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5  Diskussion

5.1 Die Regulation der Translation der TCTP-mRNA

5.1.1 Die Bedeutung der untranslatierten Regionen für die Translation der TCTP-mRNA

Die Kontrolle der Genexpression in Eukaryonten erfolgt durch komplexe ineinander greifende Regulationsvorgänge. Klassischerweise werden neue Erkenntnisse auf diesem Gebiet zunächst durch die isolierte Betrachtung eines Schrittes auf dem Weg vom Gen zum Protein untersucht. Durch experimentelle in vitro Ansätze mit zellfreien Lysaten ist es möglich, die jeweiligen Nukleinsäuresequenzen und die interagierenden Proteinfaktoren zu charakterisieren. In den letzten Jahren wurde jedoch mehr und mehr erkannt, dass es sich bei den einzelnen Schritten der Expression eines Gens nicht um eine reine lineare Abfolge von einzelnen Phasen handelt. Vielmehr sind die einzelnen Schritte zeitlich und räumlich gekoppelt und werden koordiniert über Signaltransduktionskaskaden reguliert. Selbst die ehemals strikte Unterscheidung von nukleären und cytoplasmatischen Vorgängen wird zunehmend in Frage gestellt. Diese Erkenntnisse wurden nicht zuletzt durch die Anwendung neu entwickelter Untersuchungsmethoden insbesondere auf dem Gebiet der Protein-Protein-Wechselwirkungen ermöglicht. Die Anwendung moderner Fluoreszenz-Techniken erlaubt sogar das direkte Studium von Makromolekülen und ihrer Wechselwirkungen in lebenden Zellen (Orphanides und Reinberg 2002).

Die grundsätzliche Regulation der Neusynthese eines Proteins findet auf der Ebene der Transkription statt. Daher schien die transkriptionelle Regulation eines Gens lange Zeit der attraktivere Forschungsgegenstand zu sein. Demgegenüber eröffnet die Regulation der Translation zusätzliche Möglichkeiten, Einfluss auf die Expression eines Gens zu nehmen. Die Untersuchungen zur Translationskontrolle konzentrierten sich zunächst auf Differenzierungsvorgänge wie die Entwicklung befruchteter Eizellen oder die Reifung roter Blutzellen, bei denen translationelle Regulationsvorgänge offensichtlich eine besondere Bedeutung haben. Intensiv untersucht wurde auch die Translation von mRNAs, die in translationsinaktiven RNP-Komplexen vorliegen oder deren UTRs besondere Strukturmerkmale aufweisen. In diese Gruppe von mRNAs lässt sich auch die TCTP-mRNA einordnen. Die intensive Untersuchung von gewebespezifischen Expressionsprofilen mit Micro-Array- und 2D Gelelektrophorese-Techniken identifiziert weitere Gene, deren Expression auf translationeller Ebene reguliert wird. Hinzu kommt die Assoziation von Erkrankungen mit Mutationen, die nicht den codierenden Bereich eines Gens betreffen. Funktionelle Studien [Seite 64↓]belegen hier die Bedeutung der Genregulation für die Entstehung von Krankheiten.

Das Interesse der vorliegenden Arbeit bestand darin, zum Verständnis der Mechanismen beizutragen, die auf der Ebene der Translation die Expression des Gens für das translationell kontrollierte Tumorprotein (TCTP) steuern. Es konnte gezeigt werden, dass die Translation der TCTP-mRNA1 hauptsächlich durch ihre 5’UTR reguliert wird. Diese Ergebnisse bestätigen die Ergebnisse der Untersuchungen von Böhm et al. (Böhm et al. 1991). Ebenfalls übereinstimmend ist die Beobachtung, dass im Weizenkeimlysat der Faktor, der durch Wechselwirkung mit der 5’UTR die translationelle Inhibition vermittelt, nicht vorhanden ist bzw. in einem inaktiven Zustand vorliegt.

Zusätzliche und weiterführende Ergebnisse konnten für die 3’UTR erarbeitet werden. Bei der kürzlich beschriebenen mRNA2 (Thiele et al. 2000) übt die 3’UTR2 einen zusätzlichen markanten hemmenden Einfluss auf die Translation aus. Diese Hemmung ist auch im Weizenkeimlysat zu beobachten, d. h. der an der 3’UTR2 angreifende translationshemmende Faktor ist in diesem Zellsystem vorhanden und aktiv. Im Unterschied zu Böhm et al. konnte der geringe untergeordnete Einfluss der TCTP-3’UTR1 auf die Translation nicht bestätigt werden. Die Entfernung der 3’UTR1 verbesserte die Translatierbarkeit weder im Retikulozytenlysat noch im Weizenkeimsystem. Möglicherweise lässt sich durch optimierte Bedingungen, z.B. veränderte Ionenkonzentrationen, die Sensitivität der Methode noch steigern, so dass auch sehr geringe Translationsunterschiede nachweisbar sind.

Die Ergebnisse zum unterschiedlichen Translationsverhalten von mRNA1 und 2 können als ein Hinweis auf die physiologische Funktion der Bildung der beiden alternativen Transkripte gedeutet werden. Die mRNA2 besitzt im Vergleich zur mRNA1 ein weiteres Kontrollelement in der längeren 3’UTR. So kann bei TCTP-Induktion durch vornehmliche Bildung der mRNA1 während der Transkription Einfluss auf die Translationsrate der TCTP-mRNA ausgeübt werden. Das deckt sich mit den Befunden von Guillaume et al., die ein Dominieren der mRNA1 in Zellen mit hoher Proliferationsrate beschreiben (Guillaume et al. 2001). Eine interessante Fragestellung in diesem Zusammenhang ist, ob sich durch Unterschiede in der intrazellulären Lokalisation von mRNA1 und 2 die TCTP-Lokalisation im Bereich des Zellkerns und des Cytoplasmas in Abhängigkeit von der Proliferationsrate erklären lässt.

Grundsätzlich lässt sich die Translationseffektivität entweder über eine mRNA-Stabilisierung oder eine gesteigerte Translation der vorhandenen mRNA-Menge beeinflussen. Die im Cytoplasma vorhandenen mRNA-Spiegel, wie sie in Northern Blot-Untersuchungen oder durch quantitative RT-PCR-Techniken gemessen werden, sind das Ergebnis eines Zusammenspiels von [Seite 65↓]Transkription, mRNA-Prozessierung, mRNA-Export ins Cytoplasma und mRNA-Abbau. Die Halbwertszeiten eukaryoter mRNAs liegen zwischen wenigen Minuten und mehreren Tagen. Besonders kurzlebig sind beispielsweise die mRNAs regulatorischer Cytokine und Protoonkogene, die bereits nach wenigen Minuten abgebaut werden. Dahingegen liegt die Lebensdauer von mRNAs, die für kontinuierlich exprimierte Haushaltsgene codieren, deutlich darüber.

Die Stabilität einer mRNA wird wie ihre Translationseffektivität durch Bindung von spezifischen Proteinen an cis-Elemente in den UTRs reguliert (Guhaniyogi et al. 2001). Für die Kurzlebigkeit einiger mRNAs sind AU-reiche Regionen (ARE) von besonderer Bedeutung. Das Sequenzmotiv (UUAUUUAU) wurde zuerst in der TNFα-mRNA entdeckt. Sequenzvergleiche zeigten dann, dass auch andere strukturell unterschiedliche Proteine, wie Interferone und Interleukine, dieses Sequenzmotiv in ihrer 3’UTR besitzen (Caput et al. 1986). In den letzten Jahren sind verschiedene ARE-bindende Proteine beschrieben worden. Ein gut charakterisierter Faktor ist AUF-1, auch bezeichnet als hnRNP D, von dem verschiedene Isoformen (p37, p40, p42. p45) durch alternatives Spleißen generiert werden. Die Isoformen bilden Homo-und Heterodimere und üben ihre destabilisierende Wirkung in Interaktion mit anderen Faktoren, darunter der Translationsinitiationsfaktor eIF4G, das Poly(A)-bindende Protein PABP und die Hitze-Schock-Proteine Hsc70-Hsp70, aus. Die Destabilisierung der mRNAs wird durch proteasomalen Abbau des AUF-1 vermittelt (Grzybowska et al. 2001). Ein anderes ARE-bindendes Protein ist HuR, das jedoch im Gegensatz zu AUF-1 in der Lage ist, mRNAs zu stabilisieren. Interessanterweise wurde auch die Bindung von Stoffwechselenzymen wie der Lactat-Dehydrogenase (LDH) und der Glycerinaldehyd-3-Phoshat-Dehydrogenase (GAPDH) an AREs beschrieben (Gouble und Morello 2000).

Sowohl in der 3’UTR1 als auch in der 3’UTR2 der TCTP-mRNA finden sich AU-reiche Motive (AUUUA). Deren Umgebung entspricht jedoch nicht der Konsensus-Sequenz. Die Bedeutung dieser AU-reichen Motive der TCTP-3’UTR ist derzeit noch ungeklärt. Mit Sicherheit erfüllen diese Motive nicht die Funktionen wie bei den kurzlebigen mRNAs. Die TCTP-mRNA gehört im Gegenteil zu den langlebigen mRNAs. Für die mRNA1 konnte gezeigt werden, dass ihre verminderte Translation nicht durch einen beschleunigten Abbau hervorgerufen wird (Böhm et al. 1991). Bisher nicht untersucht wurde, ob sich die Stabilität der mRNA1 und mRNA2 unterscheiden. Offen ist auch, ob AU-bindende Proteine möglicherweise den hemmenden Effekt der 3’UTR2 auf die Translationsinitiation vermitteln.

Von besonderer Bedeutung für die transkriptionelle und posttranskriptionelle Regulation des [Seite 66↓]TCTP sind Ca2+-Ionen (Xu et al. 2001). Für divalente Kationen konnte gezeigt werden, dass sie zu einer Stabilisierung von Sekundärstrukturen im Bereich der TNFα-3’UTR führen. Diese Konformationsänderung beeinflusst die Bindung von AUF-1 an die AREs in der TNFα-mRNA (Wilson et al. 2001). Es ist folglich möglich, dass die gesteigerte Translation der TCTP-mRNA bei erhöhter intrazellulärer Ca2+-Konzentration durch eine direkte elektrostatische Wechselwirkung der Ca2+-Ionen an die mRNA bedingt ist und dadurch die Bindung von translationshemmenden Proteinen vermindert wird.

Während sich in der TCTP-3’UTR keines der wenigen bisher gesicherten cis-Elemente findet, besitzt die 5’UTR einen typischen 5’terminalen Oligopyrimidintrakt (5’TOP). Es wurden verschiedene Signalwege beschrieben, die Einfluss auf die Translation der TCTP-mRNA nehmen und vorrangig im Bereich der 5’UTR wirken (Jefferies et al. 1994, Bommer et al. 1994, Bommer et al. 2002).

Eine Bedeutung des 5’TOP für die translationelle Regulation verschiedener Transkripte, neben TCTP ribosomale Proteine und Elongationsfaktoren, konnte in Untersuchungen mit dem Immunsuppressivum Rapamycin gezeigt werden. Rapamycin hemmt selektiv die Translation dieser mRNAs durch verminderte Phosphorylierung des 40S ribosomalen Proteins S6 durch die p70s6k-Kinase. Rapamycin bildet einen Komplex mit einem Protein, das als „mammalian target of rapamycin“ (mTOR) bezeichnet wird, und dieser Komplex bedingt wiederum eine verminderte Phosphorylierung der p70s6k-Kinase. Die S6-Aktivierung führt zu einer Verschiebung der TOP-mRNAs aus translationsinaktiven mRNP-Komplexen zu den Polysomen. Die Translationshemmung durch Rapamycin ist nicht vollständig und andere Mechanismen müssen zusätzlich beteiligt sein. Auch ist weiterhin offen, welche Faktoren direkt mit der mRNA wechselwirken und somit die Hemmung vermitteln (Jefferies et al. 1994, Jefferies et al. 1997).

5.1.2 Die Bedeutung allgemeiner Translationsfaktoren für die Translation der TCTP-mRNA

Verschiedene Untersuchungen belegen, dass die TCTP-mRNA zu den mRNAs gehört, die besonders empfindlich auf geringfügige Veränderungen der allgemeinen Translationsmaschinerie reagieren. So konnte gezeigt werden, dass die Phosphorylierung des Translationsinitiationsfaktors eIF4E zu einer gesteigerten Translation der TCTP-mRNA führt (Bommer et al. 1994). Bei der Translationsinitiation bindet eIF4E an die 7-Methyl-GTP-Kopfgruppe der mRNA und ermöglicht somit eine effektivere Ribosomenbindung. Die Phosphorylierung von eIF4E ist essentiell für den regelrechten Ablauf von Wachstumsvorgängen (Lachance et al. 2001). Bei eIF4E-Überexpression kommt es zur malignen Transformation und [Seite 67↓]diese Überexpression stimuliert vor allem die Translation von mRNAs, die komplexe Sekundärstrukturen in ihren 5’UTRs aufweisen. Für die Phosphorylierung von eIF4E ist der ras/src-Kinase-Signaltransduktionsweg von Bedeutung, der über eine Aktivierung der MAP („mitogen-activated protein“)-Kinase zur Aktivierung der „MAPK-interacting protein kinase“ (Mnk1) führt, die schließlich eIF4E phosphoryliert.

Die eIF4E-bindenden Proteine (eIF4E-BPs) sind in der Lage, die Wechselwirkung von eIF4E mit dem Adapterprotein eIF4G des Komplexes eIF4F zu verhindern und damit die Initiation der Translation zu hemmen. Die Affinität der eIF4E-BPs wird durch Phosphorylierung vermindert und der vollständige Komplex eIF4F kann wieder assembliert werden. Externe Stimuli wie Wachstumsfaktoren und Mitogene führen zur Phosphorylierung der eIF-BPs und steigern dadurch die Translation, wohingegen verschiedene Stresszustände einen gegenteiligen Effekt hervorrufen. Der Einfluss der eIF-BPs kann durch Überexpression von eIF4E vermindert werden. Die Phosphorylierung von eIF-BP1 wird ebenfalls durch Rapamycin gehemmt. Rapamycin beeinflusst somit synergistisch verschiedene Mechanismen der Translationshemmung, was eine besondere Bedeutung von eIF4E für die Translation von 5’TOP-mRNAs impliziert (Dennis et al. 1999).

Die in der vorliegenden Arbeit dargestellten Ergebnisse wurden mit in vitro Transkripten erarbeitet, die keine Kopfgruppe enthielten. Das Einfügen einer solchen Kopfgruppe verbesserte erwartungsgemäß die Translation durch effektivere Ribosomenbindung, jedoch bei allen Konstrukten in gleichem Maße. Das deutet darauf hin, dass für den Mechanismus der Translationshemmung durch die 5’UTR und die 3’UTR2 die Kopfgruppe von untergeordneter Bedeutung ist. Diese Hypothese wird durch eine Arbeit unterstützt, die zeigt, dass für die Bindung von Proteinen an 5’TOPs die Kopfgruppe nicht unbedingt notwendig ist (Biberman und Meyuhas 1999). Alle Experimente wurden mit Transkripten ohne Poly(A)-Schwanz durchgeführt. Offensichtlich ist auch diese mRNA-Modifizierung für die translationelle Hemmung der TCTP-mRNA nicht essentiell.

Der AU-Reichtum der 3’UTR legt nahe, dass es bei der TCTP-mRNA innerhalb des Moleküls zu einer Wechselwirkung mit der GC-reichen 5’UTR kommt. In der Tat haben Untersuchungen gezeigt, dass es innerhalb der TCTP-mRNA zur Bildung komplexer Sekundärstrukturen kommt (Chitpatima et al. 1988, Bommer et al. 2002). Die Untersuchungen von Bommer et al. belegen zudem, dass die TCTP-mRNA in der Lage ist, die durch doppelsträngige RNA aktivierbare Proteinkinase PKR zu aktivieren. Die PKR wiederum hemmt die Translation der TCTP-mRNA, so dass die TCTP-mRNA letztendlich durch einen Feedback-Mechanismus ihre eigene [Seite 68↓]Translation hemmen kann.

PKR gehört neben anderen (HRI, PERK, GCN2) zu den Kinasen, die die eIF2α-Untereinheit des Translationsinitiationsfaktors eIF2 phosphorylieren und somit zu einer allgemeinen Translationshemmung führen. Der Initiationsfaktor eIF2 wird regeneriert, indem mit Hilfe des Faktors eIF2B das zu GDP hydrolysierte GTP wieder erneuert wird. Dieser Guanin-Nukleotid-Austausch wird durch Phosphorylierung von eIF2 behindert. Die PKR ist durch Interferon induzierbar und spielt eine wichtige Rolle bei der Abwehr von viralen Infektionen. Darüber hinaus ist sie auch an einer Regulation von Zellwachstum und Apoptose beteiligt.

Ein weiterer interessanter Aspekt der Regulation der TCTP-mRNA ist, dass sie nicht nur besonders empfindlich auf Veränderungen der Translationsmaschinerie reagiert, sondern zudem mit dem 5’TOP ein charakteristisches cis-Element von mRNAs allgemeiner Translationsfaktoren besitzt. Dies ermöglicht die optimale Anpassung der TCTP-Expression an die Wachstumsbedingungen der Zelle.

Die oben beschriebenen Mechanismen belegen, dass die Translation der TCTP-mRNA auf sehr komplexe und so in der Literatur bisher für keine andere mRNA gezeigte Weise reguliert wird. Es ist anzunehmen, dass darüber hinaus noch weitere Signalwege beteiligt sind, da die translationelle Hemmung bei keinem der bisher gezeigten Mechanismen vollständig war. Hierbei ist wiederum die Bedeutung der 3’UTR2 zu unterstreichen, für die der Mechanismus der Translationshemmung ebenfalls noch ungeklärt ist. Weiterhin ist offen, welche Proteine durch unmittelbare Bindung an cis-Elemente der TCTP-mRNA die Wechselwirkungen mit den allgemeinen Translationsfaktoren vermitteln. Die in der vorliegenden Arbeit dargestellten Proteinbindungsstudien sollten einen Beitrag zur Charakterisierung von Kandidatenproteinen leisten.

5.1.3 Die Wechselwirkungen von RNA-bindenden Proteinen mit den UTRs der TCTP-mRNA

In der vorliegenden Arbeit konnten eine Reihe von Proteinen ermittelt werden, die an die UTRs der TCTP-mRNA binden. Die gewebespezifischen Unterschiede in den UV-Crosslinking-Experimenten sind bei den 3’UTR-bindenden Proteinen deutlicher ausgeprägt als bei den 5’UTR-bindenden Proteinen.

Es ließen sich durch UV-Crosslinking insgesamt vier Kandidatenproteine darstellen, die mit der 5’UTR in Wechselwirkung treten. Entsprechend ihrem Molekulargewicht wurden diese Proteine als p25-p43 bezeichnet. Mit einem affinitätschromatographischen Verfahren ließen sich drei [Seite 69↓]zusätzliche Proteine mit höherem Molekulargewicht (p68, p80, p85) darstellen. Dies ist nicht ungewöhnlich, da es sich bei den beiden Verfahren um experimentell unterschiedliche Ansätze handelt. So lassen sich zusätzliche Banden in der RNA-Affinitätschromatographie durch Protein-Protein-Wechselwirkungen erklären. Durch Anreicherung von RNA-bindenden Proteinen aus dem Retikulozytenlysat konnten außerordentlich interessante Kandidatenproteine isoliert werden. Die Spezifität der Bindung wird belegt durch differenzielle Betrachtung der Ergebnisse von 5’UTR und 3’UTR. Unspezifisch an RNA oder Streptavidin-Agarose bindende Proteine müssten jeweils in beiden Ansätzen auftreten. Die nachgewiesenen Proteinbanden traten jedoch nur bei jeweils einem der eingesetzten Transkripte auf.

Die Identifizierung der TCTP-mRNA-bindenden Proteine aus Kaninchen-Retikulozytenlysat durch Massenspektrometrie ist bisher nicht gelungen. Mit diesem Verfahren können nur bereits bekannte und in Datenbanken enthaltene Proteine identifiziert werden. In diesen Datenbanken sind hauptsächlich Proteine von Maus und Mensch zu finden, so dass die Identifizierung der isolierten Kaninchenproteine nicht möglich war.

In der TCTP-5’UTR ist mit dem 5’TOP eines der gut charakterisierten cis-Elemente von UTRs vorhanden. Es ist somit wahrscheinlich, dass einige der angereichten Proteine in diesem Bereich der 5’UTR binden. In den letzten Jahren sind einige Proteine beschrieben worden, die mit 5’TOPs verschiedener mRNAs wechselwirken (Meyuhas 2000). Pellizzoni et al. konnten zeigen, dass das Xenopus Homolog des humanen Proteins La an die 5’UTR von Xenopus ribosomalen Proteinen bindet (Pellizzoni et al. 1996). Dieses Protein ist medizinisch interessant, da Antikörper (SS-B-Antikörper) gegen dieses Protein bei bestimmten Autoimmunkrankheiten, insbesondere beim Sjögren-Syndrom, auftreten. Es konnte gezeigt werden, dass humanes La in der Lage ist, durch Bindung an den 5’TOP die Translation eines Reporter-Gens in vitro zu hemmen (Zhu et al. 2001). Für La sind noch weitere Wechselwirkungen mit mRNAs beschrieben worden, darunter die Beteiligung an der Translation viraler mRNAs, die ein IRES besitzen.

Für ein weiteres Protein, Ro60, gegen das ebenfalls Autoantikörper (SS-A-Antikörper) gebildet werden, konnte die Wechselwirkung mit 5’TOPs gezeigt werden. Die Bindung von Ro und La scheint abhängig zu sein von einem weiteren Faktor CNBP („cytoplasmic nucleic acids binding protein“), der an die angrenzenden Bereiche von 5’TOP-mRNAs bindet (Pellizzoni et al. 1996). Weiterhin wurde für hnRNP I, auch bezeichnet als PTB („pyrimidine tract binding protein“), eine Wechselwirkung mit 5’TOPs beschrieben.

Die Molekalargewichte der oben genannten Proteine CNBP, La, PTB und Ro60 beträgt jeweils [Seite 70↓]19 kD, 47 kD, 57 kD und 60 kD, so dass sich keines der in den UV-Crosslinking-Experimenten und der RNA-Affinitätschromatographie nachgewiesenen Proteine direkt einem dieser bekannten Faktoren zuordnen lässt. Es ist somit wahrscheinlich, dass es sich bei den in der vorliegenden Arbeit charakterisierten Proteinen um bisher nicht bekannte Faktoren handelt, die an den 5’TOP und die angrenzenden Bereiche binden. Nicht auszuschließen ist jedoch, dass es sich bei den nachgewiesenen Faktoren um Bruchstücke, alternativ gespleißte Isoformen, posttranslationell modifizierte Formen oder Kaninchen-Homologe mit abweichendem Molekulargewicht der bekannten 5’TOP-bindenden Proteine handelt.

In der 5’UTR der TCTP-mRNA ist neben dem 5’TOP noch ein weiteres potentielles Bindungsmotiv vorhanden. Es handelt sich dabei um das Differenzierungskontrollelement (DICE), das erstmals in der 3’UTR der 15-Lipoxygenase des Kaninchens entdeckt wurde. CU-reiche Motive dieses Typs wurden inzwischen in vielen eukaryoten mRNAs gefunden (Pesole et al. 2001). Daran binden die beiden KH-Domänen-Proteine hnRNP E1 und K und regulieren auf diese Weise Translationseffektivität und mRNA-Stabilität. Dieses Motiv liegt typischerweise in mehrfacher Wiederholung vor. Für eine effiziente Translationsregulation sind mindestens zwei dieser CU-reichen Motive erforderlich (Reimann et al. 2001). In der TCTP-mRNA ist das DICE-Motiv nur einfach vorhanden. Die Ergebnisse von UV-Crosslinking und RNA-Affinitätschromatographie legen jedoch eine Bindung von hnRNP E1 an die 5’UTR nahe. Bei Verwendung von Retikulozytenlysat ist jeweils eine Bande von 43 kD nachweisbar, die sich hnRNP E1 zuordnen lässt. In der RNA-Affinitätschromatographie stellt sich auch eine Bande bei 68 kD dar, bei der es sich um hnRNP K handeln könnte. In Untersuchungen mit spezifischen Antikörpern und rekombinant hergestellten Proteinen, derzeit nur für E1 verfügbar, ließe sich überprüfen, ob tatsächlich eine Bindung an die TCTP-5’UTR stattfindet. Zudem müsste überprüft werden, inwieweit diese Proteine Einfluss auf die Translation der TCTP-mRNA ausüben.

Auch für die aus Kaninchen-Retikulozytenlysat angereicherten 3’UTR-bindenden Proteine war eine Identifizierung der angereicherten Proteine mittels Massenspektrometrie bisher nicht möglich. Die Zuordnung zu beschriebenen RNA-bindenden Proteinen gestaltet sich hier schwieriger, da in der 3’UTR kein bekanntes cis-Element zu finden ist. Wie bereits im Kapitel 5.1.1. erwähnt, finden sich AU-reiche Motive in beiden Abschnitten der 3’UTR, die nicht der Konsensussequenz entsprechen. Es ist jedoch möglich, dass AU-bindende Proteine mit diesen Bereichen wechselwirken, zumal sich das in der RNA-Affinitätschromatographie angereicherte Protein p40 einer der vier Isoformen des AU-bindenden Faktors 1 (AUF1) zuordnen lässt. Von [Seite 71↓]AUF-1 ist eine Wechselwirkung mit hnRNP E1 bekannt, so dass hier eine Wechselwirkung von 5’UTR- und 3’UTR-bindenden Proteinen stattfinden könnte (Misquitta et al. 2001).

Es ist zudem gelungen, aus der humanen Melanomzelllinie MeWo drei 3’UTR-bindende Proteine zu identifizieren. Es handelt sich dabei um die Cytoskelettproteine α-Actinin, β-Tubulin und γ-Actin. Zahlreiche mRNAs (etwa 15-30%) sind intrazellulär mit Cytoskelett-Proteinen assoziiert. Die von Xu et al. beschriebene Regulation der TCTP-mRNA durch Ca2+ kann über eine Vermittlung durch Calcium-bindende Proteine und eine direkte Wechselwirkung der Ca2+-Ionen mit der mRNA zu Stande kommen. Im Hinblick auf die Bindung von TCTP an β-Tubulin wäre eine Assoziation seiner mRNA mit diesem Cytosklettprotein nicht ungewöhnlich, ähnlich wie dies bei der Bindung von Ca2+ an TCTP und TCTP-mRNA der Fall ist. Hinzu kommt, dass zwei der isolierten Proteine, α-Actinin und β-Tubulin, in der Lage sind, Calcium zu binden. In jedem Fall sind weitere Untersuchungen erforderlich, bei denen die Bedeutung der isolierten Proteine für die Translation und Lokalisation der TCTP-mRNA näher beleuchtet wird. Unklar ist auch, welche Adapterproteine an der Wechselwirkung der 3’UTR mit den Cytoskelettproteinen beteiligt sein könnten. In der Regel sind mRNAs in Form von RNP-Komplexen mit Cytoskelettbestandteilen assoziiert.

Theoretisch betrachtet sollten solche Zellen für die Anreicherung eines hemmenden Faktors besonders gut geeignet sein, die sich nicht in einem Zustand hoher Proliferation befinden. Diese Voraussetzung ist im Retikulozytenlysat besser erfüllt als in malignen Zellen wie den Melanomzellen. Für die RNA-Affinitätschromatographie wurde das Lysat der chemosensiblen Linie MeWo verwendet, bei der durch Vergleich der Northern und Western Blot Ergebnisse eine Hemmung der Translation gezeigt werden konnte. Weiterführende Untersuchungen müssen klären, ob sich aus den Melanomzellen 5’TOP bindende Faktoren und weitere RNA-bindende Proteine isolieren lassen, die diese Translationshemmung vermitteln.

Zusammenfassend ist anzunehmen, dass die TCTP-mRNA in Zellen mit geringer mitotischer Aktivität in inaktiven mRNP-Komplexen vorliegt, in denen 5’UTR- und 3’UTR-bindende Faktoren mit der mRNA assoziiert sind und dass sich diese mRNP-Komplexe an Cytoskelettbestandteile anlagern. Hervorgerufen durch verschiedene externe Stimuli kommt es über die Aktivierung von Signalkaskaden zu einer veränderten Bindungsfähigkeit der RNA-bindenden Proteine, so dass die mRNA an den Polysomen translatiert werden kann.

Bei gleichen Motiven in mRNAs und gleichen RNA-bindenden Proteinen wird die Individualität der Regulation eines Messengers über die Zusammensetzung des jeweiligen mRNP-Komplexes [Seite 72↓]erreicht (Dreyfuss et al. 2002). Durch Bildung von Homomeren und Heteromeren RNA-bindender Faktoren lässt sich eine große Diversität im Proteinbesatz von mRNAs erreichen. Zur vollständigen Aufklärung der individuellen Zusammensetzung des mRNP-Komplexes einer mRNA stehen jedoch bislang keine geeigneten Techniken zur Verfügung.

5.1.4 Ausgewählte Signalwege bei der TCTP-Induktion

Seit der Erstbeschreibung des Proteins wurde eine ganze Reihe von Induktoren der TCTP-Synthese identifiziert. Die wesentlichen Daten hierzu wurden in der Einleitung ausführlich dargestellt. Für einige dieser Induktoren sind die Signalkaskaden, über die der Einfluss auf Transkription und Translation vermittelt wird, bekannt. Interessanterweise lassen sich für die meisten der beobachteten Induktionsmechanismen gemeinsame Wirkungsmechanismen finden. Folglich stellt sich die Frage, ob von diesen Signalwegen Wechselwirkungen mit den oben beschriebenen Mechanismen der translationellen Regulation bekannt sind. Diese Induktoren wirken selbstverständlich nicht ausschließlich auf translationeller Ebene. Vielmehr kommt es in der Zelle parallel zum Anschalten von Transkription und Translation. Die im Folgenden beschriebenen Signalwege beeinflussen auch die Bindung von Transkriptionsfaktoren an Promotorstrukturen des TPT1-Gens. Da das wesentliche Interesse dieser Arbeit auf den translationellen Regulationsmechanismen lag, sind diese vorrangig dargestellt.

Typischerweise wirken Induktoren gleichzeitig auf mehrere intrazelluläre Signalwege. An dieser Stelle soll eine Auswahl beteiligter Mechanismen präsentiert werden. Eine zentrale Rolle bei der Regulation der Translation spielt die MAP-Kinase p38. Die beiden Subtypen der MAP-Kinasen p38 und JNK werden auch zusammenfassend als Stress-aktivierte Proteinkinasen (SAPKs) bezeichnet. Ihre Aktivierung, ausgelöst durch extrazelluläre Stimuli wie Wachstumsfaktoren und Zellstress, wird über membranständige Rezeptoren vermittelt. So bewirkt beispielsweise Lipopolysaccharid über eine Interaktion mit dem Toll-like-Rezeptor 4 eine p38-Aktivierung. Die Wirkung von LPS wurde ausführlich im Zusammenhang mit der Stabilisierung von AU-reichen mRNAs durch p38 untersucht (Frevel et al. 2003). Die p38-Aktivierung hat eine Aktivierung der Proteinkinase Mnk1 zur Folge, die den Translationsinitiationsfaktor eIF4E phosphoryliert und damit die Translation, vor allem von mRNAs mit komplexen Sekundärstrukturen, steigert (Meyuhas 2000).

Der TCTP-Induktor IL-3 bewirkt eine Hemmung der PKR (Williams 1999). Die somit verminderte inhibitorische Wirkung der PKR auf die Translation der TCTP-mRNA könnte zur beobachteten TCTP-Induktion durch IL-3 beitragen. Des Weiteren ist die PKR in der Lage p38 zu aktivieren (Goh et al. 2000), so dass es zwischen den verschiedenen Signalwegen zu einer [Seite 73↓]Vernetzung kommt.

Die Wirkung von Wachstumsfaktoren wird zusätzlich über Tyrosinkinase-Rezeptoren und die Aktivierung der Phosphatidylinositol-3-Kinase (PI3-Kinase) vermittelt. Durch die konsekutive Aktivierung des „mammalian target of rapamycin“ (mTOR) kommt es zur Phosphorylierung der 4E-BPs und des ribosomalen Proteins S6, was eine Steigerung der Translation insbesondere von 5’TOP-mRNAs zur Folge hat (Dennis et al. 1999, Meyuhas 2000). Ein Überblick über die oben beschriebenen Induktionsmechanismen auf translationeller Ebene ist in Abb. 20 dargestellt.

Abb. 20: Potentielle Signalkaskaden bei der Aktivierung der TCTP-Synthese

Bei einer Stimulation von Zellen durch Wachstumsfaktoren, Zellstress und LPS kommt es zur Aktivierung von mTOR. In der Folge kommt es zur Phosphorylierung des ribosomalen Proteins S6, was eine Verschiebung von 5’TOP-mRNAs aus inaktiven mRNP-Komplexen zu translationsaktiven Ribosomen bewirkt. Zusätzlich werden 4E-BPs phosphoryliert, was ihre Wechselwirkung mit dem Translationsinitiationsfaktor eIF-4E behindert und dadurch die Translationsrate steigert. Über eine Aktivierung der MAP-Kinase p38 wird eIF-4E selbst phosphoryliert und seine Aktivität dadurch gesteigert. Eine verminderte Aktivität der PKR hervorgerufen durch IL-3 hat eine verminderte Phosphorylierung von eIF-2α und damit ebenfalls eine Steigerung der Translationsrate zur Folge.


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5.2  Die veränderte Expression des TCTP in Melanomzellen

5.2.1 Die Bedeutung von TCTP als anti-apoptotischer Faktor

Als Reaktion auf verschiedene extrazelluläre Stressfaktoren konnte eine gesteigerte TCTP-Expression nachgewiesen werden. Es war lange Zeit ungeklärt, ob dieser Effekt eine allgemeine Reaktion von Zellen auf bestimmte Stimuli ist oder sich dahinter ein besonderer Schutzmechanismus der Zellen verbirgt.

Die Charakterisierung von TCTP als anti-apoptotischer Faktor favorisiert die letztere Variante (Li et al. 2001). Die Autoren zeigen klar, dass TCTP in der Lage ist, den durch Etoposid ausgelösten Zelltod in transfizierten HeLa-Zellen zu unterdrücken. Ferner führt eine TCTP-Depletion, hervorgerufen durch ein entsprechendes Antisense-Transkript in der Mamma-Ca-Linie MCF-7 zu einem massiven Zelltod. Einen weiteren Hinweis auf eine Bedeutung von TCTP in der Pathophysiologie maligner Zellen liefert die Beobachtung von Tuynder et al., dass es bei Tumorreversion zu einer verminderten TCTP-Expression kommt (Tuynder et al. 2002).

Offen ist nach wie vor die Frage, auf welche Weise TCTP die Apoptose hemmt. Von besonderer Bedeutung ist hierbei sicher die Sequestrierung von Ca2+-Ionen durch Bindung an TCTP. Unklar bleibt jedoch, ob das die alleinige Ursache der beobachteten Caspase-3-Hemmung ist. Einen weiteren Hinweis auf die Bedeutung der Apoptosehemmung für die Entwicklung der Chemoresistenz ist die Identifizierung eines weiteren anti-apoptotischen Proteins 14-3-3γ als überexprimierter Faktor in den chemoresistenten Melanomzellen durch Sinha et al. Die Proteine der 14-3-3–Familie interagieren mit verschiedenen Proteinen an phosphorylierten Serinresten und beeinflussen so eine Reihe von Signaltransduktionswegen und tragen dadurch unter anderen zur Regulation von Zellwachstum und Apoptose bei (Xing et al. 2000).

Sollte es gelingen, pharmakologisch in Signalwege einzugreifen, die bei der Regulation der TCTP-Expression auf transkriptioneller oder translationeller Ebene involviert sind, ergäben sich möglicherweise neue Angriffspunkte für eine cytostatische Therapie. Rapamycin und neuentwickelte Medikamente mit gleichem Wirkmechanismus werden nicht nur zur Immunsuppression eingesetzt, sondern besitzen auch eine proliferationshemmende Wirkung auf Tumorzellen (Hidalgo und Rowinsky 2000, Law BK et al. 2002). Eine interessante Fragestellung wäre, wie sich die TCTP-Expression unter diesen Bedingungen verändert und inwieweit die Aufhebung der Translationshemmung über die 5’UTR daran beteiligt ist. Für die proliferationshemmende Wirkung von Rapamycin kommen sicher noch eine ganze Reihe weiterer Proteine mit 5’TOP-mRNAs als potentielle Effektoren in Frage. Interessanterweise war [Seite 75↓]ein weiteres der in den chemoresistenten Melanomzellen überexprimierten Proteine der Translationselongationsfaktor 1δ (Sinha et al. 2000). Das könnte ein weiteres Indiz für die Bedeutung einer veränderten Proteinsyntheserate auf die Proliferation maligner Zellen sein.

5.2.2 Der Einfluss der translationellen Regulation auf die TCTP-Expression in Melanomzellen

Die vergleichenden Northern und Western Blot Analysen zeigen in Übereinstimmung mit den Ergebnissen von Sinha et al. eine deutliche Expressionssteigerung des TCTP in den chemoresistenten Abkömmlingen der Melanomzellen auf mRNA- und Proteinniveau. Es zeigt sich zudem, dass der Zusatz von hohen Konzentrationen des jeweiligen Cytostatikums nicht zu einer weiteren Steigerung der TCTP-Synthese führt. Die mRNA-Menge nimmt unter diesen Umständen sogar noch ab, was wahrscheinlich durch eine unspezifische Störung der DNA-Funktion durch die Cytostatika bedingt ist. Die Tatsache, dass es in den sensiblen Zellen unter Cisplatin-Belastung zu einer deutlichen transkriptionellen Induktion kommt, spricht gegen eine spezifische Hemmung der TPT1-Transkription durch das Cytostatikum.

Für Etoposid kommt durchaus ein spezifischer hemmender Effekt auf die Transkription des TPT1-Gens in Frage, da auch in den sensiblen Zellen bei Etoposid-Zugabe eine verminderte TCTP-mRNA-Menge nachzuweisen ist. Unter Berücksichtigung der deutlichen Erhöhung der Proteinmenge in diesen Zellen erscheint dies jedoch unwahrscheinlich. Offensichtlich wird eher ein Signalweg initiiert, der zu einer effektiveren Translation der verminderten mRNA-Menge führt. Eine entscheidende Rolle bei dieser translationellen Aktivierung könnte hierbei wiederum dem intrazellulären Calcium zukommen, das in Folge der Zellschädigung durch das Cytostatikum ansteigt.

Verglichen mit der relativen Menge an mRNA ist in den chemosensiblen Melanomzellen nur sehr wenig TCTP nachweisbar. Möglicherweise, und diese Hypothese war Ausgangspunkt für die Verwendung der sensiblen Zellen in der RNA-Affinitätschromatographie, ist die Translation der mRNA in diesen Zellen durch die Bindung hemmender Proteine unterdrückt. Zu bedenken ist dabei jedoch, dass es sich bei den sensiblen MeWo-Zellen bereits um eine Tumorzelllinie handelt, die sich durch eine hohe Proliferationsrate auszeichnet.

In UV-Crosslinking-Experimenten waren die drei dargestellten an die 3’UTR bindenden Proteine identisch trotz unterschiedlichem Erscheinungsbild der Shift-Komplexe in den EMSA-Versuchen. Die unterschiedliche Konfiguration der Shift-Komplexe mit Proteinen aus chemosensiblen und chemoresistenten Zellen deutet auf eine veränderte Wechselwirkung der [Seite 76↓]bindenden Proteine mit der mRNA hin. Die erhöhte TCTP-Synthese, die in den chemoresistenten Zellen zu beobachten ist, lässt sich auf diese Weise erklären. Eine Regulation der bindenden Proteine entweder über deren Konzentration oder Aktivität lässt sich mit dieser Art von Experimenten jedoch nicht ausmachen. Der Vergleich mit einer nicht-malignen humanen Zelllinie könnte hier hilfreich sein.

Für alle in dieser Arbeit vorgestellten RNA-Proteinbindungsstudien wurden S10-Extrakte der jeweiligen Zellen verwendet. Dabei handelt es sich um die cytoplasmatischen Überstände nach Zentrifugation bei 10000 x g, in denen sowohl Polysomen als auch mRNP-Komplexe enthalten sind.. Durch Zentrifugation bei höheren Geschwindigkeiten lassen sich Polysomen- und mRNP-Fraktionen gewinnen (S100 und S300). Mit Hilfe dieser Verfahren könnte man untersuchen, ob es bei Entwicklung der Chemoresistenz zu einer Verschiebung der TCTP-mRNA aus den translationsinaktiven mRNP-Komplexen hin zu den Polysomen kommt. Das wäre ein weiterer Hinweis für die Bedeutung der Translationsregulation in den Melanomzellen.

Die Ergebnisse der Northern Blot-Untersuchungen an den Melanomzellen weisen in die gleiche Richtung wie die Beobachtungen von Guillaume et al., dass die mRNA2 in Zellen reger mitotischer Aktivität kaum nachzuweisen ist. Unter Berücksichtigung der besonderen Translationsinhibition der mRNA2 unterstützt das die These, dass die TCTP-Expression in den Melanomzellen spezifisch hochreguliert wird. Die Frage ist dabei hier, ob die mRNA2 in diesen Zellen instabiler ist oder ob bevorzugt das erste Polyadenylierungssignal verwendet wird. Grundsätzlich ist anzunehmen, dass die TCTP-Expression sowohl auf transkriptioneller als auch auf translationeller Ebene in den malignen Melanomzellen gesteigert ist und sich dieser Effekt in den chemoresistenten Zellen noch verstärkt.

5.3 TCTP-ein rätselhaftes Protein?

Durch neue Erkenntnisse über das TCTP hat sich in den letzten Jahren ein vielschichtiges Bild entwickelt. Insbesondere bezüglich seiner Funktionen sind wertvolle Informationen hinzugekommen, auch wenn dieses Protein so manche Besonderheit aufweist und weiterhin das eine oder andere neue Rätsel aufgibt. Eine besondere Schwierigkeit war von Anfang an, dass es sich keiner bekannten Proteinfamilie zuordnen lässt. Die einzelnen Arbeiten über TCTP stehen häufig für sich und viele Zusammenhänge sind noch ungeklärt. Die Abb. 21 vermittelt einen Überblick über die vielfältigen Funktionen des TCTP und damit verbundene offene Fragen.


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Abb. 21: Funktionen des TCTP:

Für TCTP wurde eine Lokalisation sowohl im Cytoplasma als auch im Zellkern beschrieben. Unklar ist dabei, wie das Protein in den Kern gelangt. TCTP ist mit Mikrotubuli assoziiert und es kommt zu einer Wechselwirkung mit Mitosespindeln in der Metaphase der Mitose. Die Assoziation mit dem Cytoskelett wird über eine Phosphorylierung des TCTP an Ser 46 und Ser 64 durch die Plk reguliert. Die Hemmung der Apoptose ist möglicherweise auf die Bindung von Ca2+-Ionen und die konsekutive Hemmung der Caspase-3 zurückzuführen. In Frage steht, ob an der anti-apoptotischen Wirkung von TCTP noch weitere Mechanismen beteiligt sind. Völlig ungeklärt ist, wie TCTP, auch als „histamine-releasing factor“ bezeichnet, aus der Zelle gelangt. Eventuell handelt es sich dabei um einen akzidentiellen Vorgang, der durch die Interaktion mit Cytoskelettproteinen und Vesikeln zu Stande kommt. Es sind Effekte an B-Lymphozyten, eosinophilen und basophilen Granulozyten bekannt. Ob und über welche Rezeptoren TCTP auf diese Zellen wirkt, ist umstritten.

Die Homologie der Proteinstruktur zu dem Guanin-Nukleotid-freien Chaperon Mss4 hat zwar einerseits neue Aspekte zur TCTP-Funktion eingebracht, andererseits ergibt sich die Frage wie diese neuen Erkenntnisse mit den anderen beschriebenen Funktionen, Apoptosehemmung und Zellzyklusregulation, in Einklang zu bringen ist. Die durch die Mss4-Homologie implizierte Verbindung zum Vesikeltransport liefert zumindest eine mögliche Erklärung für das Auftreten von TCTP im Serum. Am wahrscheinlichsten für das extrazelluläre Auftreten dieses intrazellulären Proteins ist ein unspezifischer Transport im Rahmen von Vesikelbewegung.

Die Rolle von TCTP als ubiquitär vorkommendes, hochkonserviertes Protein, das in die [Seite 78↓]Regulation von Zellwachstum und Zelltod eingreift, ist plausibel. Wie aber ist es zu erklären, dass ein solches Protein einen so spezifischen Effekt wie die Histaminfreisetzung hervorrufen kann? Diese Frage ist derzeit nicht zu beantworten. Die Histaminfreisetzung aus isolierten Immunzellen ließ sich nur bei einem Teil der Patienten nachweisen (MacDonald et al. 1995). Das spricht dafür, dass gewisse weitere Voraussetzungen für die histaminfreisetzende Wirkung erfüllt sein müssen. Auch wenn nicht auszuschließen ist, dass es an der Zelloberfläche von Immunzellen spezifische Rezeptoren gibt, mit denen TCTP interagiert, so ist es doch wahrscheinlicher, dass es sich um eine Wechselwirkung mit IgE-Molekülen handelt. Im Hinblick auf die beschriebenen Immunphänomene durch TCTP aus Parasiten wie Plasmodien (MacDonald et al. 2001) kann man spekulieren, dass die Sensibilisierung gegen ein nicht-humanes TCTP eine Rolle spielt. In der Folge käme es durch die große Homologie zu einer Reaktion gegen körpereigenes TCTP. Mit großer Wahrscheinlichkeit handelt es sich bei der histaminfreisetzenden Wirkung nicht um eine spezifische und physiologische Reaktion, sondern eher um einen Nebeneffekt.

Die Daten bezüglich der intrazellulären TCTP-Lokalisation zeigen abweichende Ergebnisse. Neben einer cytoplasmatischen Lokalisation wurde in mehreren Studien auch eine Kernlokalisation für dieses Protein belegt, obwohl in der Proteinsequenz keinerlei Kernlokalisierungssignale vorhanden sind (Gachet et al. 1999, Guillaume et al. 2001, Li et al. 2001, Zhang et al. 2002). Einen Hinweis auf die mögliche Ursache dieser Diskrepanzen liefert die Beobachtung von Guillaume et al., dass die Kernlokalisation in den Keimzellstadien dominiert, die sich durch eine hohe mitotische Aktivität auszeichnen. Möglicherweise sind die Unterschiede durch die verschiedenen Proliferationsraten der verwendeten Zelllinien zu erklären. Eine Unterstützung dieser These wäre der Nachweis einer bevorzugten Kernlokalisation in den proliferationsaktiven Melanomzellen. Eventuell handelt sich nicht um eine klassische Kernlokalisation, sondern um eine Assoziation mit Cytoskelettproteinen im Bereich des Zellkerns während der Mitose. Ein weiterer denkbarer Weg ist die zellzyklusabhängige Wechselwirkung von TCTP mit Proteinen der Kernporen oder mit Proteinen, für die ein Shuttle in den Kern existiert.

Letztlich stellt sich die Frage, warum es ausgerechnet für ein Protein mit den oben beschriebenen Funktionen Sinn macht, auf translationeller Ebene reguliert zu werden. Erscheint es ökonomisch sinnvoll eine mRNA zu synthetisieren, um sie dann in translationsinaktiven mRNP-Komplexen zu lagern? Diese Art der Regulation ist attraktiv, da sie eine schnelle Anpassung an veränderte Wachstumsbedingungen ermöglicht. Der zeit- und energieaufwendige Vorgang der [Seite 79↓]Transkription wird umgangen. Zudem können mRNAs angepasst an die Bedürfnisse der Zelle aktiviert und wieder inaktiviert werden. Das ist weitaus schneller und effektiver als eine Regulation über mRNA-Neusynthese und Abbau. Hinzu kommt, dass ein anti-apoptotischer Faktor auch bei Zellschädigung noch aktivierbar sein sollte. Das ist über eine translationelle Regulation eher zu realisieren als über Transkriptionskontrolle. Die ansteigende intrazelluläre Calciumkonzentration als potentieller Modulator ist in diesem Zusammenhang überaus interessant.

Ist in Anbetracht der dargestellten Ergebnisse die Bezeichnung als translationell kontrolliertes Tumorprotein gerechtfertigt? Meiner Ansicht nach ist diese Bezeichnung, die sich aus den frühen Erkenntnissen zu diesem Protein ableitete, auch unter Berücksichtigung der neueren Erkenntnisse für dieses Protein passend. Einerseits weist sie darauf hin, dass es sich um ein Protein handelt, für dessen Synthese die translationelle Regulation eine besondere Bedeutung hat. Andererseits deutet der Name auf eine wichtige Funktion in der Regulation von Zellwachstum und Zelltod hin, die für die Pathophysiologie maligne transformierter Zellen von Bedeutung ist. Dessen ungeachtet spiegelt diese Bezeichnung nicht alle Aspekte wider. In jedem Fall ist TCTP ein prägnantes Beispiel für die Komplexität und Verflechtung biologischer Regulationsvorgänge.

5.4 Ausblick

Die in dieser Arbeit vorgestellten Ergebnisse leisten einen Beitrag zum Verständnis der molekularen Prozesse bei der translationellen Regulation des TCTP und können Ausgangspunkt für weiterführende Untersuchungen sein. An erster Stelle steht hierbei die Identifizierung und funktionelle Charakterisierung von weiteren UTR-bindenden Proteinen. Das vorgestellte humane Melanomzellsystem hat sich für diese Zwecke als geeignet erwiesen. Insbesondere stellt sich die Frage, welche Proteine in diesen Zelllysaten an die 5’UTR binden. Ihre Anreicherung und Identifikation mittels RNA-Affinitätschromatographie und Massenspektrometrie würde den Vergleich mit anderen 5’TOP-mRNAs und ihren bindenden Proteinen zulassen bzw. zur Entdeckung neuer bislang unbekannter 5’TOP-bindender Proteine führen. Die an der Kaninchen-TCTP-mRNA erarbeiteten Ergebnisse können hierfür eine wertvolle Hilfestellung sein. Die Bindungsmotive der RNA-bindenden Proteine können durch weitere Zerlegung der UTRs in einzelne Abschnitte und gezieltes Einfügen von Mutationen ermittelt werden.

Wichtige funktionelle Untersuchungen sind der Nachweis der gefundenen Proteine in RNA-Protein-Komplexen, beispielsweise durch Supershift-Experimente mit spezifischen Antikörpern, und das Testen der translationshemmenden Wirkung in in vitro Translationsexperimenten. [Seite 80↓]Neben den 5’UTR-bindenden Proteinen sind die Proteine von besonderem Interesse, die den starken translationshemmenden Effekt der 3’UTR2 vermitteln. Die Untersuchung von Polysomen und mRNP-Komplexen zusätzlich zu den cytoplasmatischen Fraktionen kann den Anteil translationsinaktiver TCTP-mRNA in den jeweiligen Zelllinien abschätzen. Letztlich müssen die in vitro erarbeiteten Ergebnisse an in vivo Systemen durch Zelltransfektion und Proteinexpressionsstudien überprüft werden.

Die Assoziation der TCTP-mRNA mit Cytoskelettproteinen und in Frage kommenden Adapterproteinen kann durch parallele Untersuchungen von Zellen mit Immunhistochemie und in situ Hybridisierung untersucht werden. Interessant ist auch die Frage, ob sich die beiden Messenger in ihrer intrazellulären Lokalisation unterscheiden und ob sich die zellzyklusabhängige Lokalisation des Proteins auch in der mRNA-Lokalisation widerspiegelt.

Der Einfluss des Calciums auf die Translationseffektivität kann durch Zugabe eines Ca2+-Ionophors zu den Zellkulturen untersucht werden. In diesem Zusammenhang ist auch die Frage interessant, inwieweit Rapamycin, das bekanntermaßen die Translation von 5’TOP-mRNAs hemmt, die Translation der TCTP-mRNA einerseits und das Wachstumsverhalten der Tumorzellen andererseits beeinflusst. Schließlich gilt es, die Frage zu beantworten, wie die RNA-bindenden Proteine mit der allgemeinen Translationsmaschinerie in Wechselwirkung treten und welche Signalkaskaden für die Regulation dieser Interaktionen verantwortlich sind. Die daran beteiligten Signaltransduktionswege können durch den Einsatz spezifischer Hemmstoffe untersucht werden.

Bezüglich der Funktion des TCTP bleiben weiterhin viele Fragen offen. Es muss geklärt werden, ob der anti-apoptotische Effekt allein durch eine Verminderung der intrazellulären Ca2+-Konzentration zu Stande kommt oder ob hier die Interaktion des TCTP mit anderen Proteinen eine wesentliche Rolle spielt. Durch Untersuchung von Protein-Protein-Wechselwirkungen können potentielle Bindungspartner des TCTP identifiziert werden.

Unklar ist weiterhin auch, wie die histaminfreisetzende Wirkung des TCTP zu erklären ist und ob dieser Effekt bei der Pathogenese von Allergien tatsächlich eine wichtige Rolle spielt. Wie kann es zur Wechselwirkung eines körpereigenen Proteins mit IgE-Antikörpern auf Mastzellen und Basophilen kommen? Wie und aus welchen Zellen gelangt dieses intrazelluläre Protein ins Serum?

Bedingt durch den regen Fortschritt auf den Gebieten von Genom- und Proteomforschung eröffnen sich eine Reihe interessanter Perspektiven. Vergleiche von Expressionsmustern von [Seite 81↓]Zellen, die verschiedenen Stimuli ausgesetzt wurden, gestatten Rückschlüsse auf gleichermaßen regulierte Gene und beteiligte Regulationsmechanismen.


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27.11.2003