Die Regulation des humanen Lipopolysaccharid Bindenden Proteins (hLBP)

Dissertation

zur Erlangung des akademischen Grades
doctor rerum naturalium
(Dr. rer. nat.)
im Fach Biologie

eingereicht an der
Mathematisch-Naturwissenschaftlichen Fakultät I
der Humboldt-Universität zu Berlin

von
Werner Hallatschek

geboren am 03.10.1961 in Öhringen (Baden-Württemberg)

Präsident der Humboldt-Universität zu Berlin
Prof. Dr. Jürgen Mlynek

Dekan: Dekan der Mathematisch-Naturwissenschaftlichen Fakultät I
Prof. Dr. Thomas Buckhout

Gutachter:
1. Prof. Dr. Ralf Schumann
2. Prof. Dr. Richard Lucius
3. Prof. Dr. Dr. Ernst Rietschel

Tag der mündlichen Prüfung: 20.10.2004

Abstrakt

Das Lipopolysaccharid Bindende Protein (LBP) ist ein überwiegend in der Leber synthetisiertes Akutphaseprotein. Es bindet den Zellwandbestandteil Lipopolysaccharid (LPS) Gram-negativer Bakterien und transportiert es zu zellulären Rezeptoren, wodurch das angeborene Immunsystem aktiviert wird.

In dieser Arbeit wird die Regulation der LBP-Expression in Interleukin (IL)-1, IL-6 und Dexamethason (Dex) stimulierten humanen Hepatomzelllinien HuH-7 und HepG2 untersucht. Der wichtigste Stimulator ist dabei IL-6, dessen Wirkung über die Transkriptionsfaktoren (TF) Stat-3, C/EBP-beta und AP-1 vermittelt wird. Für alle 3 TF konnten aktive Bindungsstellen auf dem LBP-Promotor nachgewiesen werden. Für IL-1-Effekte die u. a. über den TF NF-kappaB vermittelt werden, konnten ebenfalls aktive Bindungsstellen nachgewiesen werden. Die Wirkung von Dex wird über Glucocorticoid Responsive Elements (GREs) vermittelt. Auf dem LBP-Promotor befinden, sich wie gezeigt werden konnte, mehrere aktive GREs, wobei einige verstärkend und einige hemmend wirken. Eine zu beobachtende Synergiewirkung von Dex und IL-6 wird durch die Aufregulation des IL-6-Rezeptors durch Dex verursacht.

Die LBP-Expression kann durch TGF (Transforming Growth Factor)-beta gehemmt werden. Der TGF-beta-Signalweg über Smads ist in den Hepatomzellen aktiv, vermittelt aber nicht den TGF-beta-Hemmeffekt, sondern eine geringe stimulierende Wirkung, die bei alleiniger TGF-beta-Inkubation auftritt. Die inhibierende Wirkung von TGF-beta wird durch Gfi-1- und AP-1-Bindungsstellen vermittelt. Die Gfi-1-Bindungsstelle nimmt dabei, wie hier erstmals gezeigt werden konnte, eine herausragende Stellung ein.

Die Aufklärung der LBP-Regulation und dabei besonders die Hemmung der LBP-Expression kann mittelfristig dazu beitragen, den klinischen Verlauf von inflammatorischen und infektiösen Erkrankungen zu beeinflussen und bietet daher Potenzial für neue Therapieansätze.

Eigene Schlagworte: LPS binding protein (LBP) , Lipopolysaccharid (LPS), Interleukin-6 (IL-6), Dexamethason (Dex) , Transforming Growth Factor-beta (TGF-beta), Aktivatorprotein-1 (AP-1), (C)CAAT/enhancer binding protein-beta (C/EBP-beta), Signal transducer and activator of transcription 3 (Stat-3), Nuclear factor kappa B (NF kappa B), Glucocorticoid responsive element (GRE), Growth factor independence-1 (Gfi-1)

Abstract

Lipopolysaccharide (LPS) binding protein (LBP) is an acute phase protein with the ability to bind and transfer LPS of Gram-negative bacteria. This soluble pattern recognition molecule represents an important defense principle of the host. Regulation of the hepatic acute phase response and its termination are important mechanisms for limiting systemic inflammatory activity of the host.

Here were analyze the cooperation of Interleukin (IL)-1, IL-6, and Dexamethasone (Dex) at LBP expression in the hepatoma cell lines HuH-7 and Hep G2. The major inducer of LBP expression is IL-6. Within the LBP promoter numerously highly consensus binding sites such as AP-1, C/EBP-beta, and STAT3 are present, that confer transcriptional activity as shown by truncation and mutation experiments. Additionally, activate NF-kappaB sites activated by IL-1 were detected at the LBP promoter.

By mutation experiments of the promoter furthermore were found differentially active glucocorticoid response elements (GREs). The promoter contains GREs enhancing the activity as well as inhibitory ones. The enhancing effect towards LBP expression by Dex was mediated by IL-6. Dex stimulated the expression of the IL-6 receptor and therefore upregulated the IL-6 pathway.

Transforming Growth Factor (TGF)-beta is able to inhibit LBP expression in stimulated cells. An AP-1 binding site was identified mediating inhibitory TGF-beta effects towards LBP promoter activity. Furthermore it was shown that a growth factor independence (Gfi)-1 binding site localized near the AP-1 site is essential for mediating the TGF-beta inhibitory effect. The relevancy of the Gfi-1 site fore mediating TGF-beta effects indicates a novel mechanism for understanding inhibitory TGF-beta effects at the transcriptional level.

In summary the complex regulation of LBP were elucidate which may help to eventually develop novel intervention strategies for acute phase, sepsis, and septic shock.

Keywords: LPS binding protein (LBP) , lipopolysaccharid (LPS), interleukin-6 (IL-6), dexamethasone (Dex) , transforming growth factor beta (TGF-beta), activator protein-1 (AP-1), (C)CAAT/enhancer binding protein-beta (C/EBP-beta), signal transducer and activator of transcription 3 (Stat-3), nuclear factor kappa B (NF kappa B), glucocorticoid responsive element (GRE), growth factor independence-1 (Gfi-1)

Inhaltsverzeichnis

• I  Einleitung
  • 1 Das Immunsystem
    • 1.1 Die angeborene Immunantwort
    • 1.2 Die adaptive Immunantwort
    • 1.3 Lipopolysaccharid (LPS)
    • 1.4  Lipopolysaccharid Bindendes Protein
    • 1.5 CD14, Toll-like Rezeptoren und MD-2
    • 1.6 Die Akutphasereaktion
    • 1.7 Sepsis und septischer Schock
  • 2 Zytokine und Glukokortikoide
    • 2.1 IL-6
    • 2.2 IL-1
    • 2.3 TNF-α
    • 2.4 Dexamethason
    • 2.5 IL-10
    • 2.6 TGF-β
  • 3  Regulation der Genexpression
    • 3.1 Grundlagen der transkriptionellen Aktivierung
    • 3.2 AP-1
    • 3.3 C/EBP
    • 3.4 Stat
    • 3.5 NF-κB
    • 3.6 Smads
    • 3.7  Gfi-1
    • 3.8 GRE und andere GR-bindende DNA-Regionen
    • 3.9 Posttranskriptionelle Regulation
  • 4  Zielstellung der Arbeit
• II  Material und Methoden
  • 1 Kultur eukaryotischer Zellen
    • 1.1 Nährlösungen, Zusätze und Zelllinien
    • 1.2 Kultivierung
    • 1.3 Mycoplasmen
    • 1.4  Stimulation der Zelllinien
  • 2 Arbeiten mit E. coli Bakterien
    • 2.1 Plasmide und Bakterienkultur
    • 2.2 Transformation
    • 2.3  Präparation von Plasmid-DNA
    • 2.4 Konzentrationsbestimmung von Nukleinsäuren
    • 2.5 Restriktionsspaltung von DNA
    • 2.6 Elektrophoretische Auftrennung der DNA
  • 3 Luciferase Reportergen-Assay
    • 3.1 Transfektion
    • 3.2 Luciferase- und β-Galaktosidasemessung
    • 3.3 Auswertung
  • 4 Mutation des LBP-Promotors
    • 4.1  Auswahl der zu mutierenden DNA-Sequenzen
    • 4.2 Kriterien der Mutation und Übersicht
    • 4.3  Mutationsassay
    • 4.4 Probeverdau mit Restriktionsenzymen
  • 5  EMSA
    • 5.1 Zellkultur und Stimulation
    • 5.2 Isolierung nukleärer Proteine
    • 5.3 Hybridisierung und Markierung der Oligonukleotide
    • 5.4 DNA-Protein-Inkubation, Gellauf und Visualisierung
  • 6 LBP-ELISA
    • 6.1 Zellkultur und Zellstimulation
    • 6.2  Durchführung des ELISA
  • 7 Northern-Blot Analyse und RT-PCR
    • 7.1 Zellkultur und Zellstimulierung
    • 7.2  Isolierung der RNA
    • 7.3 Gelelektrophorese der RNA
    • 7.4 Übertragen der RNA auf eine Nylonmembran („blotten“)
    • 7.5 Herstellung der cDNA-Sonde
    • 7.6 Radioaktive Markierung der Sonde
    • 7.7 Hybridisierung von RNA und Sonde
    • 7.8 Mehrfachhybridisierung
    • 7.9 Reverse Transkription (RT)-PCR
  • 8 Western-Blot-Analyse und p44/42-Kinase-Assay
    • 8.1 Zellkultur und Zellstimulierung
    • 8.2 Isolierung der zytoplasmatischen Proteine
    • 8.3 Gel und Gellauf
    • 8.4 „Blotten“ und Detektion
    • 8.5 Strippen, neue Antikörperbindung
    • 8.6 p44/42-Kinase-Assay
  • 9 FACS-Messungen
    • 9.1 Zellkultur und -stimulierung
    • 9.2 Antikörperinkubation und Fixierung
    • 9.3 Messung und Auswertung
  • 10  Auswertung und Darstellung der Ergebnisse
• III  Ergebnisse
  • 1 Die Wirkung von IL-1, IL-6, Dex und TNF-α auf die LBP-Expression
    • 1.1 Der Einfluss von IL-1, IL-6 und Dex auf Transkription, RNA-Akkumulation und LBP-Synthese
    • 1.2 Die Wirkung von TNF-α auf die Aktivität des LBP-Promotors
    • 1.3  Kotransfektion verschiedener C/EBP-Varianten in Hepatomzellen
    • 1.4  Mutation von potentiellen C/EBP-β- und Stat-3-Bindungsstellen auf dem LBP-Promotor
    • 1.5  Die Rolle von AP-1-Bindungsstellen im LBP-Promotor
  • 2  Die Vermittlung der IL-1-Effekte auf die LBP-Expression
    • 2.1 IL-1-Effekte in der Signaltransduktion von Hepatomzellen
    • 2.2 Der NF-κB-Signalweg in Hepatomzelllinien
    • 2.3  Die Aktivierbarkeit des LBP-Promotors durch p65
    • 2.4  NF-κB-Bindungsstellen auf dem LBP-Promotor
  • 3  Die Ursachen der Dexamethason-Wirkung auf die LBP-Expression
    • 3.1 Dex-Bindungsstellen auf dem LBP-Promotor
    • 3.2 Die Wirkung von NF-IL6-Vektoren auf die Dex-Aktivität
    • 3.3 Der Einfluss von Dex auf die Expression des IL-6-Rezeptors und von gp130
    • 3.4 Die Wirkung von Dex auf den IL-6-induzierbaren Stat-Signalweg
  • 4  Die Wirkung von IL-10 und TGF-β1 auf die LBP-Expression
    • 4.1 Analyse von IL-10-Effekten auf die LBP-Expression
    • 4.2 Die Wirkung von TGF-β1 auf die LBP-Proteinkonzentration in Kulturüberständen
    • 4.3  LBP-Promotoraktivität in stimulierten Hepatomzellen nach TGF-β1-Inkubation
  • 5 Smad- und AP-1-Bindungsstellen bei der Vermittlung der TGF-ß1-Wirkung
    • 5.1 Smad-Bindungsstellen auf dem LBP-Promotor
    • 5.2  Lokalisation der TGF-β1-Hemmeffekte auf dem LBP-Promotor
    • 5.3 Mediation des TGF-β1-Hemmeffekts durch die AP-1-Bindungsstelle –540 bp
  • 6  Die Funktion von Gfi-1 bei der Vermittlung des TGF-β1-Hemmeffektes
    • 6.1 Analyse der Gfi-1-Bindungsstelle bei -556 bp
    • 6.2 Die Wechselwirkung der Gfi-1-, AP-1- und NF-κB-Bindungsstellen
    • 6.3 Der Einfluss weiterer Gfi-1-Bindungsstellen auf den LBP-Promotor
    • 6.4 Kotransfektion eines pGfi-1-Expressionsvektors in die Hepatomzellen
    • 6.5 Die Wirkung der pGfi-1 Mutanten pGfi-1^Zn+ und pGfi-1^Zn-- auf den LBP-Promotor
    • 6.6 Gfi-1-Expression in der Hepatomzelllinie HepG2
    • 6.7 LBP-Serumkonzentrationen in Gfi-1-Knockout-Mäusen
  • 7 Die Expression von LBP in der Lungenepithelzelllinie A-549
  • 8 Übersicht der Ergebnisse
• IV  Diskussion
  • 1  Die Aktivierung der LBP-Expression
    • 1.1  IL-6 als Hauptinduktor der LBP-Expression
    • 1.2 Die IL-1-Wirkung: Der NF-κB-Signalweg und die Synergie mit IL-6
    • 1.3  Die Vermittlung der Dex-Effekte und der Synergieeffekt von IL-6 und Dex
  • 2 Die Hemmung der LBP-Expression
    • 2.1 Die Wirkung von TGF-β1 auf die LBP-Expression
    • 2.2 Gfi-1 als regulatorisches Element des LBP-Promotors
    • 2.3 Die Inhibierung aktiver Promotoren
  • 3 Klinische Bedeutung von LBP und seiner Regulation
• V  Zusammenfassung
• Literaturverzeichnis
• Abkürzungsverzeichnis
• Publikationen
• Lebenslauf
• Danksagung
• Erklärung

Tabellen

• Tab. 1: Verwendete Zelllinien
• Tab. 2: Verwendete Plasmide
• Tab. 3: Sequenz des LBP-Promotors und untersuchter TF-Bindungsstellen
• Tab. 4: Mutierte, potentielle TF-Bindungsstellen auf dem LBP Promotor
• Tab. 5: Verwendete Oligonukleotide zur Mutation des LBP-Promotors
• Tab. 6: Verwendete Antikörper
• Tab. 7: Smad-Konsensussequenzen und potentielle Bindungsstellen
• Tab. 8: GR-Konsensussequenzen und potentielle GR-Bindungsstellen

Bilder

• Abb. 1 : Chemische Struktur von LPS  LPS besteht aus dem Polysaccharidanteil (O-Antigen, äußere Kernregion, innere Kernregion) und Lipid A. Das O-Antigen wird aus bis zu 50 (n) Oligosacchariden, die sich aus drei bis acht verschiedenen Einzelzuckern zusammensetzen, gebildet. Der äußere Kern enthält die häufig vorkommenden Saccharide Glukose, Galaktose, Glukosamin und Galaktosamin, während der innere Kern den in der Natur selten synthetisierten Zucker Ketodesoxyoctonsäure (Kdo) und Heptosereste, die phosphoryliert sein können, enthält. Das Grundgerüst des Lipid A ist ein phosphoryliertes Glukosamindisaccharid, welches vier Fettsäurereste trägt, von denen zwei wiederum sekundär acyliert sind.
• Abb. 2 : Computersimulation der LBP-Struktur  Das 3-dimensionale Modell der potentiellen LBP-Struktur basiert auf kristallografischen Daten des verwandten BPI. Demnach hat LBP eine bumerangartige Form. Vom N-terminalen Ende her, das sich hier in der Abbildung in der Mitte oben befindet, verläuft die Aminosäurenkette zunächst nach links. In dieser N-terminalen Region befindet sich der LPS-bindende Bereich. Rechts in der C-terminalen Region befinden sich wahrscheinlich die Bindungsstellen für CD14 und/oder der Lipoprotein-bindende Bereich. Das C-terminale Ende befindet sich in der Mitte unten [41].
• Abb. 3 : LPS-aktivierte Immunantwort und LBP-Regulation
  Freigesetztes LPS von Gram-negativen Bakterien wird vom LPB/CD14-Komplex erkannt und unter Beteiligung von MD-2 zum TLR-4 transportiert. Über eine komplexe Signaltransduktionskette wird unter anderem NF-κB aktiviert. Dies führt u.a. zur Biosynthese und Sekretion von IL-1, IL-6 und TNF-α aus Makrophagen. Die Zytokine stimulieren in Hepatozyten die LBP-Synthese und Freisetzung. Das synthetische Glukokortikoid Dex wirkt ebenfalls verstärkend auf die LBP-Stimulation. In einem positiven Rückkopplung verstärkt die nun erhöhte LBP-Konzentration die Reaktion auf LPS. TGF-β wirkt hemmend auf die LBP-Expression. Ein weiterer potentiell LBP-inhibierender Faktor ist IL-10. Der Bereich mit dem sich die vorliegende Arbeit befasst ist in Rottönen gefärbt.
• Abb. 4 : IL-1, IL-6 und Dex stimulieren die LBP-Expression synergistisch  HepG2-Hepatomzellen wurden mit einer Dichte von 0,5 x 10⁵ Zellen/Loch in einer 24-Lochplatte ausgesät und am nächsten Tag in 200 µl/well Kulturmedium für 48 Stunden mit den angegebenen Konzentrationen von IL-1, IL-6 und Dex stimuliert. Die Überstände wurden abgenommen und ein hLBP-ELISA, wie in Material und Methoden beschrieben, durchgeführt. Angegeben ist die LBP-Konzentration in den Kulturüberständen.
• Abb. 5 : LBP-mRNA-Akkumulation in stimulierten HuH-7 Zellen  HuH-7-Zellen wurden für 48 bzw. 72 Stunden mit den angegebenen Konzentrationen von IL-1, IL-6 und Dex stimuliert. Anschließend wurden die Zellen lysiert und die RNA isoliert. Die Abbildung zeigt einen Northern-Blot, durchgeführt wie in Material und Methoden beschrieben und mit einer ³²P-γ-ATP markierten LBP-Sonde hybridisiert. Nach dem Entfernen („Strippen“) der LBP-Sonde wurde der Blot mit GAPDH hybridisiert, dessen RNA-Konzentration als interner Abgleich diente.
• Abb. 6 : IL-1, IL-6 und Dex aktivieren die LBP-Promotoraktivität  HepG2-Zellen wurden mit dem vollständigen, 1780 bp langen LBP-Promotor/Luciferase-Konstrukt transfiziert und am darauf folgenden Tag in angegebener Weise mit IL-1, IL-6 und Dex für 48 Stunden stimuliert. Anschließend wurden die Zellen lysiert und die Luciferaseaktivität gemessen. Die β-Galaktosidase (β-Gal)-Aktivität eines kotransfizierten und konstitutiv exprimierten RSV-β-Gal Vektors wurde ebenfalls gemessen und die Luciferaseaktivität damit normalisiert. Dieses Verhältnis von Luci- zu β-Gal-Aktivität (Luci / β-Gal) wird hier und im folgenden als relative Luciferaseaktivität (RLA) bezeichnet.
• Abb. 7 : Der Effekt von TNF-α auf die LBP-Promotoraktivität  HuH-7-Zellen wurden nach der Transfektion mit dem LBP-Promotor/Luciferase-Konstrukt wie gezeigt mit IL-1, IL-6 und Dex für 48 Stunden stimuliert und zusätzlich mit TNF-α inkubiert. Die gemessene Luciferaseaktivität ist β-Gal-normalisiert (relative Luciferaseaktivität, RLA).
• Abb. 8 : C/EBP‑β von Huhn und Ratte aktivieren den LBP-Promotor  HuH-7-Zellen wurden neben dem LBP-Promotor/Luciferase-Konstrukt mit den Expressionsvektoren NF-M (C/EBP‑β des Huhns, A linke Seite), NF-M 229 (transdominante Negativmutante des NF-M mit einer Mutation bei AS 229, A rechts) und CRP2 (C/EBP-β der Ratte, B) in den angegebenen Konzentrationen transfiziert. Die Zellen wurden nach der Transfektion für 48 Stunden kultiviert und anschließend die Luciferaseaktivität gemessen. Die mit NF-M 229 transfizierten Zellen wurden zusätzlich am Tag nach Transfektion mit 50 U/ml IL-1, 500 U/ml IL-6 und 1 µM Dex für 48 Stunden stimuliert. Dargestellt ist die relative Luciferaseaktivität (RLA).
• Abb. 9 : C/EBP-Bindungsstellen vermitteln die IL-6-induzierte Aktivierung des LBP-Promotors  Drei potentielle C/EBP-Bindungsstellen wurden wie dargestellt durch Punktmutation modifiziert (unterstrichen), wobei die Mutation in trunkierte Promotorelemente eingefügt wurde, um den Einfluss weiterer im 5´-Bereich liegender C/EBP-Elemente auszuschließen. Die LBP-Promotor/Luciferase-Konstrukte wurden wie dargestellt transfiziert und mit 50 U/ml IL-1, 500 U/ml IL-6 und 1 µM Dex oder mit 500 U/ml IL-6 für 48 Stunden stimuliert. Die anschließende Luciferasemessung wurde mit β-Gal verrechnet. Dargestellt ist der Quotient der Luciferasemessung aus IL-1, IL-6 und Dex bzw. aus nur IL-6-stimulierten Zellen und der Aktivität aus unstimulierten Zellen. Dadurch erhält man die x-fache Aktivität des stimulierten Promotors verglichen mit dem unstimulierten Promotor. *Signifikanter Unterschied gegenüber wt.
• Abb. 10 : Analyse von zwei Stat-3-Bindungsstellen
  Zwei potentielle Stat-3-Bindungsstellen (Stat I bei –447 bp und Stat II bei –399 bp) wurden in der LBP-Promotor-Trunkation –463 bp mutiert. Die x-fache Promotoraktivität nach Stimulation mit IL-6 oder IL-1, IL-6 und Dex wurde im Vergleich zu der Aktivität im unstimulierten Promotor ermittelt. *Signifikanter Unterschied gegenüber wt mit gleicher Stimulation
• Abb. 11 : AP-1-Bindungsstellen vermitteln die Aktivierung des LBP-Promotors  Sechs potentielle AP-1-Bindungsstellen wurden, wie in der linken Hälfte der Abbildung dargestellt, mutiert. Die Konstrukte wurden in HuH-7-Zellen transfiziert und für 48 Stunden mit IL-6 (500 U/ml) oder IL-1 (50 U/ml), IL-6 (500 U/ml) und Dex (1µM) stimuliert. Dargestellt ist die x-fache Promotoraktivität der stimulierten Zellen im Vergleich zu unstimulierten Zellen. *Signifikanter Unterschied gegenüber wt mit gleicher Stimulierung
• Abb. 12 : Aktivierung der p44/42-Kinaseaktivität in Hepatomzellen  HuH-7-Zellen wurden mit 50 U/ml IL-1, 500 U/ml IL-6 und 1 µM Dex wie angezeigt für 20 min stimuliert und die zytoplasmatischen Proteine isoliert. Die Messung der p42/44-Kinaseaktivität erfolgte mit einem Messsystem von Amersham. Dabei wird das ³²P-Isotop aus ³²P-γ-ATP auf ein spezifisches Peptid übertragen. Die Transferrate, bestimmt im Szintillationszähler (counts per minute, CPM), entspricht dabei der enzymatischen Aktivität von p44/42 (Mittel aus Dreifachwerten +/- Standardabweichung).
• Abb. 13 : IL-1-Inkubation steigert die Phosphorylierung von p38 (pp38)  HepG2-Zellen wurden für 20 min mit IL-1 (50 U/ml), IL-6 (500 U/ml) und Dex (1 µM) wie angezeigt stimuliert. Die zytoplasmatischen Proteine wurden isoliert, elektrophoretisch aufgetrennt, auf eine Nylon-Membran transferiert und fixiert. Die p38-Kinase bzw. die phosphorylierte p38-Kinase (pp38) wurde durch spezifische Antikörper nachgewiesen.
• Abb. 14 : IL-1 aktiviert JNK und wirkt mit IL-6 synergistisch  HuH-7 Zellen wurden für 20 min wie angezeigt mit IL-1 (50 U/ml), IL-6 (500 U/ml) und Dex (1 µM) stimuliert, die zytoplasmatischen Proteine isoliert, elektrophoretisch aufgetrennt, und auf eine Nylonmembran übertragen. Anschließend wurde der Blot mit einem spezifischen Antikörper gegen phosphoryliertes JNK (pJNK) inkubiert.
• Abb. 15 : Der NF- κ B-Signalweg ist in HuH-7-Hepatomzellen aktiv  A: HuH-7-Zellen wurden mit dem ELAM/Luciferase-Konstrukt transfiziert, am nächsten Tag für 48 Stunden mit IL-1 (50 U/ml), IL-6 (500 U/ml) und Dex (1 µM) stimuliert und anschließend die Luciferaseaktivität bestimmt. Dargestellt ist die β-Gal-normalisierte, relative Luciferaseaktivität (RLA). B: HuH-7-Zellen wurden mit 50 U/ml IL-1, 500 U/mI IL-6 und 1 µM Dex für 20 min bis 4 Stunden stimuliert und anschließend die nukleären Proteine isoliert. 4 µg nukleäre Proteine wurden mit einem ³²P-γATP-markierten Oligonukleotid, das die Konsensussequenz von NF-κB trägt, für 30 min inkubiert und anschließend elektrophoretisch von ungebundenen Oligonukleotiden getrennt. Die Abbildung zeigt die NF-κB-spezifische Bande nach Stimulation über den angegebenen Zeitraum.
• Abb. 16 : Expressionsvektor p65 erhöht die LBP-Promotoraktivität  Der LBP-Promotor/Luciferase-Vektor wurde zusammen mit einem p65-Expressionsvektor wie angegeben in verschiedenen Konzentrationen in HuH-7-Zellen transfiziert. Nach 48 Stunden Kultivierung wurde die Luciferaseaktivität gemessen und β-Gal-normalisiert (relative Luciferaseaktivität, RLA)
• Abb. 17 : NF- κ B-Bindungsstellen auf dem LBP-Promotor sind aktiv  Zwei potentielle NF-κB -Bindungsstellen auf dem LBP-Promotor wurden mutiert: Bei NFkB I (–1701 bp) wurden Punktmutationen eingefügt, bei NFkB II (–515 bp) wurde die Bindungsstelle deletiert. Die beiden Mutationen wurden in trunkierte LBP-Promotorelemente eingefügt, die die Bindungsstellen nahe an ihrem 5´-Ende tragen. Die mutierten Promotoren und die wt-Trunkationen wurden in HuH-7 Zellen transfiziert und am nächsten Tag mit 50 U/ml IL-1, 500 U/ml IL-6 und 1 µM Dex oder mit 500 U/ml IL-6 für 48 Stunden stimuliert und anschließend die Luciferaseaktivität gemessen. Dargestellt ist die x-fache Promotoraktivität. *Signifikanter Unterschied gegenüber wt mit gleicher Stimulation.
• Abb. 18 : Die potentielle NF- κ B-Bindungsstelle NFkB II bindet spezifisch p50 und p65  HepG2 Zellen wurden für 20 min mit 50 U/ml IL-1, 500 U/ml IL-6 und 1 µM Dex stimuliert und anschließend die nukleären Proteine isoliert. Ein ³²P-markiertes Oligonukleotid, das die LBP-Promotorsequenz bei –515 repräsentiert (NFkB II), wurde mit den nukleären Proteinen inkubiert. Zusätzlich wurde mit nicht markierten, „kalten“ Oligonukleotiden inkubiert, welche die LBP-Sequenz bei –515 bp (spez.) oder eine zufällige Sequenz (unsp.) enthielten. Weiterhin wurden die Proben mit den Antikörpern Ak p65, Ak p53, Ak p52 und Ak p50 inkubiert um den sogenannten „Supershift“ zu erzielen.
• Abb. 19 : Zwei GRE-Bindungsstellen vermitteln eine Hemmung des LBP-Promotors  Der vollständige LBP-Promotor mit einer Länge von 1768 bp wurde an den Positionen –1672 bp und –108 bp an den unterstrichenen Stellen mutiert. Die beiden mutierten LBP-Promotor/Luciferasekonstrukte wie auch der wt-Promotor wurden in HuH-7 transfiziert und für 48 Stunden mit IL-6 und IL-1 + IL-6 jeweils mit und ohne 1 µM Dex stimuliert. Die Grafik zeigt die x‑fache Promotoraktivität nach Dex-Inkubation. Stimuliert wurde mit 50 U/ml IL-1, 500 U/ml IL-6 und 1 µM Dex. *Signifikanter Unterschied gegenüber wt mit gleicher Stimulation.
• Abb. 20 : Analyse weiterer potentieller GRE-Bindungsstelle n  Die Punktmutationen wurden wie dargestellt an den potentiellen GRE-Bindungsstellen in trunkierte LBP-Promotorelemente eingefügt und anschließend in HepG2-Zellen transfiziert. Die Zellen wurden für 48 Stunden mit 50 U/ml IL-1, 500 U/ml IL-6 und +/- 1 µM Dex stimuliert. Angegeben ist das Verhältnis der Promotoraktivität nach Stimulation + Dex zu der Aktivität nach Stimulation - Dex. *Signifikanter Unterschied gegenüber wt.
• Abb. 21 : NF-IL6-Transfektion und Dex-Inkubation  Die Zelllinie HuH-7 wurde mit dem LBP-Promotorkonstrukt transfiziert und zusätzlich mit jeweils 1 µg/Ansatz Expressionsvektor NF-IL6 vom Huhn (NF-M) oder der Ratte (CRP2) kotransfiziert. Am nächsten Tag wurde mit 0, 0,3 und 3 µM Dex für 48 Stunden stimuliert; zusätzlich wurde als Kontrolle mit IL-6 (ohne Kotransfektion) stimuliert. Dargestellt ist die x-fache Promotoraktivität nach Dex-Inkubation im Vergleich zu den Ansätzen ohne Dex.
• Abb. 22 : Der Einfluss von Dex auf die Expression von IL-6R und gp130  HepG2-Zellen wurden mit 1 µM Dex für 0 bis 8 Stunden stimuliert und anschließend jeweils mit einem Antikörperpärchen inkubiert, das der Detektion von IL-6R und gp130 diente. Aus der sich anschließenden FACS-Messung wurden die durchschnittlichen Fluoreszenzwerte grafisch dargestellt.
• Abb. 23 : Dex stimuliert die Aktivierung von Stat-1 und Stat-3 in HuH-7-Zellen  HuH-7-Zellen wurden mit 50, 500 oder 5000 U/ml IL-6 für 20 min behandelt. Davor wurden die Zellen wie dargestellt von 20 min bis 24 Stunden mit 1 µM Dex vorinkubiert. Die anschließend isolierten zytoplasmatischen Proteine wurden elektrophoretisch aufgetrennt und auf einer Nylonmembran fixiert. Die Detektion von pStat-1 und pStat-3 erfolgte mit spezifischen Antikörpern, wie in Material und Methoden beschrieben.
• Abb. 24 : IL-10 hat keinen Einfluss auf die transkriptionelle Aktivität von LBP in Hepatomzellen  HuH-7 Zellen wurden mit dem LBP-Promotor/Luciferase-Konstrukt transfiziert und wie angegeben für 48 Stunden mit IL-1, IL-6 und Dex stimuliert. Gleichzeitig wurden die Zellen mit 0, 1, 10 oder 100 µg/ml IL-10 inkubiert. Dargestellt ist die relative Luciferaseaktivität (RLA).
• Abb. 25 : TGF-β1 hemmt die LBP-Freisetzung aus stimulierten HuH-7 Zellen  A: HuH-7-Zellen wurden mit IL-1, IL-6 und Dex wie angegeben stimuliert. Zusätzlich wurden die Zellen zeitgleich mit 0 bis 5 ng/ml TGF-β1 für 48 Stunden inkubiert. B: HuH-7-Zellen wurden maximal mit 50 U/ml IL-1, 500 U/ml IL-6 und 1 µM Dex stimuliert und gleichzeitig mit den verschiedenen TGF-β1-Konzentrationen inkubiert. Die Kulturdauer betrug 12, 24, 48 oder 72 Stunden. C: Die Zellen wurden maximal stimuliert und mit zunehmenden TGF-β1-Konzentrationen für 48 Stunden inkubiert. TGF-β1 wurde entweder 4 Stunden vor, gleichzeitig oder 1,5 bzw. 3 Stunden nach den Stimulanzien in die Zellkultur gegeben. Nach Abschluss der Stimulationsreihen wurde in den Zellkulturüberständen mit einem hLBP-ELISA die LBP-Konzentration gemessen.
• Abb. 26 : TGF-β1 hemmt die LBP-Promotoraktivität in stimulierten HuH-7-Zellen  HuH-7 Zellen wurden mit dem LBP-Promotor/Luciferase-Konstrukt transfiziert und mit IL-1, IL-6 und Dex stimuliert. Zusätzlich wurden mit verschiedenen Konzentrationen von TGF-β1 inkubiert. A: TGF-β1 wurde mit den Stimulanzien zusammen verabreicht und für 48 Stunden kultiviert. Die Stimulation wurde variiert wie angegeben. B: Maximale Stimulierung mit 50 U/ml IL-1, 500 U/ml IL-6 und 1 µM Dex und gleichzeitig Inkubation von TGF-β1. Variiert wurde die Kulturdauer wie angegeben. C: Die Zellen wurden maximal für 48 Stunden stimuliert und TGF-β1 wie angegeben gleichzeitig, oder nach den Stimulanzien verabreicht. Nach Abschluss der Stimulation wurde die Luciferaseaktivität gemessen und β-Gal-normalisiert (relative Luciferaseaktivität, RLA)
• Abb. 27 : TGF-β1 verstärkt die LBP-Promotoraktivität in unstimulierten Zellen  HuH-7 Zellen wurden mit dem LBP-Promotor/Luciferase-Konstrukt transfiziert und anschließend mit TGF-β1 in Konzentrationen von 0 bis 5 ng/ml für 48 Stunden inkubiert (keine Stimulation mit Zytokinen und Dex). Anschließend wurde die Luciferaseaktivität gemessen. Dargestellt ist die β-Gal-normalisierte relative Luciferaseaktivität (RLA).
• Abb. 28 : Eine Smad-Bindungsstelle vermittelt die aktivierende Wirkung von TGF-β1  Smad I (-303 bp) und Smad II (- 1294 bp) wurden wie dargestellt auf dem LBP-Promotor mutiert und das Promotor/Luciferase-Konstrukt in HepG2-Zellen transfiziert. Die Zellen wurden mit 500 U/ml IL-6 oder mit 50 U/ml IL-1, 500 U/ml IL-6 und 1 µM Dex stimuliert und gleichzeitig mit und ohne 5 ng/ml TGF-β1 für 48 Stunden inkubiert. Dargestellt ist die Promotoraktivität nach TGF-β1-Inkubation im Verhältnis zur Aktivität ohne TGF-β1-Inkubation.
• Abb. 29 : Spezifische TGF-β1-Effekte an der Smad II-Bindungsstelle (-1294 bp)  HuH-7-Zellen wurden mit 5 ng/ml TGF-β1 15 min bis 48 Stunden inkubiert. Nach der Zelllyse wurden die nukleären Proteine isoliert und zusammen mit einem ³²P-markierten Oligonukleotid, das die Basensequenz des LBP-Promotors an der potentiellen TF-Bindungsstelle Smad II bei –1294 bp repräsentiert, inkubiert, und anschließend elektrophoretisch aufgetrennt.
• Abb. 30 : Die inhibierende TGF-β1-Wirkung wird von einem kleinen Promotorbereich vermittelt  HepG2-Zellen wurden mit den trunkierten LBP-Promotor/Luciferase-Konstrukten Nr. 1-8 transfiziert. Sie enthalten mit zunehmender Länge Teile des LBP-Promotors. Anschließend wurden die Zellen mit 50 U/ml IL-1, 500 U/ml IL-6 und 1 µM Dex oder nur mit 500 U/ml IL-6 stimuliert und mit oder ohne 5 ng/ml TGF-β1 für 48 kultiviert. A: Darstellung der relativen Luciferaseaktivität (RLA). B: Verhältnis von Promotoraktivität nach Inkubation von TGF-β1 zu Aktivität ohne TGF-β1-Inkubation. Skizzierte Darstellung der Trunkationen und potentieller TF-Bindungsstellen im Bereich -463 bis -570 bp.
• Abb. 31 : TF-Bindungsstellen und Trunkationen zwischen -463 und -570 bp  Auf dem LBP-Promotor befinden sich im Bereich zwischen -463 bp und -570 bp eine aktive NF‑κB-Bindungstelle und zwei aktive AP-1-Bindungstellen, weiterhin eine potentielle, noch nicht untersuchte Gfi-1 Bindungsstelle mit sehr hoher Übereinstimmung zur Konsensussequenz. Trunkierte Promotorelemente wurden wie dargestellt verwendet.
• Abb. 32 : TGF-β1-Effekte auf dem LBP-Promotor zwischen –570 und –463 bp  HepG2-Zellen wurden mit den abgebildeten Trunkationen des LBP-Promotors/Luciferase-Konstruktes transfiziert, 48 Stunden mit 500 U/ml IL-6 oder 50 U/ml IL-1, 500 U/ml IL-6 und 1 µM Dex stimuliert und mit +/- 5 ng/ml TGF-β1 inkubiert. Dargestellt ist die x-fache Promotoraktivität nach TGF-β1-Inkubation im Verhältnis zur Promotoraktivität ohne TGF-β1-Inkubation.
• Abb. 33 : Die Bindungsstelle AP VII ist in die Vermittlung des TGF-β1-Hemmeffekts involviert
  Die AP-1-Bindungsstelle (-540 bp) wurde in der angegebenen Weise durch Deletion einiger Basenpaare sowohl auf dem vollständigen LBP-Promotor (-1780 bp) als auch auf dem trunkierten Promotorfragment 570 bp mutiert und in HepG2 Zellen transfiziert. Die Zellen wurden mit 500 U/ml IL-6 und +/- 5 ng/ml TGF-β1 inkubiert. Dargestellt ist die Promotoraktivität mit TGF-β1-Inkubation im Verhältnis zur Promotoraktivität ohne TGF-β1.
• Abb. 34 : TGF-β1-Inkubation führt zu spezifischen Effekten an der AP-1-Bindungsstelle AP VII  HuH-7-Zellen wurden mit TGF-β1 (5 ng/ml), IL-1 (50 U/ml), IL- 6 (500 U/ml) und Dex (1 µM) inkubiert. Anschließend wurden die nukleären Proteine isoliert und mit einem Oligonukleotid inkubiert, das die Sequenz des LBP-Promotors an der AP-1 Bindungsstelle bei –537 bp repräsentiert. Linke Teilabbildung: Die Zellen wurden nur mit TGF-β1 für 30 min bis 48 Stunden inkubiert. Rechts: Die Zellen wurden mit IL-1, IL-6 und Dex +/- TGF-β1 für 4 oder 24 Stunden inkubiert.
• Abb. 35 : Mutation der Gfi-1-Bindungsstelle und die Wirkung auf den TGF-β1-Hemmeffekt  Die Gfi-1-Bindungsstelle wurde insgesamt 4x mutiert: Erstens durch den Austausch zweier Basen (Gfi Ia) und zweitens durch die Deletion von 9 Basen (Gfi Ib). Beide Mutationen wurden sowohl am vollständigen Promotor mit 1780 bp als auch am trunkierten Promotor mit 570 bp (^trunk) durchgeführt. Die mit den Konstrukten transfizierten HepG2-Zellen wurden für 48 Stunden stimuliert und mit/ohne TGF-β1 inkubiert. A: Stimulierung mit 50 U/ml IL-1, 500 U/ml IL-6, 1 µM Dex B oder mit 500 U/ml IL-6. Dargestellt ist der relative TGF-β1-Hemmeffekt nach Stimulation (+TGF-β1/-TGF-β1). In Abb. 35B sind die Mutationsexperimente mit dem vollständigen Promotor (1780 bp) aus Abb. 35A als β-Gal-normalisierte Luciferaseaktivität (relative Luciferaseaktivität, RLA) dargestellt.
• Abb. 36 : Spezifische Bindung nukleärer Proteine an die Gfi-1-Bindungsstelle –556 bp  A: HuH-7 Zellen wurden maximal mit 50 U/ml IL-1, 500 U/ml IL-6 und 1 µM Dex über die angegebenen Zeitspannen stimuliert und gleichzeitig mit 5 ng/ml TGF-β1 inkubiert. Die isolierten nukleären Extrakte wurden mit einem Oligonukleotid inkubiert, das die Sequenz der Gfi-1 Bindungsstelle vom LBP-Promotor bei –556 bp trägt. B: TGF-β1 -Inkubation (2 ng/ml) und maximale Stimulation erfolgten für 4 Stunden. B: Die Zellen wurden für 15 Stunden mit 5 ng/ml TGF-β1 inkubiert und für den gleichen Zeitraum maximal stimuliert. Die Kompetition erfolgte mit einem unspezifischen bzw. dem spezifischen Oligonukleotid ohne ³²P-Markierung im 40-fachen Überschuss.
• Abb. 37 : Die Wechselwirkung von Gfi-1 (-556 bp) und AP-1 (-540 bp)  Die Mutationen Gfi Ib und AP VII wurden einzeln und in Kombination in den LBP-Promotor integriert, HuH-7-Zellen damit transfiziert und die Zellen anschließend für 48 Stunden maximal stimuliert (50 U/ml IL-1, 500 U/ml IL-6 und 1 µM Dex) und mit und ohne 5 ng/ml TGF-β1 behandelt. Dargestellt ist das Verhältnis der Promotoraktivität mit TGF-β1-Inkubation zur Aktivität ohne TGF-β1-Inkubation.
• Abb. 38 : Der Einfluss der NFkB II- und der AP IV- Bindungsstelle auf den TGF-β1-Hemmeffekt  Die NF-κB Bindungsstelle an Position –515 bp und die AP-1-Bindungsstelle bei –493 bp wurden in der dargestellten Form im trunkierten –570 bp langen Promotor mutiert. Zusätzlich wurden diese Mutationen mit der Mutation Gfi Ib an der Gfi-1-Bindungsstelle bei –556 bp kombiniert. Die transfizierten Zellen wurden mit 50 U/ml IL-1, 500 U/ml IL-6, 1 µM Dex und mit oder ohne TGF-β1 für 48 Stunden inkubiert. Dargestellt ist der Quotient aus Luciferaseaktivität nach TGF-β1-Inkubation und Luciferaseaktivität ohne TGFβ1-Inkubation.
• Abb. 39 : Der Wirkung der Gfi-1-Bindungsstellen Gfi II, Gfi III und Gfi IV auf TGF-β1-Effekte  Die LBP-Promotoren mit den wie dargestellt eingefügten Mutationen Gfi II, Gfi III und Gfi IV und entsprechende wt-Kontrollen wurden in HuH-7-Zellen transfiziert und die Zellen anschließend mit 50 U/ml IL-1, 500 U/ml IL-6 und 1 µM Dex für 48 Stunden maximal stimuliert und zusätzlich +/- TGF-β1 inkubiert. Bei der anschließend gemessenen Luciferaseaktivität wurden die Ergebnisse mit TGF-β1-Inkubation durch die Messwerte ohne TGF-β1-Inkubation dividiert.
• Abb. 40 : Die Expression des Gfi-1-Proteins hemmt die LBP-Promotoraktivität  HepG2-Zellen wurden mit dem LBP-Promotor/Luciferase-Konstrukt transfiziert und mit 1 µg/Ansatz pGfi-1 Expressionsvektor kotransfiziert. Am Tag danach wurden die Zellen maximal, d.h. mit 50 U/ml IL-, 500 U/ml IL-6 und 1 µM Dex für 48 Stunden stimuliert. (RLA, relative Luciferaseaktivität).
• Abb. 41 : Die Wirkung des pGfi-1-Vektors auf die Gfi-1-Bindungsstelle bei –556 bp (Gfi I)  HepG2-Zellen wurden mit dem trunkierten LBP-Promotor/Luciferase-Konstrukt –570 bp und den beiden mutierten Promotoren Gfi Ia^trunk. und Gfi Ib^trunk. transfiziert und mit dem Expressionsvektor pGfi-1 bzw. einer Kontrolle ohne das Gfi-1-Gen kotransfiziert. Am Tag darauf wurde für 48 Stunden mit 50 U/ml IL-1, 500 U/ml IL-6 und 1µM Dex stimuliert. Abgetragen ist der relative Hemmeffekt nach pGfi-1-Kotransfektion im Vergleich zum Effekt des Kontrollvektors in den stimulierten Zellen.
• Abb. 42 : Die Wirkung von pGfiZn und pGfiSNAG auf den LBP-Promotor  HuH-7 Zellen wurden mit einem pGfi-1-Vektor, der nur die Zinkfingerdomäne trägt (pGfi^Zn, DNA-bindende Region), und mit einem Vektor, der nur die SNAG-Region enthält (pGfi^SNAG, Protein-Protein-Interaktion), kotransfiziert und für 48 Stunden mit 50 U/ml IL-1, 500 U/ml IL-6 und 1 µM Dex stimuliert. Aufgetragen sind die β-Gal-normalisierten Luciferasemesswerte (RLA, relative Luciferaseaktivität) aus stimulierten und unstimulierten Zellen in unterschiedlicher Skalierung, da die Werte aus den unstimulierten Zellen sehr niedrig waren.
• Abb. 43 : Gfi-1 mRNA-Akkumulation in HepG2-Zellen  HepG2-Zellen wurden mit TGF-β1 (5ng/ml) und IL-6 (500 U/ml) für 4 Stunden inkubiert. Gesamt-RNA wurde isoliert und mit Gfi-1-spezifischen Primern rtPCR durchgeführt. Die Negativkontrolle ist die sogenannte Wasserkontrolle (keine Primer, kein Mastermix). Bei der Positivkontrolle wurden die Zellen mit dem Expressionsvektor pGfi-1 transfiziert. Dem Nachweis der Integrität der RNA und dem internen Abgleich dient GAPDH.
• Abb. 44 : LBP-Serumkonzentrationen in unstimulierten Gfi-1-defizienten Mäusen  Im Serum von wt-Mäusen (5) und heterozygot (5) und monozygot (9) Gfi-1-defizienten Mäusen wurde die LBP-Konzentration mit einem murinen LBP-ELISA gemessen. Aufgetragen sind die Mittelwerte mit Standardabweichung. *Signifikant erhöht gegenüber heterozygoten Mäusen.
• Abb. 45 : IL-1- IL-6- und Dex-Effekte auf die LBP-Expression in A-549 -Zellen  Die Lungenepithelzelllinie A-549 wurde wie angezeigt mit IL-1, IL-6 und Dex für 48 Stunden stimuliert. Danach wurde in den Kulturüberständen mit Hilfe des hLBP-ELISA die LBP-Konzentration bestimmt.
• Abb. 46 : Der Einfluss von Dex auf die LBP-Expression in A-549 -Zellen  A-549-Zellen wurden wie angezeigt mit 50 U/ml IL-1, 500 U/ml IL-6 und mit ansteigenden Dex-Konzentrationen stimuliert. Nach 48 Stunden Stimulation wurde in den Kulturüberständen die LBP-Konzentration mit dem hLBP-ELISA gemessen.
• Abb. 47 : Die Wirkung von TGF-β1 und IL-10 auf die induzierte LBP-Expression in A-549-Zellen
  A-549-Zellen wurden mit 50 U/ml IL-1, 500 U/ml IL-6 und 1µM Dex maximal stimuliert, zusätzlich wurde TGF-β1 in zunehmender Konzentration zusammen mit den Stimulanzien inkubiert (A). Die maximal stimulierten Zellen wurden mit 10 oder 100 ng/ml IL-10 inkubiert (B). Nach 48 Stunden wurde die LBP-Konzentration in den Kulturüberständen bestimmt.
• Abb. 49 (nachfolgende Seite) In den horizontalen Felder sind oben die für die Inkubation verwendeten Substanzen und unten die transfizierten Vektoren dargestellt. In den Feldern dazwischen sind die Ergebnisse nach den verwendeten Untersuchungsmethoden sortiert, dabei wird auf die dazugehörigen Abbildungen im Ergebnissteil verwiesen. Nachgewiesene stimulierende Effekte sind grün und inhibierende Effekte rot dargestellt. Unten in der Abbildung ist eine Übersicht der einzelnen untersuchten potentiellen Bindungsstellen mit der jeweiligen stimulierenden oder inhibierenden Wirkung, soweit nachgewiesen, dargestellt.