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Einleitung

1 Das Immunsystem

Höhere Vertebraten haben verschiedenartige Mechanismen entwickelt, um sich gegen allgegenwärtige Pathogene wie Bakterien, Viren, Pilze oder Parasiten zu schützen. Sie verfügen über eine angeborene Immunantwort („innate immunity“) und eine erworbene Immunität („adaptive immunity“). Das phylogenetisch jüngere erworbene Immunsystem es entstand vor etwa 450 Millionen Jahren und erlaubt die Wiedererkennung des Krankheitserregers bei einer Neuinfektion; dadurch kann es selektiv auf den Erreger reagieren. Das angeborene Immunsystem hingegen, das in verschiedenen Formen in allen mehrzelligen Organismen zu finden ist, ist unveränderlich und weniger spezifisch, kann aber unmittelbar auf die Pathogene reagieren. Der wesentliche Unterschied dieser beiden Formen der Abwehr liegt im Mechanismus der Pathogenerkennung, wobei den beteiligten zellulären Rezeptoren eine besondere Bedeutung zukommt [1,2].

1.1 Die angeborene Immunantwort

Ist es einem Krankheitserreger gelungen, in den Wirtsorganismus einzudringen, wird dieser durch die unmittelbare angeborene Immunreaktion mit Hilfe von Gewebsmakrophagen und neutrophilen Granulozyten, antimikrobiellen Peptiden und dem Komplementsystem bekämpft [3]. Als erster Schritt muss dabei der Erreger als solcher vom Immunsystem erkannt werden. Dazu steht jedoch bei der angeborenen Immunantwort nur eine begrenzte Anzahl an genetisch festgelegten Rezeptoren zur Verfügung. Dem gegenüber steht die sehr heterogene und zahlenmäßig äußerst umfangreiche Gruppe der Krankheitserreger, die zudem meist noch eine hohe Mutationsrate aufweisen. Daher ist ein wichtiges Prinzip der angeborenen Immunität, nicht jedes mögliche Antigen, sondern nur wenige, hoch konservierte Antigenstrukturen zu erkennen [4]. Diese durch den kürzlich geprägten Terminus „pathogenassoziierte molekulare Muster“ („pathogen associated molecular patterns“, PAMPs) bezeichneten Moleküle sind beispielsweise das Lipopolysaccharid (LPS), Peptidoglykane (PG), Lipoteichonsäuren (LTA), Mannane, Glykane, bakterielle DNA und doppelsträngige RNA [4,5,6]. Diese Strukturen sind chemisch sehr unterschiedlich, weisen aber bestimmte Gemeinsamkeiten auf: Sie werden nur von Mikroorganismen und nicht vom Wirt gebildet, sie sind essentiell für die Pathogenität oder das Überleben des Mikroorganismus und sie kommen bei einer großen Anzahl der Pathogene vor [2,4]. Die Rezeptoren des angeborenen Immunsystems, die solche Strukturen erkennen, werden als mustererkennende Rezeptoren („pattern recognition receptors“, PRRs) bezeichnet und werden auf verschiedenen antigenpräsentierenden Effektorzellen wie Makrophagen, dendritischen Zellen und B-Zellen exprimiert [7,8]. Die einzelnen Rezeptortypen sind dabei auf verschiedenen dieser Zelltypen zu finden, so dass der Krankheitserreger gleichzeitig verschiedenen zellspezifischen Immunantworten ausgesetzt wird. Die Antwort der Zellen erfolgt im Gegensatz zur Antwort des adaptiven Immunsystems sehr schnell, ohne dass die Zellen zuvor proliferieren [4].


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1.2 Die adaptive Immunantwort

Die adaptive Immunität wird hauptsächlich durch T- und B-Lymphozyten vermittelt. Jede Zelle trägt dabei im ungeprägten Zustand nur Rezeptoren einer einzigen Spezifität, die sich von allen anderen Zellen unterscheidet. Die dafür benötigte, fast unbegrenzte Vielfalt an Rezeptoren wird durch einen einzigartigen genetischen Mechanismus erreicht, der während der Entwicklung dieser Zellen im Knochenmark und im Thymus abläuft. Dabei wird die variable Region der Rezeptoren durch die in jeder Zelle individuelle Kombination der sogenannten V-, D- und J-Gensegmente gebildet (somatische Rekombination). Bei der darauf folgenden somatischen Selektion werden autoreaktive Lymphozyten eliminiert und relevante Effektorzellen ausgewählt [9].

Bei der angeborenen Immunität existieren nur wenige, konservierte PRRs, die im Laufe der Evolution ausgebildet und selektiert wurden und gemeinsam auf einer Zelle exprimiert werden können. Im Gegensatz dazu steht die adaptive Immunität, die eine enorme Anzahl an Rezeptorvariationen hervorbringt, welche nicht auf einer Zelle kombiniert werden. Dabei erfolgt sowohl die Bildung als auch die Selektion der Rezeptoren somatisch [10].

Die Aktivierung der antigenpräsentierenden Zellen benötigt kostimulierende Faktoren, wobei die Induktion der kostimulierenden Moleküle B7.1 und B7.2 erst nach Erkennung von PAMPs durch PRRs erfolgt. Diese Rückversicherung bei der angeborenen Immunität scheint bedeutend für die Vermeidung von Immunität gegen Autoantigene und nichtpathogene Umweltantigene zu sein. So könnten Autoimmunkrankheiten und Allergien zum Teil auf Störungen dieser Mechanismen zurückzuführen sein [4]. Die Antigenpräsentation auf MHC („major histocompatibility complex“, Haupthistokompatibilitätskomplex)-II-Molekülen und die gleichzeitige Expression kostimulierender Moleküle bewirkt die Aktivierung und klonale Proliferation der zu diesem Antigen passenden nativen CD4-T-Lymphozyten, die für die Aktivierung der B-Zellen, der CD8-T-Zellen und weiterer Makrophagen benötigt werden [11].

1.3 Lipopolysaccharid (LPS)

Eines der wichtigsten und am meisten untersuchten PAMPs ist das Lipopolysaccharid (LPS). Es ist ein integraler und essentieller Bestandteil der äußeren Membran Gram-negativer Bakterien. Die Namensgebung Lipopolysaccharid verweist auf die chemische Struktur von LPS; es besteht aus einem hydrophilen Polysaccharidanteil und einem hydrophoben Lipid A (Abb. 1). Auf Grund ihres amphipatischen Charakters lagern sich die LPS-Moleküle in wässrigen Lösungen, wie z.B. Serum, zu supramolekularen Aggregaten zusammen und bilden sogenannte Mizellen [12]. Eine Untereinheit des LPS, das Lipid A, wurde in den 50er und 60er Jahren chemisch charakterisiert und später als der biologisch aktive Anteil des LPS erkannt. Das Lipid A ist die am wenigsten variable Komponente im LPS und verankert es in der bakteriellen Zellmembran [13,14,15]. Inzwischen ist die Gesamtstruktur von LPS verschiedener Bakterienarten aufgeklärt [16,17,18].


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Abb. 1 : Chemische Struktur von LPS
LPS besteht aus dem Polysaccharidanteil (O-Antigen, äußere Kernregion, innere Kernregion) und Lipid A. Das O-Antigen wird aus bis zu 50 (n) Oligosacchariden, die sich aus drei bis acht verschiedenen Einzelzuckern zusammensetzen, gebildet. Der äußere Kern enthält die häufig vorkommenden Saccharide Glukose, Galaktose, Glukosamin und Galaktosamin, während der innere Kern den in der Natur selten synthetisierten Zucker Ketodesoxyoctonsäure (Kdo) und Heptosereste, die phosphoryliert sein können, enthält. Das Grundgerüst des Lipid A ist ein phosphoryliertes Glukosamindisaccharid, welches vier Fettsäurereste trägt, von denen zwei wiederum sekundär acyliert sind.

Die historische Bezeichnung für LPS lautet Endotoxin. Sie ist in doppelter Weise irreführend, da es erstens nicht in den Bakterien vorliegt und zweitens im pharmakologischen Sinn kein Gift darstellt. Dieser Name beschreibt aber indirekt die Eigenschaften eines PAMPs: Endotoxin ist ein integraler, evolutionär stark konservierter Bestandteil der äußeren Membran Gram-negativer Bakterien und wird hauptsächlich bei Zellteilung oder Lyse der Bakterien freigesetzt. Da LPS von den Bakterien nicht aktiv abgegeben wird, wurde es als endogener Stoff verstanden und den Exotoxinen, die sezerniert werden, gegenüber gestellt [19]. Endotoxin oder LPS ist eine der stärksten bioaktiven Substanzen überhaupt; es ruft im Organismus schon bei niedrigsten, pikomolaren Konzentrationen heftige Immunreaktionen hervor, wie z.B. Zytokinfreisetzung, Adhäsionsmolekülsynthese, Phagozytose, Sauerstoffradikalfrei-setzung, Fieber, Komplement-Aktivierung, Aktivierung von Makrophagen und die Stimulation von B-Lymphozyten [20,21]. Das vermeintliche Toxin LPS, im engeren Sinn kein Gift, löst systemische Alarmreaktionen aus, die somit primär lediglich der Infektionsabwehr dienen.

Die meisten als PAMPs im Wirtsorganismus wirksamen bakteriellen Substanzen sind Elemente der Zellwandmatrix der Bakterien. Bei Gram-positiven Bakterien sind es hauptsächlich Vertreter der Stoffklasse der Peptidoglykane (PGN) und Lipoteichonsäuren (LTA), bei den Gram-negativen Erregern das LPS. Vom klinischen Erscheinungsbild der Bakteriämie her besteht kein Unterschied zwischen Gram-positiven und Gram-negativen Infektionserregern, was auf ähnliche Erkennungsmechanismen und Wirts-Reaktionsmuster schließen lässt [22].


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1.4  Lipopolysaccharid Bindendes Protein

LPS ist im Serum größtenteils an Lipoprotein hoher Dichte („High Density Lipoprotein“, HDL) -Partikel gebunden. Dieser Komplex weist eine Dichte von 1,21 g/ml auf. Tobias entdeckte 1984 einen Komplex von höherer Dichte (1,3 g/ml), der aus LPS und einem zu diesem Zeitpunkt unbekannten Protein bestand. Dieses Protein erhielt den Namen LBP (Lipopolysaccharid Bindendes Protein) [23]. LBP ist ein 60 kD Glykoprotein, das aus 452 Aminosäuren inklusive einer 25 Aminosäuren langen Signalfrequenz besteht und als Akutphaseprotein (APP) hauptsächlich in der Leber synthetisiert wird [24,25]. Zusätzlich konnte die Expression von LBP in Lungenepithelzellen Typ II und in Darmepithelzellen nachgewiesen werden [26,27]. Die Konzentration von LBP steigt von einem konstitutiven Serumspiegel von 5‑15 µg/ml auf 30 bis über 100 µg/ml in der Akutphase der Sepsis [28,29].

Wie bereits beschrieben, bildet LPS Mizellen aus, welche sehr stabile Aggregate darstellen und aus denen nur sehr langsam und in geringem Umfang einzelne LPS-Moleküle dissoziieren. Entsprechend hat in Mizellen gebundenes LPS in geringer Konzentration kaum immunostimulatorische Wirkung, in hoher Konzentration jedoch können einige Zellarten in vitro stimuliert werden. Geringe, physiologisch relevante LPS-Konzentrationen wirken in der Zellkultur nur stimulatorisch, wenn Plasma hinzugegeben wird [30,31]. Dieser verstärkende Effekt wird durch das im Serum befindliche LBP und das lösliche CD14 (sCD14) vermittelt. LBP, ein Lipidtransferprotein, fördert dabei das Herauslösen von LPS aus Mizellen und den Transport von monomerem LPS an humorale oder zelluläre Bindungsstellen [32,33]. An CD14-positiven Zellen wurde gezeigt, dass in Anwesenheit von LBP 1000-fach geringere LPS-Konzentrationen notwendig sind, um eine Zytokinausschüttung hervorzurufen [24].

Neben LBP gibt es noch weitere strukturell verwandte LPS-Bindungs- und Lipid-Transfer-Proteine: Bactericidal/Permeabiliy Increasing Protein (BPI), Cholesterolester Transfer Protein (CETP) und Phospholipid Transfer Protein (PLTP). Diese Proteine zeigen einen hohen Grad an struktureller und funktioneller Übereinstimmung mit LBP, so dass sie zu einer Proteinfamilie zusammengefasst werden. Alle Mitglieder dieser Familie binden Lipidstrukturen oder katalysieren den Austausch von Lipiden zwischen Mizellen und Rezeptor [34,35]. Zwischen LBP und BPI besteht mit 45% die größte Übereinstimmung in der Aminosäuresequenz [36]. BPI bindet ebenfalls an das LPS Gram-negativer Bakterien, aber im Gegensatz zu LBP besitzt es auch bakterizide Eigenschaften, es permeabilisiert die Zellmembran und zerstört dadurch die Bakterien. Dieser zytotoxische Effekt wird durch LBP verstärkt; die stimulatorischen Eigenschaften von LBP werden jedoch von BPI abgeschwächt [37]

Der LBP-vermittelte Transfer von LPS-Monomeren erfolgt in einem zweistufigen Prozess. Im ersten Schritt wird LPS auf sCD14 übertragen, beim zweiten Schritt wird LPS an einen zellulären Rezeptor oder an einen anderen Akzeptor übertragen. So kann LPS LBP-katalysiert auf Lipoproteine oder Phospholipidvesikel übertragen werden, was zu einer Detoxifizierung von LPS führt [38,39].


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Ferner vermittelt LBP auch die Internalisierung von LPS durch Phagozyten ohne Zellaktivierung [40]. Analysen mit Peptiden, die eine Region aus LBP und BPI mit analogem Hydrophobizitätsmuster repräsentieren, und Mutageneseuntersuchungen an LBP haben identische Ergebnisse erbracht, nämlich dass LBP und BPI LPS innerhalb einer Peptidsequenz zwischen Aminosäuren 86 und 104 erkennen [32], Abb. 2).

Abb. 2 : Computersimulation der LBP-Struktur
Das 3-dimensionale Modell der potentiellen LBP-Struktur basiert auf kristallografischen Daten des verwandten BPI. Demnach hat LBP eine bumerangartige Form. Vom N-terminalen Ende her, das sich hier in der Abbildung in der Mitte oben befindet, verläuft die Aminosäurenkette zunächst nach links. In dieser N-terminalen Region befindet sich der LPS-bindende Bereich. Rechts in der C-terminalen Region befinden sich wahrscheinlich die Bindungsstellen für CD14 und/oder der Lipoprotein-bindende Bereich. Das C-terminale Ende befindet sich in der Mitte unten [41].

LBP-Serumkonzentrationen, die während der Akutphase vorkommen, hemmen die immunstimulatorischen Wirkungen von Bakterienbestandteilen. Daher wird LBP neben der verstärkenden Wirkung bei der LPS-Erkennung auch eine detoxifizierende Wirkung zugeschrieben [29,42,43].

Wie neuere Untersuchungen zeigen, ist LBP auch an der Erkennung von Gram-positiven Bakterien beteiligt, so u.a. von Bacillus subtilis und Streptococcus pneumoniae [44]. Dabei ist unter anderem LTA ein PAMP, das von LBP erkannt wird. Auch hier hat LBP eine entscheidende Funktion bei der Erkennung von LTA, so dass unter Anwesenheit von LBP schon geringe Mengen LTA ausreichen, um in vitro eine immunstimulatorische Wirkung auszulösen [45,46].

1.5 CD14, Toll-like Rezeptoren und MD-2

Es sind verschiedene LPS-erkennende Rezeptoren beschrieben worden: Zum einen der Komplementrezeptor 3 (CR3), der oberflächengebundenes LPS wie es z.B. bei lebenden E. coli vorliegt, erkennt und dadurch Phagozytose vermittelt [47]. Der sogenannte „Scavengerrezeptor“ vermag LPS zu erkennen und nach LPS-Bindung die Internalisierung des Ligand-Rezeptor-[Seite 6↓]Komplexes und dadurch die Detoxifizierung einleiten [48,49]. Die wichtigsten zellulären Rezeptoren sind jedoch CD14 und die erst kürzlich entdeckten Toll-like Rezeptoren (TLRs).

CD14 kommt sowohl in löslicher (sCD14) als auch in membranständiger Form (mCD14) vor. Es ist vorwiegend auf Monozyten, Makrophagen und aktivierten Granulozyten zu finden [50]. Wrigth et al. konnten 1990 zeigen, dass die Aktivierung von Makrophagen mittels LPS durch anti-CD14-Antikörper blockiert werden kann und demnach CD14 an der LPS-Erkennung beteiligt ist [31]. Neben der LPS-Erkennung ist CD14 auch an der Identifizierung von Zellwand- oder Zellmembranbestandteilen von Gram-positiven Bakterien und Mykobakterien, z.B. Peptidoglykan, Lipoteichonsäure und Lipoarabinomannan beteiligt [46]. Aufgrund dieser Eigenschaften wird CD14 zu den PRRs der angeborenen Immunität gezählt [51]. mCD14 ist durch einen Glykophosphatidylinositol (GPI)-Anker in der Zellmembran fixiert und besitzt keine transmembranäre Domäne, daher wurde schon früh erkannt, dass CD14 nicht den signalübertragenden Teil des LPS-Rezeptor darstellen kann [52].

Das Gen Toll wurde erstmals in der Fruchtfliege Drosophila beschrieben. Dort erfüllt es eine wichtige Funktion in der Ontogenese und bei der antimikrobiellen Resistenz der Fliege [53,54]. Das erste humane Toll-Homolog wurde 1997 entdeckt und als Toll-like Rezeptor (TLR) bezeichnet [55]. Die TLR-Familie umfasst z.Zt. 10 Rezeptoren, die alle strukturelle Übereinstimmungen aufweisen: In der extrazellulären Domäne befinden sich so genannte „leucine rich repeats“ (LRRs), die Protein-Protein-Interaktionen vermitteln und als so genannte Typ I-Transmembranrezeptoren die Zellmembran nur einmal durchqueren. Der zytosolische Abschnitt der TLRs ist dem Drosophila-Toll und dem IL-1-Rezeptor sehr ähnlich (Toll-IL-1 receptor (TIR) domain), daher weisen auch ihre intrazellulären Signalübertragungswege einen hohen Grad an Übereinstimmung auf. Der IL-1 Rezeptor und die TLRs aktivieren den NF-κB-Signalweg; in Drosophila wird eine homologe Signalkaskade aktiviert [56,57].

Die Mitglieder der TLR-Familie sind auf die Erkennung verschiedener pathogener Strukturen spezialisiert. TLR2 erkennt wahrscheinlich in Kombination mit TLR1 und TLR6 bevorzugt bestimmte Strukturen Gram-positiver Bakterien und Mykobakterien [58,59,60]. TLR4 erkennt vor allem LPS, wie anhand von zwei schon seit langem als LPS-hyporesponsiv bekannten Mausstämmen eindrucksvoll gezeigt werden konnte: Bei beiden Stämmen konnte ein Defekt im TLR4-Gen, in dem einen Fall eine Punktmutation, im anderen eine Deletion, als eigentliche Ursache für die LPS-Resistenz nachgewiesen werden [61,62]. Bei Probanden, die sich unempfindlich gegenüber geringen inhalierten LPS-Dosen zeigten, wurde ebenfalls eine Mutation im TLR4-Gen gefunden [63].

Damit TLR4 effizient auf LPS reagieren kann, benötigt es das unterstützende Protein MD‑2. Dabei bindet MD-2 erst an den TLR und scheint dadurch die Affinität der sich anschließend bindenden bakteriellen Bestandteile zu erhöhen [64,65]. MD-2, das eine Signalsequenz, aber keine transmembranäre Domäne enthält, bildet in seiner sezernierten Form (sMD-2) große Oligomere, die aus stabilen dimeren Untereinheiten zusammengesetzt sind [66].


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Im sich schnell entwickelnden TLR-Feld ist inzwischen auch die Funktion vieler anderer TLRs beschrieben worden: TLR3 erkennt dsRNA [67], TLR5 bakterielles Flagellin [68], TLR7 erkennt Midazoquinoline (antivirale Komponenten der Immunantwort; [69] und TLR9 bakterielle DNA [70].

1.6 Die Akutphasereaktion

Unter Akutphase versteht man die systemische Reaktion von Wirbeltieren auf eine Gewebeschädigung. Die Schäden können durch Infektionen, Traumata, Verbrennungen, Neoplasien, Ischämien und Autoimmunerkrankungen hervorgerufen werden. Die Akutphasereaktion (APR) dient dazu, optimale Bedingungen für Reparaturprozesse und ‑bei einer Infektion‑ zur Abwehr von Mikroorganismen zu schaffen [71,72]. Die Aktivierung der APR erfolgt hauptsächlich über Zytokine: z.B. Tumor Nekrose Faktor-α (TNF-α), Interleukin-6 (IL-6) und IL-1 (siehe unten).

Häufig geht die APR sowohl mit allgemeinen Symptomen wie Fieber, Krankheitsgefühl und Appetitlosigkeit als auch mit lokalen Reaktionen wie Entzündung, Nekrose und Schmerzen einher. Auf zellulärer Ebene treten beispielsweise Leukozytose mit Linksverschiebung, Aggregation von Thrombozyten, Permeabilitätserhöhung der Membranen und Mastzelldegranulation mit Freisetzung von Mediatoren auf. Humoral führt die APR zum Anstieg der Konzentration der positiven Akutphaseproteine (APP) bzw. zum Abfall der Konzentration der selteneren negativen APPs (z.B. Albumin). APPs werden in erster Linie in der Leber synthetisiert. Positive APPs sind als Serumproteine definiert, die während der APR um mindestens 25 % ansteigen. Sie werden in zwei Klassen eingeteilt: Die Expression der Klasse I-APPs wird durch IL-6 und IL-1 stimuliert. Hierzu zählen das C-reaktive Protein (CRP), die Komplementkomponente C3 und Serum Amyloid A (SAA). Die Bildung der Klasse II-APPs wird ebenfalls durch IL-6 angeregt, IL-1 hat aber in diesem Fall keine oder eine hemmende Wirkung. Hierzu zählen beispielsweise humanes Haptoglobin und Fibrinogen [71,72].

Die Expression von LBP wird durch IL-1 und IL-6 erhöht, wobei die beiden Interleukine synergistisch wirken. Damit ist LBP ein typischer Vertreter der Klasse I-APPs. Weiterhin verstärkt das synthetische Glukokortikoid Dexamethason (Dex) die LBP-Expression [73,74]. Ein hemmender Einfluss auf die Synthese von LBP konnte beim Transforming Growth Factor-β1 (TGFα-1) nachgewiesen werden (Abb. 3) [75].

Das Auftreten der pathogeninduzierten Akutphase ist eng mit dem klinischen Bild der Sepsis verknüpft, die wiederum zum septischen Schock führen kann.


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Abb. 3 : LPS-aktivierte Immunantwort und LBP-Regulation
Freigesetztes LPS von Gram-negativen Bakterien wird vom LPB/CD14-Komplex erkannt und unter Beteiligung von MD-2 zum TLR-4 transportiert. Über eine komplexe Signaltransduktionskette wird unter anderem NF-κB aktiviert. Dies führt u.a. zur Biosynthese und Sekretion von IL-1, IL-6 und TNF-α aus Makrophagen. Die Zytokine stimulieren in Hepatozyten die LBP-Synthese und Freisetzung. Das synthetische Glukokortikoid Dex wirkt ebenfalls verstärkend auf die LBP-Stimulation. In einem positiven Rückkopplung verstärkt die nun erhöhte LBP-Konzentration die Reaktion auf LPS. TGF-β wirkt hemmend auf die LBP-Expression. Ein weiterer potentiell LBP-inhibierender Faktor ist IL-10. Der Bereich mit dem sich die vorliegende Arbeit befasst ist in Rottönen gefärbt.

1.7 Sepsis und septischer Schock

Die Sepsis (griech.: Fäulnis) ist eine systemische Allgemeininfektion, die infolge konstanter oder periodischer Freisetzung von pathogenen Mikroorganismen aus einem Herd erfolgt. 1991 wurde der Begriff „Systemisches Inflammatorisches Reaktions-Syndrom“ (SIRS) geprägt. Ein SIRS liegt vor, wenn mindestens zwei der folgenden Voraussetzungen gegeben sind: Temperatur höher als 38 °C oder niedriger als 36 °C, Herzfrequenz über 90 Schläge pro Minute, Atemfrequenz höher als 20-mal pro Minute, pO2 niedriger als 32 mm Hg und Leukozytenzahl größer als 12/nl oder Nachweis von mehr als 10 % Metamyelozyten. SIRS kann nicht-infektionsbedingt verursacht werden (z.B. durch immunogene Organschädigung oder Tumorerkrankungen) oder infektionsbedingt; letzteres entspricht dann einer Sepsis [76,77]. Die Sepsis wird zu 30 - 80 % durch Gram-negative Bakterien, zu 6 - 24 % durch Gram-positive Bakterien, zu 4 - 16 % polymikrobiell oder durch Pilze und zu 10 % durch unbekannte Erreger hervorgerufen [78], wobei [Seite 9↓]bei der Gram-negativen Sepsis die Translokation endogener Bakterien eine wichtige Rolle zu spielen scheint [79].

Eine schwere Sepsis liegt vor, wenn Organfunktionsstörungen, Hypoperfusionsstörungen oder eine Hypotonie hinzukommen. Kann die Hypotonie trotz Flüssigkeitssubstitution nicht kontrolliert werden, liegt ein septischer Schock vor. Seine Mortalität beträgt 40 - 70 % [78,80]. Das zunehmende Auftreten der Sepsis ist unter anderem auf moderne, aufwendige medizinische Behandlungsmethoden zurück zu führen: So gelingt es zunehmend Patienten mit schlechter Allgemeinsituation durch intensivmedizinische Maßnahmen am Leben zu halten, die dann aber gegenüber Infektionen sehr anfällig sind [81]. Knochenmarkssupprimierende Behandlungsmethoden in der Onkologie sind ebenfalls mit einem hohen Sepsisrisiko verbunden. Eine Antibiotikabehandlung der Patienten führt nur begrenzt zum Erfolg: Zum einen kann die körperliche Reaktion des Infizierten so heftig und schnell verlaufen, dass die Beseitigung des Krankheitserreger zu spät greift, zum anderen kann gerade das Absterben der Mikroorganismen zur Freisetzung von Toxinen führen, die die Sepsis verstärken [82,83].

2 Zytokine und Glukokortikoide

Die systemische APR wird neben IL-1 und IL-6 von weiteren Zytokinen reguliert: Der Tumor Nekrose Faktor-α (TNF-α), IL-8 und Granulocyte-Macrophage Colony-Stimulating Factor (GM-CSF) sind pro-inflammatorische Zytokine, IL-4, IL-10 und Transforming Growth Factor-β (TGF-β) haben inhibierende Aktivität. Zytokine sind regulatorische Peptide oder Proteine, die konstitutiv nur in geringen Mengen gebildet werden, deren Synthese aber nach einem Stimulus, wie z.B. Bakterienbestandteile oder nichtinfektiöse Gewebeschäden stark ansteigt. Sie dienen der interzellulären Kommunikation und vermitteln ihr Signal über spezifische Rezeptoren. Glukokortikoide fördern nur in der Leber die Proteinbiosynthese und verstärken daher speziell die Expression von Akutphaseproteinen der Leber [84].

2.1 IL-6

Die IL-6-Familie umfasst neben IL-6 den Leukemia Inhibitory Factor (LIF), Oncostatin M (OSM), IL-11, Ciliary Neurotrophic Factor (CNTF) und Cardiotrophin-1. IL-6 besteht nach Abspaltung eines Signalpeptids aus 184 Aminosäuren. Nach Glykosylierung, Phosphorylierung und Sulfatierung beträgt das relative Molekulargewicht 21-30 kD [85]. IL-6 wird in Makrophagen, Endothelzellen, Fibroblasten, Keratinozyten, Gliazellen, Mesangiumzellen sowie in B- und T-Zellen gebildet. Es wird nur in einigen Tumorzelllinien konstitutiv exprimiert, normalerweise ist ein adäquater Stimulus erforderlich. IL-6 ist der wichtigste Mediator für die Synthese von APPs in der Leber [86,87], hat aber auch anti-inflammatorischen Charakter. Es induziert die Ausschüttung des IL-1-Rezeptorantagonisten (IL-1RA) und des löslichen TNF-Rezeptors (sTNFR p55; [88]. IL-6 ist [Seite 10↓]ebenfalls ein wichtiger Differenzierungsfaktor hämatopoetischer Vorläuferzellen, aktivierter B-Zellen, Fibroblasten, Endothelzellen und Neuronen [89].

Transgene Mäuse mit IL-6-Überproduktion bilden u.a. maligne Neoplasien wie das Plasmozytom oder das Myelom aus und weisen eine Megakaryozytose auf [90]. IL-6-Knockout-Mäuse entwickeln sich normal, allerdings ist ihre Akutphaseantwort z.B. nach einer Infektion stark beeinträchtigt. Die Reaktion auf LPS ist dagegen kaum verändert [91,92].

Der Rezeptorkomplex der IL-6-Familie besteht aus zwei Bestandteilen: Einer individuellen α-Kette (gp 80 oder „private chain“), die den Liganden bindet aber keine Signaltransduktionsfunktion aufweist. Die α-Kette bindet gemeinsam mit IL-6 ein Homodimer der β-Kette (gp 130 oder „public chain“), die den zweiten Bestandteil des Rezeptorkomplexes darstellt [93]. Dieser zweite Bestandteil vermittelt das Signal ins Zellinnere und ermöglicht über einen langen zytoplasmatischen Abschnitt die weitere Signaltransduktion. Da die β-Kette allen Mitgliedern gemeinsam ist, können die Zytokine dieser Familie redundante biologische Effekte auslösen [94]. Die beiden wichtigsten Signalwege sind zum einen der Pfad über die Tyrosinkinasen der Familie der Janus-artigen Kinasen (Jak1, Jak2, Tyk), die letztlich die Transkriptionsfaktoren „signal transducers and activators of transcription“ (Stat) aktivieren. Der zweite Weg führt über die Tyrosinphosphatase SHP2 und die MAP-Kinasen, die ebenfalls die Stats aktivieren können, zu den Transkriptionsfaktoren der C/EBP Familie [95,96,97].

2.2 IL-1

Il-1 wurde erstmals in den 40er Jahren als so genanntes „endogenes Pyrogen“ beschrieben und seine induzierende Wirkung auf APPs schon 1977 nachgewiesen [98,99]. IL-1 wird beispielsweise nach Infektion oder Verletzung hauptsächlich in Monozyten, aber auch in epithelialem, epidermalem und lymphoidem Gewebe gebildet. Sein breites Wirkungsspektrum umfasst Einflüsse auf Immunsystem, ZNS, Stoffwechsel und Gefäßsystem. IL-1 reguliert typische Symptome der Sepsis, so u.a. Fieber, Somnolenz, das „capillary leak syndrom“, Hypotonie und die Bildung von APPs in der Leber [100]. Eine hohe IL-1-Serumkonzentration indiziert eine bakterielle oder mykotische Infektion. Eine experimentelle Vorbehandlung von Pseudomonas- oder Candida-infizierten Mäusen mit IL-1 führte zu einem protektiven Effekt gegenüber der Infektion [101].

Es sind drei Mitglieder der IL-1 Familie bekannt: IL-1α, IL-1β und der IL-1-Rezeptorantagonist (IL-1RA), der IL-1β inhibiert, indem er im Sinne eines kompetitiven Antagonisten den Rezeptor bindet und blockiert, aber kein Signal induziert. IL-1β geht aus einem 31 kD großen Vorläufermolekül (pro-IL-1β) hervor, das durch das „IL-1 converting enzyme“ (ICE oder Caspase 1) in das reife 17 kD große IL-1β gespalten wird. ICE-defiziente Mäuse sind gegenüber der experimentellen Induktion eines septischen Schocks resistent [102,103].

Der signaltransduzierende IL-1-Rezeptorkomplex wird aus IL-1, IL-1 Rezeptor Typ I (IL-1RI) und dem „IL-1 receptor accessory protein“ (IL-1R-AcP) gebildet. Der IL-1 Rezeptor Typ II (IL-1RII) ist ein so genannter „decoy“-Rezeptor, an den zwar IL-1 binden kann, durch den aber kein Signal [Seite 11↓]transduziert wird [104]. Die zytoplasmatische Domäne des IL-1RI weist hohe Homologie zu den TLRs auf, beide Rezeptorgruppen können unter anderem den Signalweg zum Transkriptionsfaktor NF-κB aktivieren [105]. Weitere Transkriptionsfaktoren die durch IL-1 induziert werden können, sind AP-1 und NF-IL6 (C/EBPβ) [106,107].

2.3 TNF-α

Tumornekrosefaktor-α (TNF-α) wurde 1975 als Faktor beschrieben, welcher bei bakteriellen Erkrankungen zu Tumorrückbildungen führt [108]. TNF-α wird aus einem primär 26 kD großen Transmembranprotein mit Hilfe des „TNF-α converting enzyme“ (TACE) in das lösliche 17 kD große Zytokin gespalten, das in homotrimerer Form vorliegt. TNF-α wird in aktivierten Makrophagen, Lymphozyten, „natural killer cells“ (NK-Zellen), in Astrozyten und weiteren Zelltypen gebildet. Die Wirkung des TNF-α ähnelt der von IL-1, beide Zytokine wirken in der Sepsis bei systemischen Veränderungen wie Fieber und Hypotonie synergistisch. Schon wenige Minuten nach experimenteller Gabe von LPS steigt die TNF-α-Serumkonzentration im Menschen stark an.

Es sind zwei TNF-α-Rezeptoren (TNFRI und II) bekannt, die beide an der Signalübermittlung beteiligt sind [109]. Bei der intrazellulären Signalübermittlung wird in einer der IL-1-Signaltransduktion ähnlichen Weise der NF-κB-Weg aktiviert. Ebenso werden Isoformen der „mitogen activated protein kinases“ (MAP-Kinasen) aktiviert, wie p38, die „extracellular related kinases“ (ERKs) und die „c-Jun NH2-terminal kinases“ (JNKs). Ziel der TNF-aktivierten Signalübertragung können auch RNA-bindende Proteine sein, die regulierend auf die Stabilität der RNA einwirken [110,111].

2.4 Dexamethason

Dexamethason (Dex) ist ein synthetisches Glukokortikoid, welches ca. 25-30-fach stärker wirkt als Kortisol. Die Glukokortikoide gehören zu der Gruppe der Steroidhormone und werden in der Nebennierenrinde gebildet. Sie dienen u.a. der langfristigen Stoffwechselumstellung bei vermindertem Nahrungsangebot. Dabei wird in der Leber die Glukoneogenese stimuliert, wodurch das Kohlenstoffgerüst von Aminosäuren zu Glukose umgewandelt wird. Im extrahepatischen Gewebe werden unterstützend die Glukoseaufnahme, die Glykolyse sowie die Proteinbiosynthese gehemmt. Die Hemmung der allgemeinen Syntheseleistung außerhalb der Leber führt besonders in den lymphatischen Organen zu einer reduzierten Antikörperbildung, wodurch die besonders klinisch bedeutsame entzündungshemmende und immunsuppressive Wirkung der Glukokortikoide zu erklären ist. Die anabole Wirkung der Glukokortikoide in der Leber bewirkt andererseits auch eine erhöhte Produktion von Zytokinen wie IL-6 und APPs. Glukokortikoide sind membrangängig und binden in den Zellen an den Glukokortikoidrezeptor (GR) [112].

Der GR gehört zur Familie der Steroidrezeptoren und besteht aus einer hormonbindenden, einer DNA-bindenden und einer transaktivierenden Domäne. Er liegt im Zytoplasma als Multiproteinkomplex mit zwei hsp90-, einem hsp70- und einem p56-Molekül vor. Die Bindung von [Seite 12↓]Glukokortikoid führt zu einer Konformationsänderung des Rezeptors und bewirkt die Freisetzung von „chaperones“ und die Translokation des Ligand-Rezeptor-Komplexes in den Kern. Der Rezeptor selbst fungiert dabei als Transkriptionsfaktor [113].

2.5 IL-10

IL-10, 1989 erstmals beschrieben, ist ein 39 kD großes, homodimeres, nicht glykosyliertes Protein, welches 24 bis 48 Stunden nach Stimulation in Th2-Zellen, Monozyten, Makrophagen, B-Zellen und Keratinozyten gebildet wird [114,115]. Der IL-10-Rezeptor ist hauptsächlich auf hämatologischen Zellen zu finden und ist dem Interferon-Rezeptor sehr ähnlich [116,117]. IL-10 reduziert die Bildung von Klasse II-Antigenen auf Monozyten, hemmt die T-Zellfunktion, unterdrückt die Zytokinbildung in stimulierten Monozyten und deaktiviert Makrophagen [118,119]. Die Letalität von Mäusen mit einer LPS-induzierten Sepsis konnte durch IL-10 gesenkt werden, ebenso waren die TNF-α Spiegel im Serum erniedrigt [120,121].

2.6 TGF-β

Von TGF-β sind die drei Isoformen TGF-β1, TGF-β2 und TGF-β3 bekannt. Sie weisen eine Aminosäurehomologie von 70-79 % auf, haben aber kaum Unterschiede in ihrer Wirkung. TGF-β wird in zahlreichen Zellen wie beispielsweise in Fibroplasten, Myozyten, Chondrozyten, Astrozyten und epithelialen Zellen gebildet. Die Hauptquellen von TGF-β1 und TGF-β2 sind Thrombozyten, TGF-β3 wird vor allem in mesenchymalen Zellen gebildet. Zur TGF-β-Familie gehören das „bone morphogenetic protein“ (BMP), Notal, Activin und das anti-Müllerian Hormon [122]. Alle TGF-β-Isoformen werden als große Vorläufermoleküle synthetisiert. Das reife TGF-β bildet als Dimer zusammen mit einem Dimer aus zwei Vorläufermolekülen einen vorläufigen, inaktiven Komplex [123].

TGF-β hat ein sehr breites Wirkungsfeld: Beispielsweise wirkt es immunsuppressiv, kann Zellmigration induzieren und ist an Wundheilung, Embryogenese, Onkogenese und Angiogenese beteiligt [124,125,126]. Frühere Studien haben gezeigt, dass TGF-β1 in der Lage ist die Expression IL-6-induzierter APPs zu modulieren [127]. Ebenso ist TGF-β in der Lage die Expression von LPS-stimuliertem IL-6 und TNF-α zu hemmen [128]. Weiterhin wurde gezeigt, dass die Hepatom-Zelllinie HepG2 geeignet ist, TGF-β1-Effekte auf APP-Expression zu untersuchen [129,130].

Die transmembranären TGF-β-Rezeptortypen 1 und 2 bilden nach der Ligandbindung einen heterodimeren Komplex, der die Aktivierung der Serin/Threonin-Kinasen bewirkt, die letztlich zur Aktivierung der so genannten Smads führt (der Name Smad ist zusammengesetzt aus den Namen der homologen Gene aus C. elegans (sma) und Drosophila (Mad, mothers against dpp). Alternative Signalwege, die z.B. zur Aktivierung von AP-1 führen, sind ebenfalls beschrieben worden [123,131].


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3  Regulation der Genexpression

Die Regulation der Proteinexpression ist im eukaryotischen Organismus wichtigster und zentraler Mechanismus, um adäquat auf Veränderungen der Umwelt zu reagieren. Grundsätzlich kann jeder der folgenden Schritte vom Gen bis zum aktiven Protein Angriffspunkt der Regulation sein: Die Transkription der DNA in RNA, das Spleißen der Vorläufer-RNA in mRNA, Transport der RNA aus dem Kern, RNA-Stabilität, Translation, Proteinaktivität und –stabilität. Vor allem der transkriptionellen Kontrolle, aber auch der Regulation der RNA-Stabilität kommt dabei in der Akutphasereaktion die größte Bedeutung zu. Dagegen haben Translation und posttranslationale Prozesse hier weniger oder keine Bedeutung [132].

3.1 Grundlagen der transkriptionellen Aktivierung

Um die Transkription eines Gens vorzubereiten, muss der entsprechende DNA-Lokus freigelegt werden. Das hoch kondensierte Chromosom liegt dann linearisiert und ohne Histone als aktives Chromatin vor. Einige Transkriptionsfaktoren, z.B. NF-κB und SP-1, können die Histone von der DNA entfernen und dadurch die Nukleosomen auflösen. Nun erst können an die DNA die sogenannten „general transcription factors“ (oder auch basale Transkriptionskomplexe) binden und anschließend die RNA-Polymerase II sowie die Transkriptionsfaktoren. Der erste Schritt zur Bildung eines stabilen Transkriptionkomplexes besteht in der Bindung von TFIID an die TATA-Box. TFIID ist ein multimeres Protein, bestehend aus den Untereinheiten „TATA-box binding protein“ (TBP) mit einer stark konservierten, an die TATA-Box bindenden Domäne und über acht „TBP-associated factors“ (TAFs). TFIIA unterstützt bzw. stabilisiert die TFIID-Bindung. Nach TFIID bindet TFIIB an die RNA-Polymerase II, dieser Komplex wiederum assoziiert erst mit TFIIF und anschließend den Faktoren TFIIE, TFIIH und TFIIJ. Faktor H hat Kinaseaktivität, wodurch die Polymerase phosphoryliert und damit aktiviert wird. Ebenso werden durch Faktor H TFIID, TFIIE und TFIIF phosphoryliert. Dieser basale Komplex ist notwendig, aber nicht hinreichend für die Aktivierung der Transkription. Parallel dazu binden Transkriptionsfaktoren (TF) an eine für jeden Faktor spezifische DNA-Region, die sehr weit (bis mehrere Tausend Basenpaare) vom Transkriptionsstart entfernt sein kann. Die Bindungsstellen können zahlreich oder nur vereinzelt vorhanden sein und können ebenso wie die TF aktivierende oder hemmende Eigenschaft aufweisen, d.h. durch ihr Zusammenspiel wird letztlich die Aktivität des Promotors reguliert [132,133].

Oftmals werden Transkriptionsfaktoren als die Promotoraktivität verstärkende „enhancer“, oder als hemmende „silencer“ klassifiziert. Tatsächlich können aber einige Transkriptionsfaktoren, je nachdem in welchem Zelltyp sie auftreten, sowohl hemmende als auch aktivierende Wirkung entfalten. Teilweise ist sogar allein das Zusammenwirken mit anderen Faktoren entscheidend dafür, ob die Promotoraktivität gefördert oder inhibiert wird. Ihre Wirkung entfalten die Transkriptionsfaktoren indem sie die Stabilität des Transkriptionskomplexes oder die Transkriptionsgeschwindigkeit beeinflussen.


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Typischerweise besteht ein TF aus folgenden funktionalen Elementen:

Oftmals werden verschiedene Funktionen von nur einer Domäne vermittelt: Beispielsweise kann die Aktivierung eines TF darin bestehen die maskierte DNA-bindende Region freizulegen; es liegen also die beiden Funktionen Aktivierung des TF und DNA-Bindung auf einer Domäne.

Die hemmende Wirkung von TF wird ebenfalls über die genannten funktionalen Elemente vermittelt:

Der hemmende TF kann dabei ein Abkömmling eines aktivierenden TF sein, der zwar an die DNA oder den basalen Faktor binden kann und damit den entsprechenden Ort belegt, jedoch durch eine Mutation die aktivierende Wirkung verloren hat. Dies entspricht der Funktion einer dominanten Negativmutante und ist beispielsweise bei den Smads zu finden [132,133,134,135].

3.2 AP-1

„Activator protein-1“ (AP-1) gehört, wie schon an der sehr allgemeinen Namensgebung zu erkennen ist, zu den ersten beschriebenen TF. AP-1 bildet sich aus den Mitgliedern der Jun-, Fos-, und ATF2-Familie. Dazu gehören unter anderem c-Jun, Jun B, c-Fos und „Fos related antigens“ (Fras; [136]. Mit Ausnahme der Fos-Proteine können sie Homo- und Heterodimere bilden, die an die AP-1-Bindungsstelle binden. Fos bildet keine Homodimere, es ist allein nicht in der Lage an DNA zu binden. Als Heterodimer mit Jun ist die Affinität an die AP-1-Bindungsstelle aber 30-fach höher als bei einem Jun-Homodimer [137]. Während der Akutphasereaktion findet man erhöhte Konzentrationen von Jun- und Fos-Proteinen, die durch die Zytokine TNF, IL-1 und IL-6 induziert werden [138]. Da in einem Gewebe verschiedene AP-1-Kombinationen auftreten können, findet man bei EMSA-Analysen auf Grund des unterschiedlichen Molekulargewichts typischerweise mehrere AP-1-Banden. Die AP-1-Monomere gehören zur Klasse der „basic region leucine zipper“ (bZIP) DNA-bindenden Proteine. Das AP-1-System interagiert in TPA-responsiven Genen mit dem TF „E26-transformation-specific“ (ETS), der an die der AP-1-Bindungsstelle benachbarten DNA-[Seite 15↓]Bindungsstelle von PEA3 bindet und dadurch die Promotoraktivität steigert [139]. Am Kollagenase-Promotor wurde gezeigt, dass das Fos/Jun-Heterodimer direkt, ohne DNA-Bindung, an den Glukokortikoid-Rezeptor binden kann. Dadurch wird die DNA-Bindung beider Faktoren blockiert und die Glukokortikoid-induzierte Promotoraktivität gehemmt [136,140].

3.3 C/EBP

Die TF der C/EBP-Familie können sowohl an die CCAAT-Box als auch an ein zweites Motiv mit der AS-Sequenz TGTGGAWWK (W = A oder T, K = G oder T) binden und werden daher als "(C)CAAT/enhancer binding proteins" (C/EBP) bezeichnet [141]. Das CCAAT-Box-Motiv, an welches ebenfalls TF wie CP1 und CP2 binden, ist in vielen Promotoren vertreten und vermittelt teilweise in Kombination mit ubiquitären TF die konstitutive Expression bestimmter Gene in verschiedenen Geweben. Die C/EBP-Faktoren dagegen, die hauptsächlich in der Leber exprimiert werden, werden konstitutiv nur in niedriger Konzentration exprimiert. Sie müssen durch spezifische Stimuli aktiviert werden und vermitteln daher eine spezifische Genaktivierung [142].

Die C/EBPs (C/EBPα, -β, -γ, -δ, -ε) weisen wie die AP-1-Proteine eine „leucine zipper“-Domäne auf. Inflammatorische Stimuli fördern die Expression von C/EBPβ (synonym mit „nuclear factor IL-6“, NF-IL6) und hemmen die Expression von C/EBPα. Die transkriptionelle Aktivität von C/EBPβ und C/EBPδ wird über eine IL-6-vermittelte Phosphorylierung während der Akutphase gesteigert [143]. C/EBPβ (das an IL-6-responsive Elemente vom so genannten Typ I bindet) und die Mitglieder der Stat-Familie (die an IL-6-responsive Elemente vom Typ II binden) sind die wichtigsten TF, die durch IL-6 aktiviert werden. Diese Aktivierung erfolgt über MAP-Kinasen-vermittelte Phosphorylierung der TF [144].

C/EBPβ wurde als ein durch IL-1 induzierter nukleärer Faktor identifiziert, der an ein Element im IL-6-Promotor bindet und ihn aktiviert [145,146]. Durch diese Induktion von IL-6 durch IL-1 können gewisse Wechselwirkungen bzw. Synergieeffekte zwischen den beiden Zytokinen erklärt werden. C/EBPβ vermittelt ebenfalls die Aktivierung diverser APPs sowohl der Klasse I als auch der Klasse II [147,148,149,150].

3.4 Stat

Zwei der sieben bekannten Mitglieder der "Signal Transducer and Activator of Transcription" (Stat)-Familie, Stat-1 und Stat-3, bilden die zweite Gruppe von TF, die durch IL-6 induziert werden kann. Die Stat-Proteine verfügen über eine bei den TF einmalige „src-homology 2“ (SH2)-Domäne. Sie vermittelt einerseits die Bindung der Stats an die Rezeptoren und andererseits, nach Tyrosinphosphorylierung durch Janus-artige Kinasen (JAK), die Dimerbildung der Stats, wobei Stat-1 und Stat-3 Heterodimere bilden und Stat-3 Homodimere. Die SH2-Domäne kann mit einer großen Anzahl von Signalproteinen interagieren, so dass die Stats mit verschiedenen Signalwegen interferieren können. An der Aktivierung der Stat sind verschiedene Zytokine beteiligt: Stat-1 wird von IL-6 und den Interferonen aktiviert, Stat-3 von allen Mitgliedern der IL-6-Familie. Nach der [Seite 16↓]Dimerbildung translozieren die Stats in den Zellkern und aktivieren die Transkription an ihren Zielorten. Der Stat-Signalweg ist sehr schnell; innerhalb von Minuten nach Zytokinstimulation sind aktivierte Stats im Kern nachweisbar [151,152,153].

3.5 NF-κB

Der „nuclear factor kappa B“ (NF-κB) besteht aus Dimeren der rel-Proteinfamilie. Typische Vertreter sind die Heterodimere p65/p52 und p65/p50. Weitere beteiligte Monomere sind c-rel und Rel B; außerdem kann NF-κB auch als Homodimer vorliegen. Im inaktiven Zustand ist „inhibitor kappa B“ (IkB) an NF-κB gebunden. Durch Phosphorylierung wird IkB abgespalten, das aktive NF-κB transloziert in den Kern und aktiviert spezifisch die Transkription bestimmter Gene. Nur c-rel, Rel B und p65 enthalten eine Transaktivierungsdomäne und können daher transkriptionell aktivierend wirken. Homo- oder Heterodimere aus p50 und p52 haben keine direkt aktivierende Wirkung, können aber die Affinität von NF-κB-Molekülen mit transaktivierender Domäne zur DNA erhöhen. Durch kompetitive Effekte können p50- und p52-Homodimere auch hemmende Wirkung auf die transkriptionelle Aktivität haben.

NF-κB kann durch IL-1 und TNF aktiviert werden. Bei der Stimulierung von Makrophagen durch LPS oder andere bakterielle Bestandteile über die TLRs scheint die NF-κB-Induktion ein wesentlicher Signalweg zu sein. NF-κB scheint somit eine zentrale Bedeutung bei immunologischen Abwehrreaktionen zu haben [111,154,155].

3.6 Smads

Die Smads, deren Name sich von den homologen Proteinen aus C. elegans (sma) und aus Drosophila „Mothers against dpp“ (Mad) herleitet, vermitteln die Effekte von TGF-β und BMP in der Zelle. Obwohl TGF-β auch andere TF wie beispielsweise AP-1 aktivieren kann, werden die erst in jüngerer Zeit entdeckten Smads als eigentliche TGF-β-Signalproteine angesehen. Die Smad-Familie besteht aus den rezeptorregulierten R-Smads, den inhibitorischen I-Smads und dem Ko-Smad Smad4. Smad1 und Smad 5 sind Effektoren von BMP, Smad2 und Smad3 vermitteln TGF-ß-Effekte. Die aktivierte Typ I-Kinase phosphoryliert die R-Smads, worauf diese mit Smad4 einen kerngängigen Komplex bilden und zusammen mit Kofaktoren als Transkriptionsfaktor wirken [156]. Die I-Smads blockieren die TGF-β1-Signaltransduktion, indem sie stabil an den aktivierten Rezeptor binden, die Bindungsstelle maskieren und dadurch die Bindung und Phosphorylierung der R-Smads verhindern. Der inhibitorische Effekt von TGF-β1 wird durch die Interaktion des R-Smad/Smad4-Komplexes mit anderen Transkriptionsfaktoren, z.B. AP-1, c-Jun/c-Fos und ATF-2, vermittelt [157,158,159,160]. In diesem Fall fungieren die Smads als transkriptionelle Komodulatoren, die die Aktivität der primären Transkriptionsfaktoren hemmen oder verstärken können [161,162,163,164,165].


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3.7  Gfi-1

„Growth factor independence-1“ (Gfi-1) ist ein TF, über den noch nicht viele Informationen vorliegen. Das Gen des nukleären Proteins Gfi-1 wurde als eine provirale Insertion in T-Lymphoid-Zellen, die auf IL-2-Unabhängigkeit hin selektiert wurden, entdeckt [166]. Das 55 kDa große Protein ist mit seinen sechs C-terminalen Zinkfingern und seiner 20 Aminosäuren großen N-terminalen Repressor-Domäne (SNAG-Region, abgeleitet von Snail/Gfi-1) ein vermeintlicher transkriptioneller Repressor. Es bindet spezifisch an die Konsensussequenz TAAAATCAC(A/T)GCA mit der kritischen Kernregion AATC. Potentielle Gfi-1-Bindungsstellen wurden in zahlreichen Promotoren gefunden, vor allem von proto-Onkogenen und Zytokinen, z.B. IL-1α und -β, IL-4, IL-5, IL-6, IFN-γ und TNF-α. Dies deutet auf eine wichtige Rolle von Gfi-1 bei der Zytokinregulation hin [167].

Außerdem ist Gfi-1 an der prä-T-Zelldifferenzierung beteiligt, und das eng verwandte Gfi-1B hemmt die Myeloid-Zelldifferenzierung [168,169]. Kürzlich wurde gezeigt, dass Gfi-1 Einfluss auf die Stat-3-vermittelte Signaltransduktion hat. Gfi-1 bindet den Stat-3-Inhibitor PIAS3 und blockiert dabei den hemmenden Effekt von PIAS3. Dadurch führt die Überexpression von Gfi-1 in HepG2-Zellen nach IL-6-Stimulation zu einer sechsfach höheren Aktivität in einem Promotor mit Stat-3-Bindungsstellen [170].

3.8 GRE und andere GR-bindende DNA-Regionen

Der Glukokortikoidrezeptor (GR), der sich inaktiv im Zytosol befindet, wird durch die Bindung der membrangängigen Glukokortikoide aktiviert, transloziert in den Kern und fungiert dort als TF. Seitdem 1985 der GR kloniert wurde, sind zahlreiche Mechanismen beschrieben worden, über die der Rezeptor die Transkription beeinflusst: Er kann direkt an funktionale DNA Elemente binden [171,172,173,174,175,176], eine Protein-Proteinbindung mit anderen Transkriptionsfaktoren eingehen [140,177] oder beides. In beiden Fällen kann die Transkription sowohl aktiviert als auch gehemmt werden, oder es kommt zu Synergieeffekten mit anderen TF. Darüber hinaus sind posttranskriptionelle regulatorische Effekte des GR beschrieben [178].

Inhibitorische GR-Effekte werden oftmals durch die Maskierung von TF-Bindungsstellen, z.B. von AP-1 oder NF-κB erreicht, die nahe dem „glucocorticoide responsive element“ (GRE) lokalisiert sind [179]. Der GR kann darüber hinaus direkt mit anderen TF, beispielsweise AP-1, eine Protein-Protein-Bindung eingehen, wodurch sich die beiden Faktoren gegenseitig in ihrer Aktivität blockieren [180] Die Glukokortikoid-bindende DNA-Sequenz hat ebenfalls Einfluss auf die Wirkung des Rezeptors. „negative glucocorticoid response elements“ (nGRE), die eine inhibierende Wirkung vermitteln, weisen einen kleinen, aber deutlichen Unterschied in der Sequenz gegenüber positiven GREs (pGRE oder GRE) auf, die die Genexpression verstärken [134,171].

3.9 Posttranskriptionelle Regulation

Die APPs werden in erster Linie transkriptionell reguliert. Bei den posttranskriptionellen Regulationsmodellen wird nur der Regulation der RNA-Transkriptstabilität eine gewisse Bedeutung [Seite 18↓]zugeschrieben. Die Menge eines in der Zelle vorliegenden spezifischen Transkripts wird einerseits von der Transkriptionsrate und andererseits von der Geschwindigkeit der mRNA-Degradation bestimmt. Daher kommt der mRNA-Stabilität grundsätzlich die gleiche regulatorische Bedeutung zu wie der mRNA-Syntheseleistung. Die als Halbwertszeit gemessene Stabilität verschiedener RNAs differiert im eukaryotischen Organismus beträchtlich: Sie beträgt zwischen etwa 15 min und 10 Stunden. Die Länge der Halbwertszeit der mRNA unterliegt spezifischen regulatorischen Prozessen: Nach dem geläufigen Modell erfolgt der Abbau der RNAs in der Regel durch eine von 5´ nach 3´ gerichteter Degradation, die durch Abbau der Poly-A-Sequenz und „decapping“ oder durch endonukleolytische Spaltung des Transkripts eingeleitet wird. Die Stabilität wird dabei von 5´- und 3´-„untranslated regions“ (UTR) und von stabilisierenden oder destabilisierenden Proteinen oder Nukleasen beeinflusst. Die Transkripte einiger Zytokine und Proteine, die in Entzündungsreaktionen involviert sind, z.B. IL-3, TNF-α, β-IFN, c-jun und -fos, enthalten im 3´-UTR Bereich sogenannte „activin response elements“ (AREs). Bei diesen Transkripten beginnt die Degradation mit dem Abbau der Poly-A-Sequenz, gefolgt vom „decapping“ und dem von 5´ nach 3´ gerichteten Verdau des Transkripts. Die Abbaurate kann durch ARE-bindende-Proteine, z.B. „embryonic lethal abnormal visual“ (ELAV), HuR oder AUF1, reduziert werden, die wiederum der Regulation durch u.a. die MAP-Kinasen p38 und JNK unterliegen [181,182,183,184].


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4  Zielstellung der Arbeit

In der vorliegenden Arbeit soll die Regulation von LBP untersucht werden. LBP mit seiner LPS-erkennenden und -verstärkenden Funktion stellt sowohl bei der Infektabwehr als auch bei der Entstehung des septischen Schocks ein Schlüsselprotein dar. Die Aufklärung der LBP-Regulation kann daher z.B. dazu beitragen den septischen Verlauf in Zukunft günstig zu beeinflussen.

Bei der Untersuchung der LBP-Regulation sind folgende Themengebiete besonders Interessant:

Wie wird die aktivierende Wirkung der Zytokine IL-1 und IL-6 auf die LBP-Expression vermittelt? Wie entsteht der Synergieeffekt von IL-1 und IL-6? Welche Signalwege sind relevant und wie wird die Wirkung reguliert? Welche Transkriptionsfaktoren sind auf transkriptioneller Ebene involviert? Ebenfalls soll die Bedeutung einiger NF-κB-Bindungsstellen auf dem LBP-Promotor geklärt und die Relevanz des NF-κB-Signalwegs auf die LBP-Regulation untersucht werden.

Weiterhin soll der Einfluss des Zytokins TNF-α auf die LBP-Expression geklärt werden.

Ein weiterer Themenkomplex ist die aktivierende Wirkung des Glukokortikoids Dexamethason auf die LBP-Expression und seine synergistische Wirkung mit IL-6. Dabei ist u.a. zu klären, ob sich aktive Glukokortikoid-Bindungsstellen auf dem LBP-Promotor befinden und ob diese die Dexamethason-Wirkung zum Teil oder vollständig vermitteln.

Besondere Aufmerksamkeit gilt der Vermittlung des TGF-β1-Hemmeffekts auf die LBP-Expression. Obwohl TGF-β1 ein sehr intensiv beforschtes Zytokin ist, liegen über die Vermittlung hemmender TGF-β1-Effekte kaum Kenntnisse vor. Es gilt zu klären wie die Signaltransduktion erfolgt und auf welcher Ebene die Regulation stattfindet und welche Faktoren und Bindungsstellen bei einer evtl. transkriptionellen Regulation beteiligt sind.

Die Wirkung des Zytokins IL-10, das evtl. einen hemmend Effekt auf die LBP-Expression ausübt soll ebenfalls untersucht werden.

Da sowohl die Initiierung als auch die Begrenzung der Akutphase ein wichtiger Prozess in der Biologie ist, werden von dieser Untersuchung wichtige Schlussfolgerungen erwartet.


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20.10.2005