II  Material und Methoden

Puffergrundsubstanzen, Lösungsmittel und weitere Laborchemikalien wurden von den Firmen Roth (Karlsruhe), Sigma (Taufkirchen) und Life Technologies (Karlsruhe) bezogen.

Für die Zellkultur wurden Eagle´s „minimal essential medium“ (MEM) von der Firma Sigma (Taufkirchen) und RPMI (nach dem Roswell Park Memorial Institute, in dem es entwickelt wurde), Phosphatpuffer („phosphate buffered saline“ (PBS) ohne Ca⁺⁺ und Mg⁺⁺) sowie Glutamax von Life Technologies (Karlsruhe) bezogen. Fötales Kälberserum (FCS), 2,5 % Trypsin, Na-Pyruvat und Gentamicin wurden von PAA Laboratories (Linz, Österreich) verwendet. In der vorliegenden Arbeit wurden die in Tabelle 1 gelisteten Zelllinien verwendet.

Tab. 1: Verwendete Zelllinien

Die verwendeten Zelllinien wurden entsprechend den Angaben ihrer Hersteller bei 37 °C unter 5 % CO2 in MEM mit den Zusätzen 10% FCS, 1% Glutamin, 1 % Na-Pyruvat und 0,5 % Gentamicin kultiviert. FCS wurde zuvor 30 min bei 56°C im Wasserbad inaktiviert. Alle Arbeiten wurden an einer Zellkulturbank unter sterilen Bedingungen durchgeführt. Das Medium wurde vor Kontakt mit der Zellkultur auf 37°C erwärmt. Ca. alle 3 Monate wurden neue Chargen der Zelllinien in Kultur genommen und nach zwei Wochen Kultur mit den Experimenten begonnen. Die Zellen wurden zweimal pro Woche umgesetzt und gegebenenfalls expandiert.

Mycoplasmeninfektionen stellen ein großes Problem in der Zellkultur dar. Die Stimulierbarkeit und das Muster der Genexpression verändern sich bei infizierten Zellen, Wachstum und Teilungsfrequenz sind herabgesetzt. Daher wurden die Hepatomzellen bei Verdacht auf eine Infektion einem Mycoplasmentest unterzogen. Der Test wurde mit dem „Mycoplasma Detection Kit" (Roche, Mannheim) durchgeführt, bei Kontamination wurde die Kultur über 6 Wochen mit „BM-Cyclin" (Roche, Mannheim) behandelt, oder die Zellen wurden verworfen. Der Behandlungserfolg wurde wiederum mit dem „Mycoplasma Detection Kit“ überprüft bevor „sanierte Zellen“ wieder verwendet wurden.

Die Zytokine IL-6, IL-1β, TNF-α, TGF-β1 und IL-10 sind humanen Ursprungs und wurden rekombinant hergestellt. Sie wurden von R&D Systems (Wiesbaden-Nordenstadt) bezogen, Dexamethason (Dex) wurde von Sigma (Taufkirchen) erworben.

Die Zytokine und Dex wurden bei -20°C als Aliquots gelagert. Verwendete Zytokine wurden nur einmal aufgetaut, bei 4 °C im Kühlschrank gelagert und innerhalb von 4 Wochen aufgebraucht. Die Zellen wurden ein bis zwei Tage vor den Experimenten in Kulturplatten ausgesät. Bei der Stimulation wurde gleichzeitig das Kulturmedium gewechselt.

Tab. 2: Verwendete Plasmide

Die Amplifikation der Plasmide und der Expressionsvektoren erfolgte in DH5-E.coli-Kulturen, die in Luria-Bertani (LB)-Medium angesetzt wurden. Alle Arbeiten wurden steril durchgeführt.

Zur Herstellung von Kulturplatten wurden dem LB-Medium 15 g/l Agar zugesetzt.

Nach dem Autoklavieren des LB-Mediums wurde sterilfiltriertes Ampicillin (50 µg/ml) zugesetzt. 200 ml LB-Medium wurden mit einer E. coli Kolonie von einer LB-Agarplatte oder 100 µl aus einem Bakterienglyzerinstock beimpft und über Nacht bei 37 °C und 170 U/min geschüttelt.

Zur Transformation von Plasmid-DNA in E. coli wurden 50 µl kompetente Bakterien (Life Technologies, Karlsruhe) vorsichtig auf Eis aufgetaut, mit 10 ng DNA vorsichtig gemischt und für [Seite 22↓]30 min auf Eis inkubiert. Danach wurde der Ansatz für 45 s einem Hitzeimpuls von 42 °C ausgesetzt, für 2 min auf Eis gestellt, 0,5 ml LB Medium zugegeben und für 1 Stunden bei 37 °C geschüttelt. Schließlich wurde der Ansatz auf LB-Ampicillinplatten ausplattiert und über Nacht bei 37 °C inkubiert. Gewachsene Einzelkolonien wurden für die Bakterienkultur verwendet.

2.3  Präparation von Plasmid-DNA

Die Bakterienkultur wurde bei 4°C und 6000 x g zentrifugiert und aus dem Bakterienpellet die Plasmid-DNA isoliert. Dazu wurde der „Maxi-Kit" zur Präparation von Plasmid-DNA der Firma Life Technologies (Karlsruhe) verwendet.

Zur Konzentrationsbestimmung wurde die DNA 1:100 in H₂0 verdünnt und in einer Quarzküvette im UV-Spektrometer bei 260 nm gemessen, wobei eine OD von 1 33 µg/ml Einzelstrang-DNA bzw. 50 µg/ml Doppelstrang-DNA entspricht. Zur Beurteilung von Salz- und Proteinverunreinigungen wurde zusätzlich bei 280 nm gemessen: Liegt der Quotient der Messwerte 260 / 280 nm unter 1,7, ist das ein Hinweis auf eine starke Verunreinigung der DNA.

Zur Kontrolle der verwendeten Plasmide und der eingefügten DNA (Insert) wurde die DNA verdaut. Dazu wurden 2-5 U Restriktionsenzym pro µg DNA, 1 x Restriktionspuffer in A. bidest. und 1 µg DNA inkubiert, wobei das Volumen des Enzyms maximal 10 % des Gesamtansatzes betrug. Die Inkubation erfolgte für 1 Stunde nach den Temperaturangaben des Herstellers, in der Regel bei 37 °C.

Plasmid-DNA und Fragmente wurden regelmäßig mit Hilfe der Elektrophorese untersucht (Probegel). Dazu wurde ein Agarosegel wie folgt hergestellt und die Elektrophorese im TBE-Puffer durchgeführt.

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1 µg DNA wurde mit Ladepuffer und A. bidest. gemischt und bei 5 V/cm im Agarosegel aufgetrennt. Als Größenmarker diente die 100 bp- oder die 1 kb-Leiter von Life Technologies (Karlsruhe).

Zur Bestimmung der LBP-Promotoraktivität wurden die Hepatomzelllinien mit LBP-Promotor/Luciferase-Konstrukten transfiziert, und im Regelfall wurde 48 Stunden später die Luciferaseaktivität gemessen. Dabei wird Luciferin unter Lichtfreisetzung durch Luciferase oxidiert. Das gemessene emittierte Licht entspricht dabei der Luciferaseaktivität, die der Luciferasemenge äquivalent ist, welche wiederum der Promotoraktivität entspricht. Zu jedem Versuchsansatz wurde ein β-Galaktosidaseplasmid mit konstitutivem Promotor kotransfiziert und die gemessene β-Gal-Aktivität zum Abgleich der Luciferasewerte verwendet.

Einen Tag vor der Transfektion wurden die Hepatomzellen in 12-Loch-Platten mit einer Dichte von 1 – 2 x 10⁵ Zellen/Loch ausgesät. Pro Loch wurden 4 µl Lipofectamin (Life Technologies, Karlsruhe) mit 40 µl Kulturmedium ohne Zusätze gemischt. Parallel dazu wurden 1 µg LBP/Luciferase-Plasmid-DNA und 0,2 µg β-Galaktosidaseplasmid gemischt und mit Kulturmedium auf 40 µl aufgefüllt. Bei Kotransfektionen wurden 0,2 bis 1 µg des entsprechenden Plasmids zugegeben. Die beiden Ansätze wurden gemischt und für 30 min bei Raumtemperatur inkubiert. In der Zwischenzeit wurden die Zellen mit Kulturmedium ohne Zusätze gewaschen. Danach wurde der Ansatz mit Medium auf 400 µl aufgefüllt, vorsichtig gemischt und nach dem Absaugen der Überstände tröpfchenweise auf die Zellen pipettiert. Die Transfektion erfolgte nun für 4 Stunden. Sie wurde durch Ersetzen des Transfektionsmediums mit FCS-haltigem Kulturmedium abgestoppt. Die Stimulierung bzw. Inkubation der Zellen mit Zytokinen und Dex erfolgte am darauffolgenden Tag, im Normalfall für 48 Stunden.

Die Luciferase- und β-Galaktosidaseaktivität wurden mit dem Luciferase Reporter Gene-Assay und dem β-Gal Reporter Gene-Assay von Roche (Mannheim) gemessen. Diese Assays enthalten auch einen Lysepuffer, der für beide Tests geeignet ist. Die Zellen wurden zuerst 2 x mit PBS [Seite 24↓]gewaschen, anschließend wurden 150 µl Lysepuffer auf die Zellen gegeben und der Ansatz für 15 min bei Raumtemperatur leicht geschüttelt. Danach wurden die restlichen Zellen durch Klopfen abgelöst, in 96-Loch-Platten überführt und für 10 min bei 3000 U/min zentrifugiert. Für die sich anschließende Luciferasemessung wurden 20 µl Überstand abgenommen und 50 µl Luciferase Reaktionspuffer dazugegeben. Die Messung erfolgte sofort nach Zugabe des Reaktionspuffers für 0,3 bis 3 sec in weißen 96-Loch-Platten (NUNC, Wiesbaden) mit dem Multifunktions-Spektrometer „SPECTRA Fluor plus“ von Tecan (Crailsheim). Bei der β-Gal-Messung wurden zu 25 µl Lysat 50 µl Substrat-Reagenz gegeben, 15-40 min unter leichtem Schütteln bei Raumtemperatur inkubiert, 25 µl Initiationsreagenz zupipettiert und ebenfalls sofort im Multifunktions-Spektrometer gemessen.

Die Messzeit betrug in der Regel 1 Sekunde, wurde aber laufend angepasst. Dabei wurde die größte Differenz zwischen den niedrigsten Probemesswerten und dem Hintergrund (leeres Loch der Platte) angestrebt, ohne dass von den hohen Probemesswerten der Messbereich des Instruments nach oben überschritten wurde. Anschließend wurde der Quotient aus Luciferase-Wert und β-Gal-Wert gebildet (β-Gal normalisiert), der in der vorliegenden Arbeit als relative Luciferaseaktivität (RLA) bezeichnet wird. Dieser Quotient bietet gegenüber den reinen Luciferasewerten („relative light units“, RLU) den Vorteil, dass Unregelmäßigkeiten in der Zellzahl und bei der Transfektionseffizienz ausgeglichen werden. Alle Versuchsansätze wurden parallel 3-fach durchgeführt und daraus der Mittelwert und die Mittelwertabweichung errechnet. Alle Experimente wurden mehrfach wiederholt und mit den beiden Hepatomzelllinien HuH-7 und HepG2 durchgeführt.

Zur Aktivitätsbestimmung potentieller TF-Bindungsstellen im LBP-Promotor wurden die Bindungsstellen durch Mutation verändert und anschließend im Luciferaseassay überprüft, ob sich die Promotoraktivität unter den spezifischen Versuchsbedingungen verändert hat. Die komplette Sequenz des LBP-Promotors und der untersuchten potentiellen TF-Bindungsstellen ist in Tabelle 3 dargestellt.

4.1  Auswahl der zu mutierenden DNA-Sequenzen

Mögliche TF-Bindungsstellen wurden in erster Linie an Hand der im Internet verfügbaren TF-Datenbank TRANSFAC 4.0 (Transcription Factor Database, http://transfac.gbf.de/) und der Auswertungssoftware MatInspector durchgeführt [188]. Sie gibt für jede potentielle Bindungsstelle einen Faktor an, der dem Grad der Übereinstimmung mit der Konsensussequenz entspricht. Dieser Faktor wird für die besonders wichtige Kernregion und für die weniger wichtige Randregion [Seite 25↓]angegeben („core similarity“ und „matrix similarity“). Es kann gezielt nach „starken“ Bindungsstellen gesucht werden, die eher eine direkte Wirkung auf den Promotor haben oder nach „schwächeren“ Sequenzen, die oft bei der Kooperation mit benachbarten Bindungsstellen wichtig sind. Zusätzlich wurde noch weitere Auswertungssoftware verwendet:

Bei neueren TF, deren Bindungsstellen noch nicht in die Datenbanken aufgenommen waren, wurde manuell gesucht und bewertet.

Die Auswahl der untersuchten Bindungsstellen erfolgte nach der Qualität der Bindungsstellen, der Lage auf dem Promotor und der Entfernung vom Transkriptionsstart sowie nach benachbarten Bindungsstellen.

Virtuell wurden einzelne Basen ausgetauscht oder kleinere Deletionen eingefügt und danach die Qualität der Mutation, wenn möglich, im MatInspector geprüft. Dadurch wurde versucht, mit geringer Veränderung an der Wildtypsequenz des Promotors die jeweilige Bindungsstelle auszuschalten (siehe Tabelle 4). Zusätzlich wurde die Mutation so gewählt, dass eine neue Restriktionsenzym-Schnittstelle entstand, an Hand derer das erfolgreiche Einfügen der Mutation überprüft werden konnte.

4.3  Mutationsassay

Ursprünglich wurde zur Einfügung der Mutationen der Morph Site-Specific Plasmid DNA Mutagenesis Kit (Eppendorf/5 Prime Inc, Hamburg) verwendet. Für diesen Kit sind Oligonukleotide mit 30 Basen ausreichend. Nach dessen Produktionseinstellung wurde der QuikChange Site-Directed Mutagenesis Kit von Stratagene (La Jolla, Kalifornien, USA) verwendet und die Mutagenese nach Herstellerangaben durchgeführt. Hierbei muss die Schmelztemperatur der Oligonukleotide genau eingestellt werden, was zu Längen der Oligonukleotide von 45 und mehr Basenpaaren führt (siehe Tabelle 5). Die Oligonukleotide, in deren Mitte sich die Mutation befindet, dienen als Primer, und über mehrere PCR-Schritte werden Strang und Gegenstrang des mutierten Plasmids generiert. Durch einen anschließenden Verdau mit dem Restriktionsenzym Dpn I, das die methylierten Ausgangsstränge schneidet, wird das nicht mutierte Plasmid zerstört. Die mutierten Plasmide wurden anschließend in E. coli transformiert und auf Selektionsmedium ausplattiert.

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Tab. 3: Sequenz des LBP-Promotors und untersuchter TF-Bindungsstellen

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Tab. 4: Mutierte, potentielle TF-Bindungsstellen auf dem LBP Promotor

¹ Name der Mutation

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Tab. 5: Verwendete Oligonukleotide zur Mutation des LBP-Promotors

*Name der Mutation, für die die Oligonukleotide verwendet wurden

Kolonien aus dem Mutationsansatz wurden einzeln ausgewählt („gepickt“), kultiviert und die Plasmid-DNA isoliert (QIAprep Spin Miniprep Kit, Qiagen, Hilden). Jede eingefügte Mutation wurde so ausgelegt, dass gleichzeitig eine neue Restriktionsenzym-Schnittstelle eingefügt wurde. Daher wurde anschließend ein Doppelverdau angesetzt: Zum einen mit dem Enzym für die neu generierte Schnittstelle und zum anderen in der Regel mit BamH I oder Xho I. An diesen Schnittstellen ist der LBP-Promotor in den Luciferase-Vektor integriert. Über ein Probegel wurde die Mutation durch das jeweils spezifische Fragment nachgewiesen. Zusätzlich wurde der mutierte Bereich kontrollsequenziert und bei kritischen oder unerwarteten Ergebnissen eine zweite Mutation zur Kontrolle durchgeführt.

Beim „electrophoretic mobility shift assay“ (EMSA) werden DNA-Protein-Interaktionen untersucht: Die Bindung eines Proteins (in der Regel eines TF) an die DNA (ein Oligonukleotid mit der Sequenz eines bestimmten Promotorabschnitts) führt gegenüber der freien DNA zu einer Veränderung der Laufeigenschaften in der Elektrophorese, d.h. zu einem „Shift“. Dieser ist an einer Verschiebung der radioaktiv markierten DNA-Bande zu erkennen. Wird zusätzlich noch ein spezifischer Antikörper gegen das DNA-bindende Protein zugegeben, tritt eine weitere Verschiebung der Bande auf, ein sogenannter „Supershift“.

Es wurden etwa 1 x 10⁶ Hepatomzellen in eine 10 cm Kulturschale ausgesät und am nächsten Tag für 15 min bis 48 Stunden stimuliert. Bei kurzen Stimulationszeiten wurde die Zelldichte entsprechend höher gewählt. Typischerweise betrug die Konfluenz der Zellen bei Lyse 80 %.

Nach Beendung der Stimulierung wurden die Zellen mit 10 ml eiskaltem (1x) PBS gewaschen, in 1 ml PBS mit einem Schaber vom Untergrund abgelöst und bei 1000 U/min und 4 °C zentrifugiert. Das Pellet wurde anschließend in 400 µl Puffer A resuspendiert und für 10 min auf Eis inkubiert.

Anschließend wurden 25 µl 10 % Nonidet NP40 zugegeben, geschüttelt und bei 4 °C bei 13000 g für 1 min zentrifugiert. Der Überstand enthielt die zytoplasmatischen Proteine. Die Pellets wurden in 50 µl Puffer B resuspendiert.

Anschließend wurden die Proben bei 4 °C für 30 min im Überkopfschüttler geschüttelt und 5 min bei 4 °C und 13000 g zentrifugiert. Die Überstände enthielten die nukleären Proteine. Die Proteinkonzentration wurde nach Bradford (Bio-Rad Protein-Assay, Bio-Rad, München) bei 595 nm im Photometer gemessen. Anschließend wurden die Proben aliquotiert, in flüssigem Stickstoff schockgefroren und bei –80 °C aufbewahrt.

Die Oligonukleotide wurden von Genset Oligos (Paris, Frankreich) oder Eurogentec (Seraing, Belgien) synthetisiert. Für den EMSA wurden i.d.R. 30 bp lange Oligonukleotide verwendet, die so gewählt wurden, dass sich die TF-Bindungsstelle im Zentrum befand.

Jeweils 10 µg der komplementären Einzelstrang-DNA wurden mit 4 µl 10 x T4-PNK-Puffer gemischt und mit A. bidest. auf 40 µl aufgefüllt, für 2 min auf 95 °C erhitzt und langsam auf Raumtemperatur abgekühlt. Das Markieren der doppelsträngigen Oligonukleotide erfolgte durch Phosphorylierung mit dem Phosphorisotop ³²P. Die PNK (Polynukleotid Kinase) wurde von Amersham Pharmacia Biotech (Freiburg) bezogen und das γ-³²P-ATP von NEN/PerkinElmer (Zaventem, Belgien).

Der Reaktionsansatz wurde für 30 min bei 37 °C inkubiert. Über Nick-Säulen (Amersham Pharmacia Biotech, Freiburg) wurden die freien Radionukleotide von der markierten doppelsträngigen DNA chromatographisch abgetrennt.

Es wurden 4 µg nukleäre Proteine, 2 µl BSA (1 µg/µl), 2 µl Puffer D⁺ und 4 µl Puffer F gemischt und mit A. bidest. auf 19 µl aufgefüllt. Zuletzt wurde 1 µl markiertes Oligonukleotid zugegeben, gemischt und für 30 min bei Raumtemperatur inkubiert.

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Für die Gfi-1-Shifts wurde folgender Puffer verwendet:

Die Ansätze wurden in einem 4 %-igen PAA-Gel mit 0,5 x TBE Laufpuffer 1 Stunde bei 200 V aufgetrennt.

Nach dem Gellauf wurde das Gel für eine Stunde auf Filterpapier in einem beheizbaren Trockner mit Vakuumpumpe getrocknet. Anschließend wurde das Gel für 30 min bis mehrere Tage auf speziellem Filmmaterial exponiert (Kodak, bezogen über Sigma-Aldrich, Taufkirchen).

Die LBP-Konzentration in den Kulturüberständen der Hepatomzellen wurde mit dem „sandwich-enzyme-linked immunosorbent assay“ (Sandwich-ELISA) gemessen. Dabei immobilisiert ein anti-LBP-Antikörper (Ak), der auf einer speziellen ELISA-Platte fixiert wurde, LBP. Mit einem zweiten, biotinylierten anti-LBP-Ak wird das LBP mittels einer Farbreaktion nachgewiesen.

Für den LBP-ELISA wurden die Hepatomzelllinien in 24-Loch-Platten mit 0,5 x 10⁵ Zellen/Loch ausgesät. Am nächsten Tag folgte die Stimulierung mit Zytokinen und Dex in 200 µl Medium/Loch für 24 bis 48 Stunden.

Die ELISA-Platte (MaxiSorp Immunoplatte, 96-well, NUNC, Wiesbaden) wurde mit 50 µl/well Coating Puffer und 0,1 µg/well des 1. Ak (polyclonal Rabbit anti-hLBP Ak, XOMA, Berkeley, USA) über Nacht bei 4 °C inkubiert. Nach dreimaligem Waschen mit Waschpuffer wurde die Platte mit 200 µl/well Verdünnungspuffer für eine Stunde bei Raumtemperatur blockiert. Danach wurden eine LBP-Verdünnungsreihe mit bekannter Konzentration (rLBP-Standard, Xoma) und 100 µl/well Zellkulturüberstände auf die Platte gegeben und nach einer Stunde 4 x gewaschen. Dann wurden 100 µl/well Verdünnungspuffer und 30 pg/well des 2. Ak (biotinylierter 1. Ak) für eine Stunde bei Raumtemperatur inkubiert und 4 x gewaschen. Streptavidin-Peroxidase (Sigma, Taufkirchen) wurde mit Verdünnungspuffer 1:1000 verdünnt und die Platte mit 100 µl/well für 30 min bei Raumtemperatur inkubiert und danach 4 x gewaschen. Durch Zugabe von 100 µg/well OPD-Substrat (o-Phenylenediamine Dihydrochloride, Tablet Sets, Sigma) erfolgte die Farbreaktion, die nach Augenmaß (5 – 30 min) durch Zugabe von 50 µl/well 2 M Schwefelsäure abgestoppt wurde. Die Extinktion der Proben wurde mit einem Spektrometer (SpectraFluor Plus, Tecan, Crailsheim) bei 492 nm gemessen und die LBP-Konzentration anhand der Eichkurve ermittelt.

Beim Northern-Blot wird die RNA (Gesamt-RNA oder mRNA) isoliert und auf einem Gel nach Fragmentgröße aufgetrennt und auf eine Nylonmembran übertragen („geblottet“). Mit Hilfe einer ³²P-markierten Sonde (einem DNA-Strang-Abschnitt aus dem zu detektierenden Gen, der mit der entsprechenden RNA hybridisiert) kann die RNA-Akkumulation nachgewiesen werden. Dazu wird die Membran mit der Sonde inkubiert, dann gewaschen und die Radioaktivität durch Auflegen eines Films nachgewiesen.

HuH-7 oder HepG2 Zellen wurden mit einer Dichte von 1 x 10⁶ Zellen/Platte in Schalen mit 10 cm Durchmesser ausgesät. Nach 2 bis 3 Tagen, bei einer Konfluenz von ca. 80 %, wurden die Zellen für 24 bis 72 Stunden stimuliert.

Die Isolierung der Gesamt-RNA wurde mit dem RNeasy Kit von Qiagen nach Angaben des Herstellers durchgeführt. Dabei wird durch Zugabe von RNAse-Inhibitoren gewährleistet, dass die RNA nicht durch zelleigene RNAsen zerstört wird. Durch β‑Mercaptoethanol, das eine stark denaturierende Wirkung auf Proteine ausübt, werden die RNA-Protein-Komplexe aufgelöst. Die Abtrennung der RNA erfolgt über Säulen, an deren Matrix sich die RNA bindet und von der sie nach mehreren Waschschritten unter geeigneten Bedingungen wieder abgelöst wird.

Die Auftrennung der RNA erfolgte unter denaturierenden Bedingungen mit Agarose-Formaldehydgel in MOPS-Puffer (3-(N-Morpholino)-Propansulfonsäure).

Für 200 ml eines 1,2 %-igen denaturierenden Agarosegels wurden 170 ml A. bidest. mit 2,4 g Agarose aufgekocht. Nach dem Abkühlen auf etwa 40 - 50 °C wurden 20 ml 10x MOPS und 6 ml 37 % Formaldehyd zugegeben.

15 µg Gesamt-RNA wurden, wenn nötig, in einer Vakuumzentrifuge auf 2 µl eingeengt und mit 13 µl Probenpuffer aufgefüllt, 15 min bei 5 °C denaturiert, auf Eis abgekühlt und nach Zugabe von 2 µl Ladepuffer auf dem Gel bei 3 V/cm aufgetrennt.

Nach dem Gellauf wurde die RNA mit einer Vakuum Blotting-Apparatur (Amersham) auf die Hybond N+ Nylonmembran (Amersham) übertragen. Zuerst wurde das Gel 2 x 5 min in A. bidest. und 30 min in 10 x SSC-Puffer (1,5 M NaCl, 0,15 M Natriumzitrat x 2 H₂O, pH 7,0) gewaschen. In 20 x SSC-Puffer wurde anschließend die RNA in der Blotting-Apparatur auf die Membran [Seite 34↓]übertragen (4 Stunden). Auf der dann getrockneten Membran wurde durch eine UV-Strahlenquelle (Stratalinker, Stratagene, La Jolla, USA) die RNA an der Membran fixiert.

Die Sonde stellt den Abschnitt eines Gens dar, dessen mRNA nachgewiesen werden soll. Dazu wurde ein Plasmid, welches das Gen trägt, in E. coli vermehrt und, wie im Abschnitt „DNA-Präparation“ beschrieben, isoliert. Das Plasmid wurde unter Verwendung geeigneter Restriktionsenzyme verdaut und das Fragment in einem 1 %-igen Agarosegel separiert. Die Isolierung des Fragments aus dem Gel erfolgte mit dem QIAquick Gel Extraktion Kit nach Angaben des Herstellers (Qiagen, Hilden).

Die Markierung der Sonde erfolgte mit dem Megaprime DNA Labelling System von Amersham Pharmacia (Freiburg) nach Herstellerangaben. In Kürze: Die denaturierten DNA-Einzelstränge der Sonde wurden mit kurzen Zufallsprimern, einem Mix aus Nukleosidtriphosphaten (außer CTP), dem Klenow-Fragment der DNA-Polymerase aus E. coli und dem Reaktionspuffer gemischt. Dazu wurde radioaktives α-³²P-dCTP gegeben, das bei der Synthese des DNA-Gegenstrangs integriert wurde. Die überschüssigen Nukleotide wurden über NAP-10 Säulen (Amersham) nach Herstellerangaben abgetrennt.

Zuerst wurde bei der Prähybridisierung die Membranoberfläche der Nylonmembran, die eine hohe Affinität zu Nukleinsäuren aufweist, so abgesättigt, dass die (DNA-) Sonde nicht unspezifisch an die Membran binden konnte. Dazu wurde der Blot für 3 Stunden bei 68 °C in Prähybridisierungslösung inkubiert.

Zur Hybridisierung wurde in die Hybridisierungslösung die bei 95 °C für 5 min denaturierte Sonde gegeben (1 – 2 x 10⁶ cpm/ml) und die Membran für 12 – 16 Stunden bei 42 °C in einem speziellen Hybridisierungsofen inkubiert. Dabei befand sich der Blot in einer zylinderförmigen Glasflasche, die sich in permanenter Drehbewegung befindet und dadurch bei minimaler Menge der Hybridisierungslösung (und der radioaktiv markierten Sonde) eine gleichmäßige Benetzung des Blots gewährleistet.

Anschließend wurde die Membran wie folgt gewaschen:

Die Schritte 3 und 4 wurden bei unspezifischen Signalen und hohem Hindergrund wiederholt. Danach wurde die noch feuchte Membran in Folie eingeschlagen und ein Röntgenfilm belichtet (Kodak X-OMAT-AR über Amersham, Freiburg).

Eine Nylonmembran kann mehrfach mit verschiedenen Sonden hybridisiert werden. Dies wurde regelmäßig mit einer GAPDH-Sonde als „house keeping“-Kontrolle durchgeführt: GAPDH wird konstitutiv exprimiert und dient der internen Kontrolle und dem Abgleich von RNA-Menge und -Qualität. Dazu wurde der Blot „gestrippt“, d.h. bei 85 °C für 15 min in A. bidest. gewaschen und dadurch die alte Sonde entfernt. Anschließend wurde der Blot wie beschrieben prähybridisiert und erneut hybridisiert.

Für die RT-PCR wurde die Gesamt-RNA wie unter 7.2 beschrieben mit dem RNeasy Kit von Qiagen isoliert. Die reverse Transkription und die PCR wurden getrennt durchgeführt. Die RT-Reaktion wurde unter Verwendung des Omniscript Reverse Transcriptase-Kit von Qiagen nach Firmenangaben mit 3 µl der Gesamt-RNA durchgeführt.

Für die PCR wurden zu 21 µl „Master-Mix“, der unter Verwendung des Taq PCR Core Kit von Qiagen hergestellt wurde, 4 µl cDNA aus der RT-Reaktion gegeben. Folgende Primer wurden verwendet:

Gfi-1sense5’-TACAAGTGCATCAAGTGCAGC-3’

Gfi-1antisense5’-TTGTGAAGCTTCTCACCAGTG-3’

Die Gfi-1-PCR wurde mit 30 Zyklen durchgeführt, und zwar erst für 30 s bei 95° C, dann 45 s bei 60° C und schließlich 30 s bei 72 °C. Danach wurden die Proben für 10 min bei 72° C inkubiert. Anschließend wurden jeweils 5 µl der PCR-Proben wie unter Abschnitt 2.3 beschrieben in einem 1,5 %igem Agarosegel aufgetrennt und unter UV-Licht fotografiert.

Beim Western-Blot werden isolierte Proteine elektrophoretisch aufgetrennt und auf einer Membran fixiert. Über anschließende Inkubation der Membran mit spezifischen Antikörpern können bestimmte Proteine nachgewiesen werden.

HuH-7- oder HepG2-Zellen wurden mit einer Dichte von 3 x 10⁵ Zellen/Loch in einer 6-Loch-Platte ausgesät. Nach 2 bis 3 Tagen, bei einer Konfluenz von ca. 80 %, wurden die Zellen in der Regel für 20 min mit Zytokinen stimuliert.

Die stimulierten Zellen wurden in kaltem PBS mit 1 mM Na₂O₄Va zweimal gewaschen und mit 150 μl/well kaltem Lysepuffer für ca. 10 min bei 4° C inkubiert. Die Zellen wurden anschließend mit einem Schaber abgelöst und 20 min bei 13000 U/min und 4° C zentrifugiert. Im Überstand befand sich die postmitochondriale Fraktion mit den zytoplasmatischen Proteinen. Die [Seite 37↓]Proteinkonzentration wurde gemessen, die Überstände aliquotiert, in flüssigem Stickstoff schockgefroren und bei –80 °C aufbewahrt.

Das Trenngel wurde bis 1 cm unterhalb des Kammendes gegossen und mit Wasser überschichtet. Nach der Polymerisierung des Trenngels wurde das Wasser abgekippt und das Sammelgel darüber gegossen.

Pro Ansatz wurden 30 µg Protein verwendet und die entsprechende Menge 4 x Probenpuffer hinzugegeben (Endkonzentration 1 x).

Die Proben wurden anschließend 5 min bei 95° C inkubiert und auf Eis abgekühlt. Das Gel wurde beladen und bei 80 V gestartet. Nachdem die Proben vollständig in das Trenngel eingelaufen waren, wurde die Spannung auf 150 V erhöht.

Die Membran (Milipore Immobilon-P, Amersham Pharmacia Biotech, Freiburg) wurde kurz in EtOH (100%, unvergällt) gespült und anschließend 10 min in Transferpuffer inkubiert. Das Gel wurde ebenfalls 10 min in Transferpuffer inkubiert. Das Blotten erfolgte in einem Semitrocken-Verfahren mit der Blottingapparatur von Hölzer GmbH (Dörfen). Dazu wurden der Reihenfolge nach zwei Lagen dickes, mit Transferpuffer getränktes Whatman-Papier (Schleicher & Schuell, Dassel), die [Seite 38↓]Membran, das Gel und nochmals getränktes Whatman-Papier auf die Apparatur gelegt und bei 15 mA für 1,5 Stunden geblottet.

Die Membran wurde anschließend kurz in PBST (PBS mit 0,05 % Tween 20) gespült und die Membran für 1 Stunde in 20 ml Blockierlösung (PBST mit 5 % Milchpulver) bei RT inkubiert, danach 3 x 5 min in PBST gewaschen und mit dem primären Antikörper in 15 ml PBST über Nacht bei 4 °C inkubiert (siehe Tabelle 6).

Am nächsten Tag wurde die Membran 3 x 5 min in PBST gewaschen und mit dem sekundären Antikörper in 15 ml PBST für eine Stunde bei Raumtemperatur inkubiert, dann 2 x 5 min in PBST gewaschen und weitere 2 x 5 min in PBS gewaschen. Der Nachweis erfolgte mit dem ECL-System (Western blotting detection reagents) und Hyperfilm ECL Film von Amersham nach Angaben des Herstellers.

Sollte auf der Membran ein zweites Protein nachgewiesen werden, wurde sie für 15 min bei 50 °C in Striplösung inkubiert, 3 x 5 min in PBST gewaschen, 30 min in Blockingpuffer blockiert und 3 x 5 min in PBST gewaschen. Die Detektion wurde wie oben beschrieben durchgeführt.

Tab. 6: Verwendete Antikörper

Die p44/42-Kinaseaktivität wurde mit einem Messsystem von Amersham Pharmacia Biotech (Freiburg) nach modifizierten Herstellerangaben nachgewiesen. Die p44/42-Kinase katalysiert den γ-Phosphat-Transfer von Adenosin-5´-Triphosphat zu einem spezifischen Peptid. Durch die Bindung des Peptids an ein spezielles Filterpapier kann das nicht umgesetzte Phosphat abgetrennt werden. Detektiert wird die Radioaktivität des verwendeten Isotops ³³P.

Pro Ansatz wurden 5 µg Protein mit Lysepuffer (Proteinisolierung und Lysepuffer siehe Western-Blot) auf 15 µl aufgefüllt, 10 µl Substrat, 5 µl kaltes ATP und 1 µCi (γ-³³P)ATP (Amersham) [Seite 39↓]gemischt, bei 37 °C inkubiert und nach 30 min mit 10 µl Stopplösung abgestoppt. 30 µl des Ansatzes wurden auf das spezielle Filterpapier aufgebracht, erst 2 x 2 min in 1 %-iger Essigsäure, dann 2 x 2 min in A. bidest. gewaschen und im Szintillationszähler (Liquid Scintillation Counter, Raytest, Berlin) die Aktivität gemessen.

Mit Hilfe von Fluorescence Activated Cell Sorter (FACS)-Analysen wurde in der vorliegenden Arbeit die Integration von Rezeptoren auf der Zelloberfläche nachgewiesen. Dabei bindet ein erster Ak spezifisch an den Rezeptor, an den ein zweiter, Fluorescein-Isothiocyanate (FITC)-markierter Ak bindet. Die Fluoreszenz jeder Zelle wird im FACS-Gerät gesondert gemessen, aufgrund der großen Anzahl erfasster Zellen sind statistisch gesicherte Aussagen leicht möglich.

Die Hepatomzellen wurden in einer Dichte von 0,5-1 x 10⁵ Zellen/Loch in einer 24-Loch-Platte ausgesät und am nächsten Tag mit Zytokinen und Dex stimuliert.

1. Antikörper:Anti-human IL-6 R Antibody, Goat (R&D Systems, Wiesbaden)
oder Anti-human gp130 Antibody, Goat (R&D Systems, Wiesbaden)

2. Antikörper:FITC-conjugated Anti-Goat IgG, Rabbit (Jackson ImmunoResearch, West Baltimore Pike, USA)

Nach Abschluss der Stimulierung wurden die Zellen 2 x mit 0,5 ml FACS-Puffer (1 x PBS mit 5 % FCS) gewaschen und für 1 Stunde bei 37 °C mit dem 1. Ak inkubiert (0,5 µg/Loch in 200 µl FACS-Puffer). Anschließend wurden die Zellen nach zweimaligem Waschen ebenfalls für 1 Stunde mit dem zweiten, FITC-markierten AK inkubiert (1:25 in 200 µl FACS-Puffer). Dieser und folgende Schritte wurden aufgrund der Lichtempfindlichkeit von FITC lichtgeschützt durchgeführt. Nach der Ak-Inkubation wurden die Zellen nochmals zweimal gewaschen und in 0,5 ml/Loch Fixierpuffer (PBS, 0,5 % Formaldehyd) abgelöst und maximal 7 Tage bei 4 °C lichtgeschützt gelagert.

Die FACS-Messungen wurden mit einem FACS-Scan (Becton Dickinson, Heidelberg) und der zugehörigen Software (CellQuest, Becton Dickinson) durchgeführt. Da nur mit Hepatomzelllinien gearbeitet wurde, war keine Abgrenzung zu anderen Zellpopulationen nötig. Pro Ansatz wurde die Fluoreszenz von 50 000 Zellen gemessen und der Mittelwert berechnet. Die Versuche wurden mindestens dreimal wiederholt.

Alle dargestellten Ergebnisse zeigen Versuche, die mindestens dreimal erfolgreich durchgeführt wurden. Die Ergebnisse wurden, wenn nicht anders bemerkt, in den beiden Zelllinien HepG2 und HuH-7 durchgeführt und bestätigt. Wurden A-549 Zellen verwendet, ist ausdrücklich darauf hingewiesen.

Die Abbildungen aus EMSA und Western- und Northern-Blot wurden in dem Programm Adobe Photoshop D1-4.0 (Adobe Systems Inc., San Jose, USA) bearbeitet. Die Berechnung der Mittelwerte, der Mittelwertabweichungen und der Signifikanzen, sowie die graphische Darstellung der Ergebnisse wurden mit den Programmen Excel 97, Power Point 97 (Microsoft Corp., Redmond, USA) und SPSS für Windows 9.0 (SPSS Inc., Chicago, USA) durchgeführt. Wenn nicht anders vermerkt ist der MIttelwert +/- Mittelwertabweichung dargestellt. Die Ergebnisse wurden mit dem U-Test von Mann Whitney untersucht und Unterschiede mit weniger als 5 % Irrtumswahrscheinlichkeit (p < 0,05) wurden als signifikant betrachtet. In Abbildungen mit uneindeutigen Ergebnissen sind die signifikanten Ergebnisse markiert, soweit sie für die Aussage des Experiments relevant sind.