an das Substrat abgegeben werden. Ihre Adsorption bzw. Desorption im Boden hängt von der Ionenkonzentration, dem pH-Wert, und der Zusammensetzung des organischen Materials ab. Auch die Bodenfeuchte und -temperatur können die Bindung der Viren beeinflussen (Nienhaus & Castello, 1989).Für Viren, die keine Vektoren aufweisen, ist die Übertragung durch kontaminierte Böden und Wasser von besonderer Bedeutung. Forstgehölze wie Fichten, Eschen und Eichen sind Viren im Boden extrem lange ausgesetzt, so dass eine Infektion über die Wurzelhaare stattfinden kann (Fillhart et al., 1998). Mit Hilfe des Fangpflanzenverfahrens oder der Bodenauswaschung können Viren aus Böden isoliert werden, wobei das erstgenannte Verfahren sensitiver ist (Büttner & Nienhaus, 1989b, Büttner et al., 1996; Fillhart et al., 1998). Verschiedene Virusgenera, wie beispielsweise Tobamoviren (Hiruki & Teakle, 1987; Fillhart et al., 1998), Potex- und Potyviren (Hiruki & Teakle, 1987, Nienhaus, 1989), Pomoviren (Savenkov et al., 1999) und Necroviren (Nienhaus, 1989) konnten bereits mit dieser Methode in Böden nachgewiesen werden. In der eigenen Arbeit wurde unter Verwendung dreier Pflanzenarten im Fangpflanzenverfahren versucht, Viren aus Böden von Stieleichenbeständen zu isolieren. An Blättern von Chenopodium quinoa wurden nach 14 Tagen nekrotische Lokalläsionen und chlorotische Ringflecken festgestellt (Kap. 3.2). In Adsorptionspräparaten des nekrotisierten Gewebes und in Wurzelproben ließen sich allerdings keine Viruspartikeln darstellen. Fillhart et al. (1998) konnten mit dieser Versuchstechnik nur wenige begrenzte Wurzelinfektionen an Chenopodium quinoa erzeugen. Dieses Ergebnis führt er auf die geringe Inokulumsdichte im Boden sowie die kurze Inkubationszeit von krautigen Pflanzen in kontaminierten Böden zurück. Tuitert & Bochen (1993) sowie Yilmaz et al. (2004) geben als optimale Inkubationszeit sechs Wochen für diesen Test an. In noch durchzuführenden Untersuchungen zur Übertragung des Erregers der Ringfleckigkeit in Stieleichen sollten neben weiteren Pflanzenarten auch längere Inkubationszeiten für das Fangpflanzenverfahren geprüft werden. Es ist davon auszugehen, dass das Agens der Ringfleckigkeit nicht, oder in sehr geringer Konzentration im Boden vorliegt, so dass es mit den bisher angewendeten Methoden nicht nachweisbar war. Nach Charakterisierung des Erregers wäre der spezifische Nachweis direkt aus dem Boden auf Basis einer PCR denkbar.

Viren können in Pflanzenresten im Boden überdauern. Durch Grund- und Oberflächenwasser können stabile Viren ausgewaschen und an andere Standorte transportiert werden. Der Wasserübertragbarkeit von Pflanzenviren ist daher ebenso Beachtung beizumessen, wie der Bodenübertragbarkeit (Nienhaus & Castello, 1989; Büttner & Nienhaus, 1989a; Büttner et al., 1996). Ein verstärktes Auftreten erkrankter Stieleichen an Wasserläufen und moorastigen Standorten war in den eigenen Bonituren und Erhebungen nicht festzustellen. Aufgrund der heterogenen Verteilung der befallenen Bäume in den einbezogenen Forstamtsbereichen ist die vorwiegende Verbreitung des Erregers über Grund- und Oberflächenwasser als unwahrscheinlich einzustufen.

Vielmehr ist eine Saatgutübertragbarkeit des symptomverursachenden Agens aus Stieleichen anzunehmen. Darauf deutet zum einen das nesterweise Auftreten der erkrankten Stieleichen in den untersuchten Forstabteilungen hin. Zum anderen sind Viren in Gehölzen bekannt, wie beispielsweise TMV (Brunt et al., 1996), die sich über das Saatgut im Bestand ausbreiten können. In den eigenen Untersuchungen wurde Saatgut erkrankter Stieleichen ausgesät und über einen Zeitraum von drei Jahren regelmäßig bonitiert. Schwach chlorotische Ringflecken waren nur an den Blättern eines Sämlings erkennbar (Kap. 3.2). Möglicherweise werden die virusverdächtigen Blattsymptome erst ab einem bestimmten Alter der Sämlinge ausgeprägt. Um die vermutete Saatgutübertragbarkeit des Agens bestätigen zu können ist die Beobachtung der Sämlinge auch in den folgenden Jahren erforderlich. Nach erfolgreicher Charakterisierung des Erregers sollten spezifische Primer entwickelt und das Saatgut erkrankter Stieleichen mittels RT-PCR überprüft werden.

Elektronenmikroskopische Studien ermöglichen den nativen Nachweis von Viren in Adsorptionspräparaten. Bei der elektronenoptischen Darstellung von Viren anhand ihrer charakteristischen Morphologie, die eine Gruppenzuordnung erlaubt, können jedoch zahlreiche Probleme auftreten (Büttner et al., 1996). So können beispielsweise Hemmstoffe und oxidative Prozesse die Nachweistechnik stören. Ebenso lassen die häufig ungleichmäßige Verteilung der Viren im Gehölz sowie deren geringe Konzentration oft nur einen ungenügenden Nachweis zu.

In eigenen elektronenmikroskopischen Untersuchungen konnten neben isometrischen Partikeln mit einem Durchmesser von ca. 30-40 nm, stäbchenförmige Partikeln mit einer Länge von etwa 120 nm und flexible Partikeln von etwa 450 nm in Blatthomogenaten symptomtragender Stieleichen gezeigt werden (Kap. 3.3, Kap. 3.4.1). Steinmöller et al. (2004) hatten in vorangegangenen Untersuchungen ebenfalls isometrische Partikeln dieser Größe in Pflanzenhomogenaten und teilgereinigten Blattpresssäften von Stieleichen mit chlorotischen Ringflecken darstellen können, nicht jedoch die stäbchen- und fadenförmigen Partikeln.

Isometrische Viruspartikeln weisen durch ihre ikosaedrische Form meistens eine deutliche Oberflächenstruktur auf.Diese konnte an den sphärischen Partikeln aus Eiche nicht beobachtet werden. Es ist möglich, dass die Oberflächenstruktur aufgrund mangelhafter Kontrastierung nicht erkennbar war. Trotz verlängerter Inkubationszeit des Kontrastmittels und der Verwendung einer 2 %igen Uranylacetatlösung konnte keine stärkere Kontrastierung der Oberfläche erreicht werden. Viele phytopathogene Virusgenera, die in Gehölzen beschrieben werden, weisen Viren mit isometrischen Partikeln mit einem Durchmesser von ca. 30-40 nm auf. Zu ihnen gehören Nepoviren, Ilarviren, Dianthoviren, Cucumoviren, Bromoviren und Alphacryptoviren (Brunt et al., 1996). Eine Zuordnung der aus Eichenproben isolierten isometrischen Partikeln konnte somit allein auf Basis der elektronenoptisch ausgewerteten Adsorptionspräparate nicht erfolgen.

Um die isometrischen Viruspartikeln anzureichern, wurde Blattmaterial von Stieleichen mit Symptomen nach der Methode von Hentsch (1998) aufgereinigt. Dem Autor war es mit dieser Methode gelungen, sphärische Viruspartikeln aus Rosskastanie zu isolieren. Steinmöller et al. (2004) konnten in vorangegangenen Untersuchungen mit der Virusreinigung nach Hentsch (1998) bereits erfolgreich isometrische Viruspartikeln aus Blattmaterial erkrankter Stieleichen anreichern.

Zur Beseitigung unerwünschter Proteinewurde das Blattmaterial zunächst einer Vorklärung mit Bentonit unterzogen. Dunn & Hitchborn (1965) fanden heraus, dass die anschließende Differentialzentrifugation durch die Vorklärung mit Bentonit um einige Zyklen verkürzt werden kann. Dieser Aspekt ist für die Reinigung instabiler Viren von besonderer Bedeutung. In eigenen Untersuchungen konnten durch die Vorklärung mit einer magnesiumhaltigen Bentonitsuspension und anschließender differentieller Zentrifugation isometrische Viruspartikeln aus Stieleichenblättern mit chlorotischen Ringflecken isoliert werden. In zwei Proben wurden darüber hinaus stäbchenförmige Viruspartikeln detektiert (Kap. 3.4.1). Auch Lister & Hadidi (1971) sowie Fuchs & Merker (1985) setzten magnesiumhaltige Bentonitsuspensionen erfolgreich zur Isolierung des instabilen Apple chlorotic leafspot virus (ACLSV) ein. Zur Stabilisierung der Viren fügten Dunn & Hitchborn (1965) die Bentonitsuspension bereits während der Extraktionsphase zu. Da in den Vorarbeiten von Steinmöller et al. (2004) durch eine Vorklärung im Anschluss an die Extraktion nur wenige virusverdächtige Partikeln isoliert werden konnten, wurde in den eigenen Untersuchungen das Bentonit bereits dem Extraktionspuffer zugesetzt. Es gelang damit nicht, die Anzahl isolierter Viruspartikeln aus Stieleichen zu erhöhen. Dunn & Hitchborn (1965) sowie Fuchs & Merker (1985) setzten eine höhere Menge an Bentonitsuspension ein. Im Vergleich zu den Untersuchungen von Hentsch (1998) und Steinmöller et al. (2004) konnte auch mit einer Verdopplung der Menge an Bentonitlösung in der eigenen Arbeit keine Anreicherung der Viruspartikeln nach der Differentialzentrifugation erreicht werden. Als Ursache muss neben dem unbekannten Ausgangstiter im Blattmaterial auch die Zusammensetzung der Bentonitsuspension bzw. deren Magnesiumgehalt diskutiert werden. So konnten Dunn & Hitchborn (1965) Unterschiede in der Adsorption der Viruspartikeln in Abhängigkeit des Magnesiumgehaltes in der Bentonitlösung feststellen. Nach Aussage der Autoren üben die Art und Zusammensetzung der Pufferlösung ebenfalls einen Einfluss auf das Adsorptionsverhalten aus. In folgenden Untersuchungen sollte daher geprüft werden, ob sich eine Veränderung der Magnesiumkonzentration in der Bentonitlösung oder der Einsatz von Magnesiumsulfat zum Extraktionspuffer positiv auf die Höhe des Virustiters in der aufgereinigten Virussupension auswirkt.

Durch die Differentialzentrifugation können Viruspartikeln aus einem Flüssigmedium isoliert werden. Eine Trennung von Partikeln unterschiedlicher Größe kann durch eine Zonalzentrifugation in einem Dichtegradienten erfolgen (Danielsson et al., 1978; Mikkelsen & Cortón, 2004). Sphärische Partikeln aus Blättern erkrankter Stieleichen wurden daher alternativ durch eine Vorklärung mit Chloroform und anschließender Dichtegradienten-zentrifugation nach Rebenstorf (2002) aufgereinigt. Die Zuckerlösung mit nach unten ansteigender Dichte verhindert, dass schneller sedimentierende Partikeln vorzeitig den Boden erreichen. Die hohe Viskosität der Zuckerlösung hat zudem eine verringerte Diffusion und Konvektion und damit eine geringere Bandenbreite der zu trennenden Partikeln zur Folge. Rebenstorf (2002) gelang es mit dieser Methode reproduzierbar Cherry leaf roll virus (CLRV)-Partikeln aufzureinigen.

Durch die Reinigungsverfahren nach Hentsch (1998) und Rebenstorf (2002) konnten in der eigenen Arbeit unter anderem isometrische Viruspartikeln mit einem Durchmesser von ca. 25-30 nm aus symptomtragenden Stieleichenblättern angereichert werden (Kap. 3.4.1). Da Stieleichen vergesellschaftet mit Birken vorkamen (Kap. 3.1) war zu prüfen, ob es sich bei den isometrischen Partikeln um das Kirschenblattrollvirus handelt. CLRV ist in Forstgehölzen weit verbreitet. Über das Auftreten von CLRV in Ulmen, Sandbirken, Esche und Holunder wurde erstmals Mitte des 20. Jahrhunderts berichtet (Varney & Moore, 1952; Schmelzer, 1966; Jones & Murant, 1971; Schmelzer, 1972; Ford et al., 1972; Horváth et al., 1975; Cooper & Atkinson, 1975; Nienhaus & Hamacher, 1990). In späteren Untersuchungen wurden Rotbuche (Winter & Nienhaus, 1989; Ackermann, 1991) und Walnuss (Borja et al., 1996) als holzige Wirte bestätigt. Durch die mögliche Übertragung über Vektoren, Wasser und Böden (Fritsche & Kegler, 1966, Jones & Wood, 1978; Cooper & Edwards, 1980; Jones et al., 1981; Brunt et al., 1996) ist eine Infektion der Stieleichen mit diesem Virus denkbar. Nienhaus (1985a) war es gelungen, aus Traubeneichen mit chlorotischen Ringflecken und Linienmustern isometrische Partikeln zu isolieren, die denen der Nepoviren ähnlich waren.

Blatthomogenate und teilgereinigte Blattpresssäfte reagierten im ELISA nicht mit Antikörpern gegen CLRV (Kap. 3.4.1). Dies bestätigt Untersuchungen von Führling (1994). Es ist davon auszugehen, dass der hohe Gehalt an Polysacchariden und Gerbstoffen in Stieleichen (Führling, 1994), sowie die ungleichmäßige Verteilung der Viren im Gehölz den serologischen Nachweis erschwerten (Bitterlin et al., 1984; Fuchs & Grünzig, 1994; Grünzig et al., 1994; Büttner et al., 1996).

Wesentlich sensitiver als serologische Nachweisverfahren ist die PCR (Ryu & Park, 1995). Die hohe Sensitivität und Spezifität der Methode macht das Verfahren für den Nachweis von Viren in Gehölzen besonders geeignet, da diese oft in geringer Konzentration und ungleichmäßig verteilt vorliegen. In einer RT-PCR mit dem hochkonservierten Primerpaar RW1/RW2 (Werner et al., 1997) konnten in Gesamt-RNA und dsRNA von Stieleichen mit chlorotischen Ringflecken keine CLRV-spezifischen Fragmente amplifiziert werden.

Weder serologisch noch durch IC-RT-PCR war CLRV in Stieleichen mit virusverdächtigen Blattsymptomen nachzuweisen. Dies könnte zum einen auf den bereits erwähnten geringen Virustiter oder die Inhibitoren zurückzuführen sein, die den PCR-Nachweis beeinträchtigen. Zum anderen ist unklar, ob CLRV als Verursacher der Ringfleckigkeit an Stieleichen in Frage kommt. Zur abschließenden Klärung könnten in noch anzustellenden Versuchen die in Stieleichen mit Ringflecken angereicherten Virussuspensionen, in denen elektronenoptisch isometrische Partikeln nachweisbar waren, in einer RT-PCR mit CLRV-spezifischen Primern getestet werden.

Auch andere Forstgehölze zeigen virusinduzierte chlorotische Ringflecken. So ist die Ringfleckigkeit der Ebereschen in Forstbeständen weit verbreitet. In ihrer Symptomausprägung ist sie der Ringfleckigkeit an Stieleichen sehr ähnlich (Kegler, 1960; Führling & Büttner; 1998; Benthack, 2001). Mielke (2004) sowie Benthack et al. (2005) entwickelten Primer zum Nachweis des Erregers der Ringfleckigkeit an Ebereschen. Die molekularbiologische Charakterisierung des Virus ermöglichte eine Zuordnung zu den Bunyaviren, zu denen auch die pflanzenpathogenen Tospoviren zählen. Virusinfizierte Ebereschen traten am Standort Berlin-Grunewald vergesellschaftet mit erkrankten Stieleichen auf (Kap. 3.1). In einer RT-PCR mit den spezifischen Primern für das Virus in Ebereschen und Gesamt-RNA aus Blättern und Rinde symptomtragender Stieleichen konnte eine Infektion der Stieleichen mit diesem Erreger nicht nachgewiesen werden. Möglicherweise war die Konzentration der viralen RNA in Gesamt-RNA-Präparationen zu gering, so dass der Erreger nicht aufgezeigt werden konnte. Um eine Infektion mit dem Erreger der Ebereschenringfleckigkeit ausschließen zu können, sollten in weiterführenden Untersuchungen angereicherte dsRNA aus Stieleichen oder teilgereinigte Blattpresssäfte zur Amplifikation eingesetzt werden. Vermutlich kommt dieses Agens jedoch nicht als Verursacher der Eichenringfleckigkeit in Frage.

Frühere Studien berichten über eine Verbreitung von Potex- bzw. Potyviren in Stieleichen (Nienhaus, 1985a), Waldböden (Büttner & Nienhaus, 1989b) und Gewässern (Büttner & Nienhaus, 1989a). Im Blatthomogenat einer Stieleiche mit chlorotischen Ringflecken konnte elektronenmikroskopisch ein flexibles Partikel dargestellt werden (Kap. 3.3). Kim & Fulton (1973) wiesen bereits in Färbereichen mit dem gleichen Symptombild Partikeln dieser Morphologie nach. Mit der von Dijkstra et al. (1996) beschriebenen Methode zur Aufreinigung verschiedenster Potyviren gelang es in der eigenen Arbeit nicht, die flexiblen Partikeln aus Stieleichenblättern mit chlorotischen Ringflecken anzureichern. Möglicherweise eignet sich dieses Verfahren nicht für die Extraktion solcher Viruspartikeln aus Stieleichen. Es bleibt zu klären, ob Potyviren oder Viren mit ähnlichen Partikeln wie Carla- oder Potexviren als symptominduzierenden Erreger der Ringfleckigkeit an Stieleichen in Frage kommen. In weiterführenden Arbeiten könnten zum einen alternative Aufreinigungsverfahren getestet und zum anderen Gesamt-RNA erkrankter Stieleichen in einer PCR mit gruppenspezifischen Primern untersucht werden.

Aus zwei Mischproben erkrankter Stieleichen (E 151, E 152) konnten neben den bereits beschriebenen isometrischen Partikeln stäbchenförmige Viruspartikeln nach der Aufreinigungsmethode von Hentsch (1998) isoliert werden (Kap. 3.3, Kap. 3.4.3). Aufgrund ihrer Morphologie wurden sie den Tobamoviren zugeordnet. Schmelzer et al. (1966) konnten in Stieleichen mit Blattscheckung bereits stäbchenförmige Viruspartikeln von 300 nm Länge elektronenoptisch darstellen. Yarwood & Hecht–Poinar (1970) wiesen in Kalifornien TMV in Eichen mit und ohne Virussymptomen nach. Nienhaus & Yarwood (1972) vermuten daher eine weit verbreitete latente TMV-Infektion in kalifornischen Eichenbeständen. TMV-ähnliche Partikeln wurden ebenso in deformierten Blättern der Zerreiche in Ungarn gefunden (Horváth et al., 1975).

In der eigenen Arbeit konnten die stäbchenförmigen Partikeln von 450 nm in zwei Proben (E 151 und E 152) nur im Anschluss an die Anreicherung des Erregers durch Differentialzentrifugation elekronenoptisch dargestellt werden. In Tropfpräparaten von Blatthomogenaten erkrankter Stieleichen gelang es nicht, diese Viruspartikeln zu zeigen. Dieses Ergebnis steht in Übereinstimmung mit den Untersuchungen von Nienhaus (1975), der die fehlende Darstellung auf die geringe Viruskonzentration in Stieleichen zurückführt. Nienhaus & Yarwood (1972) gelang es aus elf Eichenarten unabhängig von der Symptomausprägung TMV auf Chenopodium- Pflanzen zu übertragen, nachdem sie den Rohextrakt zur Abtrennung von Virusinhibitoren über ein Sephadex G 100-Gelbett fraktioniert hatten. Die Autoren schlossen aufgrund des Auftretens unterschiedlicher Symptome an den mechanisch inokulierten Testpflanzen auf verschiedene TMV-Stämme. Eigene Ergebnisse bestätigen diese Vermutung nicht. Die Tabakpflanzen zeigten nach der mechanischen Inokulation mit den TMV-Isolaten aus Stieleichen Blattdeformationen und Nekrosen, an Chenopodium quinoa waren chlorotischen Lokalläsionen zu beobachten. Diese Symptome wurden ebenfalls durch die Inokulation mit ToMV-Isolaten induziert (Kap. 3.4.3). Die Diffenzierung von Tobamovirusspezies anhand von Symptomen ist schwierig, da es keine differenzierenden Wirtspflanzen gibt (Letschert, 2003).

Das Blatthomogenat aus Indikatorpflanzen reagierte sowohl mit dem Antiserum gegen TMV als auch mit demjenigen gegen ToMV. Auch im Agargeldoppeldiffusionstest konnte nicht zwischen diesen beiden Viren unterschieden werden (Kap. 3.4.3). Die Ursache sind vermutlich Kreuzreaktionen dieser Antiseren, welche durch den ähnlichen Aufbau der Hüllproteine verschiedener Tobamovirusspezies bedingt werden (Jacobi & Castello, 1991; Fillhart et al., 1998; Jacobi et al. ,1998; Letschert et al., 2002; Kamenova & Adkins, 2004). Bislang sind jedoch kaum monoklonale Antikörper verfügbar, womit eine eindeutige Differenzierung der Tobamovirusspezies möglich wäre (Letschert, 2003). Molekulargenetische Nachweisverfahren, wie die PCR, sind daher von besonderer Bedeutung. Für die Differenzierung ist es notwendig, einen variablen Bereich des Genoms zu wählen. Analysen haben gezeigt, dass die größte Heterogenität im Bereich des Hüll- und Transportproteingens zu finden ist. Da beide Gene direkt mit den Wirtsproteinen interagieren, scheinen sie einem hohem Selektionsdruck zu unterliegen, was diese Genombereiche zur Differenzierung besonders geeignet macht (Berzal-Herranz et al., 1995; de la Cruz et al., 1997).

Mit Hilfe einer IC-RT-PCR nach Jacobi et al. (1998) konnte ein Isolat (E 151) mit einer Identität von 99,8 % über einen Bereich von 508 bp des viralen Transportproteingens dem Genus ToMV zugeordnet werden. Das zweite Isolat (E 152) wurde in einer RT-PCR mit spezifischen Primern für das Hüllproteingen nach Letschert et al. (2002) mit einer Identität von 97 % über den Bereich von 795 bp als TMV-Isolat charakterisiert. Um die beiden Isolate aus Stieleiche miteinander vergleichen und phylogenetisch einordnen zu können, wurde ein Alignment mit dem Gesamt-Genom definierter TMV und ToMV-Isolate durchgeführt. Unklare Zuordnungen vieler Tobamovirus- Isolate in den Internetsequenzdatenbanken erschwerten jedoch die Differenzierung der Isolate. Genaue Sequenzinformationen zu TMV ‘tomato strain’ (ToMV) erhielten Ohno et al. (1984) durch eine cDNA-Klonierung. Sie stellten eine Homologie von etwa 80 % zu TMV vulgare fest. Die endgültige Zuordnung der Isolate aus Stieleiche basiert auf den definierten Referenzisolaten ToMV (X02144) und TMV (X68110), auf welche sich bereits die Autoren Jacobi et al. (1998) und Letschert et al. (2002) beziehen. Dass keine 100 %ige Übereinstimmung erreicht wird liegt darin begründet, dass auch innerhalb einer Spezies Nukleotidaustausche vorkommen können. Diese werden durch die relativ hohe Fehlerrate der RNA abhängigen RNA Polymerase (RdRp) während der Replikation des Virus verursacht. Die Mutationsrate pflanzlicher Viren wird ähnlich hoch eingeschätzt wie die tierpathogener Viren, welche nach Domingo & Holland (1994) 10^-4 beträgt.

Auf Basis der Sequenzanalysen ist anzunehmen, dass sowohl ein ToMV- als auch ein TMV-Isolat aus Stieleichen isoliert wurde. Die Genomorganisation der Tobamovirusgruppe der Solanaeae, zu der TMV und ToMV zählen, zeigt, dass der ‘Open Reading Frame’ (ORF) des Hüllproteingens und der ORF des Transportproteingens durch einige Nukleotide getrennt ist. Die Sequenz dieses Bereiches fehlt, um beide Isolate direkt miteinander vergleichen zu können. Daher ist es ebenso denkbar, dass es sich bei den beiden Isolaten aus Stieleiche um ein einziges rekombinantes Isolat handelt, welches im Bereich des Transportproteingens eine Identität zu ToMV und im Bereich des Hüllproteingens eine Identität zu TMV aufweist. Es bedarf daher noch weitere Genomanalysen.

Da Tobamoviren aufgrund ihrer physikalischen Eigenschaften außerordentlich stabil sind und über mehr als 10 Jahre infektiös bleiben, wurde mit großer Sorgfalt darauf geachtet, Fremdkontaminationen auszuschließen. Eine Laborkontamination für das Isolat E 152 kommt nicht in Betracht, da die Sequenzen der Vergleichsisolate E 317, 5/11/1988 und 13/08/1989 nicht mit den Hüllproteinsequenzen des in Stieleiche definierten TMV-Isolates übereinstimmten. Ein direkter Vergleich mit dem aus Stieleiche isolierten ToMV-Isolat E 151 war nicht möglich, da von diesem nur Sequenzinformationen im Bereich des Transportproteingens vorliegen. Im Vergleich zu dem ToMV-Referenzisolat erzielten alle ToMV-Isolate eine Übereinstimmung von etwa 99 %. Eine Kontamination mit einem dieser Isolate kann daher für E 151 nicht ausgeschlossen werden.

Ein ursächlicher Zusammenhang von TMV und ToMV mit den an Eichen beobachteten chlorotischen Ringflecken wird in vorherigen Untersuchungen angezweifelt (Kim & Fulton, 1973; Nienhaus, 1975; Führling, 1994). In der eigenen Arbeit wurden beide Tobamovirusisolate aus Blattmaterial mit chlorotischen Ringflecken gewonnen. Es wurde durch die Rückübertragung des TMV-Isolates E 152 auf Eichensämlinge versucht, das Vorkommen von Tobamoviren in Stieleichen zu belegen. Die Erfüllung der Koch´schen Postulate schreibt die Rückübertragung des aus den Indikatorpflanzen isolierten Erregers auf die natürliche Wirtspflanze vor. Es ist allerdings schwierig Viren durch mechanische Inokulation auf holzige Wirte zu übertragen. Als alternative Methode beschreiben Garnsey et al. (1977) das ‘Stem-Slashing’. Verschiedene Viren aus Citrus, wie CTV, Citrus leaf rugose virus (CiLRV), Tatter leaf virus (TLV) sowie zwei infektiöse dRNAs des CTV konnten mit dieser Methode bereits übertragen werden (Garnsey et al., 1977; Frison & Taher, 1991; Che et al., 2002; Iwanami & Shimizu, 2004). Durch ‘Stem-Slashing’ und mechanische Inokulation des Isolates E 152 auf Eichensämlinge gelang es in der eigenen Arbeit bisher nicht die Koch´schen Postulate zu erfüllen. Im Untersuchungszeitraum 2002-2004 konnten an den behandelten Sämlingen weder die chlorotischen Ringflecken, noch TMV-Viruspartikeln in elektronenmikroskopischen Untersuchungen von Blatthomogenaten nachgewiesen werden (Kap. 3.2). Als Ursache ist die lange Latenz zwischen der Infektion und der Entwicklung von Blattsymptomen bzw. der Nachweisbarkeit des Erregers anzunehmen (Kegler, 1960; Nienhaus & Castello, 1989). Die Bonitur der behandelten Eichensämlinge auf virusverdächtige Symptome ist auch in den folgenden Jahren erforderlich. Ferner ist denkbar, dass die isolierten Tobamoviren keine charakteristischen Symptome in Stieleichen erzeugen. Dies würde die These einer weit verbreiteten latenten Infektion der Eiche mit Tobamoviren, die Nienhaus & Yarwood (1972) für kalifornische Eichenbestände vermuten, bestätigen. Latente Infektionen werden als Anzeichen für extrem geringe Viruskonzentrationen angesehen (Nienhaus, 1972; Nienhaus, 1975). Die Virusinfektion in Eichen scheint sehr gering zu sein, denn elektronenoptisch waren die Tobamoviren erst nach einer partiellen Reinigung von Blattextrakten aufzuzeigen (Kap. 3.3). Auch in Gesamt-RNA von Stieleichenblattproben mit verschiedenen Symptombildern gelang es nicht, die Tobamoviren mit Hilfe der RT-PCR nachzuweisen. Durch einen PCR-Nachweis pflanzeneigner Gene in Eichen, wie Ubiquitin oder Aktin (Brunner et al., 2004), könnte in nachfolgenden Untersuchungen getestet werden, ob möglicherweise sekundäre Pflanzeninhaltsstoffe den direkten Nachweis in Eichenblattproben beeinträchtigen.

Neben den serologischen Verfahren und der Virusaufreinigung bieten molekularbiologische Methoden zur Analyse des viralen Genoms eine Möglichkeit der Identifikation von Viren. Da über 90 % aller phytopathogenen Viren RNA-Genome besitzen (Zaitlin & Hull, 1987), ist die Voraussetzung zur Amplifikation von viraler cDNA die Isolierung hochreiner, intakter Gesamt-RNA. Für die Extraktion von Gesamt-RNA aus Stieleichen wurden verschiedene Verfahren getestet. Das in der vorliegenden Arbeit verwendete Kit der Fa. Invitek eignete sich nicht für Gesamt-RNA Präparationen aus Stieleichengeweben. Ursache dafür kann der hohe Gehalt an Polyphenolen, wie den Tanninen sein. Diese binden die Nukleinsäuren, die dann nicht mehr durch herkömmliche Verfahren abgetrennt werden können (Newbury & Possingham, 1977; Maliyakal, 1992). Aus krautigen Pflanzen konnte mit diesem Verfahren hingegen RNA extrahiert werden. Da die Ausbeute mit 10-15 µg/100 mg Ausgangsmaterial eher gering war, wurde für weitere Untersuchungen ein Extraktionsverfahren, modifiziert nach Dellaporta et al. (1983) angewendet, welches ursprünglich für die Isolierung von Gesamt-Nukleinsäuren entwickelt worden war. Zur Entfernung von Proteinen wurde dieses Verfahren in der eigenen Arbeit durch eine Phenol-Chloroform-Extraktion ergänzt. Für die Präparation der Gesamt-RNA wurde zusätzlich ein Verdau mit DNase 1 mit anschließender Ethanolfällung durchgeführt. Somit war es möglich, große Mengen Gesamt-RNA aus verschiedenen Stieleichengeweben zu gewinnen. Da die Gesamt-RNA teilweise degradiert war, wurde alternativ das Extraktionsverfahren modifiziert nach Boom et al. (1990) angewendet. Die Autoren fanden heraus, dass Nukleinsäuren in Gegenwart von chaotropen Reagenzien mit hoher Effizienz an Silica-Partikel binden. Die Autoren extrahierten mit dieser Methode verschiedenste Nukleinsäuren aus menschlichem Serum und Urin. Für die Isolierung von Gesamt-RNA aus verschiedenen holzigen Pflanzen wie Kirsche (Rott & Jelkmann, 2001; 2005) Apfel (Menzel et al., 2002) und Eberesche (Mielke, 2004) wurde das Verfahren bereits erfolgreich eingesetzt. Auch aus menschlichem und tierischem Serum, Urin und Kot wurden Nukleinsäuren mit Hilfe dieser Extraktionsmethode gewonnen (Boom et al., 1990; van der Hoeck et al., 1995; Bastos et al., 2001). Mielke (2004) modifizierte das Protokoll durch die Zugabe von 2,5 % PVP zum Extraktionspuffer. Diese Substanz bildet durch Wasserstoffbrückenbindungen Komplexe mit Polyphenolen, die sich infolgedessen vom Pflanzenhomogenat abtrennen lassen. Durch die Ergänzung einer Phenol-Chloroform-Extraktion mit anschließender Fällung können Proteine und RNasen entfernt werden. Somit war es der Autorin gelungen, hochreine und intakte RNA aus Ebereschengeweben zu isolieren. Das Verfahren eignete sich in der eigenen Arbeit ebenfalls zur Extraktion qualitativ hochwertiger Gesamt-RNA aus Blättern, Rinde und Knospen von Stieleichen, die ein ideales Template für die nachfolgende RT-PCR darstellte.

Die Isolierung von dsRNA wird bevorzugt zur Diagnose verwendet, wenn Viren nicht übertragbar sind oder keine Partikeln isoliert werden können (Jordan et al., 1983). Diese Methode wird daher besonders häufig für die Charakterisierung von Viren aus holzigen Pflanzen eingesetzt, da deren hoher Gehalte an Phenolen und Polysacchariden die Übertragung und Isolierung von Viren erschweren (Cox et al., 2000). Bei der Replikation von Viren mit einzelsträngigem (ss)RNA- Genom entstehen intermediäre und replikative Formen. Während die intermediären Formen nur teilweise doppelsträngige RNA (dsRNA) aufweisen, besteht die replikative Form aus einer vollständig durchgepaarten dsRNA. Der Nachweis hochmolekularer dsRNA kann demzufolge als erstes Indiz für eine Virusinfektion angesehen werden, sofern sie in gesunden Pflanzen nicht zu finden ist (Dodds et al., 1984; Valverde et al., 1990b). Außer in replikativen Formen und Intermediaten von ssRNA-Viren kann dsRNA aber auch als genomische RNA von dsRNA-Viren und Satelliten-Viren sowie als endogene RNA pflanzlichen Ursprungs vorkommen (Dodds et al., 1984; Lukács, 1994). Doppelsträngige RNAs lassen sich gut durch eine Chromatographie mit CF11-Cellulose in Gegenwart einer Ethanolkonzentration von 15-18% von anderen Nukleinsäuren abtrennen (Franklin, 1996). Nach der Auftrennung der isolierten dsRNA im elektrischen Feld, ist anhand des entstandenen Bandenmusters eine Differenzierung von Viren möglich. Die dsRNA-Isolierung kann somit Hinweise zur Taxonomie von Viren geben und die Zuordnung zu bestimmten Virusgruppen ermöglichen.

Die Befunde der eigenen dsRNA-Analysen in Stieleichen beruhen hauptsächlich auf den in den Monaten Mai bis Juli entnommenem Blattproben. Zu diesem Zeitpunkt kann meistens eine zuverlässige visuelle Bonitur und Bewertung im Freiland erfolgen, da die virusverdächtigen Blattsymptome noch nicht durch andere biotische und abiotische Schadfaktoren maskiert werden (Führling, 1994). Der Gehalt an phenolischen Verbindungen, zu denen Gerbstoffe wie Tannine gehören, ist im Blatt- und Rindengewebe der Stieleiche mit bis zu 20 % sehr hoch. Diese behindern nicht nur die Isolierung von dsRNA, sondern binden und denaturieren virale Enzyme (Scalbert, 1991). Daherempfehlen auch Dodds et al. (1984) eine Probenahme im Frühjahr bzw. Frühsommer. In diesem Zeitraum können aufgrund verhältnismäßig geringer Mengen an sekundären Pflanzeninhaltsstoffen in den jungen Blättern hohe Ausbeuten und Reinheiten bei der Nukleinsäureextraktion erzielt werden (Führling, 1994). Diese Angabe konnte in eigenen Untersuchungen nicht bestätigt werden. DsRNA-Extrakte aus Stieleichenblättern mit Ringflecken, die im Verlauf der Vegetationsperiode hergestellt wurden, wiesen während des gesamten Untersuchungszeitraumes zwischen Mai und August hohe Gerbstoffgehalte auf, die vermutlich die dsRNA-Ausbeute stark beeinträchtigten. Erst aus im Oktober entnommene Proben ließ sich die dsRNA bei gleich bleibender Qualität und Quantität nach vereinfachtem Protokoll extrahieren (Kap. 3.5.2) (Rott et al., 2004). Dies könnte auf einen geringeren Gehalt an phenolischen Verbindungen zurückzuführen sein. Salminen et al. (2004) führten Untersuchungen zur jahreszeitlichen Veränderung der Konzentration an hydrolisierbaren Tanninen, Flavonoidglykosiden und Proanthocyanen in Eichenblättern durch. Die Autoren stellten fest, dass der Gehalt an hydrolisierbaren Tanninen, welche den größten Teil der phenolische Verbindungen ausmachen, im Mai und Juni am höchsten ist. Im Verlauf der Vegetationsperoide sinkt er um mehr als die Hälfte ab und erreicht sein Minimum im Oktober in seneszenten Blättern. Gleiches beobachteten Bedgood et al. (2005) bei der Bestimmung einfacher Biophenole in Eichen. Dies spricht für eine Entnahme der Blattproben gegen Ende der Vegetationsperiode, um die dsRNA-Verluste bei der Isolierung zu minimieren, die mit der Extraktion von Blattmaterial mit hohem Gerbstoffgehalt einhergehen können (Kap. 3.5.2). Durch frühzeitige Markierung von Pflanzen mit typischen Symptomen kann geeignetes Untersuchungsmaterial auch später im Jahr entnommen werden, wenn die Symptome durch sekundäre Infektionen maskiert worden sind.

Verschiedene Modifikationen des dsRNA-Extraktionsverfahrens nach Benthack (2001) wurden auf ihre Eignung für die Isolierung von dsRNA aus jungen Eichenblättern überprüft. Positiv wirkte sich eine Vorklärung des Blattpresssaftes mit Chloroform und Phenol aus. Durch die Erhöhung des Extraktionspuffervolumens, wie von Dodds et al. (1984) zur Reduzierung der Viskosität des Pflanzenpresssaftes vorgeschlagen, konnten die Schleimstoffe verdünnt und leichter ausgewaschen werden. Die Absenkung des pH-Wertes im Extraktionspuffer bewirkt die Anreicherung von Protonen, welche die reaktiven OH-Gruppen der Phenolmoleküle inaktivieren (Pierpoint, 2003). So kann das Aggregieren der Moleküle vermindert (Pierpoint, 2003) und die Eluierung der dsRNA aus der CF11-Cellulose erleichtert werden. Um eine ausreichende Pufferwirkung zu erhalten und die dsRNA nicht zu degradieren wurde der pH-Wert auf maximal 5,5 abgesenkt. Die höchste dsRNA-Konzentration wurde bei einem pH-Wert von 6,0 erzielt (Rott et al., 2004). Eine Erleichterung der Elution der dsRNA konnte allerdings nicht erreicht werden. In noch anzustellenden Versuchen sollten daher alkalische Pufferlösungen geprüft werden, da die sauren Phenole mit Alkalilaugen wasserlösliche Salze bilden, die bei der Eluierung der dsRNA nicht mehr stören würden. Zhang et al. (1998) setzten zur Extraktion von dsRNA aus Prunus zusätzlich Bentonit ein. An die hochaktive Oberfläche von Bentonit können Proteine gebunden und mittels Zentrifugation beseitigt werden (DePaulo & Powell, 1995). DsRNA könnte demzufolge durch eine Zugabe von Bentonit zum Extraktionspuffer ebenso gut isoliert werden, wie Viruspartikeln nach dem Aufreinigungsverfahrens von Hentsch (1998). Der Einsatz von Bentonit zum Extraktionspuffer wirkte sich jedoch nicht postiv auf die Ausbeute isolierter dsRNA aus. Bentonit bindet unspezifisch Proteine, so dass nicht nur pflanzliche, sondern auch virale Proteine mit diesem Zusatzstoff entfernt werden können. König & Roffael (2003)setzten zur Extraktion von Tanninen aus Fichtenrinde heißes Wasser ein. Für dsRNA-Isolierungen aus dem tanninhaltigen Eichengewebe könnte versucht werden, dass Pflanzenmaterial vor der Extraktion mit heißem Wasser zu behandeln. Die dsRNA sollte durch die Hitze nicht degradiert werden, da es Karan et al. (1991) gelang, dsRNA auch aus Blattmaterial von Pangola Gras zu isolieren, welches bei 105 °C getrocknet worden war. König & Roffael (2003) extrahierten Tannine ebenso durch den Einsatz von wässrigen Harnstofflösungen und Harnstoff-Formaldehyd-Polymeren aus Fichtenrinde. Neben Harnstoffverbindungen sollte in weiteren Untersuchungen PEG zur Beseitigung der Tannine aus Eichengewebe eingesetzt werden. Makkar et al. (1995), Getachew (1999) sowie Makkar (2005) gelang es mit Hilfe von PEG, Tannine aus tropischen Gehölzen zu binden und zu entfernen. Auch K₂CO₃ und Ca(OH)₂ eignen sich als tanninbindende Substanzen (Makkar, 2005).

Alternativ zur Chromatographiesäule wurde die dsRNA aus Stieleichen im ‘Batch-Verfahren’ von der CF11-Cellulose getrennt. Bei der Eluierung aus der Chromatographiesäule wurden die Nukleinsäuren mit Hilfe eines1 x STE-Puffers gelöst und aus der CF11-Cellulose filtriert. Beim ‘Batch-Verfahren’ hingegen wurde die CF11-Cellulose durch Zentrifugation sedimentiert, so dass die gelösten Nukleinsäuren im EtOH-freien Puffer im Überstand zurückblieben. Ein Teil der Nukleinsäuren verblieb durch die Gravitationskräfte in der Cellulose und konnte damit nicht vollständig im Puffer aufgefangen werden. Auch Pufferrückstände im Zentrifugenröhrchen trugen zu einem dsRNA-Verlust von etwa 50 % bei. Der Einsatz des ‘Batch-Verfahren’ kann daher nur zum Waschen der CF11-Cellulose-gebundene Nukleinsäuren empfohlen werden. Die Eluierung sollte anschließend auf einer Chromatographiesäule erfolgen.

Die Lagerdauer und -temperatur des tiefgefrorenen Probenmaterials übten keinen Einfluss auf die Qualität und die Konzentration der dsRNA aus (Kap. 3.5.2). Die charakteristischen Doppelbanden konnten sowohl aus Blattmaterial welches bei -80 °C als auch bei -20 °C gelagert worden war isoliert werden. Karan et al. (1991) gehen von einer hohen Stabilität der Nukleinsäuren von dsRNA-Viren aus. Die Autoren extrahierten dsRNA von Pangola stunt virus (PaSV) und Fiji disease virus (FDV) aus Blättern, welche bei 105 °C getrocknet, bei Raumtemperatur oder in flüssigem Stickstoff aufbewahrt worden waren. PaSV-dsRNA konnte ebenso in geringen Mengen aus Blättern isoliert werden, die für vier Wochen bei 23-37 °C gelagert worden waren. DsRNA ist durch starke Wechselwirkungen der Wasserstoffbrückenbindungen in Verbindung mit der Ribonukleinsäurerückrat- Konformation stabiler als RNA-DNA oder DNA–DNA-Doppelstränge, was sich in einer hohen Schmelztemperatur ausdrückt (Matthews, 1991; Libonati et al., 1980). Für lange Transporte könnte das Pflanzenmaterial somit auch getrocknet werden. Durch die Dehydrierung steigt die Salzkonzentration im Zytoplasma, die dsRNA wird aus den zerstörten Virionen freigesetzt und kann ihre doppelsträngige Struktur behalten (Karan et al., 1991).

Die CF11-gereinigten dsRNA-Extrakte aus Stieleichenblättern zeigten symptomunabhängig bei der gelelektrophoretischen Auftrennung zwei oder vier als Doppelbande auftretende dsRNA-Fragmente mit Größen von 1,6 kbp und 1,5 kbp sowie 2,0 und 1,8 kbp. Dieser Befund steht in Übereinstimmung mit den Ergebnissen von Führling (1994). Die Autorin trennte CF11-Cellulose gereinigte Nukleinsäurerohextrakte im Polyacylamidgel auf und konnte nach Silberfärbung dsRNA mit Längen von 1,5 bis 2,0 kbp sowohl in symptomlosem Blattmaterial als auch in Blattmaterial von Stieleichen mit virusverdächtigen Symptomen nachweisen. Die doppelsträngige Struktur der Nukleinsäuren konnte anhand des Immunoblottings mit einem dsRNA spezifischen monoklonalen Antikörper gezeigt werden (Führling, 1994; Lukács, 1994).

Eine Überprüfung von zwei Rinden- und Knospenproben erkrankter sowie einer Rindenprobe einer symptomlosen Stieleiche zeigte, dass diese dsRNA-Fragmente in beiden Gewebearten in gleicher Qualität jedoch in wesentlich höherer Konzentration als im Blattgewebe vorliegen. Aus Rindengewebe konnte in etwa die 25-fache Menge an dsRNA isoliert werden wie aus Blattmaterial. Der Gehalt an dsRNA in Knospen war etwa zehnmal so hoch wie im Blattgewebe. Diese Ergebnisse stehen nicht in Übereinstimmung mit den Erkenntnissen aus vorangegangenen Untersuchungen. Führling (1994) isolierte dsRNA in gleicher Quantität aus Stengeln, Wurzeln und Blättern von Stieleichensämlingen. Benthack (2001) untersuchte das Auftreten von dsRNA in Blättern und Rinde von Ebereschen mit virusverdächtigen Blattsymptomen. Dabei zeigte sich, dass die dsRNA im Rindengewebe niedriger konzentriert vorlag als im Blattgewebe. Jordan et al. (1983) stellten in ihren Untersuchungen zur Verbreitung und Verteilung eines virusähnlichen Erregers in Avocado ebenfalls fest, dass die dsRNA-Gehalte in Blattextrakten höher waren als in Rinde und Wurzeln.

Die nachgewiesenen doppelsträngigen Ribonukleinsäuren weisen nicht auf einen viralen Erreger in Stieleichen mit chlorotische Ringflecken, Scheckungen und/oder Mosaik hin, da sie auch aus symptomlosen Blattmaterial isoliert werden konnten.

Sowohl die Größe der Banden von 1,5- 2,0 kb als auch das Auftreten als Doppelbanden könnten auf das Vorkommen von kryptischen Viren in Eichen hindeuten. Die Vermutung wird zudem durch das jahreszeitlich unabhängige Auftreten der Doppelbanden bestätigt (Kap. 3.5.2). Kryptische Viren verursachen keine Symptome in ihren Wirtspflanzen und sind weder durch Pfropfung und Inokulation noch durch Vektorenübertragbar. Vielmehr wird eine 80-100 %ige Saatgutübertragung angenommen (Boccardo et al., 1987). Dadurch wäre erklärbar, weshalb in eigenen Übertragungsversuchen durch mechanische Inokulation keine Symptome an Wirtpflanzen erzeugt werden konnten (Kap. 3.2). Die fehlende Infektiösität und der symptomfreie Krankheitsverlauf schließen die Erfüllung der Koch´schen Postulate als Beweis einer infektiösen Krankheit aus. Führling (1994) sowie Büttner et al. (1996) vermuteten bereits eine Kontamination der Eichen mit kryptischen Viren. Die Autoren beschreiben gleichermaßen die Isolierung von dsRNA aus Pflanzenmaterial symptomfreier und symptomtragender Stieleichen, konnten jedoch elektronenoptisch die für kryptische Viren typischen isometrischen Viruspartikeln nicht darstellen. Bisher beschriebene kryptische Viren weisen Partikeln mit Größen von 29-32 nm und 37-38 nm auf (Louisoni et al. 1987; Boccardo et al., 1987). Vertreter der kryptischen Viren mit Partikeln von 29-32 nm, wie z.B. Beet cryptic virus 1 (BCV 1) weisen keine Oberflächenstruktur auf (Boccardo et al. 1987; Brunt et al. 1996). In eigenen elektronenmikroskopischen Untersuchungen von Blatthomogenaten erkrankter Stieleichen konnten isometrische Partikeln von 30-40 nm ohne Oberflächenstruktur dargestellt werden (Kap. 3.3). Steinmöller et al. (2001) beschrieben in ihren Arbeiten ebenso Partikeln dieser Morphologie in symptomtragenden Stieleichenblättern.

Nach einer Nukleokapsidanreicherung aus Blattmaterial symptomloser Stieleichen und Rindengewebe erkrankter Bäume konnte zudem ein Protein von etwa 54 kDa in einer SDS-PAGE dargestellt werden, dessen Größe in etwa mit dem Hüllprotein des BCV 1 übereinstimmte (Kap. 3.4.2). Ein weiteres Merkmal für kryptische Viren ist die geringe Konzentration, in der sie in Wirtspflanzen vorliegen (Boccardo et al., 1987; Brunt et. al., 1996). Die Aussage, dass diese Viren gleichmäßig verteilt in allen Gewebearten vorkommen, konnte in eigenen dsRNA-Analysen nicht bestätigt werden. Vielmehr wird eine ungleiche Verteilung der vermutlich kryptischen Viren in Stieleichen angenommen, da die höchste dsRNA-Konzentration in Rindengewebe und die niedrigste im Blattgewebe der Stieleichen festgestellt wurde (Kap. 3.5.2). Kühne & Stanarius (1990) diagnostizierten ebenfalls ein ungleichmäßiges Verteilungsmuster für kryptische Viren in Rüben, wobei BCV 1 im Blattmesophyll am höchsten konzentriert vorzuliegen scheint, während BCV 2 im Phloem lokalisert ist. Für weitere Erkenntnisse zur Verteilung und Konzentration der kryptischen Viren in Stieleichen sollten Viruspartikeln isoliert und angereichert werden können. Boccardo et al. (1987) empfehlen die Extraktion kryptischer Viren durch den Zusatz von Antioxidantien (DIECA, Thioglycollat) zum Extraktionspuffer und eine Vorklärung mit Chloroform und anschließend niedrigtouriger Zentrifugation zur Phasentrennung. Die Reinigung mittels PEG-Fällung hingegen führte in früheren Untersuchungen durch die Gelatierung der Pflanzenextrakte zum Verlust von Viruspartikeln. Kryptische Viren aus Pfeffer konnten jedoch mit Hilfe der PEG-Fällung angereichert werden (Arancibia et al., 1995). Kassanis et al. (1977) setzten zur Reinigung von Beet cryptic virus 1+2 (BCV), Raddish yellow edge virus (RYEV), Alfalfa cryptic virus (ACV) und White clover temperate virus (WCTeV) erfolgreich die Dichtegradientenzentrifugation ein. Steinmöller et al. (2004) gelang es die isometrischen Partikeln in geringer Konzentration durch eine Vorklärung mit Bentonit aufzukonzentrieren. In der eigenen Arbeit konnten die isometrischen Partikeln sowohl durch die Verwendung eines natriumsulfithaltigen Extraktionspuffers, einer Vorklärung mit Bentonit, PEG-Fällung und anschließend differentieller Zentrifugation als auch durch Ultrazentrifugation über einen Zuckergradienten angereichert werden (Kap. 3.4.1). Es gelang nicht, diese Viruspartikeln aus zwei Proben symptomfreien Blattmaterials zu isolieren.

Zur Amplifikation und Identifikation der dsRNA-Sequenz aus Stieleiche wurden sowohl die RT-DOP-PCR als auch die “klassische” Zweitstrangsynthese mit anschließender Klonierung angewendet. Dafür musste die dsRNA zuvor denaturiert und in eine cDNA umgeschrieben werden. Nach konventioneller Hitzedenaturierung konnten zunächst keine Fragmente in einer RT-DOP-PCR amplifiziert werden (Kap. 3.5.3). Als Ursache wird die unvollständige Denaturierung der dsRNA und eine schnelle Renaturierung der stabilen Struktur angenommen, die bereits von Coffin & Coutts (1992) sowie Goodin (1995) und Batten et al. (2000) beschrieben wurde. Nach Coffin & Coutts (1991) ist die vollständige Denaturierung der dsRNA die wichtigste Voraussetzung für die erfolgreiche cDNA-Klonierung. Alternativ wurde die dsRNA aus Stieleiche durch Dimethyl-Sulfoxid (DMSO) denaturiert. Hiermit konnten Fragmente in einer anschließenden RT-DOP-PCR gewonnen, aber nicht kloniert werden (Kap. 3.5.3). Cashdollar et al. (1982) setzten die Denaturierung mit DMSO zur Klonierung genomischer dsRNA aus Reoviren ein.Gorziglia et al. (1983) sowie Jelkmann et al. (1989) hingegen bezeichnen diese Methode als ineffektiv für die Reverse Transkription von dsRNA.

Die größte Anzahl rekombinanter Klone wurde in der eigenen Arbeit durch Hitzedenaturierung des Primer-dsRNA-Gemisches und sofortiges Überführen auf flüssigen Stickstoff erzielt (Kap. 3.5.3). Durch die Schockfrierung und die Erhöhung des Reaktionsvolumens für die Reverse Transkription von 20 µl auf 100 µl konnte einer Rückfaltung der denaturierten dsRNA-Stränge entgegengewirkt werden.

Nach der Denaturierung wurde die dsRNA bei -80 °C gefällt und in einer RT-DOP-PCR amplifiziert.Das Prinzip der RT-DOP-PCR beruht auf der Verwendung unspezifisch bindender Primer, die einen sechs Nukleotid langen degenerierten Bereich aufweisen und damit die partielle Amplifikation jedes unbekannten (c)DNA-Templates ermöglichen. Dieses PCR-Verfahren ist sehr sensitiv und wurde ursprünglich für die Amplifikation geringer Mengen an chromosomaler DNA entwickelt.Rott & Jelkmann (2001) setzten diese Methode erstmals zur Amplifikation von cDNA synthetisiert aus viraler dsRNA ein und identifizierten so verschiedene filamentöse Viren aus Kirsche. Benthack et al. (2005) gelang es, durch die Amplifikation von dsRNA-Fragmenten in einer RT-DOP-PCR, ein bis dahin unbekanntes Virus in Ebereschen mit chlorotischen Ringflecken und Scheckung partiell zu charakterisieren. Ein entscheidender Vorteil dieser Methode ist, dass sehr geringe Mengen an dsRNA amplifiziert und kloniert werden können. Auch in den eigenen Untersuchungen konnte die RT-DOP-PCR für die Amplifikation von dsRNA aus Stieleichen etabliert werden.

Für die Reverse Transkription wurden zunächst hexamere Zufallsprimer eingesetzt, da diese aufgrund ihrer variablen Nukleotidkomposition potentiell viele Bindungsstellen auf dem cDNA-Template besitzen. Nach Amplifikation der Erststrang-cDNA in einem DOP-PCR-Ansatz nach Roche (1999) konnten erst nach Reamplifizierung PCR-Produkte erzeugt werden. Zudem waren die Fragmente mit 250-500 bp eher klein und stellten sich nach gelelektrophoretrischer Trennung im 1 %igen nativen Agarosegel als “Schmier” dar. Die niedrige Amplifikationsrate könnte durch die geringe Ausgangsmenge der dsRNA verursacht worden sein, die bei maximal 40 ng für die cDNA-Synthese lag (Kap. 3.5.3). Aus 50 g Eichenblattmaterial konnten zwischen 4 bis 40 ng dsRNA isoliert und in die nachfolgende cDNA-Synthese eingesetzt werden. Jelkmann et al. (1989) empfehlen jedoch den Einsatz von 500 ng dsRNA. Als ein weiterer Grund für die geringe Menge an PCR-Produkten und deren unzureichender Länge ist eine unvollständige Denaturierung oder schnelle Rückfaltung der hitzedenaturierten dsRNA in Betracht zu ziehen. So beschreiben Jelkmann et al. (1989) die Verwendung von Methylquecksilber als die effizienteste Methode der dsRNA-Denaturierung. Die Autoren erhielten durch die Denaturierung mit Methylquecksilberhydroxid mehr als doppelt so viele cDNA-Stränge im Vergleich zur Hitzedenaturierung. Ähnliche Ergebnisse erzielte Jelkmann (1995) bei der Charakterisierung eines neuen Capillovirus aus Kirsche sowie Theilmann et al. (2001) bei der partiellen Charakterisierung eines kanadischen Little Cherry Disease (LCD)-Isolates, Sabanadzovic et al. (2000) bei der Diagnose des GFKV inWeinreben, Tzanetakis et al. (2004 a und b) bei der Identifizierung des Strawberry pallidosis virus (SPaV) und Thompson et al. (2002) bei der Charakterisierung des Strawberry mottle virus (SMoV). Aufgrund der hohen Humantoxizität ist der Einsatz von Methylquecksilberhydroxid nicht zu empfehlen (Orme & Kegley, 2004). Für zukünftige Untersuchungen sollte die Denaturierung der dsRNA mittels Säure getestet werden. Yamakawa & Nakagomi (1990) schlagen dafür eine 10 min Inkubation in 80 mM HCL vor. Den Autoren gelang es damit erfolgreich dsRNA von Rotaviren, die mittels Ionen-Austausch-Chromatographie isoliert worden war, zu denaturieren und in einer DOT-BLOT-Hybridisierung nachzuweisen.

Um distinkte Banden zu erhalten, wurden in weiteren Untersuchungen DOP-Primer für die Reverse Transkription eingesetzt.Diese Primer sind Zufallshexamere, die am 5`- bzw. 3`-Ende zusätzlich einen definierten Sequenzbereich von zwei bis neun Nukleotiden aufweisen. Dadurch erfolgt eine spezifischere Bindung der DOP-Primer an die DNA als bei Verwendung hexamerer Zufallsprimer. In der eigenen Arbeit wurden zwei DOP-Primer unterschiedlicher Spezifität verwendet, um verschiedene Bereiche der unbekannten dsRNA-Sequenz amplifizieren zu können. In einer RT-DOP-PCR mit dem DOP-Primer Bgl-Eco-RH konnten keine Fragmente amplifiziert werden. Dieser Primer bestand aus 12 Nukleotiden am 5´-Ende und einem Abschnitt von sechs variablen Nukleotiden am 3`-Ende und war damit zu unspezifisch, um eine Amplifikation der dsRNA zu bewirken. Mit Hilfe des DOP-Primers Bgl-Eco RH 2, welcher zwei Cytosine am 3`-Ende aufweist, konnten Fragmente amplifiziert werden, die sich nach gelelektrophoretrischer Trennung als Bandenschmier von 1000 bp bis 250 bp darstellten (Kap. 3.5.3). Rott & Jelkmann (2001) gelang es, durch den Einsatz eines DOP-Primers mit 10 definierten Nukleotiden am 5`-Ende und fünf definierten Nukleotiden am 3´-Ende, distinkte virusspezifische Fragmente zu erzeugen. Bei der hohen Spezifität des Primers ist jedoch die Sequenz der definierten Primerabschnitte für die Amplifizierung des unbekannten Templates von besonderer Bedeutung. In weiteren Versuchen zur Amplifizierung und Klonierung der eichensassoziierten dsRNA sollte verschiedenartige DOP-Primer mit definierten 3´-Enden eingesetzt werden, um distinkte Banden zu erzeugen.

Die größte Menge an PCR-Produkten wurde unter Verwendung des Primers Bgl-Eco-RH 2 in Kombination mit einem alternativen DOP-PCR-Programm amplifiziert (Kap. 3.5.3).Für die ersten fünf Zyklen wurde die Annealingtemperatur abweichend vom ursprünglichen Protokoll nicht schrittweise von 30 °C auf 42 °C erhöht, sondern konstant bei 30 °C gehalten.Bei der Verwendung von DEPC-behandeltem, einfach demineralisiertem Wasser im Mastermix konnte eine Anreicherung der PCR-Fragmente, besonders im Bereich von 400-600 bp, gegenüber der Variante mit hochreinem, mehrfach demineralisiertem (MilliQ) Wasser beobachtet werden (Kap. 3.5.3). Als Ursache ist die unterschiedliche Ionenkonzentration anzunehmen. Der pH-Wert und die Ionenkonzentration beeinflussen die PCR. Kationen reduzieren durch die Anlagerung an das Desoxyribose-Rückrat der DNA die elektrostatischen Abstoßungskräfte zwischen den einzelnen DNA-Strängen, so dass die Anlagerung des Primers an die Matrize erleichtert wird (Löffert et al., 1997; Vogel & Siebert, 2002).

Alternativ zur DOP-PCR wurde die mit dem DOP-Primer Bgl-Eco-RH 2 synthetisierte cDNA in eine “klassische” Zweitstrangsynthese eingesetzt. Diese wurde bereits mehrfach für die Klonierung von viraler dsRNA aus holzigen Wirten beschrieben (Jelkmann et al. 1989, Jelkmann, 1995; Meng et al., 1998; Zhang et al. 1998) und eignet sich besonders zur Charakterisierung von Viren, bei denen die Isolierung von Viruspartikeln oder ein serologischer Nachweis nicht möglich ist (Jelkmann et al., 1989). In der eigenen Arbeit konnte dsRNA aus Stieleiche mit dieser Methode partiell kloniert werden (Kap. 3.5.3). Basierend auf der bei dieser cDNA-Synthese einhergehenden geringen Menge an Template im Vergleich zur RT-DOP-PCR, resultierte aus diesem Versuch auch eine geringe Ausbeute an Klonen. Aus fünf Versuchsansätzen gingen nur zwei Klone von 354 bp und 436 bp hervor. Es ist außerdem anzunehmen, dass es im Verlauf der cDNA-Synthese durch die notwendigen Fällungsschritte zu Verlusten kam. Benthack (2001) beispielsweise gelang es auch nach zahlreichen Ansätzen nicht, dsRNA aus Ebereschen über eine cDNA-Synthese zu klonieren. Neben Fällungsverlusten sieht die Autorin die unzureichende Denaturierung bzw. Rückfaltung der dsRNA als Hauptproblem an. In der eigenen Arbeit konnte durch die sofortige Überführung der hitzedenaturierten dsRNA auf flüssigen Stickstoff der Rückfaltung der dsRNA entgegengewirkt und somit dsRNA über die “klassische” Zweitstrangsynthese kloniert werden.

Unabhängig von der Probenherkunft und der Klonierungsstrategie konnten insgesamt drei Klone aus dsRNA von Stieleichen erhalten werden, die Identitäten von 61-64 % mit der Sequenz der RdRp des Beet cryptic virus 3 (BCV 3) aufwiesen (Kap. 3.5.3, Kap. 3.5.5). Vom 5`-nahen Bereich eines der Klone wurde das spezifische Primerpaar Oak Cryp 1 abgeleitet und im RT-PCR-Verfahren zur Untersuchung von Eichenproben eingesetzt. Durch das abgeleitete Primerpaar war der eindeutige Nachweis dieser Sequenz in dsRNA-Proben aus symptomtragenden und symptomlosen Stieleichen möglich. In einer RT-PCR mit den RdRp-spezifischen Primern Oak Cryp 1 und den aus einem Agarosegel extrahierten dsRNA-Banden von 1,5 kb und 1,6 kb wurde ein eindeutiges PCR-Produkt mit der 1,6 kb Bande amplifiziert. Ein schwaches Produkt konnte jedoch ebenso in der 1,5 kb dsRNA-Bande amplifiziert werden. Xie et al. (1993) fanden heraus, dass die 1,6 kb-Bande von BCV 3 für die RdRp kodiert, während die 1,7 kb-Bande dem Hüllproteingen zugeordnet wird. Die 1,5 kb und 1,6 kb dsRNA-Banden aus Stieleiche im Agarosegel lagen sehr dicht beieinander und konnten daher möglicherweise nicht sauber voneinander getrennt ausgeschnitten werden. Dadurch kann es zur Erzeugung des RdRp-spezifischen PCR-Produktes in der 1,5 kb dsRNA-Bande gekommen sein. Es ist aber ebenfalls möglich, dass beide dsRNA-Banden für die RdRp kodieren, denn Osaki et al. (1998) isolierten fünf dsRNA-Fragmente unterschiedlicher Länge aus Pyrus ssp. und stellten fest, dass sie partiell annähernd die gleiche Aminosäuresequenz für eine RdRp kodierten.

Die RdRp-spezifischen PCR-Produkte ließen sich ebenso in Gesamt-RNA von Stieleichen über eine zusätzliche Nested-PCR amplifizieren (Kap. 3.5.4). Dieses Ergebnis bekräftigt die Vermutung, dass es sich bei den als Doppelbanden auftretenden dsRNA-Fragmenten aus symptomlosen und symptomtragenden Stieleichen um die genomische RNA eines kryptischen Virus handeln könnte. Es können jedoch ebenso dsRNA-Fragmente endogenen Ursprungs in Stieleichen vorliegen. Gestützt wird diese Annahme durch die ähnlich hohe Übereinstimmung der eichenassoziierten dsRNA-Sequenz zur dsRNA-Sequenz isoliert aus Pyrus ssp. die ebenso eine Identität von 67 % zur RdRp des BCV 3 aufweist (Osaki et al., 1998) (Kap. 3.5.3 und Kap. 3.5.5). Die Autoren diskutieren die Existenz von endogener dsRNA in Pyrus ssp., weil keine Viruspartikeln nachgewiesen werden konnten und die dsRNA in hoher Konzentration im pflanzlichen Gewebe vorlag.

Für den Ursprung der 2,0 kb/1,8 kb-Bande konnte im Rahmen dieser Arbeit keine Erklärung gefunden werden. Möglicherweise liegt eine Mischinfektion von kryptischen Viren in Stieleichen vor. Vier dsRNA-Banden ähnlicher Größe, wie derjenigen aus Stieleichen wurden z.B. in BCV-infizierten Rübenkultivaren beschrieben (Kassanis et al., 1977). Jüngere Untersuchungen zeigten, dass es sich dabei um eine Mischinfektion mit BCV 1 (2060 bp/1740 bp) und BCV 2 (1420 bp/1320 bp) handelt (Acotto & Boccardo, 1986; Boccardo et al., 1987; Xie et al. 1993). In Übereinstimmung zur Genomorganisation des BCV 3 kodiert die größere der dsRNA-Komponente für die RdRp und die kleinere für das Hüllprotein (Acotto et al., 1987). Zwischen den vier dsRNA-Komponenten bestehen jedoch keine signifikanten Sequenzhomologien (Antoniw et al., 1986; Xie et al. 1989; Xie et al. 1993). BCV 1 und BCV 2 können aber auch einzeln in Rübenkultivaren vorkommen (Natsuaki et al., 1986; Antoniw et al., 1986; Boccardo et al., 1987). Es wäre möglich, dass die ca. 2,0 kb/1,8 kb-Banden in Stieleichen mit BCV 1 oder dem Vicia cryptic virus (VCV) (Blawid et al., 2004) verwandt sind, welche ebenso dsRNA-Banden der Größen 2,0/1,8 kb aufweisen. Es sollten für die Untersuchung einer Mischinfektion in noch anzustellenden Versuchen aus den bekannten Sequenzen der kryptischen Viren spezifische Primer abgeleitet und in einer RT-PCR mit der 2,0/1,8 kb dsRNA aus Stieleichen eingesetzt werden. Da nicht ausgeschlossen werden kann, dass alle vier dsRNAs aus Stieleiche für eine RdRp kodieren, wie Osaki et al. (1998) für Pyrus beschreiben, ist in RT-PCR-Analysen zu prüfen, ob sich mit den RdRp-spezifischen Oak Cryp-Primern in der 2,0/1,8 kb dsRNA-Bande ebenfalls ein spezifisches PCR-Produkt amplifizieren lässt.

Wie bereits erwähnt konnte im Anschluss an eine Nukleokapsidanreicherung nach Kellmann et al. (2002) aus Blattmaterial symptomloser Stieleichen und Rindengewebe erkrankter Bäume ein Protein von etwa 54 kDa in einer SDS-PAGE dargestellt werden (Kap. 3.4.2). Dass es sich dabei möglicherweise um die große Untereinheit der Rubisco handelt, die eine ähnliche Größe aufweist (Freshwater et al., 1999), konnte ausgeschlossen werden. Das Rubisco-Protein ist in den Chloroplasten-Stroma lokaliert (Smith et al., 1997) und damit in grünen Pflanzenteilen in großen Mengen vorhanden. Das angereicherte Protein aus Stieleichen lag jedoch in Rindengewebe höher konzentriert als im Blattmaterial vor. Um ‘Vegetative Storage Proteins’ (VSP) bzw. ‘Bark Storage Proteins’ (BSP) kann es sich bei den angereicherten Proteinen aus dem Rindengewebe ebenfalls nicht handeln. Sie sind mit 38 kDa deutlich kleiner als die aus der Rinde von Stieleichen angereicherten Proteine. Sie werden während des Winters verstärkt in Rinde und anderen überdauernden Organen als Stickstoffvorrat für den Beginn der Vegetationsperiode eingelagert (Cooke & Weih, 2005).

Mit Hilfe der RT-PCR und dem Primerpaar Oak Cryp 1 konnte das spezifische Fragment der RdRp in den angereicherten Nukleokapsidfraktionen amplifiziert werden (Kap. 3.5.4). Das spricht für eine Assoziation des Proteins von etwa 54 kDa mit der RdRp-kodierenden RNA. Das errechnete Molekulargewicht der abgeleiteten Aminosäuresequenz stimmte mit 54,7 kDa ebenfalls mit der Größe dieses Proteins überein (Kap. 3.5.5).

RNA-abhängige RNA-Polymerasen wurden nicht nur in allen RNA-Viren, mit Ausnahme der Retroviren, die eine Reverse Transkriptase besitzen, sondern auch in Pflanzen nachgewiesen (Schiebel et al., 1998; Gopalakrishna, 1999). Für die Gruppen der ssRNA-Viren und dsRNA-Viren wurden sechs verschiedene hochkonservierte Motive beschrieben (Poch et al. 1989; Muller et al., 1994; von Poelwjik, 1997). In neueren Untersuchungen wurde das Prämotiv A in die Motive F1 bis F 3 unterteilt, so dass heute zwischen acht konservierten RdRp-Motiven unterschieden wird (Ruthier & Bruenn, 1998; Osaki et al., 2002; Bruenn, 2003), auf deren Basis sich Viren in verschiedene Superfamilien einteilen lassen. Diese sind am Aufbau funktionaler Domänen beteiligt. Für die abgeleitete Aminosäuresequenz des ORF der dsRNA-Sequenz aus Stieleiche, konnten die acht konservierten Motive der RdRp identifiziert werden (Kap. 3.5.5). Alle bisher bekannten Polymerasen sind ähnlich aufgebaut. Sie haben die Form einer rechten Hand und untergliedern sich in die ‘thumb’-, ‘palm’- und ‘fingers’-Domänen. Die ‘fingers’-und ‘thumb’-Domäne unterscheiden sich in allen vier Polymerase-Familien. Die ‘palm’-Domäne ist in allen Polymerasen hochkonserviert (Steitz, 1999; Butcher et al., 2001) und deutet auf einen gemeinsamen Ursprung hin (Kamer & Argos, 1984; Argos, 1988; Poch et al., 1989; Delarue et al. 1990). Sie beinhaltet die Sequenzmotive A, B und C (Gorbalenya et al., 2002). Motiv A (DX_4-5D) formt einen β-Strang und besitzt zwei Asparaginsäure-Reste, die durch 4-5 Aminosäuren voneinander getrennt sind. Motiv C (XDD) besitzt ein Asparaginsäure-Dipeptid, wird durch hydrophobe Bereiche flankiert und weist eine ‘beta-hairpin’-Struktur auf. Die Asparaginsäure-Reste binden divalente Mangan- bzw. Magnesium-Ionen und sind entscheidend für die Katalyse. Motiv B formt eine lange α-Helix und ist in vielen RdRps konserviert. Es enthält einen Asparaginsäure-Rest, der die Unterscheidung zwischen dNTPs und NTPs steuert und damit festlegt, ob RNA oder DNA synthetisiert wird (Gorbalenya et al., 2002).

Der aus dem Vergleich verschiedener viraler und pflanzlicher RdRp-Sequenzen im Bereich der Motive F1 bis E resultierende phylogenetische Stammbaum zeigte die höchste Verwandtschaft der abgeleiteten RdRp-Aminosäure-Sequenz aus dsRNA von Stieleichen zur RdRp der Partitiviren. Neben der RdRp des BCV 3 und der RdRp pilzpathogener Viren (Ahn & Lee, 2001; Osaki et al., 2002) weisen auch die RdRp-kodierenden dsRNAs aus Pyrus ssp. (Osaki et al., 1998) und Bryopsis citricola die höchste Identität zu dieser Virusgruppe auf (Koga et al., 2003) (Kap. 3.5.5). Die Gruppierung zur dsRNA aus Bryopsis citricola deutet erneut auf den endogenen Charakter der 1,5/1,6 kb-dsRNA-Banden in Stieleichen hin, denn Koga et al. (1998) hatten die dsRNA-Fragmente von 1,7 bis 2,2 kb aus den Mitochondrien von Bryopsis-Algen isoliert und konnten aufgrund diesen Ursprungs eine Kontamination mit einem kryptischen Virus ausschließen. Die Autoren nehmen wegen der einfachen Genomstruktur der dsRNA den Verlust des Transportproteingens im Verlauf der Evolution an und führen darauf die Plasmid-ähnliche Natur der endogenen dsRNA zurück.

DsRNA-Replikons kommen in Protozoen, Insekten, Pilzen und höheren Pflanzen vor (Wang & Wang, 1991; Ghabrial, 1998; Miyazaki et al., 1996). Auf Basis der Morphologie und genomischen Struktur können sie in fünf Gruppen eingeteilt werden: Hochmolekulare dsRNA >10 kb wurde in Pilzen und Pflanzen gefunden. Die pilzpathogenen dsRNAs werden als Hypoviren klassifiziert (Hillmann et al., 1994), während pflanzliche dsRNAs >10 kb, die aus Oryza sativa, Viccia faba und Phaseolus vulgaris isoliert wurden den Endoviren zugeordnet werden (Fukuhara, 1999; Gibbs et al., 2000).

Darüber hinaus sind 2,3-3,6 kb lange dsRNAs in Pilzen als Narnaviren bekannt (Wickner et al., 2000). Ihre RdRps weisen die höchste Ähnlichkeit zu den Bakteriophagen auf. Die Vertreter der Totiviren aus Pilzen und Protozoen besitzen ein einziges dsRNA-Molekül von 4,6-7,0 kb, das über zwei oder drei ORFs das Hüllprotein und die RdRp kodiert (Wickner, 1996).

Die dsRNA-Sequenz aus Stieleiche, ist wie die aus Pyrus ssp. und Bryopsis citricola mit den Partitiviren verwandt, die isometrische Partikeln mit zwei segmentierten dsRNA-Strängen von 1,4 bis 3,0 kb ausbilden (Ghabrial et al., 1994a). In den eigenen Untersuchungen konnten ebenfalls isometrische Partikeln von etwa 30 nm in Adsorptionspräparaten symptomtragender Stieleichen nachgewiesen werden (Kap. 3.3). Ishihara et al. (1992) isolierten endogene dsRNA von 2,0 kb aus 25 nm großen Partikeln, die sie aus Chloroplasten von Bryopsis ssp. angereichert hatten. Kryptische Viren verpacken ihre dsRNA in Partikeln, die etwa 29-32 nm bzw. 37-38 nm groß sind (Boccardo et al., 1987). Anhand der gezeigten isometrischen Partikeln in Stieleichen kann also nicht geschlussfolgert werden, inwieweit ein kryptisches Virus oder ein endogenes dsRNA-Replikon vorliegt. Eine Assoziation dieser Partikeln zur Stieleichen-dsRNA konnte ebenfalls nicht nachgewiesen werden. Für zukünftige Untersuchungen zur möglichen Verbreitung von Partitiviren in Stieleichen müssen effiziente Reinigungsverfahren entwickelt und zur Untersuchung verschiedener Gewebearten eingesetzt werden. Um das Vorkommen dieser Viren nachweisen zu können, müssten Viruspartikeln auch in symptomfreien Pflanzenmaterial elektronenoptisch dargestellt und daraus dsRNA isoliert werden. Im RT-PCR-Verfahren könnten diese dann mit den spezifischen Primern getestet werden.

Für den möglichen pflanzlichen Ursprung der eichenassoziierten dsRNA sprechen die Nested-PCR-Analysen mit den spezifischen Primern Oak-Cryp 3 unter Verwendung von Gesamt-RNA und DNA verschiedener krautiger und holziger Pflanzen. Das spezifische Fragment ließ sich ebenfalls in Gesamt-RNA von Sambucus nigra und Chenopodium quinoa sowie in Gesamt-RNA und genomischer DNA von Nicotiana tabacum var. ‘Samsun’ amplifizieren. Über einen Bereich von 610 bp stimmten sie zu 99 % mit der Sequenz aus dsRNA von Stieleichen überein (Kap. 3.5.4). Durch Negativkontrollen mit Wasser konnte eine Kontamination der PCR-Reagenzien ausgeschlossen werden.

In früheren Untersuchungen wurde bereits durch die Hybridisierung von zellulärer dsRNA mit Zellkern-DNA für Phaseolus vulgaris (Wakarchuk & Hamilton, 1985, 1990), Vicia faba (Turpen et al., 1988), Oryza sativa (Wang et al., 1990) und Persea ssp. (Cook et al., 1994) ein gemeinsamer Ursprung der verschiedenen Nukleinsäuren in Pflanzenzellen vermutet. Ishihara et al. (1992) postulieren dafür den Transfer von partiellen Basensequenzen zellulärer dsRNAs zu Zellkern-DNA. Wakarchuk & Hamilton, (1985) sowie Cook et al. (1994) gehen von einem Ursprung der dsRNA in der genomischen DNA der Wirtspflanze aus und Fraenkel-Conrat (1983) erklären den genomischen Ursprung von dsRNA in Pflanzen über die Transkription von zelleigenen RNA-Molekülen durch RdRps.

DNA-kodierte, pflanzeneigeneRdRp-Sequenzen, konnten bereits in verschiedenen Pflanzenarten nachgewiesen werden. Auch wenn keine Identitäten zu bisher beschriebenen pflanzlichen RdRps wie der in den Aminosäurevergleich aufgenommenen Nicotiana und Solanum gefunden wurden (Kap. 3.5.5) besteht die Möglichkeit, dass die RdRp-Sequenz aus Stieleichen im pflanzlichen Genom vorliegt, worauf die Amplifikation des spezifischen Fragmentes in genomischer DNA von Tabak hindeutet. Der Replikationszyklus und die Entstehung der nachgewiesenen dsRNA könnten wie folgt erklärt werden:

Das im Zellkern in das pflanzliche Genom integrierte RdRp-Gen wird zur mRNA transkribiert und anschließend im Zytoplasma an den Ribosomen zum funktionellen Protein (RdRp) translatiert, wie es auch für eukaryotische RdRps beschrieben wird (Gopalakrishna, 1999). Diese kann ihre eigene mRNA erkennen, dsRNA-Intermediate bilden und sich so semikonservativ wie ssRNA(+)-Viren replizieren (Rybicki, 2000). Es entstehen dsRNA-Replikons, die sich selbstständig vermehren und innerhalb der Zellen anreichern können (Koga et al., 1998, 2003). In dieser Form können sie in wesentlich höherer Konzentration vorliegen und demzufolge in dsRNA und in den angereicherten Nukleokapsiden bereits in einer RT-PCR amplifiziert werden (Kap. 3.5.4). Im pflanzlichen Genom hingegen kommt das RdRp-Gen vermutlich nur als Einzelkopie vor und kann erst in einer Nested-PCR nachgewiesen werden (Kap. 3.5.4). Um diese Hypothese zu bestätigen, sollte in nachfolgenden Arbeiten geprüft werden, ob sich das RdRp-spezifische Fragment in einer PCR mit anschließender Nested-PCR auch in genomischer DNA aus Stieleichen amplifizieren lässt. Zudem könnte versucht werden, dsRNA aus Nicotiana tabacum var. ‘Samsun’, Chenopodium quinoa und Sambucus nigra zu extrahieren und diese mit den RdRp-spezifischen Primern zu testen. Es ist möglich, dass solche dsRNA-Replikons in allen Pflanzen nachzuweisen sind.

Als Funktion der pflanzeneigenen RdRp-Sequenz in Stieleichen ist die Einbindung in das ‘Post transkriptionelle Gene-Silencing’ (PTGS) denkbar. Dieser Mechanismus ist für viele Pflanzen bekannt. Schiebel et al. (1998) isolierten erfolgreich die RdRp aus Lycopersicon esculentum und stellten eine steigende RdRp-Aktivität in Viroid-infizierten Tomatenpflanzen und eine Zunahme der RdRp-kodierenden mRNA fest. Die Autoren diskutieren die Rolle der pflanzeneigenen RdRp bei der RdRp-abhängigen Auslösung des ‘Post transkriptionellen Gene-Silencing‛ (PTGS). Untersuchungen der katalytischen Eigenschaften belegen, dass die RdRp ssRNAs und demzufolge auch virale mRNAs als Template benutzt, um copy (c)RNAs zu synthetisieren, die den ‘Silencing’-Prozess aktivieren. Interaktionen zwischen mRNA und der cRNA führen zur Ausbildung einer dsRNA-Struktur, die durch dsRNA spezifische RNasen zerstört werden (Dougherty & Parks, 1995; Schiebel et al., 1998).

Der Ursprung eukaryotischer RdRps ist bisher nicht bekannt. Ausgehend von einer RNA-Welt, könnten alle Polymerasen aufgrund ihrer Sequenzidentitäten von einer “Ur-RdRp” abstammen. Iyer et al. (2003) nehmen an, dass RdRps im Verlauf der Evolution in das pflanzliche Genom integriert wurden. Sie können aus bestimmten zellulären Lebensformen entfernt und später durch Bakteriophagen wieder in eukaryotische Genome eingeführt worden sein. Schiebel et al. (1998) stellten zwischen Vertretern der Solanaceae (Lycopersicon, Petunia, Nicotiana) Leguminosae und Poaceae (Vigna, Triticale) RdRp-Sequenzidentitäten von 70 – 95 % über 93 Aminosäuren im Bereich der Sequenzmotive F1 bis F3 am 5´-Ende der RdRp-Sequenz fest. In der eigenen Arbeit wurden auf Nukleotidebene über 604 bp ebenso wie in der daraus abgeleiteten Aminosäuresequenz am 5´-Ende der RdRp Identitäten von 99 % zwischen Stieleichen, Nicotiana tabacum var. ‘Samsun’, Chenopodium quinoa und Sambucus nigra gefunden. Ähnliche RdRp-Sequenzen fanden Schiebel et al. (1998) in Hefe (Schizosaccharomyces pombe)und Nematoden (Caenorhabditis elegans). Wakarchuk & Hamilton (1985) vermuten ebenfalls Sequenzhomologien zwischen Prokaryoten und Eukaryoten, da die dsRNA aus Phaseolus vulgaris mit einem 3 kb großen Fragment aus E. coli hybridisierte. Diese Beobachtungen unterstützen die Theorie eines gemeinsamen Ursprungs aller Polymerasen, vor der Entstehung der Eukaryoten. Geringere Sequenzkonservierung in RdRps von Pflanzen fanden Schiebel et al. (1998) im 3´-terminalen Bereich. In weiteren Untersuchungen sollten daher Primer in Nähe des 3´-Endes der eichenassoziierten RdRp abgeleitetet werden, um zu prüfen, ob in diesem Bereich möglicherweise Sequenzunterschiede zwischen den einzelnen Pflanzenarten festgestellt werden können.

Auch für dsRNA-Viren wird ein gemeinsamer Ursprung der RNA abhängigen RNA-Polymerasen angenommen. Die hohe Identität zwischen nichtinfektiösen dsRNA-Viren in Pilzen und Hefen erklärt Bruenn (1993) durch einen gemeinsamen Ursprung in einem nichtinfektiösen Virus eines einzelnen Zelltypus. Dieser Zelltyp hat sich in Protozoen und Pilzen verbreitet. Auch Mertens (2004) geht aufgrund der strukturellen und funktionalen Ähnlichkeiten vieler dsRNA-Viren aus unterschiedlichen Organismen von einem gemeinsamen Ursprung aus. Gleiches nahmen Bamford et al. (2002) an, als sie in Strukturanalysen Parallelen von Reo-Toti-und Birnaviren zur Reo- Φ 6 Linie fanden. Neue Daten lassen einen frühen evolutionären Ursprung vor der Teilung von Tieren und Pflanzen vermuten (Bruenn, 1993). Die mögliche Verbindung zum nicht infektiösen Pflanzenvirus BCV 3 erklärt der Autor durch eine möglicherweise frühere Abzweigung der Pflanzen von der Linie, die zu den Protozoen und Pilzen führte. Die Existenz von dsRNA-Viren vor der Teilung von Pilzen und Protozoen nimmt Ghabrial (1998) ebenso an, da ein Totivirus in filamentösen Pilzen charakterisiert wurde, der näher verwandt zu Protozoen-Totiviren ist als zu Hefe-Totiviren.

Der scheinbar gemeinsame Ursprung, die einfache Genomorganisation sowie die hohen Übereinstimmungen der RdRps untermauern die Theorie, von einer zellulären selbstreplizierenden mRNA als Ursprung der Totiviren. Partitiviren weisen eine ebenso einfache Genomstruktur auf, Hüllprotein- und RdRp-Gen liegen jedoch auf separaten dsRNA-Segmenten. Aufgrund der RdRp-Ähnlichkeiten ist anzunehmen, dass die Partitiviren aus den Totiviren hervorgingen.

Ein Charakteristikum von endogenen dsRNA-Replikons ist die gleichmäßige Konzentration der dsRNA in allen Gewebeteilen, die durch die horizontale Verbreitung erreicht wird. Weshalb in Knospen und Rinde von Stieleichen signifikant höhere dsRNA-Konzentrationen vorliegen (Kap. 3.5.2), konnte im Rahmen dieser Arbeit nicht geklärt werden.

Um die RdRp-Sequenz aus Stieleiche eindeutig den dsRNA-Fragmenten zuordnen zu können, wurden Digoxigenin (DIG)-markierte DNA-Sonden hergestellt und in die Northern-Hybridisierung sowohl mit dsRNA als auch mit Gesamt-RNA aus Stieleichen eingesetzt. Weder im Northern-Blot mit denaturierten Agarosegelen noch mit denturierenden Formaldehyd- bzw. Glyoxalgelen konnten Signale erzeugt werden. Auch im Spottest reagierte die dsRNA aus verschiedenen Stieleichengeweben nicht mit den Sonden.

Ebenso wie bei der RT-DOP-PCR bzw. cDNA-Synthese wird sowohl die unzureichende Denaturierung der dsRNA als auch die geringe Konzentration der dsRNA bzw. Gesamt-RNA als Ursache angenommen. Der spezifische Nachweis in dsRNA und Gesamt-RNA konnte nur mit der RT-PCR erfolgen. Diese Nachweisverfahren gilt als das Sensitivste. Falsch positive Ergebnisse durch unspezifische Primerbindungen können bei diesem Extraktionsverfahren auftreten und sind als nachteilig zu werten (Hengen, 1995; Jaakola et al., 2001). In zukünftigen Untersuchungen könnten für das Screening rekombinanter Klone in einer Kolonie-Filter-Hybridisierung zunächst direkt markierte dsRNA-Sonden z. B. mit Hilfe des “Enhanced-Chemiluminescense” (ECL)-System der Fa. Amersham hergestellt werden. Für die Synthese Dig-markierter RNA-Sonden aus den rekombinanten Klonen wird eine In vitro-Transkription empfohlen, die wiederum in eine Northern-Hybridisierung mit dsRNA bzw. Gesamt-RNA eingesetzt werden können. Benthack (2001) gelang es so, virusspezifische RNA in Gesamt-RNA symptomtragender Ebereschen nachzuweisen.

Northern-Hybridisierungen auf RNA-Basis sind besonderes in sekundärstoffreichen Pflanzen schwierig (Jaakola et al., 2001). Phenolische Verbindungen bilden kovalent gebundene Quinonen in oxidierter Form, welche die Nukleinsäuren binden (Levi et al., 1992). Als alternative Methode schlagen Jaakola et al. (2001) das cDNA-Blotting vor. Dafür wird die RNA sofort nach der Isolierung in cDNA revers transkribiert, elektrophoretisch getrennt und auf eine Nylon-Membran transferiert. Den Autoren gelang es dadurch das Chalcone-Synthase Gen in Gesamt-RNA von Blaubeeren nachzuweisen.

Das symptomverursachende Agens für die Ringflecken, Scheckungen und mosaikartigen Blattverfärbungen in Stieleichen konnte im Rahmen dieser Arbeit nicht identifiziert werden. Zwei Tobamovirus-Isolate konnten aus Stieleichen mit chlorotischen Ringflecken isoliert und charakterisiert werden. Diese werden jedoch nicht als Erreger der Stieleichenringfleckigkeit angenommen, da sie bisher keine charakteristischen Symptome nach Rückübertragung auf Eichen induzierten. Partitiviren, auf deren Vorkommen in Stieleichen die Analysen der dsRNA hindeuten, verursachen in Pflanzen normalerweise keine Symptome. Nur in wenigen Fällen kann eine Infektion mit kryptischen Viren mit der Ausprägung von Symptomen einhergehen. So konnten Kassanis et al. (1978) schwache Chlorosen an BCV-infizierten Zuckerrüben beobachten. Eine Gelbfärbung der Blattspreite wurde an RYEV-infizierten Radieschenkulturen festgestellt (Natsuaki et al., 1983).

Bei der Ringfleckigkeit der Stieleiche kann nicht davon ausgegangen werden, dass die Symptome ausschließlich durch ein solches putatives Partitivirus oder durch das Zusammenwirken mit biotischen und abiotischen Standortfaktoren verursacht werden. Anhand von dsRNA-Analysen von Bäumen gleicher Herkunft konnte gezeigt werden, dass bei gleichen Standortbedingungen die gleichen dsRNA-Banden aus symptomtragenden und symptomlosen Stieleichen isoliert werden können (Kap. 3.5.2). Wie bereits erwähnt, ist es jedoch möglich, dass die Symptome in Abhängigkeit der Standortvoraussetzungen varrieren können (Büttner & Führling, 1993), was anhand der beobachteten, verstärkt gelbgrünen Ringflecken und Chlorosen an Stieleichenblättern des Standortes Sachsen, FA Dresden-Nord bestätigt werden konnte (Kap. 3.1).

Aufgrund der von Barnett (1971), Nienhaus (1975) und Führling (1994) gezeigten Pfropfübertragbarkeit der Eichenringflecken, -scheckungen und -mosaiks sind diese als Symptome infektiösen Ursprungs zu werten. Büttner & Führling (1993) beschreiben die Pfropfübertragung als einfaches und sicheres Nachweisverfahren für Viren in Forstgehölzen. Es muss daher angenommen werden, dass neben einer Kontamination mit Partitiviren eine Infektionskrankheit bisher unbekannter Ursache vorliegt. So konnten in Untersuchungen zu Viruserkrankungen in Poinsettien (Euphorbia pulcherima) isometrische Partikeln beobachtet werden, die in Verbindung mit Poinsettia mosaic virus (PnMV) mosaikartige Aufhellungen an Blättern erkrankter Pflanzen verursachten. Diese Partikeln konnten ebenso aus gesunden Pflanzen isoliert werden und wurden als Poinsettia cryptic virus (PoiCV) identifiziert (Bertaccini et al., 1996).

Ein infektiöses RNA-Virus in Stieleichen vorausgesetzt, müsste sich mindestens eine weitere hochmolekulare dsRNA-Bande aus erkrankten Stieleichen nachweisen lassen. In den eigenen Untersuchungen konnten ausschließlich aus Probenmaterial von Stieleichen mit virusverdächtigen Symptomen hochmolekulare dsRNA-Banden > 3,0 kb nachgewiesen werden. Aus dem Rindenextrakt von Stieleichen mit chlorotischen Ringflecken wurde eine hochmolekulare dsRNA mit einer Segmentlänge von ca. 3,5 kb isoliert, die jedoch in Knospengewebe und Blattmaterial derselben Bäume nicht auftrat (Kap. 3.5.2). Des weiteren wurde in einer Mischprobe von Blattmaterial erkrankter Stieleichen eines niedersächsischen Standortes eine hochmolekulare dsRNA von etwa 5 kb, sowie reproduzierbar eine zusätzliche dsRNA von ca. 1,6 kb nachgewiesen (Kap. 3.5.2). Aus Blattmaterial des folgenden Probenahmejahres konnten diese dsRNA-Segmente nicht mehr isoliert werden. Ursache ist vermutlich die Heterogenität des Blattmaterials der verwendeten Mischproben. Im Untersuchungsjahr 2003 waren etwa doppelt so viele Stieleichen mit Symptomen in diesem Bestand zu beobachten als im darauf folgenden Jahr. Obwohl ausschließlich Blätter mit Symptomen verwendet wurden, kann eine mögliche Virusfreiheit des Blattmaterials nicht ausgeschlossen werden. Von Viren in Gehölzen ist bekannt, dass deren Verteilung im Gehölz sehr inhomogen ist (Bitterlin et al., 1984). Führling (1994) gelang es ebenso nur aus vereinzelten Blattproben hochmolekulare dsRNA von >3,4 kb zu isolieren. Die Autorin begründet dies nicht nur mit dem verwendeten Pflanzenmaterial sondern auch mit dem Zeitpunkt der Probenahme. Ein Zusammenhang zwischen dem Probenahmezeitpunkt und den hochmolekularen dsRNA-Banden konnte in den eigenen Untersuchungen nicht festgestellt werden (Kap. 3.5.2). Außerdem wurden die Probenahmen am niedersächsischen Standort in den beiden aufeinander folgenden Probenahmejahren in der gleichen Kalenderwoche durchgeführt (Tab. A1, Anhang 4).

Die Verschiedenheit der hochmolekularen dsRNA-Strukturen (Kap. 3.5.2), der virusverdächtigen Partikeln (Kap. 3.4.1) und der beobachteten Blattsymptome (Kap. 3.1), sowie das sporadische Auftreten von Tobamoviren in erkrankten Stieleichen (Kap. 3.4.3) lassen das Vorkommen von verschiedenen Mischinfektionen in Stieleichen vermuten.

In den eigenen Untersuchungen konnte über die Isolierung und Klonierung von dsRNA kein Hinweis auf ein symptomverursachendes Agens gefunden werden. Die möglicherweise endogenen dsRNAs von ca. 1,6 kb/1,5 kb und ca. 2,0/1,8 kb werden auch in zukünftigen Untersuchungen die Isolierung und Charakterisierung putativer viraler dsRNA erschweren, da diese im Vergleich zu hochmolekularen dsRNAs durch eine höhere Konzentration vordergründig auftreten.

Es bleibt zudem nicht auszuschließen, dass eine Infektion mit DNA-Viren vorliegt, welche mit der Methode der dsRNA-Isolierung nicht nachgewiesen werden können (Dodds, 1993). Auch wenn in den bisherigen Arbeiten den Symptomen keine Viruspartikeln zugeordnet werden konnten, sollte in folgenden Arbeiten eine Kontamination der Stieleichen mit DNA-Viren oder auch Viroiden geprüft werden. Zu den ökonomisch bedeutendsten Obstgehölzen, an denen Viroide weltweit Schäden verursachen, gehören Orangen-und Zitronenbäume (Citrus viroid III, IV; Citrus bent leaf viroid, Citrus exocortis viroid), der Avocadobaum (Avocado sunblotch viroid), sowie Weinreben (G rapevine yellow speckle viroid 1, Hop stunt viroid) und die Kokospalme (Coconut-cadang-cadang-viroid) (Polivka et al., 1996; Wan Chow Wah & Symons, 1999; Schnell et al., 2001; Malfitano et al., 2005). Die Symptome, die von Viroiden verursacht werden, ähneln denen der Viren. Mischinfektionen von Viren und Viroiden wurden in Malus, Pyrus und Prunus nachgewiesen (Loreti et al., 1998; Hassan et al., 2004; Bouani et al., 2004). Zu den pflanzenpathogenen DNA-Viren gehören Vertreter der Gemini-, Nano- und Badnaviren (Büchen-Osmond, 2003). Als Gehölzpathogene sind das Cocoa swollen shoot virus (CSSV) in Theobroma (Cilas et al., 2005; Muller & Sackey, 2005) und das Rubus yellow net virus (RYNV) in Rubus bekannt (Jones et al., 2004).

Obwohl in europäischen Forstgehölzen bisher nicht von Infektionen induziert durch Viroide bzw. DNA-Viren berichtet wurde, ist eine potentielle Vektorübertragbarkeit vorausgesetzt (Mink, 1993; Brunt et al., 1996; Büchen-Osmond, 2003) davon auszugehen, dass sich diese in Forstbeständen ausbreiten könnten. In zukünftigen Untersuchungen zur Ringfleckigkeit der Stieleiche sollte mit Hilfe von Virusaufreinigungsverfahren für DNA-Viren, wie für das Abutilon mosaic bigeminivirus (AbMV) (Abouzid & Jeske, 1986) oder das Banana bunchy top virus (Thomas et al., 1991), versucht werden solche Viren anzureichern. Ebenso könnte der Nachweis von DNA-Viren über eine Ionenaustauschchromatographie erfolgen, die beispielsweise Harper et al. (2003) zur Reinigung des Petunia vein clearing virus (PVCV) einsetzten. Eine mögliche Viroidinfektion in Stieleichen könnte mit Hilfe einer R-PAGE (Reisner, 1987; Fakhfakh et al., 2002; Jeffries & James, 2005) oder der Northern-Hybridiserung (Wan Chow Wah & Symons, 1999) diagnostiziert werden. Sofern sich Primer für bekannte Viroide ableiten lassen ist deren Nachweis auf Basis einer RT-PCR mit Nukleinsäureextrakten möglich. [Elleuch et al. (2003) schlagen für die Extraktion der Nukleinsäuren die Verwendung eines Hochsalz-Puffers in Kombination mit einer partiellen Reinigung durch nicht-ionische Cellulose vor.]

Es ist nahe liegend, dass auch Eichen Virusinfektionen aufweisen; alle Wege der Evolution sprechen dafür. Es ist nicht ungewöhnlich, dass Viren in Gehölzen schwer oder unregelmäßig nachweisbar sind. Die Instabilität der Viruspartikeln, der geringe Virustiter und der hohe Gehalt an pflanzlichen Sekundärstoffen erschweren die Diagnose. Zum heutigen Forschungszeitpunkt steht zwar ein weites Methodenspektrum auf serologischer und molekularbiologischer Basis für den Nachweis von Viren zur Verfügung, da diese Verfahren in der Regel jedoch nicht für die Analyse von Proben aus Gehölzen entwickelt wurden, führen deren Anwendung bei der Isolierung/Charakterisierung von viralen Erregern aus Stieleiche häufig zu unterschiedlichen Ergebnissen und erschweren die Reproduzierbarkeit erheblich.