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4  Ergebnisse

4.1 Die Regulation der Translation der TCTP-mRNA

4.1.1 Verhalten der TCTP-mRNA1 und 2 und ihrer Deletionsvarianten in der in vitro Translation

Die mRNA des translationell kontrollierten Tumorproteins (TCTP) stellt einen interessanten Gegenstand zur Untersuchung von Regulationsmechanismen auf der Stufe der Translation dar. Das Ziel dieser Arbeit war es, die an dieser Kontrolle beteiligten Faktoren genauer zu charakterisieren. Für eine solche translationelle Regulation sind die Abschnitte einer mRNA von Bedeutung, die nicht für die Aminosäuresequenz eines Proteins kodieren und daher als untranslatierte Regionen (UTRs) bezeichnet werden. Spezifische RNA-bindende Proteine binden an cis-Elemente in diesen untranslatierten Regionen und beeinflussen dadurch überwiegend die Translationseffizienz und Stabilität der mRNA. Im Vergleich zur Transkriptionskontrolle durch DNA-bindende Transkriptionsfaktoren weist die Translationsregulation einige wesentliche Unterschiede auf. Die RNA-bindenden Proteine sind derzeit noch vergleichsweise weniger gut charakterisiert.

Für die Bindung von Proteinen an Elemente in mRNAs scheinen neben der Konsensussequenz die räumlichen Strukturen der mRNA von besonderer Bedeutung zu sein. Die einsträngige RNA bildet durch Basenpaarungen innerhalb des Moleküls komplexe Sekundärstrukturen aus. An ein ähnliches cis-Element können in verschiedenen mRNAs unterschiedliche Proteine binden, so dass sich aus einer mRNA-Sequenz nicht ohne weiteres voraussagen lässt, welche Proteine daran binden, zumal es hierbei auch gewebespezifische Unterschiede gibt. Darüber hinaus kann ein RNA-bindendes Protein an einer mRNA die Translation hemmen, während es an einer anderen durch Stabilisierung der mRNA eine erhöhte Proteinsyntheserate bewirkt. Dadurch kann eine Zelle schnell und reversibel auf veränderte Anforderungen reagieren und gleichzeitig und koordiniert die Syntheserate mehrerer Proteine verändern.

Im Vergleich zum TPT1-Gen des Kaninchens (3,8 kb) ist das humane TPT1-Gen länger (4,4 kb). Sämtliche Exon-Intron-Übergänge sind konserviert. Der Größenunterschied kommt hauptsächlich durch mehrere Insertionen im Intron 5 des humanen Gens zustande. In den Exons 2 bis 5, die den kodierenden Bereich der mRNA umfassen, findet man eine hochgradige Homologie von 94-98%. Das entspricht einer Sequenzhomologie auf Proteinniveau von 98,3%. In Exon 1 und 6, die die UTRs der mRNA beinhalten, liegt die Homologie bei 85% und ist damit noch vergleichsweise hoch. Das spricht dafür, dass nicht nur die kodierende Sequenz, sondern auch die UTRs der mRNA unter einem evolutionären Erhaltungsdruck stehen. Eine Bedeutung [Seite 37↓]der UTRs für die Regulation der TCTP-Synthese liegt somit nahe.

Bei der vergleichenden Betrachtung der TCTP-mRNA von Kaninchen und Mensch, in Abb. 4 dargestellt, sind strukturelle Besonderheiten augenfällig, die in diesen und weiteren Spezies eine große Homologie aufweisen.

Abb. 4: Sequenz-Alignment der TCTP-mRNA von Mensch (AJ 400717) und Kaninchen (AJ 131951):

Übereinstimmende Nukleotide sind durch Boxen hervorgehoben. In der 5’UTR ist der 5’terminale Oligopyrimidintrakt rot markiert, der identisch ist bei Mensch und Kaninchen. Beginn und Ende des Leserahmens sind durch Sternchen markiert. Der Beginn der 3’UTR 2 ist mit einem Pfeil hervorgehoben. In der 3’UTR sind die beiden Polyadenylierungssignale grün markiert.

Eine Reihe von mRNAs, die für wachstumsregulierte Proteine kodieren, darunter TCTP, weisen an ihrem 5’terminalen Ende einen Oligopyrimidintrakt (5’TOP) auf. Die charakteristische Konsensus-Sequenz beginnt mit einem Cytidin, auf das 5 bis 14 weitere Pyrimidine folgen (Avni et al. 1994). Bei einem Wachstumsarrest der Zelle wird über diese 5’TOPs eine Hemmung der Translation vermittelt. Die Sequenz des 5’TOP der TCTP-mRNA (CTTTTCCG) ist konserviert und identisch bei Kaninchen und Mensch. Die entsprechende Struktur bei der Maus ist CTTTTTTCC.


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Für die Wirkung der 5’TOPs ist nicht nur der Pyrimidintrakt von Bedeutung, sondern auch seine Lokalisation unmittelbar am 5’Ende sowie ein GC-Reichtum in der gesamten 5’UTR. Diese Voraussetzungen sind in der TCTP-mRNA gegeben, und Untersuchungen belegen, dass es im Bereich der 5’UTR zur Ausbildung von komplexen Sekundärstrukturen kommt (Chitpatima et al. 1988, Bommer et al. 2002).

Aus dem TPT1-Gen werden bei der Transkription und bei der nachfolgenden mRNA-Prozessierung durch Verwendung alternativer Polyadenylierungssignale, zwei verschieden lange mRNAs gebildet, die mRNA1 mit einer Länge von 843 Nukleotiden und die mRNA2 mit einer Länge von 1163 Nukleotiden beim Kaninchen. Aus Voruntersuchungen war bekannt, dass die untranslatierten Regionen der TCTP-mRNA die Translationsrate der mRNA beeinflussen (Böhm et al. 1991). Zunächst sollte daher untersucht werden, ob sich diese Effekte auch an der TCTP-mRNA des Kaninchens nachweisen lassen. Dabei war insbesondere das Translationsverhalten der mRNA2 von besonderem Interesse, da diese längere mRNA kürzlich erstmals beschrieben wurde (Thiele et al. 1998).

Das Translationsverhalten sollte an der in vitro transkribierten TCTP-mRNA1 (843 nt) und 2 (1163 nt) des Kaninchens sowie deren Deletionsvarianten, denen die untranslatierten Regionen deletiert wurden, in zellfreien Translationssystemen untersucht werden. Dazu mussten zunächst volllange cDNA-Klone der mRNA1 und der mRNA2 hergestellt werden. Es lagen bereits für beide mRNAs Klone aus cDNA-Banken vor: für die mRNA1 Klon 33/34 und für die mRNA2 Klon 31/1 (Berger, Promotion 1998).

Bedingt durch die Klonierungstechnologie stellt das 5’Ende von Klonen aus cDNA-Banken bekanntermaßen eine Schwachstelle dar. Aus Vergleichen mit prozessierten Pseudogenen ließ sich der Transkriptionsstart und damit das 5’Ende der TCTP-mRNA exakt rekonstruieren, und es zeigte sich, dass den beiden cDNA-Bank-Klonen 5’terminal jeweils 34 Nukleotide fehlten. Für die Herstellung der vollständigen cDNA-Klone standen grundsätzlich zwei Möglichkeiten zur Verfügung: die Klonierung eines PCR-Fragments aus Kaninchen-mRNA mittels Reverser Transkriptase oder die Vervollständigung der cDNA-Bank-Klone mit einem geeigneten durch Restriktionsendonukleasen hergestellten Fragment. Es wurde hierbei der letztere Weg bevorzugt. Die angewandte Klonierungsstrategie ist in Abb. 5 dargestellt.


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Abb. 5: Aufbau der vollständigen TCTP-cDNA1 und 2:

Aus einer cDNA-Bank lagen die Klone 33/34 und 31/1 vor, die jeweils die unvollständige TCTP-cDNA1 bzw. 2 enthielten. Diesen beiden Klonen fehlten am 5’Ende jeweils 34 Nukleotide. Mit den beiden Restriktionsendonukleasen NheI und ApaI wurde aus diesen Klonen jeweils ein Fragment generiert, das an ein gleichermaßen geschnittenes Fragment aus dem genomischen TPT1-Klon (H2-Eco RI) im pCR ScriptII SK+-Vektor ligiert wurde. Somit lagen schließlich die vollständige cDNA1 und 2 im pCR ScriptII SK+-Vektor vor.

Um ein entsprechendes Restriktionsfragment herstellen zu können, wurde zunächst ein PCR-Fragment aus dem Klon hergestellt, der das TPT1-Gen enthielt. Dieses PCR-Fragment erstreckte sich vom Transkriptionsstart bis in Exon 2 hinein und wurde in den pCR-Script-Vektor (Stratagene) einkloniert. Dieses Konstrukt wurde dann, ebenso wie die unvollständigen [Seite 40↓]cDNA-Klone mit den beiden Restriktionsendonukleasen NheI und ApaI ebenso gespalten. Die Fragmente aus den cDNA-Klonen wurden dann an das 5’terminale Fragment im pCR-Script-Vektor ligiert, so dass schließlich die vollständigen cDNAs der mRNA1 und 2 im pCR-Script-Vektor vorlagen.

Die Deletionsvarianten wurden als PCR-Fragmente aus diesen beiden Klonen in den PCRII-TOPO-Vektor (Invitrogen) kloniert. Zur Vereinheitlichung wurden auch die beiden vollständigen cDNAs per PCR amplifiziert und ebenfalls in den PCRII-TOPO-Vektor kloniert. In Abb. 6 sind die mRNA1 und 2 sowie ihre Deletionsvarianten graphisch dargestellt.

Abb. 6: TCTP-mRNA1 und 2 und ihre Deletionsvarianten:

Die vollständige mRNA1 und 2 sowie ihre Deletionsvarianten wurden mittels PCR aus den cDNA-Klonen im pCR ScriptII SK+-Vektor amplifiziert und in den PCRII-TOPO-Vektor kloniert. Für die in vitro Translationsversuche wurden Konstrukte verwendet, denen entweder die 3’UTR (3), die 5’UTR (4) und (5) oder sowohl 5’UTR als auch 3’UTR (6) deletiert wurden.

Mit Hilfe von zellfreien Translationssystemen lässt sich in vitro das Translationsverhalten von mRNAs untersuchen. Es stehen hierfür kommerziell erhältliche Zelllysate zur Verfügung. Lysate aus Weizenkeim und Kaninchen-Retikulozyten haben sich für derartige Untersuchungen als besonders geeignet erwiesen, weil sie einerseits in großen Mengen herzustellen sind und andererseits eine geringe endogene Nuklease-Aktivität besitzen (Pelham and Jackson 1976, Anderson CW et al. 1983). In beiden Systemen werden auch geringe Mengen zugegebener mRNA effektiv translatiert, so dass sich diskrete Veränderungen der Syntheserate eines Proteins nachweisen lassen. Die in den Lysaten vorhandene mRNA wird durch Behandlung mit Nuklease aus Mikrokokken und CaCl2 zerstört. Nachfolgend werden die Ca2+-Ionen durch Zugabe von EDTA gebunden und die Nuklease somit inaktiviert. Untersuchungen an diesen Systemen haben [Seite 41↓]gezeigt, dass bei dieser Behandlung die für die Proteinsynthese erforderlichen Strukturen erhalten bleiben (Dasso and Jackson 1989, Kozak 1990). Es wird bei derartigen Experimenten zudem vorausgesetzt, dass neben den allgemeinen Translationsfaktoren auch die für die jeweilige mRNA spezifischen Faktoren wirksam sind. Die Darstellung und Auswertung der neusynthetisierten Proteine erfolgt durch den Einbau von [35S]-Methionin und die nachfolgende Autoradiographie.

Die TCTP-mRNA1 und 2 sowie ihre Deletionsvarianten wurden in vitro transkribiert, um nachfolgend im Weizenkeim- und im Retikulozytenlysat in vitro translatiert zu werden. Für die in vitro Translation wurden äquimolare Mengen dieser Transkripte eingesetzt. Auch in vitro ist die Regulation der Translation abhängig von den vorhandenen Proteinfaktoren. Durch Vergleich der Translationsmuster in beiden Systemen lassen sich erste Hinweise auf Unterschiede in der Translation der mRNAs in pflanzlichen und tierischen Zellen erarbeiten. Die Abb. 7 zeigt das Verhalten der TCTP-mRNA und ihrer Deletionsvarianten in der in vitro Translation im Retikulozytenlysat. Die Reihenfolge der aufgetragenen Ansätze entspricht der Reihenfolge der dargestellten Konstrukte in Abb. 6.

Abb. 7: In vitro Translation der TCTP-mRNA1 und 2 und ihrer Deletionsvarianten im Retikulozytenlysat:

In Bahn (1) und (2) sind die Proben mit den beiden vollständigen mRNAs aufgetragen. Es folgt in Bahn (3) die Translation der (-3’UTR)-Deletionsvariante. Bahn (4) und (5) zeigen die Translation der (-5’UTR)-Konstrukte und in Bahn (6) das Ergebnis des Konstrukts, das nur noch den kodierenden Bereich darstellt.

Die vollständige mRNA1 und mRNA2 sind im Retikulozytenlysat in vitro nicht translatierbar (Bahn 1 und 2). Das Entfernen der 3’UTR verbessert die Translatierbarkeit der mRNA nicht (Bahn 3). Entfernt man jedoch die 5’UTR der mRNA1, findet eine effektive Translation statt (Bahn 4). Die mRNA2 wird jedoch bei auch fehlender 5’UTR im Gegensatz zur mRNA1 nicht translatiert (Bahn 5). Dies deutet darauf hin, dass die 3’UTR2 im Gegensatz zur 3’UTR1 einen markanten hemmenden Einfluss auf die Translatierbarkeit der mRNA hat. Die Menge an neusynthetisiertem TCTP bei fehlender 5’ und 3’UTR (Bahn 6) entspricht der Menge bei [Seite 42↓]fehlender 5’UTR der mRNA1.

Das Translationsverhalten der mRNA 1 wird somit hauptsächlich durch ihre 5’UTR bestimmt. Die 3’UTR1 allein scheint keinen hemmenden Einfluss auf die Translation zu haben. Ein so genannter Ribosomen-Run-off ist ausgeschlossen, da das Transkript noch einige Nukleotide (73nt bzw. 82nt je nach Verwendung von T7 oder SP6-Polymerase) der Vektorsequenz enthält. Des weiteren wird das Konstrukt, dem sowohl die 5’ als auch die 3’UTR fehlen und das dasselbe 3’Ende aufweist, effektiv translatiert. Die mRNA2 ist bei fehlender 5’UTR weiterhin translationell inaktiv. Dies spricht für einen eigenständigen regulatorischen Einfluss der 3’UTR2 auf die Translationseffektivität.

Die dargestellten Untersuchungen wurden mit in vitro Transkripten durchgeführt, die weder eine 5’cap-Struktur noch einen Poly(A)-Schwanz am 3’Ende enthielten. Das Einfügen einer 7-Methyl-Guanosin-Gruppe am 5’-Ende führte bei allen Konstrukten gleichermaßen zu einer leichten Erhöhung der Translationseffektivität. Bei den Konstrukten, denen die 5’UTR deletiert wurde, ermöglichen Nukleotide (42nt bzw. 33nt je nach Verwendung von T7 oder SP6-Polymerase) der Vektorsequenz eine effektive Bindung der Ribosomen. Von diesen Vektorsequenzen ist keine Beeinflussung der Translationsrate bekannt.

In Abb. 8 ist die in vitro Translation der Konstrukte im Weizenkeimlysat dargestellt. Die Reihenfolge der aufgetragenen Ansätze entspricht der in Abb.7.

Abb. 8: In vitro Translation der TCTP-mRNA1 und 2 und ihrer Deletionsvarianten im Weizenkeimlysat:

In Bahn (1) und (2) sind die Proben mit den beiden vollständigen mRNAs aufgetragen. Es folgt in Bahn (3) die Translation der (-3’UTR)-Deletionsvariante. Bahn (4) und (5) zeigen die Translation der (-5’UTR)-Konstrukte und in Bahn (6) das Ergebnis des Konstrukts, das nur noch den kodierenden Bereich darstellt.

Die mRNA1 wird im Weizenkeimlysat gut translatiert (Bahn 1). Eine Translation der mRNA2 findet jedoch auch hier nicht statt (Bahn 2). Das trifft auch für die (-3’UTR)-Variante zu (Bahn 3). Die (-5’UTR)-Variante der mRNA1 (Bahn 4) ist wiederum gut translatierbar, wohingegen [Seite 43↓]das gleiche Konstrukt der mRNA2 (Bahn 5) nicht translatiert wird. Bei Fehlen aller UTRs findet auch im Weizenkeimsystem eine gute Translation statt (Bahn 6). Die Hemmung der Translation der mRNA1 durch ihre 5’UTR ist im Weizenkeimsystem nicht zu beobachten. Die Proteinfaktoren, die diese Hemmung im Retikulozytenlysat vermitteln, scheinen im Weizenkeim nicht enthalten bzw. nicht aktiv zu sein. Jedoch ist auch hier die Bindung von Faktoren an die 3’UTR2 von Bedeutung, denn die mRNA2 ist hier ebenso wie im Retikulozytenlysat translationell inaktiv. Das trifft auch für die (-5’UTR)-Variante dieser mRNA zu.

Bei derartigen in vitro Translationsexperimenten betrachtet man die Übersetzung einer exogen zugeführten mRNA. Da die verwendeten Zelllysate mit Nuklease behandelt wurden, kann es nicht zu Wechselwirkungen verschiedener mRNAs kommen, die intrazellulär vorkommen und die Translationsrate beeinflussen. Zudem sind diese Untersuchungen auf die beiden verwendeten Zellsysteme limitiert. Um Aussagen über das Verhalten der TCTP-mRNA und ihrer Deletionsvarianten in vivo zu treffen, wären an dieser Stelle weiterführende Untersuchungen in kultivierten Zellen möglich. Hierfür eignen sich insbesondere Xenopus-Oocyten, in die sich auf Grund ihrer Größe mRNA gut injizieren lässt. Es besteht weiterhin die Möglichkeit, mit Hilfe von Reporter-Gen-Konstrukten den Einfluss von einzelnen Abschnitten einer mRNA auf die Translation des Reporter-Gens, wie zum Beispiel der Luciferase, zu untersuchen. Dazu werden Kulturzellen (z.B. HeLa-Zellen) mit dem entsprechenden Plasmid transfiziert und die Höhe der Luciferase-Expression durch Bestimmung ihrer enzymatischen Aktivität ermittelt.

Die hauptsächliche thematische Ausrichtung dieser Arbeit lag jedoch in der genaueren Untersuchung und Identifizierung von Proteinen, die über eine Bindung an die untranslatierten Regionen der TCTP-mRNA an der Beeinflussung der Translationseffektivität beteiligt sind. Daher dienten die oben gezeigten Experimente in erster Linie dazu, den Einfluss der einzelnen UTR-Abschnitte auf die Hemmung der Translation der TCTP-mRNA zu bestimmen. Besonders hervorzuheben ist in diesem Zusammenhang die besondere Bedeutung der 3’UTR2 für die Translation der TCTP-mRNA2. Die 3’UTR2 stellt folglich zusammen mit der 5’UTR einen Bereich dar, dem in den im Folgenden dargestellten Untersuchungen ein besonderes Interesse zuteil wurde.


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4.1.2  Proteinbindungsstudien an den untranslatierten Regionen der TCTP-mRNA

Electromobility Shift Assays

Nachdem die in vitro Translationsexperimente gezeigt hatten, dass für die translationelle Repression der TCTP-mRNA ihre untranslatierten Regionen von Bedeutung sind, sollte geklärt werden, ob sich in diesen Sequenzbereichen die Bindung von Proteinen nachweisen lässt. Hierfür mussten zunächst wieder Plasmidkonstruktionen hergestellt werden, die die jeweiligen untranslatierten Abschnitte der mRNA enthalten. Die untranslatierten Bereiche der Kaninchen-TCTP-mRNA (5’UTR, 3’UTR1, 3’UTR2, 3’UTR1+2) wurden mittels PCR amplifiziert und in den PCRII-TOPO-Vektor (Invitrogen) kloniert. In Abb. 9 sind die entsprechenden Konstrukte dargestellt.

Abb. 9: Subklonierung der untranslatierten Regionen der TCTP-mRNA:

Die untranslatierten Bereiche der TCTP-mRNA des Kaninchens wurden aus der TCTP-mRNA2 per PCR amplifiziert und in den PCRII-TOPO-Vektor kloniert. (1)=5’UTR (116 nt), (2)=3’UTR1 (211 nt), (3)=3’UTR2 (320 nt), (4)=3’UTR1+2 (531 nt)

Die durchgeführten Proteinbindungsstudien wurden angelehnt an das Protokoll von Leibold und Munro (Leibold und Munro 1988) durchgeführt. Für Electromobility Shift Assays (EMSA) wurden die [a32P]-markierten in vitro Transkripte der untranslatierten Regionen mit Proteinextrakten ausgewählter Kaninchengewebe inkubiert. Zur Vermeidung unspezifischer RNA-Protein-Wechselwirkungen wurde den Ansätzen eine RNA aus einem heterologen System (E. coli) zugesetzt, die sich durch eine hohe Proteinaffinität (ribosomale RNA) auszeichnet (Ostareck-Lederer et al. 1994). Im Anschluss an die Inkubation wurde zudem Heparin zugesetzt, das unspezifisch gebundene Proteine von der RNA freisetzt. Die RNA-Proteinkomplexe wurden anschließend in einer nicht-denaturierenden Polyacrylamid-Gelelektrophorese aufgetrennt und autoradiographisch dargestellt (Konarska und Sharp 1986). Die Bildung eines Komplexes aus RNA und Protein ist im Autoradiogramm sichtbar durch eine Verzögerung der [Seite 45↓]Laufgeschwindigkeit dieses Komplexes (Shift) im Vergleich zur nicht an Protein gebundenen freien RNA.

Das TCTP war in allen bisher untersuchten Geweben nachweisbar. Es bestehen jedoch Unterschiede in der Höhe der Expression. Besonders interessant erscheint hierbei wiederum der Aspekt, dass in allen Geweben beide verschieden lange mRNAs vorliegen. Ihr Verhältnis zueinander variiert jedoch von Gewebe zu Gewebe. Somit sollte geprüft werden, ob sich derartige Differenzen der Expression auch in der Bindung unterschiedlicher Proteinfaktoren an die beiden Abschnitte der 3’UTR widerspiegeln. Für die Proteinbindungsstudien wurden daher Extrakte aus Kaninchen-Leber, -Lunge, -Niere und -Retikulozyten verwendet. Nach der Homogenisation wurden Zellorganellen und Membranbruchstücke bei 10 000x g abzentrifugiert. Für die Proteinbindungsstudien wurden die cytosolischen Überstände (S10) verwendet, in denen sowohl Polysomen als auch mRNP-Komplexe enthalten sind. Die Abb. 10 zeigt das Autoradiogramm eines solchen Experiments.

Abb. 10: EMSA der UTRs der TCTP-mRNA:

[a32P]-markierte in vitro Transkripte der vier UTRs der TCTP-mRNA wurden mit S10-Lysaten verschiedener Kaninchen-Gewebe inkubiert. Die Bildung von RNA-Protein-Komplexen ist sichtbar durch die verzögerte Laufgeschwindigkeit der Komplexe im Vergleich zur freien ungebundenen RNA (Bahn 1, 5, 9, 13). 1-4=5’UTR, Bahn 5-8=3’UTR1, Bahn 9-12=3’UTR2, Bahn 13-16=3’UTR1+2, Inkubation mit Lungenextrakt (Bahn 2, 6, 10, 14), Leberextrakt (Bahn 3, 7, 11, 15), Nierenextrakt (Bahn 4, 8, 12, 16)


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Im Vergleich zum Transkript der 5’UTR ohne Zugabe eines Proteinextrakts (Bahn 1) zeigt sich bei Zugabe eines Extrakts aus Kaninchenlunge ein deutlicher Shift (Bahn 2). Auch bei Zugabe eines Leberextrakts (Bahn 3) bzw. eines Nierenextrakts (Bahn 4) zeigt sich eine Komplexbildung. Die Unterschiede in der Gestalt der RNA-Protein-Komplexe sind ein starker Hinweis auf eine verschiedenartige Zusammensetzung der Komplexe in den einzelnen Geweben. Das kann zum einem durch unterschiedliche Proteine, die mit der mRNA wechselwirken, bedingt sein. Zum anderen haben auch die molaren Verhältnisse von RNA zu Protein einen Einfluss auf die Gestalt der Shift-Komplexe, so dass auch Differenzen in der Höhe der Expression der RNA-bindenden Proteine die unterschiedliche Konfiguration der Komplexe hervorrufen können.

Die Komplexe der 3’UTR1 mit Proteinen aus Lunge (Bahn 6), Leber (Bahn 7) und Niere (Bahn 8) im Vergleich zur freien Probe (Bahn 4) stellen sich in etwa gleich dar, was auf eine ähnliche Zusammensetzung in diesen Geweben hindeutet. Die Inkubation der 3’UTR2 mit einem Leberextrakt (Bahn 11) führt zu einer stärkeren Verzögerung der Laufgeschwindigkeit als die Inkubation mit einem Lungenextrakt (Bahn 10), verglichen mit der ungebundenen RNA (Bahn 9). Der Komplex aus Nierenextrakt und 3’UTR2 (Bahn 12) entspricht in seiner Ausprägung dem in Bahn 10 (Inkubation mit Lungenextrakt). Die RNA-Protein-Komplexe aus der gesamten 3’UTR und den Proteinen aus Lunge (Bahn 14), Leber (Bahn 15) und Niere (Bahn 16) grenzen sich deutlich zum ungebundenen Transkript in Bahn 13 ab. Die Abgrenzung der einzelnen Komplexe zueinander ist jedoch aufgrund der Länge des Transkriptes und der damit verbundenen kurzen Laufstrecke in der Elektrophorese schwierig. Somit zeigt sich, dass an alle untranslatierten Regionen der TCTP-mRNA ein oder mehrere Proteine binden. Die Ergebnisse legen nahe, dass die Zusammensetzung der Shift-Komplexe sich zwischen den einzelnen Geweben stark unterscheidet.

Um die Sequenzspezifität der Proteinbindung in den Shift-Komplexen nachzuweisen, wurden Kompetitionsexperimente durchgeführt, bei denen dem EMSA-Ansatz verschiedene Mengen nicht-markierten Transkripts zugegeben werden. An das im Überschuss vorhandene nicht-markierte Transkript binden ebenfalls die spezifischen Proteinfaktoren, so dass für die Bindung an die radioaktiv markierte RNA nicht mehr genügend Protein zur Verfügung steht. Im Autoradiogramm zeigt sich dann eine Veränderung der Shift-Komplexe.

Die Kompetitionsexperimente in Abb. 11 wurden beispielhaft für die 3’UTR der TCTP-mRNA [Seite 47↓]mit Extrakten aus Kaninchen-Lunge und Leber durchgeführt. In den Verdrängungsversuchen wurde eine dem markierten Transkript äquimolare Menge (2,5ng) und in einem weiteren Ansatz ein Überschuss (500ng) des nicht-markierten Transkripts der 3’UTR beigemischt. Eine weitere Probe enthielt eine heterologe Kompetitor-RNA der Glühwürmchen-Luciferase im Überschuss.

Abb. 11: EMSA-Kompetitions-Experiment an der 3’UTR:

Ein radioaktiv markiertes Transkript der 3’UTR wurde mit Extrakten aus Lunge (Bahn 1-5) und Leber (Bahn 6-10) sowie verschiedenen unmarkierten Transkripten als Kompetitor inkubiert. Bahn 1 und 6=freie Probe, Bahn 2 und 7=RNA-Protein-Komplexbildung ohne Kompetitor, Bahn 3 und 8=äquimolare Menge unmarkiertes 3’UTR-Transkript als Kompetitor, Bahn 4 und 9=200-fache Menge an unmarkiertem 3’UTR-Transkript als Kompetitor, Bahn 5 und 10=200fache Menge Luciferase-Transkript als Kompetitor

In der Abbildung zeigen Bahn 1 und 6 die freie Probe der 3’UTR ohne Zugabe von Proteinextrakt und Kompetitor-RNA. In Bahn 2 und 7 sind jeweils deutliche Shift-Komplexe nach Zugabe von Proteinen aus Lunge und Leber zu sehen. Diese Bahnen entsprechen den Bahnen 14 und 15 der Abb. 10. In Abb. 11 wurden die Elektrophorese-Bedingungen für die verhältnismäßig lange 3’UTR (531 nt) optimiert, so dass sich hier deutlichere Unterschiede der Shift-Komplexe mit Proteinen aus Lunge und Leber darstellen.

Die Zugabe einer äquimolaren Menge des nicht-markierten Transkripts führt nicht zu einer Veränderung der Shift-Komplexe (Bahn 3 und 8). Gibt man jedoch nicht-markierte RNA im Überschuss hinzu, verändert sich der Komplex und es kommt zu einer unvollständigen Unterdrückung der Komplexbildung, sichtbar durch eine Veränderung der Shift-Komplexe (Bahn 4 und 9). Nach Zugabe derselben Menge der heterologen Kompetitor-RNA ändert sich die [Seite 48↓]Konfiguration der Shift-Komplexe nicht in dieser Weise. Somit lässt sich aus diesen Versuchen ableiten, dass die Bindung von Proteinfaktoren aus Kaninchen-Lunge und Leber an die 3’UTR der TCTP-mRNA sequenzspezifisch ist.

Die Aussagekraft des Experiments bezüglich eines Vergleichs der Komplexe aus verschiedenen UTRs und ihren gebundenen Proteinen ist auf Grund der Größenunterschiede der UTRs und den daraus folgenden Laufeigenschaften eingeschränkt. Um hier weitere Aussagen treffen zu können, ist die Darstellung der bindenden Proteine in UV-Crosslinking-Experimenten notwendig.

Vergleicht man Electromobility Shift Assays von radioaktiv markierten DNA- und RNA-Abschnitten, ist augenfällig, dass die Banden aus RNA-Proteinkomplexen sich unschärfer begrenzt und insgesamt diffuser darstellen. Das ist zum Teil durch stärkere Abbauvorgänge durch RNasen zu erklären. Dieser Effekt lässt sich jedoch durch den Einsatz von RNase-Inhibitoren minimieren. Die verwendeten UTR-Transkripte der TCTP-mRNA hatten eine erhebliche Länge (116-531nt), so dass Sekundärstrukturen innerhalb der RNA-Moleküle einen besonderen Einfluss auf die Gestalt der Shift-Komplexe hatten. Durch einen Denaturierungsschritt vor der Inkubation mit Proteinextrakt ließ sich dieser Einfluss verringern. Jedoch war die erhaltene native Struktur durchaus beabsichtigt, da die Sekundärstruktur einer RNA wichtig für die Erkennung durch RNA-bindende Proteine ist. Größe und Gestalt der RNA-Protein-Komplexe lassen vermuten, dass in den Komplexen jeweils mehrere Proteine enthalten sind. Dies lässt sich ebenfalls durch UV-Crosslinking-Experimente klären. So genannte Supershift-Experimente mit spezifischen Antikörpern zur Identifizierung von Proteinfaktoren sind für RNA-bindende Proteine derzeit noch schwer zu konzipieren, da die Vorhersage von RNA-Protein-Wechselwirkungen aus Sequenzmotiven nur selten möglich ist.

UV-Crosslinking-Experimente

In UV-Crosslinking-Experimenten (Leibold und Munro 1988, Ostareck-Lederer et al. 1994) wurden [a32P]–markierte in vitro Transkripte der untranslatierten Regionen analog zu den Electromobility Shift Assays mit S10-Extrakten aus Kaninchengeweben inkubiert. Während der Heparin-Inkubation wurden die Proben mit einer UV-Lampe (λ=254nm) bestrahlt, was zu einer kovalenten Vernetzung der RNA-Protein-Bindungen führt. Diese Bindungen schützen den bindenden Bereich der RNA nach dem UV-Crosslinking vor dem Abbau durch RNase A und T1. Die durch die gebundene RNA markierten Proteine werden in einem denaturierenden Polyacrylamidgel (SDS-PAGE) aufgetrennt und autoradiographisch dargestellt. Proteine, die [Seite 49↓]unspezifisch an die RNA binden, führen nicht in dem Maße zu einer stabilisierenden Wechselwirkung, und der betroffene RNA-Abschnitt ist somit nach dem UV-Crosslinking nicht vor einem RNase-Abbau geschützt. Mit dieser Art von Versuchen kann man die RNA-bindenden Proteine der Shift-Komplexe bezüglich Anzahl und Molekulargewicht charakterisieren. Diese Experimente lassen daher auch Aussagen über die bindenden Proteine an die verschiedenen Bereiche der TCTP-mRNA sowie über gewebespezifische Unterschiede zu.

In Abb. 12 sind die Ergebnisse eines UV-Crosslinking-Experiments an die vier untranslatierten Abschnitte der TCTP-mRNA mit Extrakten aus verschiedenen Kaninchengeweben dargestellt. Die Proteinmuster der verschiedenen UTRs und der eingesetzten Extrakte zeigen deutliche Unterschiede. Wie schon nach den Electromobility Shift Assays vermutet, binden jeweils mehrere Proteine an die UTRs.

Abb. 12: UV-Crosslinking Experiment der vier UTRs der TCTP-mRNA:

[a32P]-markierte Transkripte der 5’UTR (Bahn 1 bis 5), 3’UTR1 (Bahn 6-10), 3’UTR2 (Bahn 11-14) und 3’UTR1+2 (Bahn 15-18) wurden mit S10-Extrakten aus Kaninchengeweben inkubiert: Lunge Bahn 2, 7,16; Leber Bahn 3, 8, 12, 17; Niere Bahn 4, 9, 13; Retikulozyten Bahn 5, 10, 14, 18. Ohne Zusatz eines Proteinextraktes (Bahn 1, 6, 11, 15) sind keine Proteine darstellbar. Das Molekulargewicht der kreuzvernetzten Proteine wurde durch Vergleich mit einem Proteinmarker abgeschätzt, und die Proteine wurden entsprechend ihrer Größe als p22 bis p80 bezeichnet.


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Ohne Zugabe eines Proteinextraktes zum [a32P]-markierten in vitro Transkript der 5’UTR (Bahn 1), der 3’UTR1 (Bahn 6), der 3’UTR2 (Bahn 11) und der 3’UTR1+2 (Bahn 15) kommt es nicht zum Auftreten von Banden im Autoradiogramm. Nach Inkubation des in vitro Transkripts der 5’UTR mit Proteinextrakten aus Kaninchen-Lunge (Bahn 2), Leber (Bahn 3), Niere (Bahn 4) und Retikulozyten (Bahn 5) sind in allen vier Bahnen drei Proteine von 25 kD, 32 kD und 40 kD (p25-p40) nachweisbar. Das Protein von 40 kD ist nach Zugabe des Nierenextraktes (Bahn 4) nur sehr schwach nachweisbar. Das deutet auf eine geringere Konzentration oder Aktivität dieses Proteins in der Niere hin. Im Retikulozyten-Lysat (Bahn 5) wird noch ein weiteres Protein von 43 kD (p43) gebunden.

An die 3’UTR1 binden im Lungenextrakt (Bahn 7) drei Proteine p38, p50 und p68. Nach Inkubation dieser UTR mit einem Leberextrakt (Bahn 8) binden Proteine mit einem Molekulargewicht von 40 kD und 68 kD (p40 und p68). Nach Zugabe des Nierenextrakts zu diesem Bereich der 3’UTR (Bahn 9) sind drei Proteine von 22 kDa, 25 kD und 38 kD (p22-p38) nachweisbar. In Bahn 10 stellen sich nach Zugabe von Retikulozytenlysat zwei Proteine p43 und p50 dar.

Die Inkubation der 3’UTR2 mit einem Extrakt aus Kaninchen-Leber (Bahn 12) zeigen sich drei Proteinbanden (p40, p42 und p68), mit einem Extrakt aus Lunge zeigen sich 6 Banden (p25, p28, p30, p40, p42, p50) und mit einem Extrakt aus Retikulozyten sind zwei Proteine (p43 und p50) nachweisbar.

Inkubiert man die Transkripte der kompletten 3’UTR mit Lysaten aus Lunge (Bahn 16) und Retikulozyten (Bahn 18), ähneln die Bandenmuster denen nach Inkubation der 3’UTR1 (Bahn 6, 10 und 14), jedoch stellen sich die an die komplette 3’UTR bindenden Proteine mit einem höheren Molekulargewicht dar (Lunge: p42, p68 und p80, Retikulozyten: p48 und p68). Aus Leberextrakt binden an dieses Transkript drei Proteine (p30, p32 und p80).

Der Nachweis der Sequenzspezifität und Stabilität der Proteinbindung erfolgte in Kompetitionsexperimenten analog zu den Electromobility Shift Assays. In Abb. 13 ist ein solches Experiment dargestellt.

Es wurde das radioaktiv markierte Transkript der 3’UTR und Retikulozytenlysat verwendet. Die Bahn 1 der Abb. 13 entspricht somit Bahn 18 in der Abb. 12. Aufgrund der für diese Banden optimierten Belichtungszeit sind die Banden im Kompetitions-Experiment deutlicher zu erkennen.

Es stellen sich wiederum die beiden Proteine p48 und p68 dar, deren Auftreten sich durch [Seite 51↓]Zugabe des unmarkierten Transkripts der 3’UTR im Überschuss weitgehend unterdrücken lässt (Bahn 3). Eine äquimolare Menge des unmarkierten Transkripts (Bahn 2) sowie der heterologen Kompetitor-RNA (Luciferase-mRNA) rufen diesen Effekt nicht hervor (Bahn 4). Bei Zugabe der Luciferase-mRNA im Überschuss (Bahn 5) lässt sich das Auftreten der Banden nicht in dem Maße unterdrücken. Eine Sequenzspezifität ist somit wahrscheinlich.

Abb. 13: UV-Crosslinking-Kompetitions-Experiment an der 3’UTR:

Ein radioaktiv markiertes Transkript der 3’UTR wurde mit Retikulozytenlysat und verschiedenen unmarkierten Transkripten als Kompetitor inkubiert. Bahn 1=RNA-Protein-Komplexbildung ohne Kompetitor, Bahn 2=äquimolare Menge unmarkiertes 3’UTR-Transkript als Kompetitor, Bahn 3=100-fache Menge an unmarkiertem 3’UTR-Transkript als Kompetitor, Bahn 4=äquimolare Menge unmarkiertes Luciferase-Transkript als Kompetitor, Bahn 5=100fache Menge Luciferase-Transkript als Kompetitor

Diese UV-Crosslinking Experimente erlauben lediglich Aussagen über die Anzahl der RNA-bindenden Proteine und über ihr ungefähres Molekulargewicht. Eine Identifizierung der bindenden Faktoren ist mit diesem Verfahren nicht möglich. Die Proteine sind durch die gebundene radioaktiv markierte RNA dargestellt, die nur in geringem Maße (~2kD) zum Molekulargewicht beiträgt. Es ist auch nicht auszuschließen, dass es sich bei Proteinen, die sich in diesen Experimenten mit demselben Molekulargewicht darstellen, um unterschiedliche Proteine handelt. Auf der anderen Seite ist es auch möglich, dass es sich bei Banden, die sich unterschiedlich darstellen, um ein Protein handelt, das durch posttranslationelle Modifizierung, [Seite 52↓]wie zum Beispiel eine Phosphorylierung, verändert wurde. Genauere Aussagen hierüber sind letztlich nur über eine Proteinidentifizierung möglich.


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4.1.3  Anreicherung von UTR-bindenden Proteinen in der RNA-Affinitätschromatographie

Um die an die TCTP-mRNA bindenden Proteine identifizieren zu können, wurde für ihre Anreicherung und Isolierung ein affinitätschromatographischer Ansatz gewählt (Rouault et al. 1989, Ostareck et al. 1997). Dazu wurden Biotin-markierte Transkripte der 5’UTR und 3’UTR an Streptavidin-Agarose gebunden und anschließend mit Kaninchen-Retikulozytenlysat inkubiert. Danach wurden die Streptavidin-Agarose-Partikel mehrfach mit einem Puffer niedriger Salzkonzentration (0,15 M KCl) gewaschen, um unspezifisch gebundene Proteine zu entfernen. Die Elution der spezifisch an den jeweiligen UTR-Abschnitt gebundenen Proteine erfolgte schließlich mit Hochsalzpuffern (1 M KCl, 3 M KCl, 8 M Urea).

Das für die RNA-Affinitätschromatographie verwendete Kaninchen-Retikulozytenlysat wurde im Gegensatz zu dem Lysat, das bei den in vitro Translationsexperimenten eingesetzt wurde, nicht mit Mikrokokken-Nuklease vorbehandelt. Die Proteinfaktoren, die in den in vitro Translationsexperimenten eine Hemmung hervorgerufen haben, sind in dem für die RNA-Affinitätschromatographie verwendeten Lysat somit vorhanden und sollten sich mit dem affinitätschromatographischen Verfahren anreichern lassen. Wechselwirkungen zwischen verschiedenen mRNAs und Kompetition um bindende Faktoren, wie sie in der Zelle auftreten, sind wegen der endogen im Retikulozytenlysat vorhandenen mRNAs durchaus möglich.

Da die in vitro Translationsexperimente einen ausgeprägten hemmenden Einfluss der 5’UTR und der langen 3’UTR auf die Translation der TCTP-mRNA gezeigt hatten, wurden in der RNA-Affinitätschromatographie Biotin-markierte Transkripte dieser UTR-Bereiche eingesetzt (Konstrukt 1 und 4 in Abb. 9). In der Abb. 14 ist die Analyse der gewonnenen Proteinfraktionen in einem mit Silber gefärbten SDS-Polyacrylamid-Gel dargestellt.

Da es sich bei der Silberfärbung um eine sehr sensitive Färbemethode handelt, sind in der Abbildung sehr viele Proteinbanden zu sehen. Bei der Analyse wurden daher die deutlichsten Kandidaten ausgewählt. Nach dem letzten Waschschritt (Bahn 2 und 5) sind im Eluat nur noch Spuren von Proteinen nachweisbar. Unspezifisch gebundene Proteine wurden somit entfernt. Im Vergleich zum Proteinmuster des Retikulozytenlysates in Bahn 1 und 6 zeigen sich nach der Elution mit 1 M KCl einige neue und deutliche Banden, die sich auch in den Eluaten mit 3 M KCl und 8 M Urea nachweisen lassen. Keine der Banden des Retikulozytenlysats (Bahn 1 und 6) sind in den eluierten Proteinfraktionen (Bahn 3-5 und Bahn 8-10) wieder zu finden. Das spricht für eine Elution spezifisch an die UTRs gebundener Proteine.


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Abb. 14: Anreicherung der TCTP-mRNA bindenden Proteine durch RNA-Affinitätschromatographie:

Biotin-markierte in vitro Transkripte der 5’UTR (Bahn 1-5) und 3’UTR (Bahn 6-10) wurden an Streptavidin-Agarose gebunden und mit Retikulozytenlysat inkubiert. Nach fünfmaligem Waschen mit 0,15 M KCl-Puffer, Bahn 1 und 6=Waschschritt 1, Bahn 2 und 7=Waschschritt 5, wurden die gebundenen Proteine mit 1 M KCl (Bahn 3 und 8), 3 M KCl (Bahn 4 und 9) und 8 M Urea eluiert. Die Proteinfraktionen wurden in einem 15%igen SDS-Polyacrylamid-Gel aufgetrennt und mit Silber gefärbt. Die spezifisch gebundenen Proteine sind hervorgehoben und entsprechend ihrem Molekulargewicht als p22-p90 bezeichnet.

In der Silberfärbung lassen sich eine Reihe von Proteinen anfärben, die an die 5’UTR binden. Die sechs markantesten Banden wurden entsprechend ihrem Molekulargewicht als p25, p34, p43, p68, p80 und p85 bezeichnet. In den Eluaten, die nach Bindung an die 3’UTR gewonnen wurden, stellen sich sieben wesentliche Proteine dar: p22, p28, p32, p40, p68, p80 und p90. Dabei stellen sich einige dieser Banden als Doppelbanden dar. Es kann sich dabei um verschiedene Proteine mit ähnlichem Molekulargewicht oder um posttranslationell modifizierte Formen eines Proteins handeln.

Ein direkter Vergleich mit den UV-Crosslinking-Experimenten ist aus verschiedenen Gründen [Seite 55↓]nur bedingt möglich. Ein wesentlicher Unterschied besteht in den molaren Verhältnissen von Transkript zu Proteinen. Während beim UV-Crosslinking nur sehr geringe Mengen Transkript (~15ng) eingesetzt werden, verwendet man in der RNA-Affinitätschromatographie einen Überschuss an Transkript (~3-5μg). Das Bindungsgleichgewicht verschiebt sich zu Gunsten des RNA-Protein-Komplexes, so dass sich mehr Protein für eine spätere Identifizierung isolieren lässt.

Im Gegensatz zu den UV-Crosslinking-Experimenten kommt es bei der RNA-Affinitätschromatographie nicht zu einer kovalenten Vernetzung von RNA und Proteinen. Es kann bei der RNA-Affinitätschromatographie auch zur Anreicherung von Proteinen kommen, die nicht unmittelbar an die RNA binden, sondern vielmehr mit den direkt bindenden Proteinen in Wechselwirkung treten. Das Auftreten von zusätzlichen Banden lässt sich auf diese Weise erklären. Beim UV-Crosslinking werden die Laufeigenschaften der Proteine zudem, wenn auch nur zu einem geringen Anteil (~2kD), durch die kovalent gebundenen radioaktiv markierten Nukleotide beeinflusst. Die Intensität der Banden ist beim UV-Crosslinking neben der Proteinmenge auch abhängig davon, wie viel Radioaktivität gebunden wird, d.h. wie groß das Motiv in der mRNA ist, an dem die Bindung stattgefunden hat. Eine zusätzliche Schwierigkeit der RNA-Affinitätschromatographie besteht weiterhin darin, dass durch den Einsatz der Streptavidin-Agarose-Partikel die Wahrscheinlichkeit unspezifisch gebundener Proteine zunimmt. Die Abgrenzung der spezifisch gebundenen Proteine ist jedoch durch Vergleich der Eluate verschiedener UTR-Abschnitte möglich.

Unter Berücksichtigung dieser Überlegungen ist anzunehmen, dass es sich bei den in der RNA-Affinitätschromatographie isolierten Proteinen p25, p34 und p43 um die beim UV-Crosslinking an die 5’UTR bindenden Proteine p25, p32 und p43 handelt. Ebenso trifft dies für das Protein p68 zu, das an die 3’UTR bindet.

Da die in vitro Translationsexperimente erstmals einen markanten Einfluss der 3’UTR auf die Translation der TCTP-mRNA gezeigt hatten, wurden die Coomassie-gefärbten Banden der 3’UTR bindenden Proteine p68 und p90 aus dem Gel ausgeschnitten. Um Aufschluss über ihre Identität zu erhalten, wurden ihre Fragmente nach tryptischen Verdau mittels MALDI-TOF-Massenspektrometrie analysiert. Allerdings ließen sich die Spektren der tryptischen Fragmente der angereicherten Proteine nach Suchen in Datenbanken keiner bekannten Proteinsequenz zuordnen. Leider sind die vorhandenen Daten zu Kaninchen-Proteinen nicht so umfangreich wie beispielsweise für humane Proteine. Es erwies sich daher als sinnvoll, zur Identifizierung der bindenden Proteine diese Ergebnisse durch Experimente mit humanen Zellextrakten zu ergänzen.


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4.2  Translationelle Regulation der TCTP-mRNA in Melanomzellen

4.2.1 Nachweis der veränderten TCTP-Expression in chemosensiblen und chemoresistenten Melanomzellen

Die Untersuchungen von Sinha et al. haben gezeigt, dass es bei der Ausbildung einer Chemoresistenz der Melanomzelllinie MeWo zu einer ausgeprägten Expressionssteigerung des TCTP kommt (Sinha et al. 2000). Diese Ergebnisse beruhten auf der Analyse von 2D-Gelelektrophoresen, so dass die Expressionsunterschiede somit auf Proteinniveau beschrieben wurden. Die Menge an vorhandenem Protein ist das Ergebnis eines Zusammenspiels von Synthese- und Abbauvorgängen. Die Synthese wiederum kann sowohl auf der Ebene der Transkription als auch auf der Ebene der Translation beeinflusst werden. In einem ersten Schritt wurde daher die Bedeutung dieser beiden Regulationsebenen für die beobachtete Expressionssteigerung untersucht.

Zu diesem Zweck eignete sich die vergleichende Analyse von parallel durchgeführten Northern und Western Blot-Untersuchungen. Dazu wurden diejenigen Cytostatika (Cisplatin und Etoposid) ausgewählt, die in der Arbeit von Sinha et al. zu den markantesten Expressionsanstiegen führten. Die Analyse des Northern Blots in Abb. 15 zeigt Expressionsunterschiede zwischen sensiblen und resistenten Melanomzellen auf mRNA-Ebene.

Abb. 15: Northern Blot mit mRNA aus chemosensiblen und chemoresistenten Melanomzellen:

Die Hybridisierung wurde mit einer Sonde durchgeführt, die den gesamten Bereich der TCTP-mRNA2 umfasste. Die Positionen der mRNA1 (843nt) und der mRNA2 (1163nt) sind mit Pfeilen markiert. Zur Kalibrierung wurde die Ethiumbromid gefärbte 18S-Bande verwendet. Eine ausführliche Beschreibung der Zelllinien und ihrer Bezeichnungen findet sich im Abschnitt 3.2.10.

Man erkennt jeweils ein deutliches Signal bei rund 0,8 kb und ein sehr schwaches Signal bei etwa 1,2 kb, die den beiden alternativen Transkripten der TCTP-mRNA entsprechen. [Seite 57↓]Interessanterweise ist die mRNA2 in den Melanomzelllinien nur in geringem Maße nachzuweisen. Gleicht man die Signale nach der Hybridisierung mit der Ethiumbromid gefärbten 18S-Bande ab, findet man ausgeprägte quantitative Unterschiede der mRNA1 zwischen den einzelnen Melanomzelllinien.

Der Zusatz von Cisplatin führt bei der sensiblen Zelllinie MeWo zu einer Steigerung der TCTP-Transkription (Bahn 2) im Vergleich zu unbehandelten MeWo-Zellen (Bahn 1). Selbst wenn der Cisplatin-resistente Abkömmling MeWo CIS in einem Medium wächst, das nur soviel Cisplatin enthält wie zur Aufrechterhaltung der Resistenz notwendig ist, ist die TCTP-mRNA-Menge (Bahn 4) deutlich erhöht. Dieser Effekt lässt sich nicht allein durch eine allgemeine Reaktion auf einen Stimulus, in diesem Falle das Cytostatikum erklären, sondern spricht für eine konstitutionelle Veränderung auf Transkriptionsebene bei der Ausbildung der Chemoresistenz. Bei einer höheren Cisplatin-Konzentration (Bahn 5) ist kein weiterer Anstieg der mRNA-Menge zu beobachten.

Bei Etoposid verhält es sich ähnlich. In einem Medium mit hoher Konzentration an Cytostatikum ist sowohl bei den sensiblen (Bahn 3) als auch bei den resistenten Zellen (Bahn 7) vergleichsweise wenig mRNA nachzuweisen. Beim Etoposid-resistenten Abkömmling (Bahn 6) kommt es jedoch ebenfalls zu einer gesteigerten Transkription. Die Abnahme der Transkriptionsrate bei Zusatz einer größeren Menge an Etoposid ist möglicherweise durch eine Beeinträchtigung der DNA-Funktion durch den Topoisomerase II-Hemmer zu erklären.

Die vorhandene mRNA-Menge, die in Northern Blots nachgewiesen werden kann, spiegelt nicht nur eine Steigerung der Transkription wider, sondern kann auch durch eine Stabilisierung der mRNA bedingt sein. Auch wenn für die TCTP-mRNA bisher keine besondere Stabilisierung beschrieben wurde, sollte man diesen Aspekt nicht außer Acht lassen. Aufschluss hierüber kann man letztlich nur durch die genaue Aufklärung der Regulationsvorgänge auf transkriptioneller und posttranskriptioneller Ebene erhalten.

Für Western Blot-Untersuchungen wurden Proteinextrakte derselben Zellen verwendet, aus denen auch die RNA für den Northern Blot extrahiert wurde. Die Abb. 16 präsentiert die Darstellung der Expressionsunterschiede auf Proteinniveau. Die Reihenfolge der aufgetragenen Proben ist dieselbe wie in Abb. 15. Man erkennt bei allen untersuchten Zelllinien ein deutliches TCTP-Signal bei rund 23 kD. Es wurde von jeweils gleichen Gesamtproteinmengen ausgegangen. Zu berücksichtigen ist dennoch, dass die Aussagekraft des Western Blots limitiert ist, da keine Kalibrierung mit Antikörpern gegen Haushaltsgene durchgeführt wurde.


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Abb. 16: Western Blot mit Proteinen aus chemosensiblen und chemoresistenten Melanomzellen:

Der TCTP-Nachweis wurde mit einem Kaninchen-Anti-Maus-TCTP-Antikörper durchgeführt, der auch mit humanem TCTP reagiert. Es zeigt sich ein deutliches TCTP-Signal bei etwa 23 kD.

Augenfällig ist, dass die Expression auf Proteinebene nicht so große Unterschiede zeigt wie auf mRNA-Niveau. Analog zu den Ergebnissen von Sinha et al. ist die TCTP-Expression in der chemosensiblen Zelllinie MeWo am geringsten. Die TCTP-Konzentration in den anderen Zelllinien liegt deutlich darüber. Im Gegensatz zum Northern Blot lassen sich bei den chemoresistenten Abkömmlingen auf Proteinniveau keine wesentlichen Expressionsunterschiede mehr nachweisen. Die TCTP-Konzentration in den Etoposid-resistenten Zellen ist etwas geringer als in den Cisplatin-resistenten Zellen.

Im Vergleich zum präsentierten Northern Blot sind zwei wesentliche Unterschiede augenfällig. Erstens steht der mRNA-Menge in den chemosensiblen Zellen ohne Cytostatikum (Bahn 1) eine vergleichsweise geringe Menge an Protein im Western Blot gegenüber. Die vorhandene mRNA scheint in diesen Zellen in einem translationsinaktiven Zustand vorzuliegen. Zweitens ist der Unterschied an vorhandener mRNA bei den resistenten Zellen mit und ohne Cytostatikum auf Proteinebene nicht mehr nachweisbar. Neben der Regulation auf transkriptioneller Ebene, die in den Northern Blots gezeigt wurde, trägt also in den Melanomzellen auch die posttranskriptionelle Kontrolle zur TCTP-Expression bei. Eine translationelle Inhibition scheint dabei vor allem bei den chemosensiblen Zellen vorzuliegen.

4.2.2 Proteinbindungsstudien an der TCTP-3’UTR mit Melanomzelllysaten

Es sollte der Versuch unternommen werden, in Analogie zu den Untersuchungen an der Kaninchen-TCTP-mRNA, in den Melanomzellen Faktoren anzureichern und zu identifizieren, die an die TCTP-mRNA binden und an einer translationellen Regulation beteiligt sein könnten. Der erste Schritt hierbei war wiederum der Nachweis einer RNA-Protein-Wechselwirkung in Electromobility Shift Assays.


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Unter Berücksichtigung des besonderen Einflusses der 3’UTR2 auf die Regulation der Translation wurden die folgenden Experimente mit einem [a32P] markierten in vitro Transkript der langen 3’UTR (517 nt) durchgeführt. Dieses Transkript wurde mit Lysaten der chemosensiblen Linie MeWo sowie ihrer resistenten Abkömmlinge Mewo CIS und MeWo ETO inkubiert. Die beiden resistenten Zelllinien wuchsen in einem Medium, das nur die Konzentration des Cytostatikum enthielt, die für das Aufrechterhalten der Chemoresistenz notwendig war. Damit entsprechen die verwendeten Lysate in der Abb. 17 den Bahnen 1, 4 und 6 der Abb. 15.

Abb. 17: EMSA der TCTP-3’UTR:

Das [a32P]-markierte in vitro Transkript der 3’UTR wurde mit S10-Lysaten der verschiedenen Melanomzelllinien inkubiert. Bahn 1=freie RNA ohne Zugabe eines Proteinextraktes, Bahn 2=Inkubation mit dem S10-Lysat der chemosensiblen Linie MeWo, Bahn 3=Inkubation mit dem S10-Lysat des Cisplatin-resistenten Abkömmlings MeWo CIS, Bahn 4=Inkubation mit dem S10-Lysat des Etoposid-resistenten Abkömmlings MeWo ETO. Es wurden dem Medium jeweils 0,01 μg/ml Cisplatin bzw. 0,1 μg/ml Etoposid zugesetzt, um die Chemoresistenz aufrecht zu erhalten.

Bei Zusatz von S10-Lysaten der chemosensiblen Linie MeWo sowie ihrer chemoresistenten Abkömmlinge MeWo CIS und MeWo ETO kommt es zur Ausbildung von RNA-Protein-Komplexen. In der nicht-denaturierenden Polyacrylamid-Gel-Elektrophorese ist dies sichtbar durch das verzögerte Wandern der Komplexe im Vergleich zur freien ungebundenen RNA (Bahn 1). Während sich die Shift-Komplexe nach Zugabe von Extrakten der resistenten Zellen (Bahn 3 und 4) in etwa gleich darstellen, ist die Laufgeschwindigkeit der Komplexe aus RNA und Proteinen der sensiblen Zellen stärker verzögert (Bahn 2). Hierfür kommen verschiedene Ursachen in Frage. Zum einen können aus den einzelnen Extrakten unterschiedliche Proteine an [Seite 60↓]die TCTP-3’UTR binden. Weiterhin kann die Konzentration der bindenden Proteine in den einzelnen Zelllinien variieren oder die RNA-bindenden Proteine können durch posttranslationelle Modifizierung in ihrer Bindungsfähigkeit verändert werden. Weitere Erkenntnisse hierzu wurden in UV-Crosslinking-Experimenten gewonnen.

In der Abb. 18 ist das Autoradiogramm eines UV-Crosslinking-Experiments dargestellt, das analog zu den Electromobility Shift Assays durchgeführt wurde. Die Proben wurden in gleicher Reihenfolge aufgetragen.

Abb. 18: UV-Crosslinking-Experiment der TCTP-3’UTR:

Das [a32P]-markierte in vitro Transkript der 3’UTR wurde mit S10-Lysaten der Melanomzellen inkubiert. Bahn 1=ohne Zugabe eines Proteinextraktes, Bahn 2=Inkubation mit dem S10-Lysat der chemosensiblen Linie MeWo, Bahn 3=Inkubation mit dem S10-Lysat des Abkömmlings MeWo CIS, Bahn 4=Inkubation mit dem S10 Lysat des Abkömmlings MeWo ETO. Es wurden dem Medium jeweils 0,01 μg/ml Cisplatin bzw. 0,1 μg/ml Etoposid zugesetzt, um die Chemoresistenz aufrecht zu erhalten. Das Molekulargewicht der Proteine wurde durch Vergleich mit einem Proteinstandard abgeschätzt. Die drei Proteine wurden mit p45, p66 und p85 bezeichnet.

Ohne Zugabe eines Proteinextraktes sind keine Banden nachweisbar (Bahn 1). Nach Inkubation der 3’UTR mit den Lysaten aus chemoresistenten und chemosensiblen Melanomzellen sind in allen drei Bahnen gleichermaßen drei Proteinbanden sichtbar. Entsprechend ihrem Molekulargewicht sind diese Proteine als p45, p66 und p85 bezeichnet. Es binden folglich in allen drei Zelllinien die gleichen Proteine an die 3’UTR. Es sind jedoch quantitative Unterschiede der drei gebundenen Proteine zu beobachten. Die intensiveren Banden in Bahn 3 können entweder durch eine höhere Konzentration oder eine posttranslationelle Modifizierung dieser Proteine, beispielsweise durch eine Phosphorylierung, in den Cisplatin resistenten Zellen zu Stande kommen.


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4.2.3  Identifizierung von 3’UTR-bindenden Proteinen

Für die Identifizierung der 3’UTR-bindenden Proteine wurde das biotin-markierte in vitro Transkript der 3’UTR mit dem S10-Lysat der chemosensiblen Melanomzelllinie MeWo inkubiert, da die TCTP-mRNA in diesen Zellen in einem translationsinaktiven Zustand vorliegt. Die angereicherten Proteine wurden in einer SDS-PAGE analysiert und die Coomassie-gefärbten Banden sind in Abb. 19 dargestellt.

Abb. 19: Anreicherung 3’UTR-bindender Proteine:

Mit RNA-Affinitätschromatographie wurden aus Lysaten der chemosensiblen Melanomzelllinie MeWo drei Proteine angereichert, die an die 3’UTR der TCTP-mRNA binden. Dargestellt sind die Coomassie-gefärbten Banden der mit 8 M Urea eluierten Proteine. Die Proteine wurden entsprechend ihrem Molekulargewicht als p40, p50 und p100 bezeichnet. Die Banden wurden ausgeschnitten und massenspektrometrisch identifiziert.

Im Vergleich zu den verschiedenen mit der RNA-Affinitätschromatographie aus Kaninchen-Retikulozytenlysat isolierten Proteinen stellen sich in Abb. 19 nur drei markante Proteine dar. Dieser Unterschied ist im Wesentlichen auf die verschiedenen Färbetechniken zurück zu führen. Die Coomassie-Färbung ist deutlich weniger empfindlich und folglich werden nur Proteine angefärbt, die in einer größeren Menge vorliegen. Nach der Elution mit einem Puffer hoher Salzkonzentration (8 M Urea) sind drei deutliche Proteinbanden von 40 kD, 50 kD und 100 kD erkennbar. Diese drei Banden wurden aus dem Gel ausgeschnitten und ihre Fragmente nach dem tryptischen Verdau in einem MALDI-TOF-Massenspektrometer analysiert. Alle drei Proteine konnten eindeutig identifiziert werden. Es handelt sich dabei um die drei Cytoskelettproteine γ Actin (42 kD), β2-Tubulin (49 kD) und α-Actinin (103 kD).


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In der Zelle sind RNP-Komplexe und Polysomen mit Mikrotubuli und Mikrofilamenten assoziert und diese Bestandteile des Cytoskeletts erfüllen wichtige Funktionen bei der Translation und intrazellulären Lokalisation von mRNAs (Jansen 1999). Die Cytoskelettproteine treten unter Vermittlung von RNA-bindenden Proteinen mit mRNAs in Wechselwirkung. Die Frage nach diesen Adapterproteinen an der TCTP-mRNA bleibt offen und muss in weiterführenden Experimenten untersucht werden. Die Bedeutung der Wechselwirkungen mit den identifizierten Cytoskelettproteinen für die Translation und intrazelluläre Lokalisation der TCTP-mRNA muss in funktionellen Untersuchungen geklärt werden.


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27.11.2003