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1  Einleitung

1.1 Das translationell kontrollierte Tumorprotein

1.1.1 Struktur und Funktion des TCTP

Das translationell kontrollierte Tumorprotein (TCTP) wurde erstmals in Experimenten nachgewiesen, die sich mit der Identifizierung von wachstumsregulierten Proteinen in stimulierten Zellkulturen befassten. In der Fibroblasten-Tumorzelllinie Swiss 3T3 der Maus kommt es nach Stimulation mit Serum zur veränderten Expression von etwa 20 Proteinen (Thomas et al. 1981, Thomas und Thomas 1986). Nach Behandlung dieser Zellen mit Actinomycin D, einem Hemmstoff der Transkription zeigt sich, dass es bei einem Teil dieser Proteine nicht zu einem Abfall der Syntheserate kommt. Das legte eine Regulation auf translationeller Ebene nahe. Eines dieser Proteine wurde entsprechend seines Molekulargewichts als Q23 bezeichnet. In gleichartigen Experimenten an Maus-Erythroleukämie-Zellen wurde dieses Protein als p21 bezeichnet (Yenofsky et al. 1983, Chitpatima et al. 1988). Auch beim Wachstum von Ehrlich-Aszites-Tumorzellen der Maus und ihrer Stimulation mit Serum zeigte sich eine erhöhte Expression dieses Proteins, das hier p23 genannt wurde. Diese Arbeiten belegen darüber hinaus, dass es unter Behandlung mit Actinomycin D sogar zu einer zusätzlichen Induktion kommt. (Benndorf et al. 1988, Böhm et al. 1989, Böhm et al. 1991). Eine solche Regulation auf translationeller Ebene ist typisch für wachstumsregulierte Proteine, da somit potentiell eine schnelle Anpassung der Syntheserate an die Bedürfnisse der Zelle gewährleistet ist.

Die Bezeichnung TCTP (Gross et al. 1989) als Abkürzung für „translationally controlled tumor protein“ bringt zum Ausdruck, dass es sich um ein Protein handelt, dessen Synthese auf der Ebene der Translation reguliert wird und das in Tumorzellen erstmals nachgewiesen wurde. Eine Fülle von Arbeiten hat inzwischen gezeigt, dass TCTP keineswegs ein tumorspezifisches Protein ist, sondern ubiquitär in Einzellern, Hefen, Pflanzen, wirbellosen Tieren und Vertebraten zu finden ist. Das entsprechende Gen mit seinen Pseudogenen wird nach der GDB (genome database)-Nomenklatur (Zugangsnummer GDB 1060912) als TPT1 bezeichnet (Cayanis et al. 1998). Im Folgenden beziehen sich daher TPT1 auf Gen und Pseudogene und TCTP auf seine mRNA und das Protein.

Nach der Klonierung einer cDNA des Proteins und dem Vergleich der Aminosäuresequenz mit bekannten Sequenzen in Datenbanken zeigte sich keinerlei Ähnlichkeit zu einer bekannten Proteinfamilie (Böhm et al. 1989). Das berechnete Molekulargewicht liegt bei 19,4 kD.


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Struktur und Funktion des TCTP

Abb. 1: Proteinsequenzvergleich des TCTP:

Dargestellt ist ein Alignment der TCTP-Sequenzen von Mensch (P 13693), Kaninchen (R 43348), Maus (P 14701) und Spalthefe (Q 10344), Datenbank Expasy. Der grün markierte Abschnitt stellt den für die Tubulinbindung verantwortlichen Bereich dar (Position 74-123). Darin befindet sich die Ca2+-bindende Domäne (Aminosäuren 81-112). Gelb dargestellt sind die in allen bisher veröffentlichen TCTP-Sequenzen identischen Aminosäuren an den Positionen 12, 16, 53, 78, 93, 138 und 171. Die beiden beschriebenen Phosphorylierungsstellen an den Positionen 46 und 64 sind rot markiert. Eine potentielle Glykosylierungsstelle an Position 51 ist violett markiert.

Die in Abb. 1 dargestellten Vergleiche der Proteinsequenzen verschiedener Spezies zeigen ausgeprägte Homologien. Diese Konservierung spricht für eine wichtige physiologische Funktion dieses Proteins in der Zelle. So ist die Sequenz des TCTP von Ratte und Maus zu 100% identisch. Zwischen der humanen Sequenz und der des Kaninchens beträgt die Homologie 98%. Daher sollten die von uns am TCTP des Kaninchens erarbeiteten Ergebnisse zur translationellen Regulation mit hoher Relevanz auf das humane Homolog übertragbar sein. Identisch in allen untersuchten Spezies sind 7 der 172 Aminosäuren und zwar an den Positionen 12, 16, 53, 78, 93, 138 und 171. Diese Aminosäuren stehen vermutlich unter evolutionärem Erhaltungsdruck, und eine direkte Beteiligung an der physiologischen Funktion ist daher zu postulieren.

In der Tat erbrachte die Aufklärung der dreidimensionalen Struktur des TCTP der Hefe [Seite 3↓] Schizosaccharomyces pombe mittels NMR-Spektroskopie hierzu neue interessante Erkenntnisse (Thaw et al. 2001). Danach besitzt TCTP strukturelle Ähnlichkeiten zu dem humanen Guanin-Nukleotid-freien Chaperon Mss4. Guanin-Nukleotid-freie Chaperone binden die GDP/GTP-freie Form von Rab-Proteinen, einer Unterfamilie der Ras-Proteine. Rab-Proteine spielen eine Rolle bei der Regulation von sekretorischen Vorgängen. Die in allen untersuchten Spezies konservierten Aminosäuren Glu 12, Leu 74 und Glu 134 (Positionen in S. pombe) bilden eine Triade in einer Region, die mit dem Bereich von Mss4 korrespondiert, in dem das Rab-Protein Sec4 gebunden wird.

Beschrieben ist eine Phosphorylierung des humanen TCTP an Serinen in Position 46 und 64 durch eine polo-like Kinase (Plk). Diese Kinasen phosphorylieren Cytoskelett-bindende Proteine und regulieren auf diese Weise Funktionen von Mikrotubuli wie zum Beispiel die Spindelbildung in der Mitose (Yarm 2002). Eine Regulation des Proteins durch Phosphorylierung würde das Auftreten von Isoformen in 2D-Gelelektrophoresen erklären (Sanchez et al. 1997, Kern et al. 1997).

Die Diskrepanz zwischen berechnetem und in SDS-Gelelektrophoresen beobachtetem Molekulargewicht könnte auch auf weitere posttranslationelle Modifikationen wie beispielsweise eine Glykosylierung zurückzuführen sein. Eine potentielle Glykosylierungsstelle besteht im konservierten Bereich Asn 51, Ala 52, Ser 53. Eine derartige posttranslationelle Modifikation wurde jedoch bisher nicht nachgewiesen.

Die genaue physiologische Funktion des TCTP konnte bisher nicht vollständig geklärt werden. Multi-Tissue-Dotblot-Analysen zeigten, dass es in allen 50 untersuchten humanen Geweben exprimiert wird (Thiele et al. 2000). Es handelt sich um ein cytoplasmatisches Protein, und Immunfluoreszenz-mikroskopische Untersuchungen zeigten, dass TCTP in Zellen mit α-Tubulin im Bereich der Mikrotubuli kolokalisiert ist und in vitro an α-Tubulin und β-Tubulin bindet (Gachet et al. 1999). Neben den Actin-Filamenten und den intermediären Filamenten sind die Mikrotubuli Bestandteile des Cytoskeletts. In der Zelle bildet ein kleiner Teil des vorhandenen TCTP Heteromere mit α-Tubulin von 100-150 kD. Während der G1, S, G2 und frühen M-Phase lässt sich eine Assoziation zu den Mikrotubuli zeigen. In der Metaphase bis zum Übergang in die Anaphase bindet TCTP an die Mitosespindel. Mit Hilfe von Mutationsanalysen wurde die Tubulin-bindende Domäne bestimmt, und es zeigte sich, dass sie Ähnlichkeit zur Tubulin-bindenden Domäne des Mikrotubuli-assozierten Proteins MAP-1b besitzt. Mikrotubuli-assoziierte Proteine (MAP) sind ebenfalls Angriffspunkte der Plk, die auch TCTP phosphoryliert. Eine Überexpression von TCTP führt zur Verzögerung des Zellwachstums, zu [Seite 4↓]zellmorphologischen Veränderungen und zu einer größeren Stabilität der Mikrotubuli. Gleichsinnige Veränderungen, sowie mehrkernige Zellen und apoptotische Zellen, beobachtet man bei Expression eines veränderten Proteins, dem die Serinreste zur Phosphorylierung durch die Plk fehlen. Dies legt eine Veränderung der Affinität des TCTP zu den Mikrotubuli beim Übergang von der Metaphase zur Anaphase der Mitose durch Phosphorylierung nahe (Yarm 2002). Es häufen sich Befunde, die zeigen, dass TCTP in die große Gruppe der MAPs einzuordnen ist. MAPs stabilisieren Mikrotubuli und vermitteln darüber hinaus Wechselwirkungen mit anderen Proteinen in der Zelle. Neben der Ausbildung der Mitosespindel sind wesentliche Funktionen der Mikrotubuli der intrazelluläre Transport und die Bewegung von endo-und exocytotischen Vesikeln.

Nur ein Teil des TCTP assoziiert mit Mikrotubuli, und es stellt sich die Frage, welche weiteren Funktionen das Protein ausübt. Obwohl die Sequenz keinerlei Kernlokalisations-Signale enthält, wird neben der cytoplasmatischen auch eine nukleäre Lokalisation von TCTP beschrieben (Li et al. 2001, Guillaume et al. 2001). Guillaume et al. haben sich der Expression von TCTP in verschiedenen Keimzellstadien im Hoden der Ratte gewidmet. Dabei beschreiben sie eine vorrangige Lokalisation im Bereich des Zellkerns in den Keimzellstadien mit hoher mitotischer Aktivität. In den darauf folgenden Entwicklungsstadien findet man TCTP hauptsächlich im Cytoplasma.

Die Arbeit von Li et al. zeigt zudem eine Wirkung von TCTP als anti-apoptotischer Faktor, hier als Fortilin bezeichnet, durch Hemmung der Caspase-3-Aktivität. Die Überexpression schützt HeLa-Zellen vor einem durch Etoposid induzierten Zelltod. Eine TCTP-Depletion durch ein Antisense-Transkript führt in der Mamma-Ca-Linie MCF-7 zum programmierten Zelltod.

Mehrere Arbeiten belegen, dass TCTP verschiedener Spezies in der Lage ist, Calcium zu binden (Haghighat und Ruben 1992, Sanchez et al. 1997, Xu et al. 1999, Rao et al. 2002). Mit Hilfe von Deletionskonstrukten wurde die Ca2+-Bindungsstelle im Bereich der Aminosäurereste 81-112 lokalisiert (Kim et al. 2000). Dieses Ca2+-Bindungsmotiv zeigte keinerlei Ähnlichkeit zu Motiven in bisher bekannten Ca2+-bindenden Proteinen. Der Bereich der Ca2+-Bindung liegt in der von Gachet et al. beschriebenen Tubulin-bindenden Domäne.

Es wurde auch eine Einordnung in die Gruppe ribosomale Proteine/Proteinsynthese vorgeschlagen. So ordnet eine statistische Analyse von Transkriptionsprofil-Daten mehr als 5000 Hefe-Proteine in 45 Klassen. TCTP wird dabei mit hoher Wahrscheinlichkeit der Protein-Synthese-Maschinerie zugeordnet (Moler et al. 2000). Induziert man in Spalthefe eine Wachstumsverzögerung durch Ammoniummangel, korreliert die reduzierte Expression des [Seite 5↓]ribosomalen Proteins Rps6 mit einer verminderten TCTP-Expression (Bonnet et al. 2000).

1.1.2 Regulation der Expression des TCTP

Eine Induktion der TCTP-Expression wurde in sehr verschiedenen Zusammenhängen beschrieben. Neben den bereits erwähnten Induktionsmechanismen durch Serum und Actinomycin D wurde in Makrophagen eine gesteigerte Expression durch Phorbolester und Lipopolysaccharid hervorgerufen (Walsh et al. 1995). Bei Regenwürmern, die schwermetallbelasteten Böden ausgesetzt waren, induzierten Cadmium und Kupfer die TCTP-Expression (Stürzenbaum et al. 1998). Im Süßwasserpolypen Hydra vulgaris findet die TCTP-Expression vor allem in Regionen reger Zellproliferation statt (Yan et al. 2000). Eine erhöhte Expression wurde auch in Ratten-Gliom-Zellen beschrieben, die einem Vitamin-D-induzierten programmierten Zelltod ausgesetzt waren (Baudet et al. 1998). In der Pflanze Pharbitis tritt eine hell/dunkel-abhängige Induktion des TCTP auf (Sage-Ono et al. 1998). Diese Studien zeigen jeweils Veränderungen auf RNA-Niveau, so dass folglich die TCTP-Expression nicht ausschließlich auf translationeller Ebene reguliert wird.

Das authentische TPT1-Gen des Kaninchens hat eine Größe von 3,8 kb und enthält 5 Introns und 6 Exons (Thiele et al. 1998). Bei der Transkription des Gens werden zwei verschieden lange mRNAs generiert, eine kürzere mit einer Länge von 843 und eine längere von 1163 Nukleotiden. Sie unterscheiden sich in der Länge ihrer untranslatierten Regionen am 3’Ende (EMBL database AJ 131951). Die 3’UTR1 (211 Nukleotide) der mRNA1 ist bei der mRNA2 um 320 Nukleotide verlängert (3’UTR2). Grundsätzlich gibt es für die Entstehung unterschiedlich langer Messenger eines Gens zwei Möglichkeiten, das alternative Spleißen oder die Nutzung verschiedener Polyadenylierungssignale (Sureau et al. 1994). Da sowohl die 3’UTR1 als auch die 3’UTR2 ein Polyadenylierungssignal (AATAAA) enthält, ist für die Entstehung der beiden verschieden langen mRNAs die alternative Verwendung dieser beiden Polyadenylierungssignale wahrscheinlich. Beide UTRs liegen zudem im gleichen Exon, so dass keine Möglichkeit zum alternativen Spleißen besteht. Northern Blot-Analysen verschiedener Gewebe zeigten, dass beide Messenger-RNAs in allen Geweben mit einem Überwiegen der kurzen mRNA vorkommen. Das Verhältnis der kurzen zur langen mRNA schwankt von Gewebe zu Gewebe. Eine reifungsabhängige Veränderung des Verhältnisses kurzer zu langer mRNA lässt sich aus den Befunden von Guillaume et al. ableiten. In den Zellen mit hoher mitotischer Aktivität wird nur die kürzere mRNA gefunden, während das Auftreten des langen Messengers erst in den differenzierteren Zellen der Spermatogenese nachzuweisen ist (Guillaume et al. 2001).

Beim Menschen befindet sich das TPT1-Gen auf dem Chromosom 13 in der Bande q14. Ganz in [Seite 6↓]der Nähe liegt das Retinoblastoma-Gen, eines der bekanntesten Tumorsuppressorgene. Es gibt Tumoren, bei denen dieser Chromosomenabschnitt deletiert ist (Kalachikov et al. 1997). Ob sich durch das Fehlen des TCTP pathophysiologische Konsequenzen ableiten, wurde bisher nicht untersucht. TCTP-Knock-outs in Hefen erwiesen sich als nicht letal.

Im Genom von Säugerspezies sind mehrere prozessierte TPT1 Pseudogene zu finden (Thiele et al. 2000). Pseudogene leiten sich durch Genduplikation von ihren Ursprungsgenen ab. In der ursprünglichen Definition handelt es sich um Sequenzen, die Ähnlichkeiten zu einem Gen aufweisen, jedoch in ihrer Expression gestört sind oder zur Synthese fehlerhafter Proteine führen (Vanin et al. 1985). Inzwischen wurde die Transkription einiger Pseudogene beschrieben (Mighell et al. 2000). Es gibt prozessierte und nicht-prozessierte Pseudogene. Die nicht-prozessierten Pseudogene enthalten wie funktionelle Gene Exons, Introns und Promotorstrukturen. Sie sind seltener als prozessierte Pseudogene und wahrscheinlich durch Mutation aus Genduplikationen funktioneller Gene hervorgegangen. Prozessierte Pseudogene hingegen sind intronlos und zeigen Homologien zur mRNA-Sequenz eines Gens. Sie weisen als typisches Merkmal eine A-reiche Sequenz am 3’Ende auf und werden beidseits von kurzen Wiederholungssequenzen flankiert. Diese Repeats liefern einen Hinweis auf den Entstehungsmechanismus. Aus mRNAs entstanden im Laufe der Evolution Abschriften komplementärer DNA durch Aktivität einer reversen Transkriptase, die durch Retrotransposition wieder ins Genom eingefügt wurden. Das häufigere Vorkommen von prozessierten Pseudogenen in Genomen von Säugern lässt sich möglicherweise auf die vergleichsweise lange Dauer der Meiose in Eizellen zurückführen. Durch zufälligen Einbau in das Genom ist es möglich, dass Pseudogene von einer Region im 5’Bereich flankiert werden, die in der Lage ist, eine Promotoraktivität zu entfalten. Für die 5’flankierende Region zweier Kaninchen-TPT1 -Gene konnte eine Promotoraktivität gezeigt werden (Thiele et al. 2000). Das in vitro translatierte Produkt dieser Pseudogene unterscheidet sich in seinen Laufeigenschaften in der SDS-Gelelektrophorese nicht vom authentischen TCTP. Ob auch in vivo Produkte dieser Pseudogene synthetisiert werden und ob diese funktionell aktiv sind, ist derzeit noch ungeklärt. Interessanterweise findet man in den Genomen von Kaninchen, Maus, Ratte und Mensch jeweils unmutierte prozessierte TPT1-Pseudogene. Unklar ist dabei, ob diese Sequenzen unter einem evolutionären Erhaltungsdruck stehen, weil sie funktionell von Bedeutung sind.

Durch Vergleich der Sequenz mit prozessierten Pseudogenen konnte der Transkriptionsstart identifiziert werden, der durch Primer-Extension-Analysen von unvollständigen Klonen aus cDNA-Banken bestätigt wurde. Der Promotor enthält an Position –30 eine TATA-Box, die von [Seite 7↓]potentiellen Bindungsstellen verschiedener Transkriptionsfaktoren umgeben ist. Transfektionsstudien in glatten Muskelzellen mit Reporter-Gen-Konstrukten, die das Gen für die Chloramphenicol-Transferase enthielten, zeigten eine Aktivität des Promoters in Bereichen von potentiellen cis-Elementen der trans-aktivierenden Faktoren wie „activating protein 1“ (AP-1), „nuclear factor 1“ (NF-1), „myeloid-specific zinc finger protein 1“(MZF-1), „cAMP-response element binding protein“ (CREB), „stimulating protein 1“ (SP-1) und andere (Thiele et al. 1998). Als Vermittler von Serum- und Phorbolester-induzierten Änderungen der Transkription wurden AP1-, AP2- und SP1-ähnliche Proteine beschrieben (Descheemaker et al. 1992), und NF1 spielt eine Rolle bei Cytokin-vermittelten Antworten (Faisst et al. 1992).

Eine wichtige Rolle bei der Regulation der Expression des TPT1-Gens konnte für Calcium gezeigt werden (Xu et al. 1999). Erhöhte cytosolische Ca2+-Spiegel führen zu einer vermehrten TCTP-Expression. Diese Regulation durch Calcium findet auf transkriptioneller und posttranskriptioneller Ebene statt. Die Autoren schlagen eine Wirkung des TCTP als Ca2+-Speicher der Zelle beim stressinduzierten Zelltod vor, was zur Verzögerung oder Verhinderung der Apoptose führen kann.

Es gibt mehrere Hinweise, die auf eine Bedeutung der posttranskriptionellen Regulation des TCTP hindeuten:

  1. Die Expression des TCTP steigt nach Stimulation durch Serum oder Zellstress sehr schnell an, und der Anstieg an neusynthetisiertem Protein geht dem Anstieg an mRNA voraus (Thomas et al. 1986, Böhm et al. 1989, Xu et al. 1999).
  2. Transkriptionsinhibitoren wie Aktinomycin D haben keinen hemmenden Einfluss auf die Expression. Aktinomycin D wirkt im Gegenteil noch als zusätzlicher Induktor (Benndorf et al. 1988, Böhm et al. 1989, Böhm et al. 1991).
  3. Dem zellzyklusabhängigen Anstieg auf Proteinniveau steht eine konstante Menge an mRNA gegenüber (Böhm et al. 1989).
  4. Die TCTP-mRNA der Maus liegt proteingebunden in translationsinaktiven mRNP-Komplexen vor. Die Bildung dieser mRNP-Partikel lässt sich durch DMSO induzieren (Yenofsky et al. 1983).

Es erfolgten erste Experimente zur Aufklärung der Translationskontrolle. Es konnte gezeigt werden, dass die untranslatierten Regionen der TCTP-mRNA der Maus diese Translationsinaktivierung in vitro in zellfreien Translationssystemen und in vivo in Xenopus-Oocyten vermitteln (Böhm et al. 1991). Deletionsmutanten, denen 5’UTR bzw. 3’UTR fehlten, [Seite 8↓]erwiesen sich als effizienter translatierbar als die komplette mRNA mit ihren UTRs. Der größte inhibierende Effekt ging von der 5’UTR aus, wohingegen der Einfluss der 3’UTR geringer ausgeprägt war. Dieser Effekt scheint jedoch auf tierische Zellen beschränkt zu sein. Im zellfreien Translationssystem aus Weizenkeimlysat wird auch die vollständige TCTP-mRNA translatiert. Dies legt eine Regulation über spezifische Faktoren nahe, die in pflanzlichen Zellen entweder nicht vorhanden sind oder deren Aktivität sich darin nicht entfaltet.

Die TCTP-mRNA weist typische Merkmale von mRNAs auf, deren Übersetzung in die Aminosäuresequenz eines Proteins genau reguliert wird. Nicht nur die Proteinsequenz des TCTP ist hochkonserviert. Dies trifft auch für die Nukleotidsequenz der untranslatierten Regionen zu, was dafür spricht, dass auch diese Abschnitte unter einem hohen evolutionären Erhaltungsdruck stehen.

Computeranalysen mit Programmen, die aus einer RNA-Sequenz potentielle Sekundärstrukturen vorhersagen, zeigen dass die gesamte TCTP-mRNA in der Lage ist, komplexe Sekundärstrukturen auszubilden (Bommer et al. 2002). Es wurde eine Aktivierung der Proteinkinase PKR durch die TCTP-mRNA gezeigt. PKR ist eine Kinase, die durch doppelsträngige RNA aktiviert wird. Sie wurde ausführlich im Zusammenhang mit der antiviralen Wirkung von Interferonen untersucht. Nach Aktivierung durch doppelsträngige virale RNA wird die α-Untereinheit des Translationsinitiationsfaktors eIF2 durch PKR phosphoryliert. Dies führt zum generellen Translationsstop und somit auch zur Hemmung der weiteren Synthese viraler Proteine. Inzwischen wurde dieser Mechanismus auch für andere Signaltransduktionswege bei Zellwachstum und Apoptose beschrieben. Bommer et al. zeigten, dass die TCTP-mRNA nicht nur in der Lage ist, PKR zu aktivieren, sondern dass ihre Translation auch durch PKR reguliert wird.

Für eine effektive Translation ist die Entfaltung von Sekundärstrukturen in mRNAs notwendig. Neben der Bindung an die Cap-Gruppe der mRNA ist dies die wesentliche Aufgabe des Initiationsfaktors eIF4. Die Phosphorylierung dieses Initiationsfaktors führt zu einer gesteigerten Translation der TCTP-mRNA (Bommer et al. 1994). Es ist also wahrscheinlich, dass die phosphorylierte Form des Faktors eIF4 an der Aufwindung der Sekundärstrukturen der TCTP-mRNA beteiligt ist und so eine effektive Translation ermöglicht.

1.1.3 Pathophysiologische Bedeutung des TCTP

In den letzten Jahren kristallisierten sich drei medizinische Schwerpunkte heraus, bei denen TCTP von besonderer Bedeutung ist. Zunächst betrifft dies Erkrankungen des allergischen [Seite 9↓]Formenkreises, bei denen TCTP als „Histamine-Releasing Factor“ (HRF) beschrieben wurde (MacDonald et al. 1995). Darüber hinaus wurde die Wirkung des TCTP in Parasiten wie Plasmodien, Filarien und Schistosomata ausführlich untersucht, und es scheint ein Zusammenhang zur Wirkung als histaminfreisetzender Faktor zu bestehen (Rao et al. 2002, MacDonald et al. 2001). Die dritte große Gruppe von Erkrankungen, bei denen eine erhöhte Expression des TCTP auf RNA- und Proteinniveau beschrieben ist, umfasst onkologische Erkrankungen.

Da TCTP offenbar ein intrazellulär lokalisiertes Protein ist, dessen Sequenz keinerlei Signale für eine Sekretion enthält, ist die Wirkung als extrazellulärer histaminfreisetzender Faktor überraschend. Insbesondere deshalb, weil es ubiquitär auch in Organismen wie Einzellern und Hefen vorkommt, bei denen diese Funktion wohl keine Rolle spielt. Möglich ist, dass es sich hierbei nicht um eine physiologische Form der Histaminfreisetzung, sondern um eine pathologische Reaktion von einer Subpopulation atopischer Patienten auf ein körpereigenes oder parasitäres Protein handelt. Die Histaminfreisetzung durch TCTP ist IgE-abhängig, wurde in den Untersuchungen aber nur bei der Hälfte der untersuchten Patienten gefunden. Sie spielt eine Rolle bei der verzögerten Antwort (late phase response, LPR) allergischer Reaktionen, wenn das Allergen schon eliminiert ist. An dieser Reaktion sind neben Mastzellen basophile und eosinophile Granulozyten beteiligt. TCTP führt neben der Freisetzung von Histamin auch zur IL-4 und IL-13 Sekretion aus basophilen Granulozyten (Schroeder et al. 1996). Die Synthese und Freisetzung von TCTP aus basophilen Granulozyten steht unter dem Einfluss von IL-3. Es scheint sich also um einen cytokin-gesteuerten autokrinen Mechanismus zu handeln (Nielsen et al. 1998). Zusätzlich konnte kürzlich eine durch TCTP hervorgerufene IL-8-Sekretion aus Eosinophilen gezeigt werden (Bheeka-Escura et al. 2000). In B-Lymphozyten kommt es zur Aktivierung, was eine vermehrte Expression von MHC-Komplexen und Immunglobulinen zur Folge hat (Kang et al. 2001). Die Induktion von TCTP durch Dioxin und die konsekutive Histaminfreisetzung könnte mit der Modulation allergischer Erkrankungen durch Umweltgifte in Verbindung stehen (Oikawa et al. 2002).

Im Erreger der Malaria tropica Plasmodium falciparum wurde TCTP als möglicher Angriffsort des neuen Malaria-Medikaments Artemisinin beschrieben (Bhisutthibhan et al.1998). Diese Substanz, ursprünglich aus einem chinesischen Naturheilmittel isoliert, scheint unter Vermittlung von Hämin und Sauerstoffradikalen mit TCTP zu interagieren. Ob ein Zusammenhang zur Wirkung des Medikaments besteht oder ob diese Wechselwirkung ein Nebeneffekt ist, bleibt abzuwarten. Gut gezeigt hingegen ist die Bindung des Abbauprodukts des Hämoglobins, des [Seite 10↓]Hämins, an TCTP. Die Induktion von TCTP führt zur Ausbildung einer Resistenz gegenüber Artemisinin. (Walker et al. 2000). Eine weiterführende Arbeit (MacDonald et al. 2001) belegt, dass TCTP auch aus Plasmodien frei gesetzt wird und im Serum infizierter Individuen nachweisbar ist. Rekombinant hergestelltes Plasmodien-TCTP ist in vitro in der Lage, Histamin aus Basophilen und IL-8 aus Eosinophilen freizusetzen. Eine weitere Studie unterstützt die Vermutung, dass TCTP an antiparasitären Immunreaktionen beteiligt ist. Darin zeigen Rao et al., dass TCTP aus Schistosoma mansoni neben der in vitro histaminfreisetzenden Wirkung auch in vivo bei Mäusen nach intraperitonealer Injektion lokal zu einer eosinophilen Infiltration führt (Rao et al. 2002). Einen weiteren interessanten Aspekt zur Wirkung als histaminfreisetzender Faktor fügte eine Arbeit hinzu, die verminderte TCTP-Konzentrationen im Hirn verstorbener Alzheimer-Patienten zeigte (Kim et al. 2001). Diese Krankheit ist durch einen Mangel an Histamin in den Hirnstrukturen gekennzeichnet, die für kognitive Fähigkeiten verantwortlich sind. Auch wenn es bezüglich der Wirkung als histaminfreisetzender Faktor noch offene Fragen gibt, ist diese Wirkung doch gut belegt, und weitere Experimente werden hierzu sicher noch wertvolle Erkenntnisse liefern.

Nahe liegender erscheint jedoch eine Rolle in der Pathogenese von Tumoren. Die zellzyklusabhängige Regulation und die Wirkung als anti-apoptotischer Faktor lassen dies vermuten. Schon die frühen Versuche, die schließlich auch zur Bezeichnung des Proteins führten, zeigten einen Anstieg der Expression beim Wachstum von kultivierten Tumorzellen. Mehrere Arbeitsgruppen konnten mit Hilfe von Proteom-Analysen zeigen, dass TCTP in bestimmten Tumoren zu den Proteinen gehören, deren Synthese am meisten ansteigt. Eine erhöhte Expression des TPT1-Gens in Colon-Ca-Zelllinien wurde auf mRNA-Niveau beschrieben (Chung et al. 2000). Nach Stimulation der Mamma-Ca-Zelllinie MCF-7 mit dem Fibroblasten-Wachstumsfaktor FGF-2 wurde eine verstärkte Expression des TCTP auf Proteinebene nachgewiesen (Vercoutter-Edouart et al. 2001). FGF-2 wirkt über die Aktivierung von Tyrosin-Kinase-Rezeptoren und konsekutiver Aktivierung der MAP (mitogen-activated protein)-Kinase-Kaskade als potenter Wachstumsfaktor auf Brustkrebszellen.

Ein interessanter neuer Aspekt für diese Arbeit ergab sich aus einer Untersuchung von Sinha et al., die sich mit den molekularen Veränderungen in chemoresistenten Melanomzellen beschäftigte (Sinha et al. 2000). In vergleichenden 2D-Gelelektrophoresen wurde ein bis zu zehnfacher Anstieg der TCTP-Expression in den resistenten Melanomzellen relativ zu den Zellen, die auf die Chemotherapeutika sensibel reagierten, nachgewiesen.


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1.1.4  TCTP und Chemoresistenz in Tumorzellen

Bei der Behandlung von malignen Tumoren hat das Vorkommen natürlicher und cytostatika-induzierter Resistenzmechanismen einen entscheidenden Einfluss auf den Therapieerfolg. Grundsätzlich schützen diese Mechanismen gesunde Zellen vor schädlichen Noxen. Neben allgemeinen Mechanismen, wie beispielsweise DNA-Reparatursystemen oder Entgiftungssystemen wie MDR (multi drug resistance)-Membrantransportern oder dem Glutathion-System, findet man hochspezifische Resistenzmechanismen, die in Stoffwechsel und Wirkungsweise der jeweiligen Cytostatika eingreifen. Neben diesem Prinzip der Schadensbegrenzung gibt es ein bisher nur unvollkommen verstandenes offensichtlich in der Tumorzelle genetisch fixiertes Programm, das die Wirkung von Cytostatika auf den programmierten Zelltod moduliert. Das konnte für eine Überexpression des anti-apoptotischen Onkogens bcl-2 nachgewiesen werden (Fisher et al. 1993), und auch für TCTP gibt es erste Hinweise auf eine solche Wirkung (Li et al. 2001). Auf toxische Ereignisse reagiert die Zelle mit einer veränderten Genexpression, die Einfluss auf das komplexe Wechselspiel von Überleben und Zelltod hat. Die Komplexität und Redundanz dieser Netzwerke grenzen die Möglichkeiten des therapeutischen Eingreifens ein (Schmoll et al. 1999).

Das maligne Melanom gehört zu den häufigsten Tumorerkrankungen, und zudem lässt sich eine steigende Inzidenz beobachten, was in erster Linie auf ein verändertes Freizeitverhalten zurück zu führen ist. Die Therapie der Wahl stellt nach wie vor die chirugische Entfernung des Tumors dar. Ein Problem bei adjuvanter oder palliativer Chemotherapie ist, dass maligne Melanome eine hohe intrinsische Chemoresistenz aufweisen und die Ansprechraten auf cytostatische Therapieschemata nur bei etwa 30% liegen. Das Ausbilden von Resistenzen unter Therapie führt dazu, dass langfristige Remissionen unter cytostatischer Therapie nur in seltenen Fällen zu beobachten sind. Ein Verständnis der pathophysiologischen Zusammenhänge der Chemoresistenz ist notwendig, um den Patienten zukünftig effektivere Therapien anbieten zu können. Bisher beschrieben sind eine reduzierte Expression von DNA-mismatch-repair-Proteinen und eine verstärkte Aktivität der O6-Methylguanin-DNA-Methyltransferase in resistenten Melanomzellen (Lage et al. 1999).

Sinha et al. untersuchten Expressionsunterschiede von Proteinen zwischen der chemosensiblen Melanomzelllinie MeWo im Vergleich zu resistenten Abkömmlingen dieser Zellen, die durch Zugabe von Cytostatika selektiert wurden. Die Zellen wurden mit vier verschiedenen Cytostatika (Cisplatin, Fotemustin, Etoposid, Vindesin) behandelt. Diese Medikamente weisen unterschiedliche Wirkmechanismen auf. Cisplatin und Fotemustin gehören zu den Alkylantien [Seite 12↓]und führen zur Alkylierung von DNA, RNA und Proteinen. Cisplatin löst zusätzlich Apoptose aus. Die wesentlichen Resistenzmechanismen gegenüber den Alkylantien bestehen in der Reparatur von DNA-Schäden und in der Entgiftung der Substanzen, z.B. durch Bindung an Glutathion. Etoposid hemmt die Zellteilung durch einen bisher nicht vollständig geklärten Mechanismus, bei dem die Hemmung der Topoisomerase II eine wesentliche Rolle spielt. Auch Etoposid wirkt Apoptose auslösend. Die Ursache für eine Resistenz gegenüber Etoposid wird in erster Linie in einer verminderten Expression und Aktivität der Topoisomerase II gesehen. Vindesin gehört zu den Spindelgiften. Durch fehlende Ausbildung der Mitose-Spindel kommt es zur Arretierung der Zellen in der Metaphase und zur Induktion von Apoptose. Wie bei anderen Vincaalkaloiden kommt es durch verstärkten Cytostatika-Efflux aus der Zelle, vermittelt durch den MDR-1-Transporter, zur Resistenz.

Die Analyse von 2D-Gelelektrophoresen zeigte, dass es in den chemoresistenten Melanomzellen zu einer Überexpression von TCTP und drei weiteren Proteinen kommt. Am stärksten ausgeprägt ist dieser Effekt bei den Cisplatin- und Etoposid-resistenten Zellen, wo es zu einer zehnfachen Expressionssteigerung kommt (Sinha et al. 2000). Diese Untersuchungen geben jedoch keinen Aufschluss darüber, ob dieser Effekt vornehmlich auf einer transkriptionellen oder translationellen Aktivierung beruht.

1.2 Die Regulation der Translation in Eukaryonten

1.2.1 Die Ebenen der Genregulation

Die Veröffentlichung der Sequenzdaten des menschlichen Genoms im Jahre 2001 war ohne Zweifel ein Meilenstein der biomedizinischen Forschung. Die Lösung einiger lang umstrittener Fragen, wie z.B. die Anzahl der menschlichen Gene, ihre Lokalisation und Organisation im Genom ist näher gerückt. Jedoch gibt die reine Abfolge der Nukleotidbausteine unzählige neue Rätsel auf. Derzeit sind etwa 31 000 menschliche Gene identifiziert, und man schätzt ihre Gesamtzahl auf etwa 35 000 (Lander et al. 2001). Das sind weitaus weniger als noch vor kurzem angenommen. Besonders überraschend ist dabei, dass das humane Genom offensichtlich nur für etwas mehr als doppelt so viele Gene wie das Genom der Fruchtfliege Drosophila kodiert. Daraus wird ersichtlich, dass die alleinige Anzahl der Gene wenige Erklärungen für die Komplexitäteines Organismus liefern kann. Der entscheidende Schlüssel zu Komplexität und Differenzierung muss im Wechselspiel der Genprodukte und nicht zuletzt in der Regulation der Gene liegen.

Grundsätzlich kann man eine transkriptionelle und eine posttranskriptionelle Ebene der [Seite 13↓]Genregulation unterscheiden. In der Zelle sind diese Ebenen jedoch eng verflochten, und es kommt zur Ausbildung komplexer Netzwerke. Die wichtigsten Angriffspunkte von Regulationsmechanismen sind in Abb. 2 dargestellt.

Abb. 2: Ebenen der Expressionskontrolle in der Zelle:

1.Transkription, 2. RNA-Prozessierung, 3. RNA-Transport, 4. Translation, 5. mRNA-Stabilität, 6. Proteinaktivität (Alberts et al. 1995)

Angepasst an die jeweiligen Bedürfnisse der Zelle werden bestimmte Gene zunächst in eine unreife Prä-mRNA abgeschrieben. Die Transkriptionskontrolle wird von Transkriptionsfaktoren vermittelt, deren Aktivität über Signaltransduktionskaskaden beeinflusst wird. Während der Transkription wird am 5’Ende eine Kopfgruppe aus 7-Methyl-GTP und ein Schwanz aus etwa 100-200 Adenylresten am 3’Ende angefügt. Daran schließt sich die Reifung der mRNA durch Spleißen an. An dieser Stelle wirken Regulationsmechanismen wie alternatives Spleißen, alternative Polyadenylierung oder RNA-Editing (posttranskriptioneller Basenaustausch in der mRNA). Die reifen mRNAs werden aus dem Zellkern exportiert, und im Cytoplasma findet eine streng regulierte Kontrolle der Proteinsynthese statt. Die Gesamtheit der mRNAs einer Zelle bezeichnet man angelehnt an die Bezeichnung Genom als Transkriptom. Unter Proteom versteht man die Gesamtheit der synthetisierten Proteine einer Zelle.

In den letzten Jahren wurden zunehmend molekulare Ursachen von Krankheiten gefunden, die ihren Ursprung in einer gestörten Regulation bestimmter Gene haben. Es ist anzunehmen, dass in den nächsten Jahren weitere derartige Defekte beschrieben werden. Die Erforschung der Genregulation wird uns also in Zukunft nicht nur Einblicke in physiologische zelluläre Vorgänge geben, sondern auch zum besseren Verständnis von Pathomechanismen beitragen. Auf der [Seite 14↓]Grundlage solcher Erkenntnisse werden zukünftig Wirkstoffe, die in genregulatorische Vorgänge eingreifen, medizinische Anwendung finden, wie dies z.B. beim bereits angewandten Immunsuppressivum Rapamycin der Fall ist.

1.2.2 Ausgewählte Mechanismen der translationellen Regulation

Veränderungen der Transkriptionsrate beeinflussen die Proteinsyntheserate erst mit einer gewissen Latenz. Unter bestimmten Umständen ist jedoch eine schnellere Steigerung der Proteinsynthese notwendig. An diesen Stellen greifen translationelle Regulationsmechanismen an. Diese Form der Regulation ist auch in den Fällen notwendig, in denen eine Aktivierung im Kern noch nicht, wie bei der Entwicklung einer befruchteten Eizelle, oder nicht mehr, wie beispielsweise im Retikulozyten nach Ausschleusung des Zellkerns, möglich ist (Hentze 1995).

In der Zelle liegen mRNAs nicht nackt vor, sondern werden von Proteinen mit enzymatischer oder regulatorischer Aktivität gebunden. Es kommt zur Bildung von Ribonukleoprotein (RNP)-Partikeln. Die eigentliche translationelle Kontrolle wird von allgemeinen und spezifischen Faktoren ausgeübt. Die wesentlichen Regulationsmechanismen sind die Beeinflussung von Translationseffizienz, mRNA-Stabilität und Lokalisation (Wickens 1993, Wickens et al. 1997, Kloc et al. 2002). Neben der für ein Protein codierenden Sequenz enthalten mRNAs an ihren 5’ und 3’Enden unterschiedlich lange Sequenzen, die nicht in Protein übersetzt werden. Man bezeichnet diese Abschnitte als untranslatierte Regionen (UTRs). Sie sind durch Bindung von Proteinen maßgeblich an der Translationsregulation beteiligt. Schon während der Translation beginnt die Adressierung in die jeweiligen Zellkompartimente, und es finden Modifizierungen durch Anlagerung chemischer Gruppen oder durch Abspaltung von Fragmenten statt.

Beeinflussung der Translationsinitiation durch allgemeine Translationsfaktoren

Eine Übersicht über den Ablauf der Translationsinitiation ist in Abb. 3 dargestellt. Bei der Initiation der Translation wird zunächst ein 43S-Prä-Initiationskomplex aus der ribosomalen 40S Untereinheit, der Initiator-Methionin-tRNA und den Initiationsfaktoren eIF1A, eIF2 und eIF3 gebildet. An die 5’Cap-Struktur der mRNA bindet das Protein eIF4E, ein Bestandteil des Cap bindenden Komplexes eIF4F, der neben eIF4E die Faktoren eIF4B und eIF4G beinhaltet. Dieser Faktor windet auch vorhandene Sekundärstrukturen in der 5’UTR auf. Der 43S-Komplex interagiert mit eIF4E am 5’Ende der mRNA und die mRNA wird bis zum ersten AUG „gescannt“. Dort dissoziieren die Initiationsfaktoren ab, und unter Anlagerung der 60S-Untereinheit wird das komplette 80S-Ribosom unter Vermittlung des Faktors eIF5 zusammengesetzt (Preiss und Hentze 1999).


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Abb. 3: Translationsinitiation:

Die kleine ribosomale Untereinheit bildet unter Vermittlung der Faktoren eIF1A, 2, 3 den 43S-Komplex mit der Starter-tRNA. An die Kopfgruppe bindet eIF4, der auch die Sekundärstrukturen in der 5’UTR aufwindet. Der Komplex scannt die mRNA bis zum Startcodon. Dort beginnt die Translation nach Bildung des kompletten 80S-Ribosoms (Alberts et al. 1995).

Es existiert auch ein Cap-unabhängiger Initiationsmechanismus an einer speziellen Sekundärstruktur der 5’UTR, der Internal Ribosome Entry Site (IRES), die vor allem in viralen mRNAs zu finden ist, aber auch in einigen wenigen zellulären mRNAs beschrieben wurde. Die Besonderheit dieses Mechanismus besteht darin, dass er teilweise unabhängig von den Translationsinitiationsfaktoren funktioniert und somit eine Möglichkeit bietet, den üblichen Weg [Seite 16↓]der Translationsinitiation zu umgehen.

Zwischen den oben genannten allgemeinen Translationsfaktoren kommt es zu Interaktionen, was die Geschwindigkeit und Genauigkeit des Translationsinitiationsprozesses gewährleistet und zugleich Angriffspunkte für Regulationsmechanismen schafft (Dever 2002). Ein besonders interessanter Aspekt der Translationsregulation durch allgemeine Initiationsfaktoren ist, dass sich nicht nur die globale Proteinsyntheserate beeinflussen lässt, sondern durch veränderte Aktivität der allgemeinen Translationsfaktoren auch eine genspezifische Regulation möglich ist. Es scheint also mRNAs zu geben, die auf geringgradige Veränderungen der Translationsmaschinerie empfindlicher reagieren als andere.

Beeinflussung der Translationsinitiation durch spezifische Translationsfaktoren

Auch wenn hier in der Beschreibung eine inhaltliche Trennung der allgemeinen und spezifischen Translationsfaktoren vollzogen wird, sind diese Prozesse in der Zelle verknüpft, und die genspezifischen Faktoren üben ihre Wirkung letztlich durch Beeinflussung der allgemeinen Translationsmaschinerie aus.

Man nimmt an, dass der 5’UTR auf Grund ihrer Mitwirkung am Initiationsprozess engere Grenzen in Bezug auf individuelle Kontrollelemente gesetzt sind. Folglich finden sich viele cis-Elemente im Bereich von 3’UTRs. Was zunächst überraschend erschien, wurde plausibel, als physikalische und funktionelle Wechselwirkungen der beiden mRNA-Enden beschrieben wurden. So kommt es beispielsweise zur Interaktion des Poly(A)-bindenden Proteins PABP und des Initiationsfaktor eIF4G (Untereinheit von eIF4F) an der 5’Cap-Struktur. Dieser Mechanismus gewährleistet, dass nur regelrecht prozessierte mRNAs in Proteine übersetzt werden. Über Bindung an cis-Elemente in den 5’und 3’UTRs nehmen RNA-bindende Proteine spezifisch Einfluss auf die Translationsinitiation. Dabei spielt die Phosphorylierung der Faktoren eIF4E und eIF2α eine wichtige Rolle. Selbst die kodierende Sequenz einer mRNA kann regulatorische Funktionen erfüllen. Dies ist jedoch vergleichsweise selten, da diese Abschnitte unter dem evolutionären Druck der Proteinkonservierung stehen (Grzybowska et al. 2001). Die Diversität dieser Prozesse wird noch gesteigert, da RNA-bindende Proteine sowohl eine Hemmung als auch eine Aktivierung der Translation bewirken können.

Ein gut untersuchtes Beispiel ist die translationelle Regulation der 15-Lipoxygenase (15-LOX) des Kaninchens in Vorläuferzellen von Erythrozyten. In den frühen Entwicklungsstadien roter Blutzellen liegt die 15-LOX in translationsinaktiven mRNP-Komplexen vor. An ein CU-reiches Element in der 3’UTR, das in zehnfacher Wiederholung vorliegt und als [Seite 17↓]Differenzierungskontrollelement (DICE) bezeichnet wird, binden die hnRNP-Proteine E1 und K und verhindern die Translation der mRNA. In den Retikulozyten wird diese Hemmung aufgehoben, und das Enzym kann seine Funktion, den Abbau der Membranen von Zellorganellen ausüben (Ostareck-Lederer et al. 1994, Ostareck et al. 1997). In anderen Geweben liegt ein zweiter längerer Messenger (mRNA2) vor. Dieser enthält ein zweites DICE und man geht davon aus, dass auf diese Weise der hemmende Effekt des ersten DICE aufgehoben wird (Reimann et al. 2001). Die Bindung von hnRNP K an DICE wird durch Phosphorylierung durch die c-Src-Kinase aufgehoben (Ostareck-Lederer et al. 2002). Der kritische Schritt der Hemmung der Translation durch hnRNP E1 und K ist die Assemblierung des 80S-Ribosoms durch Anlagerung der 60S-Untereinheit (Ostareck et al. 2001).

Stabilität von mRNAs

Die Syntheserate eines Proteins kann außerdem über die Stabilität seiner mRNA reguliert werden. Die Länge des Poly(A)-Schwanzes einer mRNA nimmt im Laufe der Zeit ab. Wenn die kritische Länge für die Bindung des Poly(A)-bindenden Proteins PABP von 10 Adenosinresten erreicht ist, dissoziiert PABP von der mRNA ab und leitet damit die Abspaltung der Cap-Gruppe ein. Danach erfolgt der Abbau der mRNA durch 5’3’Exonukleasen. Die Wechselwirkung des Initiationsfaktors eIF4G mit PABP beeinflusst folglich nicht nur die Translationsinitiation, sondern schützt die mRNA gleichzeitig vor ihrem Abbau (Wickens et al. 1997). Darüber hinaus spielen Verlängerungen des Poly(A)-Schwanzes im Cytoplasma eine wichtige Rolle für die Anschaltung der Translation in der frühen Embryonalentwicklung, wenn der Zellkern noch inaktiv ist (Hentze 1995). Der Abbau von mRNAs kann ferner unabhängig von der Deadenylierung erfolgen und wird dann über die Bindung von Proteinen an cis-Elemente in 3’UTRs reguliert. Regulatorische Proteine wie Protoonkogene, Wachstumsfaktoren oder Cytokine zeichnen sich durch besonders kurzlebige mRNAs aus. Auf Grund von AU-reichen Elementen (ARE) in ihren 3’UTRs sind sie anfällig für einen Abbau, der von der Deadenylierung unabhängig ist. Der AU-bindende Faktor 1 (AUF1) bildet einen Komplex mit den Hitze-Schock-Proteinen Hsc70-Hsp70, dem Initiationsfaktor eIF4G und dem Poly(A)-bindenden Protein. Nach Abspaltung von eIF4G aus diesem Komplex, kommt es zur Ubiquitin-Markierung von AUF1 und konsekutiv zum Abbau des Faktors durch Proteasomen, was schließlich zum mRNA-Abbau führt (Grzybowska et al. 2001).

Die Bindung von Proteinen an Strukturen in UTRs kann mRNAs zudem vor dem Abbau durch Endonukleasen schützen, indem potentielle Spaltstellen maskiert werden. Ein Beispiel hierfür ist die Stabilisierung der mRNA des Transferrin-Rezeptors bei Eisenmangel. An ein Eisen-[Seite 18↓]responsives-Element (IRE) in der 3’UTR binden Eisen-regulatorische-Proteine (IRPs) und stabilisieren die mRNA. Dieses Beispiel verdeutlicht ebenfalls die Verknüpfung von mRNA-Stabilität und Translationshemmung, denn das gleiche Element führt in der 5’UTR der mRNA des Eisenspeicherproteins Ferritin zur Verhinderung der Proteinsynthese durch Hemmung der Interaktion des 43S-Komplexes mit eIF4F bei niedrigen Eisenspiegeln (Hentze 1996).

Lokalisation von mRNAs

Für die morphologische Assymmetrie einer Zelle ist eine ordnungsgemäße Verteilung der Proteine im Cytoplasma unentbehrlich. Eine effiziente Möglichkeit dies zu gewährleisten, ist die Lokalisation von mRNAs und die Synthese der Proteine an ihren entsprechenden Bestimmungsorten.

Besonders bedeutend ist dieser Mechanismus bei der Polarisation von befruchteten Eizellen. In Drosophila-Embryonen vermittelt das Produkt des Gens Staufen die Lokalisation der Bicoid-mRNA an den anterioren Pol und der Oskar-mRNA an den posterioren Pol der Zelle. Staufen ist ein RNA-bindendes Protein, dass Strukturen in der 3’UTR von mRNAs erkennt und diese unter Mitwirkung von Mikrotubuli transportiert (St. Johnston und Nüsslein-Volhard 1992).

Auch in differenzierten Zellen wurden derartige Vorgänge beschrieben. In Oligodendrocyten, den Zellen, die im Gehirn die Markscheiden der Nervenzellen bilden, kommt es zur Lokalisation der mRNA des Myelin basic protein (MBP) in die Peripherie der Zellen. An cis-Elemente in der MBP-3’UTR bindet hnRNP A2 und vermittelt die Lokalisation der mRNA in die Zellperipherie (Oleynikov und Singer 1998).

In größeren Zellen wie Eizellen und Nervenzellen scheinen Mikrotubuli den Prozess zu vermitteln, wohingegen in den kleineren somatischen Zellen actin-haltige Mikrofilamente eine Rolle spielen. Die Motoren für die aktive und gerichtete Bewegung vermutet man in Kinesin (Mikrotubuli) bzw. Myosin (Actin-Filamente). Da diese Cytoskelettproteine keine RNA-bindenden Domänen besitzen, wird die Wechselwirkung höchstwahrscheinlich über RNA-bindende Proteine vermittelt und von Mikrotubuli-assoziierten Proteinen moduliert (Jansen 1999). Auch die mRNA-Lokalisation muss eng mit Translationshemmung und zeitgerechter Aktivierung verknüpft sein, um eine vorzeitige Translation während des Transportes zu verhindern (St. Johnston 1998).

Krankheitsrelevante Störungen der Translationsregulation

In den letzten Jahren wurde für viele Erkrankungen eine Assoziation mit Mutionen in nicht-[Seite 19↓]codierenden Genabschnitten gefunden. Neben Mutationen im Promotor und Splice-Site-Mutationen sind dabei Mutationen in den untranslatierten Regionen von mRNAs von besonderer Bedeutung. Die gestörte Proteinsynthese kann dazu führen, dass entweder zu viel oder zu wenig Eiweiß gebildet wird, was unter Umständen im Organismus krankheitsauslösend wirkt (Conne et al. 2000).

So scheint beispielsweise die Akkumulation von Eisen im Gehirn von Alzheimer-Patienten an der Entstehung von oxidativem Stress beteiligt zu sein. Die Ferritin-Synthese wird durch Stabilisierung der Bindung der Eisen-regulatorischen Proteine (IRPs) an das Eisen-responsive Element (IRE) gehemmt, und folglich kann das Eisen nicht regelrecht gespeichert werden. Zusätzlich kommt durch verstärkte Stabilisierung der Transferrin-Rezeptor-mRNA ebenfalls durch die stabilere IRE/IRP-Wechselwirkung zur verstärkten Eisenaufnahme in die Hirnzellen (Guhaniyogi und Brewer 2001). Weiterhin kommt es bei diesen Patienten zur Ablagerung von β-Amyloid in bestimmten Hirnstrukturen. Die mRNA des Amyloid-Vorläufer Proteins (APP) wird durch Bindung von hnRNP C an die 3’UTR stabilisiert (Rajagopalan et al. 1998).

Medizinisch außerordentlich bedeutsam ist die Punktmutation G→A des letzten Nukleotids in der 3’UTR des Gerinnungsfaktors Prothrombin. Diese Mutation kommt in der Bevölkerung mit einer Häufigkeit von 1-2% vor und stellt neben der Faktor V Leiden-Mutation eine der wichtigsten Ursachen der Thrombophilie dar. Das Thromboserisiko ist bei Trägern der Prothrombin-Mutation auf das 2,5-fache erhöht. Die Mutation am 3’Ende führt zu einer effektiveren Prozessierung der Prä-mRNA und damit zu einer Akkumulation der Prothrombin-mRNA. In der Folge kommt es zu einer gesteigerten Synthese und zum Anstieg der Plasmaspiegel des Prothrombins, was zu einer vermehrten Aktivierung von Fibrinogen zu Fibrin führt (Gehring et al. 2001).

Es ist anzunehmen, dass bei der systematischen Suche nach krankheitsassoziierten Mutationen weitere genetische Veränderungen gefunden werden, die sich in den regulatorischen Bereichen von mRNAs befinden und denen über Beeinflussung von mRNA-Stabilität, Lokalisation und Translationseffizienz pathophysiologische Bedeutung zukommt.

1.2.3 RNA-bindende Proteine als Regulatoren der Genexpression

Schon während der Transkription vermittelt die carboxyterminale Domäne der RNA-Polymerase II die Bindung von mRNA-prozessierenden Proteinen an die neusynthetisierte hnRNA. Die RNA liegt in Ribonucleoprotein-Komplexen vor, die entsprechend hn (heterogenous nuclear) RNP-Komplexe an der unreifen RNA im Kern bzw. mRNP-[Seite 20↓]Komplexe an der reifen exportierten Messenger-RNA genannt werden. Diese Einteilung wird jedoch zunehmend in Frage gestellt, da RNA-bindende Proteine mit der mRNA exportiert werden können und offensichtlich zwischen Kern und Cytoplasma ein Shuttle für diese Proteine existiert. RNPs sind komplexe und dynamische Gebilde aus RNA und einer Vielzahl von Proteinen. Für diese Interaktionen sind neben der Sequenz einer mRNA insbesondere Sekundärstrukturen der mRNA von Bedeutung (Dreyfuss et al. 2002).

RNA-bindende Proteine enthalten neben RNA-bindenden Domänen auch Bereiche, die für eine Interaktion mit weiteren Proteinen und die Lokalisierung des Proteins in der Zelle verantwortlich sind. Die am häufigsten zu findende RNA-bindende Domäne ist das RNP-Motiv, das auch als RNA-Bindungsdomäne (RBD) und RNA-Erkennungsmotiv (RRM) bezeichnet wird. Derzeit sind etwa 300 Proteine bekannt, die dieses Motiv enthalten. Das RNP-Motiv weist ein großes zentrales antiparalleles β-Faltblatt auf, das von zwei Helices eingerahmt wird, und folgt dem allgemeinen Schema β-α-β-β-α-β. Es kommt zu Adaptationen zwischen RNA und Protein im Sinne eines „induced-fit“ Mechanismus (Siomi und Dreyfuss 1997).

Ein anderes häufiges RNA-Bindungsmotiv ist die KH-Domäne. Dieses Motiv wurde zuerst in hnRNP K charakterisiert und nach diesem Protein benannt (KH-Domäne für hnRNP K homologe Domäne). Sie ist gekennzeichnet durch ein stabiles dreisträngiges antiparalleles β-Faltblatt, das von drei Helices umgeben ist, so dass sich folgende Struktur ergibt: β-α-α-β-β-α. RNA-bindende Proteine enthalten jeweils mehrere gleichartige oder verschiedene RNA-Bindungsdomänen. Wie schon am Beispiel von hnRNP K bei der Regulation der 15-LOX-Synthese beschrieben, wird die Affinität der bindenden Proteine an die RNA durch Phosphorylierung moduliert.

Die Wirkungen von RNA-bindenden Proteinen auf Translationsinitiation, mRNA-Stabilität und Lokalisation wurden bereits in den entsprechenden Abschnitten beschrieben. Insbesondere die Interaktion mit dem Initiationskomplex ist noch nicht vollständig geklärt und derzeit Gegenstand von Untersuchungen. Man nimmt an, dass Proteine spezifisch an Konsensus-Strukturen in der mRNA binden und mit den Initiationsfaktoren und/oder ribosomalen Untereinheiten wechselwirken (Ostareck et al. 2001).


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27.11.2003