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2  Aufgabenstellung

In der Zelle findet eine regulierte Expression genetischer Information statt. Diese Regulation greift sowohl an der DNA in Form der transkriptionellen Kontrolle als auch an der mRNA in Form der posttranskriptionellen Kontrolle an. Die Regulation der cytoplasmatischen Proteinsynthese ist im Vergleich zu den Prozessen der Transkription und der Prozessierung der unreifen mRNA weniger gut charakterisiert. Zunehmend wird jedoch aus Vergleichen der Daten aus Transkriptom- und Proteom-Untersuchungen ersichtlich, dass eine ganze Reihe von mRNAs auf translationeller Ebene reguliert werden. Die Berichte über Erkrankungen, die mit Mutationen in den untranslatierten Regionen (UTRs) von mRNAs assoziiert sind, unterstreichen die Bedeutung dieser Regulationsmechanismen für den regelrechten Ablauf physiologischer Vorgänge.

Das translationell kontrollierte Tumorprotein (TCTP) stellt ein aus medizinischer Sicht interessantes Modell zur Untersuchung von Regulationsphänomenen auf der Ebene der Translation dar. Seine zellzyklus-abhängige Assoziation mit Bestandteilen des Cytoskeletts und seine Fähigkeit, den programmierten Zelltod zu hemmen, legen eine wichtige Rolle bei der Zellproliferation und der malignen Transformation von Zellen nahe.

Auf Grund der hochgradigen Konservierung der TCTP-Sequenz unter den Säugetierspezies sollten grundlegende Regulationsmechanismen zunächst an einem ausgewählten Tiermodell, in diesem Falle am Kaninchen, untersucht werden. Zur Ergänzung sollten Untersuchungen zur Bedeutung der Translationsregulation des TCTP in chemoresistenten Melanomzellen an einer humanen Zelllinie durchgeführt werden. Der Vergleich konservierter Elemente in den UTRs verschiedener Spezies der TCTP-mRNA ermöglicht die Identifizierung potentieller Motive für RNA-bindende Proteine.

In den letzten Jahren wurde zunehmend die Bedeutung der UTRs für die Regulation von Translation, Stabilität und Lokalisation von mRNAs erkannt. Die TCTP-mRNA des TCTP gehört zu den mRNAs, deren Übersetzung in die Aminosäuresequenz eines Proteins einer besonderen Kontrolle unterliegen. Diese translationelle Regulation des TCTP ist bisher erst in Anfängen untersucht. Die TCTP-mRNA besitzt in ihrer 5’UTR eine charakteristische pyrimidinreiche Struktur. An derartige 5’terminale Oligopyrimidintrakte (5’TOPs) binden spezifische Proteinfaktoren, die regulatorische Wirkungen vermitteln. Es existieren zwei verschieden lange TCTP-mRNAs (mRNA1 und 2), die sich in der Länge ihrer 3’UTRs unterscheiden.


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Zunächst sollte daher die Frage geklärt werden, welchen Einfluss die einzelnen Abschnitte der TCTP-mRNA auf die Translatierbarkeit haben. Dazu mussten zuerst aus unvollständigen cDNA-Bank-Klonen volllange cDNA-Klone der TCTP-mRNA1 und 2 sowie Konstrukte, bei denen die untranslatierten Regionen deletiert sind, hergestellt werden. Die Aufgabe umfasste insbesondere, Unterschiede in der Translationsrate der beiden verschieden langen mRNAs zu erarbeiten und die Translatierbarkeit der Konstrukte in den beiden in vitro Translationssystemen Retikulozytenlysat und Weizenkeimlysat zu vergleichen.

Anschließend sollte untersucht werden, ob eine Proteinbindung an in vitro Transkripte der untranslatierten Bereiche nachzuweisen ist und ob sich diese Proteinfaktoren anreichern und identifizieren lassen. Der Nachweis der Proteinbindung sollte in Electromobility Shift Assays (EMSAs) erbracht werden. Zur näheren Charakterisierung der bindenden Proteine sollten UV-Crosslinking Experimente durchgeführt werden. In der RNA-Affinitätschromatographie sollten Kandidatenproteine für eine spätere Identifizierung in der MALDI-TOF-Massenspektrometrie angereichert werden.

Der Nachweis einer vermehrten TCTP-Expression in chemoresistenten Melanomzellen von Sinha et al. mit Hilfe von 2D-Gelelektrophoresen erlaubte keine Aussagen darüber, ob diese erhöhte Expression auf transkriptioneller oder posttranskriptioneller Ebene reguliert wird (Sinha et al. 2000). Es sollte daher die Frage beantwortet werden, inwieweit eine translationelle Regulation für diesen Effekt verantwortlich ist. Im Anschluss an eine solche Zuordnung des Effekts an Hand von Northern und Western Blot-Analysen, sollte untersucht werden, ob in Proteinbindungsstudien Unterschiede zwischen Extrakten von sensiblen und resistenten Melanomzellen zu beobachten sind. Auch hier sollte eine Anreicherung und Identifizierung RNA-bindender Proteine angestrebt werden.

Im Ergebnis sollte ein Beitrag zum Verständnis grundlegender Regulationsphänomene auf translationeller Ebene am Beispiel der TCTP-mRNA unter physiologischen Umständen geleistet werden und eine Bedeutung dieser Vorgänge für die erhöhte TCTP-Expression in chemoresistenten Melanomzellen belegt werden.


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27.11.2003