III  Ergebnisse

Zunächst wurde die Induzierbarkeit der Genexpression von LBP durch IL-1, IL-6 und Dex auf Protein-, RNA-, und Promotorebene untersucht und der Einfluss von TNF-α beurteilt. Außerdem wurden die Mechanismen beleuchtet, die für die Vermittlung der IL-6-Effekte verantwortlich sind.

Zunächst wurde die LBP-Proteinkonzentration in den Zellkulturüberständen stimulierter Hepatomzellen mit Hilfe eines humanen LBP-ELISA gemessen. Da LBP sezerniert wird und es keine Hinweise auf eine posttranslationale Regulation von LBP gibt, entspricht die gemessene LBP-Konzentration in den Kulturüberständen der akkumulierten LBP-Proteinbiosynthese.

HepG2-Zellen wurden mit IL-1, IL-6 und Dex in verschiedenen Kombinationen für 48 Stunden stimuliert. Bei der verwendeten Versuchsanordnung (siehe Material und Methoden) konnte keine konstitutive LBP-Expression gemessen werden (Abb. 4).

	Abb. 4 : IL-1, IL-6 und Dex stimulieren die LBP-Expression synergistisch HepG2-Hepatomzellen wurden mit einer Dichte von 0,5 x 105 Zellen/Loch in einer 24-Lochplatte ausgesät und am nächsten Tag in 200 µl/well Kulturmedium für 48 Stunden mit den angegebenen Konzentrationen von IL-1, IL-6 und Dex stimuliert. Die Überstände wurden abgenommen und ein hLBP-ELISA, wie in Material und Methoden beschrieben, durchgeführt. Angegeben ist die LBP-Konzentration in den Kulturüberständen.

Eine Wirkung von IL-1 und Dex allein war ebenfalls nicht nachweisbar. Die Inkubation mit IL-6 allein bewirkte eine Zunahme der LBP-Konzentration auf etwa 20 ng/ml LBP, wobei mit 500 U/ml IL-6 die stärkste Stimulation erzielt wurde. Die Kombination von IL-6 mit IL-1 oder Dex ergab eine weitere, deutliche Erhöhung der LBP-Konzentration in den Kulturüberständen. Die maximale LBP-Konzentration wurde nach einer Stimulationsdauer von 48 Stunden gemessen. Nach kürzerer Stimulation (12 und 24 Stunden) konnte ebenfalls LBP-Protein in den Überständen nachgewiesen werden, wobei es aber in geringerer Konzentration als nach 48 Stunden Stimulationsdauer vorlag. [Seite 42↓]Nach 72 Stunden Inkubationsdauer war die LBP-Konzentration ebenfalls deutlich geringer als nach 48 Stunden (nicht dargestellt). Die Stimulierung der zweiten verwendeten Hepatomzelllinie, HuH-7, führte zum gleichen Stimulationsmuster wie in den HepG2-Zellen (nicht dargestellt). In Bezug auf die untersuchten LBP-Effekte wurde zwischen den Zelllinien in der Regel kein oder kein wesentlicher Unterschied festgestellt. Wurden doch Unterschiede gefunden, wird darauf ausdrücklich hingewiesen.

Um die Wirkungsweise der Stimulanzien auf die LBP-Expression näher zu bestimmen, wurde zunächst die LBP-mRNA-Akummulation untersucht. Es zeigte sich, dass IL-1, IL-6 und Dex auf die mRNA in ähnlicher Weise wirken wie auf die Proteinexpression. Die Inkubation der Hepatomzellen mit IL-1 und Dex allein hatte nur geringen Einfluss auf die LBP-mRNA-Akkumulation (nicht gezeigt).

	Abb. 5 : LBP-mRNA-Akkumulation in stimulierten HuH-7 Zellen HuH-7-Zellen wurden für 48 bzw. 72 Stunden mit den angegebenen Konzentrationen von IL-1, IL-6 und Dex stimuliert. Anschließend wurden die Zellen lysiert und die RNA isoliert. Die Abbildung zeigt einen Northern-Blot, durchgeführt wie in Material und Methoden beschrieben und mit einer 32P-γ-ATP markierten LBP-Sonde hybridisiert. Nach dem Entfernen („Strippen“) der LBP-Sonde wurde der Blot mit GAPDH hybridisiert, dessen RNA-Konzentration als interner Abgleich diente.

Die stärkste Anhäufung von LBP-mRNA wurde nach Stimulierung mit 50 U/ml IL-1, 5000 U/ml IL-6 und 1 µM Dex für 48 Stunden gemessen (Abb. 5).Nach 72 Stunden war die detektierbare mRNA-Konzentration gegenüber dem 48 Stunden-Wert wieder deutlich abgefallen.

Als nächstes wurde die transkriptionelle Aktivität des LBP-Promotors mit Hilfe eines in die Zelllinien transfizierten LBP-Promotor/Luciferase-Konstruktes untersucht (hier mit dem 1780 bp langen 5´-Bereich vor dem Transkriptionsstart des LBP-Gens). Einen Tag nach der Transfektion wurden die Zellen stimuliert und 48 Stunden später die Luciferase-aktivität gemessen, welche sich proportional zu der LBP-Promotoraktivität verhält. Auch hier war das Stimulationsmuster ähnlich dem der Proteinfreisetzung, aber mit kleinen Unterschieden (Abb. 6). IL-6 wirkt stark stimulierend auf den LBP-Promotor und die Kombination mit IL-1 und/oder Dex verstärkt diesen Effekt. Wurden die Zellen mit IL-1 oder Dex alleine inkubiert, zeigte sich zwar ein wesentlich geringerer aktivierender Effekt als bei IL-6, dieser war aber, im Gegensatz zur Protein- und mRNA-Ebene, messbar und lag signifikant über der konstitutiven Aktivität unstimulierter Zellen. Da das Luciferase-Meßsystem besonders sensitiv ist, können hiermit Effekte dargestellt werden, die in den anderen Systemen unter der Nachweisbarkeitsgrenze liegen. Dies deutet darauf hin, dass die Unterschiede der [Seite 43↓]alleinigen IL-1- oder Dex-Wirkung bei den verschiedenen Messsystemen mit Sensitivitätsunterschieden der Methoden erklärt werden können.

	Abb. 6 : IL-1, IL-6 und Dex aktivieren die LBP-Promotoraktivität HepG2-Zellen wurden mit dem vollständigen, 1780 bp langen LBP-Promotor/Luciferase-Konstrukt transfiziert und am darauf folgenden Tag in angegebener Weise mit IL-1, IL-6 und Dex für 48 Stunden stimuliert. Anschließend wurden die Zellen lysiert und die Luciferaseaktivität gemessen. Die β-Galaktosidase (β-Gal)-Aktivität eines kotransfizierten und konstitutiv exprimierten RSV-β-Gal Vektors wurde ebenfalls gemessen und die Luciferaseaktivität damit normalisiert. Dieses Verhältnis von Luci- zu β-Gal-Aktivität (Luci / β-Gal) wird hier und im folgenden als relative Luciferaseaktivität (RLA) bezeichnet.

TNF-α ist ein Zytokin, das typischerweise während einer Sepsis in erhöhter Konzentration im Blutserum vorliegt. Dies und seine bekannte stimulierende Wirkung auf verschiedene Akutphase-Proteine ließen vermuten, dass TNF-α ebenfalls bei der Aktivierung der LBP-Expression mitwirkt. Daher wurde die Wirkung von TNF-α auf die LBP-Promotoraktivität untersucht. Dabei konnten keine wesentlicher Effekte von TNF-α auf die Aktivierung der LBP-Transkription nachgewiesen werden (Abb. 7). Bei Verwendung von 500 U/ml IL-6 und 1 µM Dex schien die Zugabe von 10 ng/ml TNF-α die LBP-Promotoraktivität leicht zu erhöhen. Nach alleiniger Inkubation der Hepatomzelllinien mit TNF-α konnte in keinem Fall ein signifikanter TNF-α-Effekt festgestellt werden. Insgesamt hat TNF-α unter den verwendeten Bedingungen in der Regel offensichtlich keinen nachweisbaren Einfluss auf die Aktivität des LBP-Promotors. Die Untersuchung der TNF-α -Wirkung auf die LBP-Proteinsynthese zeigte ebenfalls keine signifikanten Effekte (nicht dargestellt).

	Abb. 7 : Der Effekt von TNF-α auf die LBP-Promotoraktivität HuH-7-Zellen wurden nach der Transfektion mit dem LBP-Promotor/Luciferase-Konstrukt wie gezeigt mit IL-1, IL-6 und Dex für 48 Stunden stimuliert und zusätzlich mit TNF-α inkubiert. Die gemessene Luciferaseaktivität ist β-Gal-normalisiert (relative Luciferaseaktivität, RLA).

1.3  Kotransfektion verschiedener C/EBP-Varianten in Hepatomzellen

Im Folgenden wurde die Wirkung von IL-6 auf die Aktivität des LBP-Promotors untersucht. Dazu wurde zusammen mit dem LBP-Promotor/Luciferase-Konstrukt der Nukleäre Faktor (NF)-M (das (C)CAAT/enhancer binding protein (C/EBP)‑β-Homolog des Huhns) in die untersuchten Zellen kotransfiziert. C/EBP‑β ist eines der wichtigsten Ziele der IL-6-Signalketten. Zusätzlich wurde die NF-M 229-Mutante kotransfiziert, die durch einen Aminosäurenaustausch an AS 229 als dominante Negativmutante wirkt.

	Abb. 8 : C/EBP‑β von Huhn und Ratte aktivieren den LBP-Promotor HuH-7-Zellen wurden neben dem LBP-Promotor/Luciferase-Konstrukt mit den Expressionsvektoren NF-M (C/EBP‑β des Huhns, A linke Seite), NF-M 229 (transdominante Negativmutante des NF-M mit einer Mutation bei AS 229, A rechts) und CRP2 (C/EBP-β der Ratte, B) in den angegebenen Konzentrationen transfiziert. Die Zellen wurden nach der Transfektion für 48 Stunden kultiviert und anschließend die Luciferaseaktivität gemessen. Die mit NF-M 229 transfizierten Zellen wurden zusätzlich am Tag nach Transfektion mit 50 U/ml IL-1, 500 U/ml IL-6 und 1 µM Dex für 48 Stunden stimuliert. Dargestellt ist die relative Luciferaseaktivität (RLA).

Durch Kotransfektion von NF-M in steigender Konzentration konnte eine zunehmende LBP-Promotoraktivität nachgewiesen werden (Abb. 8A, linke Teilabbildung). Nach Kotransfektion eines mock-Kontrollvektors, der ein Plasmid ohne das NF-M-Gen darstellt, wurde dagegen nur eine geringe Zunahme der Promotoraktivität erzielt. Die Kotransfektion der dominanten Negativmutanten NF-M 229 führte in stimulierten HuH-7-Zellen zu einer starken Reduktion der Promotoraktivität (Abb. 8A rechter Teil).

Des weiteren konnte bei der Kotransfektion eines Expressionsvektors, der das C/EBP-β der Ratte (CRP2) trägt, ebenfalls eine deutliche Zunahme der LBP-Promotoraktivität nachgewiesen werden (Abb. 8B).

Die Analysen des LBP-Promotors in TF-Datenbanken (siehe Mat & Met 4.1) ergaben eine Vielzahl von möglichen Bindungsstellen für C/EBP-β und Stat-3, den beiden wichtigsten TF, die das IL-6-Signal in den Zellkern vermitteln. Einige der Bindungsstellen wurden mit Hilfe von Mutageneseexperimenten untersucht.

	Abb. 9 : C/EBP-Bindungsstellen vermitteln die IL-6-induzierte Aktivierung des LBP-Promotors Drei potentielle C/EBP-Bindungsstellen wurden wie dargestellt durch Punktmutation modifiziert (unterstrichen), wobei die Mutation in trunkierte Promotorelemente eingefügt wurde, um den Einfluss weiterer im 5´-Bereich liegender C/EBP-Elemente auszuschließen. Die LBP-Promotor/Luciferase-Konstrukte wurden wie dargestellt transfiziert und mit 50 U/ml IL-1, 500 U/ml IL-6 und 1 µM Dex oder mit 500 U/ml IL-6 für 48 Stunden stimuliert. Die anschließende Luciferasemessung wurde mit β-Gal verrechnet. Dargestellt ist der Quotient der Luciferasemessung aus IL-1, IL-6 und Dex bzw. aus nur IL-6-stimulierten Zellen und der Aktivität aus unstimulierten Zellen. Dadurch erhält man die x-fache Aktivität des stimulierten Promotors verglichen mit dem unstimulierten Promotor. *Signifikanter Unterschied gegenüber wt.

In Abb. 9 sind die drei untersuchten potentiellen C/EBP-Bindungsstellen mit wt-Sequenz und eingefügter Mutation dargestellt. Die Aktivität des wt- und des mutierten Promotors nach maximaler Stimulation bzw. nach Stimulation mit IL-6 ist im Verhältnis zur Promotoraktivität in unstimulierten Zellen dargestellt (stimuliert / unstimuliert = x-fache Aktivität). Die Ergebnisse zeigen eine signifikant verringerte Promotoraktivität nach maximaler und nach IL-6-Stimulation bei Verwendung der CEBP III-Mutanten. Bei den potentiellen C/EBP-β-Bindungsstellen CEBP I und II konnte hingegen kein signifikanter Einfluss auf den Promotor nachgewiesen werden.

Zwei potentielle Stat-3-Bindungsstellen wurden ebenfalls mutiert und die relative Luciferaseaktivität aus stimulierten und unstimulierten Zellen ins Verhältnis gesetzt (Abb. 10).

	Abb. 10 : Analyse von zwei Stat-3-Bindungsstellen Zwei potentielle Stat-3-Bindungsstellen (Stat I bei –447 bp und Stat II bei –399 bp) wurden in der LBP-Promotor-Trunkation –463 bp mutiert. Die x-fache Promotoraktivität nach Stimulation mit IL-6 oder IL-1, IL-6 und Dex wurde im Vergleich zu der Aktivität im unstimulierten Promotor ermittelt. *Signifikanter Unterschied gegenüber wt mit gleicher Stimulation

Hier zeigte sich ein Einfluss dieser Bindungsstellen besonders auf die Promotoraktivität nach IL-6-Stimulation. Beide Mutationen, Stat I und Stat II, führten dabei zu einer deutlichen Herabsetzung der Aktivität. Nach maximaler Stimulation mit IL-1, IL-6 und Dex konnte hingegen keine signifikante Reduzierung der Promotoraktivität nachgewiesen werden.

1.5  Die Rolle von AP-1-Bindungsstellen im LBP-Promotor

Von AP-1, einem TF, der sowohl Endpunkt der IL-6- als auch der IL-1-Signaltransduktion sein kann, befinden sich ebenfalls eine Vielzahl potentieller Bindungsstellen auf dem LBP-Promotor. Sechs dieser möglichen Bindungsstellen wurden untersucht und im folgenden mit AP I bis AP VI bezeichnet (Abb. 11). In der Regel wurden Punktmutationen eingefügt, lediglich bei AP IV wurde der relevante Bereich komplett deletiert. Auch hier ist die x-fache Promotoraktivität nach Stimulierung im Vergleich zu unstimulierten Zellen dargestellt, jeweils beim wt und beim wie angezeigt mutierten Promotor.

	Abb. 11 : AP-1-Bindungsstellen vermitteln die Aktivierung des LBP-Promotors Sechs potentielle AP-1-Bindungsstellen wurden, wie in der linken Hälfte der Abbildung dargestellt, mutiert. Die Konstrukte wurden in HuH-7-Zellen transfiziert und für 48 Stunden mit IL-6 (500 U/ml) oder IL-1 (50 U/ml), IL-6 (500 U/ml) und Dex (1µM) stimuliert. Dargestellt ist die x-fache Promotoraktivität der stimulierten Zellen im Vergleich zu unstimulierten Zellen. *Signifikanter Unterschied gegenüber wt mit gleicher Stimulierung

Nach Mutationen der Loci AP I und AP II konnte nach maximaler Stimulierung mit 50 U/ml IL-1, 500 U/ml IL-6 und 1 µM Dex eine klar verminderte Promotoraktivität gegenüber dem wt-Promotor nachgewiesen werden. Nach alleiniger IL-6-Stimulierung wurde nur in AP II eine reduzierte Promotoraktivität detektiert. Die potentielle AP-1-Bindungsstelle bei –819 bp (Mutation AP III) scheint keinen Einfluss auf die Aktivierbarkeit des LBP-Promotors zu haben. Die Mutation AP IV reduziert die Promotoraktivität sowohl nach IL-6-Stimulation als auch nach maximaler Stimulation. Die Effekte bei AP V sind nicht signifikant, bei AP VI hingegen konnte eine deutliche Reduzierung der Promotoraktivität nach maximaler Stimulierung gezeigt werden.

Wie in Abb. 6 gezeigt wurde, hat auch IL-1 allein eine stimulierende Wirkung auf die LBP-Promotoraktivität, entfaltet aber seine volle Wirkung erst in Synergie mit IL-6. Außerdem konnte gezeigt werden, dass die maximale Wirkung von IL-1 bei einer Konzentration von 50 U/ml erreicht wird (nicht dargestellt). Im Folgenden sollen die Ursachen der IL-1-Wirkung genauer untersucht werden.

In den Hepatomzellen wurden unterschiedliche Signalübertragungswege untersucht, die bekanntermaßen durch IL-1 aktiviert werden können. Dazu wurde zunächst die Aktivität von p44/42 mit einem Analysesystem von Amersham untersucht, das den Transfer von ³²P auf ein spezifisches Peptid, also direkt die Kinaseaktivität von p44/42 misst. Nach Inkubation mit 50 U/ml IL-1 für 20 min konnte eine deutliche Aktivierung der p44/42-Kinaseaktivität nachgewiesen werden (Abb. 12).

	Abb. 12 : Aktivierung der p44/42-Kinaseaktivität in Hepatomzellen HuH-7-Zellen wurden mit 50 U/ml IL-1, 500 U/ml IL-6 und 1 µM Dex wie angezeigt für 20 min stimuliert und die zytoplasmatischen Proteine isoliert. Die Messung der p42/44-Kinaseaktivität erfolgte mit einem Messsystem von Amersham. Dabei wird das 32P-Isotop aus 32P-γ-ATP auf ein spezifisches Peptid übertragen. Die Transferrate, bestimmt im Szintillationszähler (counts per minute, CPM), entspricht dabei der enzymatischen Aktivität von p44/42 (Mittel aus Dreifachwerten +/- Standardabweichung).

Die Inkubation mit IL-6 (500 U/ml) alleine und Dex (1 µM) alleine führte zu keiner erhöhten Kinaseaktivität. Die Kombination der drei Stimulanzien führte zur gleichen p44/42-Aktivität wie nach Inkubation mit IL-1 allein. Demnach ist von den untersuchten Stimulanzien allein IL-1 in der Lage, in den Hepatomzellen den p44/42-Signalweg zu aktivieren.

Die Aktivierung der Kinase p38, ebenfalls ein Glied eines bekannten IL-1-Signalwegs, erfolgt durch Phosphorylierung. Dieses phospho-p38 wurde durch spezifische Antikörper, die nur an phosphoryliertes p38 binden können, im Western-Blot detektiert. Auch hier erfolgte die Aktivierung ausschließlich nach IL-1-Inkubation. Die Kombination von IL-1, IL-6 und Dex führte zu etwa dem [Seite 50↓]gleichen Effekt wie nach alleiniger IL-1-Inkubation (Abb. 13). Die Detektion der p38-Kinase diente als Ladekontrolle.

	Abb. 13 : IL-1-Inkubation steigert die Phosphorylierung von p38 (pp38) HepG2-Zellen wurden für 20 min mit IL-1 (50 U/ml), IL-6 (500 U/ml) und Dex (1 µM) wie angezeigt stimuliert. Die zytoplasmatischen Proteine wurden isoliert, elektrophoretisch aufgetrennt, auf eine Nylon-Membran transferiert und fixiert. Die p38-Kinase bzw. die phosphorylierte p38-Kinase (pp38) wurde durch spezifische Antikörper nachgewiesen.

Dagegen ergaben sich bei der Untersuchung der Aktivierbarkeit (Phosphorylierung) von JNK durch IL-1, IL-6 und Dex Unterschiede im Induktionsmuster: Auch hier stimulierte IL‑1 die Phosphorylierung von JNK, und die Inkubation von IL-6 und Dex alleine zeigte keine Effekte auf JNK. Nach Stimulierung mit IL-1, IL-6 und Dex allerdings war die Phosphorylierung gegenüber der Stimulation mit IL-1 alleine deutlich erhöht. Demnach verstärkten IL-6 und Dex die Wirkung von IL-1, obwohl sie allein keinen detektierbaren Effekt zeigen (Abb. 14).

	Abb. 14 : IL-1 aktiviert JNK und wirkt mit IL-6 synergistisch HuH-7 Zellen wurden für 20 min wie angezeigt mit IL-1 (50 U/ml), IL-6 (500 U/ml) und Dex (1 µM) stimuliert, die zytoplasmatischen Proteine isoliert, elektrophoretisch aufgetrennt, und auf eine Nylonmembran übertragen. Anschließend wurde der Blot mit einem spezifischen Antikörper gegen phosphoryliertes JNK (pJNK) inkubiert.

Typischerweise enden die hier untersuchten IL-1-Signalwege beim TF AP-1. Der Einfluss von AP-1 auf den LBP-Promotor wurde schon in Abschnitt 1.5 untersucht, da AP-1 ebenfalls IL-6-Effekte vermittelt.

Ein zweiter wichtiger Pfad für die Übermittlung des IL-1-Effekts ist der NF-κB-Signalweg. Da auf dem LBP-Promotor mehrere Bindungsstellen, die eine hohe Übereinstimmung mit der NF-κB-Konsensussequenz aufweisen gefunden wurden, wurden die NF-κB-Signaltransduktion und die [Seite 51↓]Aktivität der potentiellen NF-κB-Bindungsstellen auf dem Promotor untersucht. Zuerst wurde getestet, ob in den beiden verwendeten Hepatomzelllinien HepG2 und HuH-7 der NF-κB-Weg aktiv ist. Dazu wurden die Zellen mit einem ELAM-Luciferase-Plasmid transfiziert, das vor dem Luciferasegen einen Promotor trägt, der mehrere NF-κB-Bindungsstellen aufweist. Die Aktivierung des NF-κB-Wegs führt so in diesem Assay zu einer erhöhten Luciferasesynthese.

	Abb. 15 : Der NF- κ B-Signalweg ist in HuH-7-Hepatomzellen aktiv A: HuH-7-Zellen wurden mit dem ELAM/Luciferase-Konstrukt transfiziert, am nächsten Tag für 48 Stunden mit IL-1 (50 U/ml), IL-6 (500 U/ml) und Dex (1 µM) stimuliert und anschließend die Luciferaseaktivität bestimmt. Dargestellt ist die β-Gal-normalisierte, relative Luciferaseaktivität (RLA). B: HuH-7-Zellen wurden mit 50 U/ml IL-1, 500 U/mI IL-6 und 1 µM Dex für 20 min bis 4 Stunden stimuliert und anschließend die nukleären Proteine isoliert. 4 µg nukleäre Proteine wurden mit einem 32P-γATP-markierten Oligonukleotid, das die Konsensussequenz von NF-κB trägt, für 30 min inkubiert und anschließend elektrophoretisch von ungebundenen Oligonukleotiden getrennt. Die Abbildung zeigt die NF-κB-spezifische Bande nach Stimulation über den angegebenen Zeitraum.

Nach Stimulation und Transfektion von ELAM konnte gezeigt werden, dass NF-κB durch IL-1 in den Hepatomzelllinien HuH-7 (Abb. 15A) und HepG2 (nicht dargestellt) aktivierbar ist und IL-6 und Dex auf NF-κB keinen Einfluss haben. Bestätigt wurde die Aktivierbarkeit von NF-kB durch die Stimulierung der Zellen für 20 min bis 4 Stunden und die anschließende Analyse mit der EMSA-Technik. Hierbei zeigte sich die typische NF‑κB-Wirkung nach Stimulierung. Die maximale Aktivierbarkeit trat dabei schon nach 20 min ein und nahm danach, ohne ein Plateau zu bilden, wieder ab (Abb. 15B).

NF-κB kann sich aus verschiedenen Monomeren zusammensetzen: Typischerweise besteht es aus einem p50- und p65-Heterodimer; Homodimere aus zwei p65-Untereinheiten sind ebenfalls aktiv, während p50-Homodimere inaktiv sind. Um die direkte Wirkung von NF-κB auf den LBP-Promotor untersuchen zu können, wurde zusammen mit dem LBP-Promotor/Luciferase-Konstrukt ein p65-Expressionsvektor in verschiedenen Konzentrationen in die verwendeten Zellen transfiziert (Abb. 16).

	Abb. 16 : Expressionsvektor p65 erhöht die LBP-Promotoraktivität Der LBP-Promotor/Luciferase-Vektor wurde zusammen mit einem p65-Expressionsvektor wie angegeben in verschiedenen Konzentrationen in HuH-7-Zellen transfiziert. Nach 48 Stunden Kultivierung wurde die Luciferaseaktivität gemessen und β-Gal-normalisiert (relative Luciferaseaktivität, RLA)

Die Expression von p65 bewirkt dabei eine Erhöhung der LBP-Promotoraktivität um das 7- bis 20-fache gegenüber der stimulierenden Aktivität des mock-Kontrollvektors, der kein p65-Gen beinhaltet.

2.4  NF-κB-Bindungsstellen auf dem LBP-Promotor

Zwei von mehreren potentiellen NF-κB-Bindungsstellen auf dem LBP-Promotor wurden durch Mutationsexperimente untersucht. Sowohl die Mutation NF-κB I (-1701 bp) als auch NF-κB II (-515 bp) hatten einen deutlichen Einfluss auf die Aktivierbarkeit des LBP-Promotors (Abb. 17). Nach der Stimulation der Zellen mit IL-1, IL-6 und Dex waren die beiden mutierten LBP-Promotoren bis zu 50 % geringer stimulierbar als die entsprechenden Trunkationen des wt-Promotors. Nach Stimulation mit IL-6 allein zeigte sich, wie zu erwarten, keine signifikante Abnahme der Aktivität in den mutierten Promotoren. Nach Stimulation der NF-κB-Mutanten mit IL-1 alleine zeigte sich regelmäßig ein Abfall der Promotoraktivität gegenüber den wt-Trunkationen. Die NF-κB-Bindungsstelle NFkB II, die den stärksten Effekt auf die Aktivierbarkeit des Promotors zeigte, wurde mit Hilfe von EMSA weiter untersucht. Die Inkubation der nukleären Proteine mit einem Oligonukleotid, das die Basensequenz des LBP-Promotors an dieser Bindungsstelle trägt, führte zu einer DNA-Protein-Interaktion („shift“; Abb. 18).

	Abb. 17 : NF- κ B-Bindungsstellen auf dem LBP-Promotor sind aktiv Zwei potentielle NF-κB -Bindungsstellen auf dem LBP-Promotor wurden mutiert: Bei NFkB I (–1701 bp) wurden Punktmutationen eingefügt, bei NFkB II (–515 bp) wurde die Bindungsstelle deletiert. Die beiden Mutationen wurden in trunkierte LBP-Promotorelemente eingefügt, die die Bindungsstellen nahe an ihrem 5´-Ende tragen. Die mutierten Promotoren und die wt-Trunkationen wurden in HuH-7 Zellen transfiziert und am nächsten Tag mit 50 U/ml IL-1, 500 U/ml IL-6 und 1 µM Dex oder mit 500 U/ml IL-6 für 48 Stunden stimuliert und anschließend die Luciferaseaktivität gemessen. Dargestellt ist die x-fache Promotoraktivität. *Signifikanter Unterschied gegenüber wt mit gleicher Stimulation.

Diese Bindung war, wie durch Kompetitiontests gezeigt werden konnte, NF-κB-spezifisch. Mit Hilfe zusätzlicher Antikörper-Inkubation („Supershifts“) wurde nachgewiesen, dass die NF-κB-Monomere p50 und p65 an die DNA binden.

	Abb. 18 : Die potentielle NF- κ B-Bindungsstelle NFkB II bindet spezifisch p50 und p65 HepG2 Zellen wurden für 20 min mit 50 U/ml IL-1, 500 U/ml IL-6 und 1 µM Dex stimuliert und anschließend die nukleären Proteine isoliert. Ein 32P-markiertes Oligonukleotid, das die LBP-Promotorsequenz bei –515 repräsentiert (NFkB II), wurde mit den nukleären Proteinen inkubiert. Zusätzlich wurde mit nicht markierten, „kalten“ Oligonukleotiden inkubiert, welche die LBP-Sequenz bei –515 bp (spez.) oder eine zufällige Sequenz (unsp.) enthielten. Weiterhin wurden die Proben mit den Antikörpern Ak p65, Ak p53, Ak p52 und Ak p50 inkubiert um den sogenannten „Supershift“ zu erzielen.

Wie aus Abb. 4 und Abb. 5 zu ersehen ist, führte die Inkubation von Dex bei IL-6-stimulierten Zellen zu einer zusätzlichen Aktivierung des LBP-Promotors bzw. der Proteinsynthese. Wurden die Hepatomzelllinien nur mit Dex inkubiert, war hingegen bei der Promotoraktivität eine geringe Steigerung und auf Proteinebene kein Effekt zu beobachten. Die Stimulation der Hepatomzellen mit verschiedenen Dex-Konzentrationen ergab eine Zunahme der LBP-Expression bis zu einer Konzentration von 1 µM. Die Inkubation mit 3 µM Dex führte in der Regel zu keiner weiteren Erhöhung der LBP-Expression und höhere Dex-Konzentrationen zur Abnahme der stimulierenden Dex-Wirkung (Ergebnisse nicht gezeigt).

Schon bei ersten Analysen des LBP-Promotors mit Hilfe der Transkriptionsfaktoren-Datenbank SigScan, Version 4.05 (siehe Material & Methoden) wurden zwei potentielle „glucocorticoid responsive elements“ (GREs) identifiziert. Um zu überprüfen, ob diese beiden Elemente an der Vermittlung der Dex-Wirkung beteiligt sind, wurden jeweils zwei Punktmutationen eingefügt. Überraschenderweise zeigte sich dabei, dass beide Mutationen der GREs nicht zu einer Reduktion der Dex-Wirkung führten, sondern im Gegenteil dessen Effekte noch verstärkten (Abb. 19). Demnach vermitteln die beiden mutierten Bindungsstellen eine hemmende Wirkung von Dex. Dieser Effekt ist nach IL-1- und IL-6-Stimulation +/- Dex signifikant und wurde nach IL-6 Stimulation +/- Dex im Trend bestätigt.

	Abb. 19 : Zwei GRE-Bindungsstellen vermitteln eine Hemmung des LBP-Promotors Der vollständige LBP-Promotor mit einer Länge von 1768 bp wurde an den Positionen –1672 bp und –108 bp an den unterstrichenen Stellen mutiert. Die beiden mutierten LBP-Promotor/Luciferasekonstrukte wie auch der wt-Promotor wurden in HuH-7 transfiziert und für 48 Stunden mit IL-6 und IL-1 + IL-6 jeweils mit und ohne 1 µM Dex stimuliert. Die Grafik zeigt die x‑fache Promotoraktivität nach Dex-Inkubation. Stimuliert wurde mit 50 U/ml IL-1, 500 U/ml IL-6 und 1 µM Dex. *Signifikanter Unterschied gegenüber wt mit gleicher Stimulation.

Die inhibierende Wirkung der GRE I-Bindungsstellen konnte durch den Vergleich des vollständigen Promotors mit einer Trunkation des LBP-Promotors, die die GRE I-Bindungsstelle nicht enthält, bestätigt werden. Dieses Promotorfragment zeigte in etwa die gleiche Zunahme der [Seite 55↓]Promotoraktivität nach Inkubation mit Dex wie der vollständige Promotor mit der mutierten GRE I-Bindungsstelle, verglichen mit dem wt-Promotor (nicht dargestellt).

Wenn die aktivierende Wirkung von Dex auf transkriptioneller Ebene reguliert wird, müssten auf dem Promotor weitere Dex-Bindungsstellen vorhanden sein, die eine aktivierende Wirkung vermitteln und dadurch die inhibierende Wirkung der beiden untersuchten Bindungsstellen überlagern. Um dies zu verifizieren, wurde mit MatInspector und anderen Datenbanken nach weiteren potentiellen Glukokortikoid-bindenden Regionen gesucht. Drei der neu gefundenen potentiellen GR-Bindungsstellen wurden mutiert, wobei hierbei die Mutationen in trunkierte Promotorelemente eingefügt wurden, so dass die jeweilige GR-Bindungsstelle nah am 5´-Ende lag (Abb. 20). Nach Mutation der GRE III-Bindungsstelle (-788 bp) war die Responsivität des Promotors gegenüber Dex deutlich herabgesetzt, d.h. hier wird tatsächlich eine stimulatorische Dex-Wirkung vermittelt. Die GRE IV-Bindungsstelle (-417 bp) vermittelte ebenfalls einen schwachen, aber signifikanten stimulatorischen Dex-Effekt. Die dritte Mutation (GRE V, -185 bp) zeigte keinen Einfluss auf die Promotoraktivität. Im unmutierten 266 bp kurzen Promotorfragment wurde kein stimulierender Dex-Effekt mehr beobachtet, entsprechend sind hier auch keine aktiven, stimulatorisch wirkenden Bindungsstellen zu erwarten.

	Abb. 20 : Analyse weiterer potentieller GRE-Bindungsstelle n Die Punktmutationen wurden wie dargestellt an den potentiellen GRE-Bindungsstellen in trunkierte LBP-Promotorelemente eingefügt und anschließend in HepG2-Zellen transfiziert. Die Zellen wurden für 48 Stunden mit 50 U/ml IL-1, 500 U/ml IL-6 und +/- 1 µM Dex stimuliert. Angegeben ist das Verhältnis der Promotoraktivität nach Stimulation + Dex zu der Aktivität nach Stimulation - Dex. *Signifikanter Unterschied gegenüber wt.

Um die Dex-Wirkung auf den LBP-Promotor weiter zu untersuchen, wurden die unter Abschnitt 1.3 beschriebenen, aktiven NF-IL6-Expressionsvektoren der Ratte (CRP2) und des Huhns (NF-M) mit dem LBP-Promotor/Luciferase-Konstrukt in die Hepatomzellen transfiziert und anschließend mit Dex stimuliert. Wie in Abb. 21 gezeigt, ergab sich in IL‑6-stimulierten Zellen nach zusätzlicher Inkubation mit Dex wie zu erwarten eine Zunahme der Promotoraktivität um das 1,6-fache. Bei beiden transfizierten Vektoren führte die zusätzliche Inkubation mit Dex zu keinem Anstieg der [Seite 56↓]Promotoraktivität, im Gegenteil war bei bestimmten Dex-Konzentrationen eine Reduktion der Vektoreffekte zu beobachten.

	Abb. 21 : NF-IL6-Transfektion und Dex-Inkubation Die Zelllinie HuH-7 wurde mit dem LBP-Promotorkonstrukt transfiziert und zusätzlich mit jeweils 1 µg/Ansatz Expressionsvektor NF-IL6 vom Huhn (NF-M) oder der Ratte (CRP2) kotransfiziert. Am nächsten Tag wurde mit 0, 0,3 und 3 µM Dex für 48 Stunden stimuliert; zusätzlich wurde als Kontrolle mit IL-6 (ohne Kotransfektion) stimuliert. Dargestellt ist die x-fache Promotoraktivität nach Dex-Inkubation im Vergleich zu den Ansätzen ohne Dex.

Zum einen konnten durch die Mutationsexperimente zwar aktive Dex-Bindungsstellen auf dem LBP-Promotor nachgewiesen, aber der im Gesamtsystem stimulatorische Dex-Effekt damit nicht hinreichend erklärt werden. Zum anderen führte die Transfektion der NF-IL6-Vektoren, die letztlich ein Überspringen der IL-6-Signalwege darstellen, zu keinem Synergieeffekt mit Dex. Daher wurde im Folgenden untersucht, ob der IL-6-Dex-Synergieeffekt weiter aufwärts in der IL-6-Signalkette zu lokalisieren ist. Dazu wurde der mögliche Einfluss von Dex auf die Expression des IL6-R untersucht.

Die Hepatomzelllinien wurden dabei für 30 min bis 8 Stunden mit Dex stimuliert, und anschließend wurde mit einem anti-IL6-R Antikörper in Kombination mit einem FITC-markierten IgG-Antikörper die IL6-R-Expression in einem FACS-Messsystem detektiert. Auf gleiche Weise wurde der IL6-R-Korezeptor gp130 untersucht. Die Dex-Inkubation führte schon nach 30 min zu einem deutlichen Anstieg der Expression des IL6-R und erreichte nach zwei Stunden ein Maximum. Nach acht Stunden war die IL6-R-Konzentration wieder nahe der Ausgangskonzentration. Die Konzentrationsänderung des Korezeptors gp130 auf der Zelloberfläche zeigte von einem niedrigeren Niveau startend einen ähnlichen Verlauf wie der IL6-R (Abb. 22).

	Abb. 22 : Der Einfluss von Dex auf die Expression von IL-6R und gp130 HepG2-Zellen wurden mit 1 µM Dex für 0 bis 8 Stunden stimuliert und anschließend jeweils mit einem Antikörperpärchen inkubiert, das der Detektion von IL-6R und gp130 diente. Aus der sich anschließenden FACS-Messung wurden die durchschnittlichen Fluoreszenzwerte grafisch dargestellt.

Um zu untersuchen, ob die erhöhte Expression des IL-6R ebenfalls zu einer Aktivierung der sich anschließenden Signaltransduktionskette führt, wurde mit Hilfe der Western-Blot-Analyse die Aktivierung von Stat-1 und -3, typische Vertreter des IL-6-Signalwegs, untersucht. Stat-1 und Stat-3 werden durch Phosphorylierung aktiviert, die durch spezifische Ak nachgewiesen werden kann.

Die Hepatomzellen wurden 20 min bis 24 Stunden mit Dex vorinkubiert und anschließend für 20 min mit IL-6 stimuliert. Die Inkubation von 50, 500 und 5000 U/ml IL-6 für 20 min ergab bei steigender Konzentration eine deutliche Zunahme von phosphoryliertem Stat-3 (pStat-3, Abb. 23A). Die zusätzliche Vorinkubation mit 1 µM Dex führte bei zunehmender Vorinkubationsdauer von 20 min bis 24 Stunden zu einer zeitabhängigen Zunahme von pStat-3.

	Abb. 23 : Dex stimuliert die Aktivierung von Stat-1 und Stat-3 in HuH-7-Zellen HuH-7-Zellen wurden mit 50, 500 oder 5000 U/ml IL-6 für 20 min behandelt. Davor wurden die Zellen wie dargestellt von 20 min bis 24 Stunden mit 1 µM Dex vorinkubiert. Die anschließend isolierten zytoplasmatischen Proteine wurden elektrophoretisch aufgetrennt und auf einer Nylonmembran fixiert. Die Detektion von pStat-1 und pStat-3 erfolgte mit spezifischen Antikörpern, wie in Material und Methoden beschrieben.

Die Phosphorylierung von Stat-1 (pStat-1) durch IL-6 konnte ebenso nachgewiesen werden wie die Steigerung dieser Aktivierung durch Vorinkubation mit Dex. Allerdings waren dafür 10x höhere IL-6 Konzentrationen notwendig als bei der Stat-3-Phosphorylierung (Abb. 23B).

Um die Regulation von LBP zu studieren, erschien es wichtig, auch nach Substanzen zu suchen, die die LBP-Expression hemmen. In unserer Arbeitsgruppe konnte gezeigt werden, dass TGF-β1 die LBP-mRNA-Transkriptakkumulation in stimulierten Hepatomzellen unterdrückt [75]. IL-10 ist ebenfalls ein Zytokin mit vielfach beschriebenen inhibierenden Eigenschaften und sollte daher ebenfalls ein aussichtsreicher Kandidat für die Vermittlung hemmender Effekte sein. Zunächst wurde die Wirkung von IL-10 untersucht und anschließend die LBP-hemmenden TGF-β1-Effekte analysiert.

Die Hepatomzelllinien wurden mit dem LBP-Promotor/Luciferase-Konstrukt transfiziert, anschließend mit IL-1, IL-6 und Dex stimuliert und gleichzeitig mit verschiedenen Konzentrationen von IL-10 inkubiert.

	Abb. 24 : IL-10 hat keinen Einfluss auf die transkriptionelle Aktivität von LBP in Hepatomzellen HuH-7 Zellen wurden mit dem LBP-Promotor/Luciferase-Konstrukt transfiziert und wie angegeben für 48 Stunden mit IL-1, IL-6 und Dex stimuliert. Gleichzeitig wurden die Zellen mit 0, 1, 10 oder 100 µg/ml IL-10 inkubiert. Dargestellt ist die relative Luciferaseaktivität (RLA).

Weder die Inkubation der HuH-1 Zellen mit IL-10 allein noch die Inkubation zusammen mit IL-1, IL-6 und Dex in verschiedenen Kombinationen führte zu einer signifikanten Wirkung von IL-10 (Abb. 24). Die Vorinkubation von IL-10 für eine oder vier Stunden oder die IL-10-Inkubation nach Gabe der Stimulanzien zeigte ebenfalls keine Wirkung (nicht dargestellt). Die Inkubation der Hepatomzelllinie HepG2 mit IL-10 unter stimulierten und unstimulierten Konditionen führte ebenfalls zu keiner messbaren IL-10-Wirkung (ebenfalls nicht dargestellt). Um mögliche posttranskriptionelle IL-10-Effekte erkennen zu können, wurden die Versuche mit beiden Zelllinien wiederholt und die LBP-Konzentration mit dem hLBP-ELISA bestimmt. Auch hier zeigten sich keinerlei IL-10-Effekte auf die LBP-Expression (nicht dargestellt). Da in der Literatur IL-10-Effekte [Seite 60↓]in HepG2-Zellen beschrieben sind (siehe Diskussion) und in Zellkulturlinien auf Grund von Mutationen Störungen von Signalwegen auftreten können, wurde die HepG2-Zelllinie von DSMZ (Braunschweig) neu bezogen. Die wiederholten Versuche mit der neu etablierten HepG2-Zelllinie zeigten ebenfalls keine IL-10-Effekte (nicht dargestellt). Des Weiteren wurde die IL-10-Wirkung auch an der Lungenepithelzelllinie A549 und der Darmepithelzelllinie Caco-2 untersucht, die ebenfalls nach Zytokininduktion LBP exprimieren. Auch hier konnte nach wiederholten Versuchen kein IL-10-Effekt auf die LBP-Expression nachgewiesen werden (nicht dargestellt).

Um zu untersuchen, inwieweit sich der TGF-β1-Hemmeffekt auf die LBP-Proteinsynthese auswirkt, wurden die beiden humanen Hepatomzelllinien mit IL-1, IL-6 und Dex stimuliert, mit TGF-β1 inkubiert und anschließend die LBP-Konzentration in den Kulturüberständen mit dem hLBP-ELISA bestimmt. Es konnte gezeigt werden, dass die LBP-Konzentration in den Kulturüberständen kontinuierlich mit zunehmender TGF-β1-Konzentration abnimmt. Diese Dosis-Wirkungs-Abhängigkeit ist unabhängig von der Stärke und Art der Stimulation. Ob die LBP-Produktion mit 500 U/ml IL-6 induziert wurde oder die Zellen maximal mit 50 U/ml IL-1, 500 U/ml IL-6 und 1 µM Dex stimuliert wurden, TGF-β-1 hemmte die LBP-Freisetzung in gleicher Weise (Abb. 25A).

Die Variation der Kulturdauer ergab auch zu verschiedenen Zeitpunkten eine Verminderung der induzierten LBP-Expression durch TGF-β1. Nach 24 bis 72 Stunden Stimulation und TGF-β1-Inkubation wurde eine zunehmende Hemmung bei steigender TGF-β1-Konzentration beobachtet. Nach 12 Stunden Stimulation konnte dabei kein Hemmeffekt mehr gezeigt werden (Abb. 25B). Die Inkubation von TGF-β1 vier Stunden vor der Zellstimulierung, gleichzeitig oder bis zu drei Stunden nach der Stimulierung führte in jedem Fall zu verminderter LBP-Konzentration in den Kulturüberständen (Abb. 25C).

	Abb. 25 : TGF-β1 hemmt die LBP-Freisetzung aus stimulierten HuH-7 Zellen A: HuH-7-Zellen wurden mit IL-1, IL-6 und Dex wie angegeben stimuliert. Zusätzlich wurden die Zellen zeitgleich mit 0 bis 5 ng/ml TGF-β1 für 48 Stunden inkubiert. B: HuH-7-Zellen wurden maximal mit 50 U/ml IL-1, 500 U/ml IL-6 und 1 µM Dex stimuliert und gleichzeitig mit den verschiedenen TGF-β1-Konzentrationen inkubiert. Die Kulturdauer betrug 12, 24, 48 oder 72 Stunden. C: Die Zellen wurden maximal stimuliert und mit zunehmenden TGF-β1-Konzentrationen für 48 Stunden inkubiert. TGF-β1 wurde entweder 4 Stunden vor, gleichzeitig oder 1,5 bzw. 3 Stunden nach den Stimulanzien in die Zellkultur gegeben. Nach Abschluss der Stimulationsreihen wurde in den Zellkulturüberständen mit einem hLBP-ELISA die LBP-Konzentration gemessen.

Im Folgenden wurde untersucht, ob der TGF-β1-Hemmeffekt transkriptionell vermittelt wird. Dazu wurden die im vorigen Abschnitt beschriebenen Stimulationsexperimente mit Zellen, in die vorher das LBP-Promotor/Luciferase-Konstrukt transfiziert wurde, in Anwesenheit unterschiedlicher Konzentrationen von TGF-β1 wiederholt und die Promotoraktivität gemessen.

	Abb. 26 : TGF-β1 hemmt die LBP-Promotoraktivität in stimulierten HuH-7-Zellen HuH-7 Zellen wurden mit dem LBP-Promotor/Luciferase-Konstrukt transfiziert und mit IL-1, IL-6 und Dex stimuliert. Zusätzlich wurden mit verschiedenen Konzentrationen von TGF-β1 inkubiert. A: TGF-β1 wurde mit den Stimulanzien zusammen verabreicht und für 48 Stunden kultiviert. Die Stimulation wurde variiert wie angegeben. B: Maximale Stimulierung mit 50 U/ml IL-1, 500 U/ml IL-6 und 1 µM Dex und gleichzeitig Inkubation von TGF-β1. Variiert wurde die Kulturdauer wie angegeben. C: Die Zellen wurden maximal für 48 Stunden stimuliert und TGF-β1 wie angegeben gleichzeitig, oder nach den Stimulanzien verabreicht. Nach Abschluss der Stimulation wurde die Luciferaseaktivität gemessen und β-Gal-normalisiert (relative Luciferaseaktivität, RLA)

Im Wesentlichen entspricht die durch TGF-β1 induzierte Hemmung der LBP-Promotoraktivität (Abb. 25) dem Muster der Hemmung bei der LBP-Proteinsynthese (Abb. 26). Ingesamt aber war die Hemmung der Promotoraktivität durch TGF-β1 geringer als auf Proteinebene, was evtl. ein Hinweis auf zusätzlich wirksame posttranskriptionelle Prozesse ist.

Typischerweise werden TGF-β1-Effekte durch die so genannten Smad-TF vermittelt. Sie umfassen eine Gruppe von Proteinen, die sowohl für die Signaltransduktion zuständig sind als auch als TF fungieren. In der Literatur sind verschiedene Smad-Konsensussequenzen beschrieben. Bei der Suche nach solchen potentiellen Smad-Bindungsstellen auf dem LBP-Promotor wurden mehrere gefunden. In Tabelle 7 sind fünf untersuchte, potentielle Smad-Bindungsstellen mit ihren Konsensussequenzen aufgeführt. Weitere 6 Smad-Konsensussequenzen mit der Basenfolge AGAC, die sich ebenfalls auf dem Promotor befinden, wurden nicht analysiert.

Tab. 7: Smad-Konsensussequenzen und potentielle Bindungsstellen

* Auf dem LBP-Promotor befindet sich die Kernregion (TCTAGA) der Konsensussequenz
** Die zwei untersuchten AGAC-Bindungsstellen von insgesamt acht auf dem LBP-Promotor

Insgesamt befinden sich 11 AGAC-Elemente auf dem LBP-Promotor. Bei einer zufälligen Verteilung der 4-basigen Sequenz würde im Mittel alle 256 Basen eines dieser Element auftreten, d.h. auf dem gesamten Promotor wären etwa 6 - 7 dieser Elemente zu erwarten. Dieses Smad-Bindungsmotiv ist also überdurchschnittlich häufig auf dem LBP-Promotor vertreten. Die fünf untersuchten Elemente wurden mit Hilfe der EMSA-Technik und/oder durch Mutagenese-Experimente analysiert. Die Ergebnisse der drei Bindungsstellen ohne positiven Befund sind hier nicht abgebildet.

Um die unerwartete Wirkung einer Smad-Bindungsstelle auf den LBP-Promotor nach TGF-β1-Inkubation besser zu verstehen hier zunächst die Darstellung eines bislang noch nicht gezeigten TGF-β1-Experiments: Wurden die Zellen mit TGF-β1 allein und nicht mit IL-1, IL-6 und Dex inkubiert, zeigte sich eine signifikante und regelmäßig auftretende Induktion des LBP-Promotors die etwa 2- bis 4-fach über der konstitutiven Promotoraktivität lag (Abb. 27). TGF-β1 hat demnach [Seite 64↓]neben seiner hemmenden Hauptwirkung auch einen stimulatorischen Effekt auf den LBP-Promotor, wenn es allein verabreicht wird.

	Abb. 27 : TGF-β1 verstärkt die LBP-Promotoraktivität in unstimulierten Zellen HuH-7 Zellen wurden mit dem LBP-Promotor/Luciferase-Konstrukt transfiziert und anschließend mit TGF-β1 in Konzentrationen von 0 bis 5 ng/ml für 48 Stunden inkubiert (keine Stimulation mit Zytokinen und Dex). Anschließend wurde die Luciferaseaktivität gemessen. Dargestellt ist die β-Gal-normalisierte relative Luciferaseaktivität (RLA).

Nun wurden die beiden potentiellen Smad-Bindungsstellen Smad I und II wie in Abb. 28 dargestellt im LBP-Promotor mutiert. Unabhängig davon, ob mit 50 U/ml IL-1, 500 U/ml IL-6 und 1 µM Dex maximal oder nur mit 500 U/ml IL-6 stimuliert wurde, konnte keine Änderung des TGF-β1-Hemmeffekts in mutierten Promotoren beobachtet werden (linker und mittlerer Dreierblock). Wurden die Zellen nur mit TGF-β1 inkubiert, zeigte sich im wt-Promotor die beschriebene stimulierende Wirkung von TGF-β1. Nach Mutation der Smad II-Bindungsstelle konnte diese stimulierende Wirkung durch TGF-β1 nicht mehr beobachtet werden. Nach Mutation der Smad I-Stelle ergab sich keine signifikante Abnahme der TGF-β1-Wirkung im Vergleich zum wt-Promotor (rechter Dreierblock).

	Abb. 28 : Eine Smad-Bindungsstelle vermittelt die aktivierende Wirkung von TGF-β1 Smad I (-303 bp) und Smad II (- 1294 bp) wurden wie dargestellt auf dem LBP-Promotor mutiert und das Promotor/Luciferase-Konstrukt in HepG2-Zellen transfiziert. Die Zellen wurden mit 500 U/ml IL-6 oder mit 50 U/ml IL-1, 500 U/ml IL-6 und 1 µM Dex stimuliert und gleichzeitig mit und ohne 5 ng/ml TGF-β1 für 48 Stunden inkubiert. Dargestellt ist die Promotoraktivität nach TGF-β1-Inkubation im Verhältnis zur Aktivität ohne TGF-β1-Inkubation.

Die EMSA-Analyse der Smad II-Bindungsstelle ergab ebenfalls spezifische Effekte nach Inkubation mit TGF-β1. Wurden HepG2-Zellen mit TGF-β1 allein für die Dauer von 0 bis zu 12 Stunden inkubiert, konnte eine über den Zeitverlauf zunehmende Proteinbindung an Smad II gezeigt werden (Abb. 29).

	Abb. 29 : Spezifische TGF-β1-Effekte an der Smad II-Bindungsstelle (-1294 bp) HuH-7-Zellen wurden mit 5 ng/ml TGF-β1 15 min bis 48 Stunden inkubiert. Nach der Zelllyse wurden die nukleären Proteine isoliert und zusammen mit einem 32P-markierten Oligonukleotid, das die Basensequenz des LBP-Promotors an der potentiellen TF-Bindungsstelle Smad II bei –1294 bp repräsentiert, inkubiert, und anschließend elektrophoretisch aufgetrennt.

Nach 48 Stunden war die Proteinbindung wieder auf dem Niveau unbehandelter Zellen. Mit Kompetitionsexperimenten konnte gezeigt werden, dass die Proteinbindung spezifisch an die Smad-Sequenz erfolgt (nicht dargestellt).

5.2  Lokalisation der TGF-β1-Hemmeffekte auf dem LBP-Promotor

Nachdem die Vermittlung der TGF-β1-Hemmeffekte nicht auf Smad-Bindungsstellen oder Smad-ähnliche Elemente zurückgeführt werden konnte, wurde der LBP-Promotor mit Hilfe trunkierter Promotorelemente weiter untersucht (Abb. 30). Es wurden acht Trunkationen verwendet, die den LBP-Promotor bis etwa –1000 bp abdecken. Die Hepatomzellen wurden mit den Luciferasekonstrukten transfiziert und anschließend mit IL-6 oder IL-1, IL-6 und Dex stimuliert und +/- TGF-β1 für 48 Stunden inkubiert. Es konnte gezeigt werden, dass die Stimulierbarkeit des Promotors ab der Trunkation Nr.6 deutlich zunimmt, gleichzeitig ist ab diesem Element der TGF-β1-Hemmeffekt zu beobachten, der in kürzeren Promotorfragmenten nicht auftritt (Abb. 30A). In Abb. 30B sind die TGF-β1-Effekte, die nach Stimulation auftreten, im Verhältnis zur Promotoraktivität ohne TGF-β1-Inkubation aufgetragen. In den kurzen Promotorfragmenten bis Nr. 5 vermittelt TGF-β1 eine stimulierende Wirkung auf den Promotor, die zu einer Steigerung der Aktivität um bis zu 70 % führt. Dieser Effekt ist - im Gegensatz zu dem weiter oben beschriebenen stimulierenden TGF-β1-Effekt im ganzen Promotor - unabhängig von einer eventuellen Stimulierung der Zellen.

	Abb. 30 : Die inhibierende TGF-β1-Wirkung wird von einem kleinen Promotorbereich vermittelt HepG2-Zellen wurden mit den trunkierten LBP-Promotor/Luciferase-Konstrukten Nr. 1-8 transfiziert. Sie enthalten mit zunehmender Länge Teile des LBP-Promotors. Anschließend wurden die Zellen mit 50 U/ml IL-1, 500 U/ml IL-6 und 1 µM Dex oder nur mit 500 U/ml IL-6 stimuliert und mit oder ohne 5 ng/ml TGF-β1 für 48 kultiviert. A: Darstellung der relativen Luciferaseaktivität (RLA). B: Verhältnis von Promotoraktivität nach Inkubation von TGF-β1 zu Aktivität ohne TGF-β1-Inkubation. Skizzierte Darstellung der Trunkationen und potentieller TF-Bindungsstellen im Bereich -463 bis -570 bp.

Deutlich ist der Umschwung von stimulierender zu hemmender TGF-β1-Wirkung zu erkennen. Die Vermittlung des hemmenden TGF-β1-Effekts muss demnach über ein Promotorelement erfolgen, das im Bereich zwischen –570 und –493 bp vor dem Transkriptionsstart lokalisiert ist. In diesem Bereich befinden sich mehrere potentielle TF-Bindungsstellen, die annähernd ideal mit ihren [Seite 68↓]Konsensussequenzen übereinstimmen (Abb. 31): Zwei aktive AP-1-Bindungsstellen, eine bei -493 bp (siehe Abb. 11) und eine zweite bei -540 bp, deren Aktivität in der Arbeitsgruppe schon nachgewiesen werden konnte [73]; eine aktive NF-κB-Bindungsstelle (siehe Abb. 17) und ein noch nicht untersuchtes Gfi-1-Element.

	Abb. 31 : TF-Bindungsstellen und Trunkationen zwischen -463 und -570 bp Auf dem LBP-Promotor befinden sich im Bereich zwischen -463 bp und -570 bp eine aktive NF‑κB-Bindungstelle und zwei aktive AP-1-Bindungstellen, weiterhin eine potentielle, noch nicht untersuchte Gfi-1 Bindungsstelle mit sehr hoher Übereinstimmung zur Konsensussequenz. Trunkierte Promotorelemente wurden wie dargestellt verwendet.

Um den Bereich, der die TGF-β1-Hemmeffekte vermittelt, weiter eingrenzen zu können, wurden feiner abgestufte Trunkationen des LBP-Promotors entworfen, kloniert und verwendet (Abb. 31): Die Ergebnisse dieser Trunkationen zeigen, dass offensichtlich nicht eine Bindungsstelle allein für die Vermittlung der TGF-β1-Effekte verantwortlich ist (Abb. 32). Die hauptsächliche Vermittlung des TGF-β1-Hemmeffekts erfolgt im Bereich des Promotors zwischen –570 bp und –544 bp, in dem sich die Gfi-1-Bindungsstelle befindet.

	Abb. 32 : TGF-β1-Effekte auf dem LBP-Promotor zwischen –570 und –463 bp HepG2-Zellen wurden mit den abgebildeten Trunkationen des LBP-Promotors/Luciferase-Konstruktes transfiziert, 48 Stunden mit 500 U/ml IL-6 oder 50 U/ml IL-1, 500 U/ml IL-6 und 1 µM Dex stimuliert und mit +/- 5 ng/ml TGF-β1 inkubiert. Dargestellt ist die x-fache Promotoraktivität nach TGF-β1-Inkubation im Verhältnis zur Promotoraktivität ohne TGF-β1-Inkubation.

Der TGF-β1-Hemmeffekt reduziert sich hier um etwa 2/3. Die sich anschließende AP-1-Bindungsstelle könnte evtl. ebenfalls einen Teil des Hemmeffekts vermitteln, da bei Ausschluss [Seite 69↓]dieser Sequenz die TGF-β1-Hemmung noch einmal deutlich abgefallen war. Die NF‑κB- und die zweite AP-1-Bindungsstelle scheinen hingegen nach diesem Experiment keine hemmende TGF-β1-Wirkung zu vermitteln.

AP-1 ist kürzlich als Transkriptionsfaktor beschrieben worden, der unter anderem auch in die Vermittlung von TGF-β1-Effekten involviert ist. Daher wurde zunächst die AP-1-Site bei –540 durch Deletion der Bindungsstelle untersucht. Diese in Abb. 33 abgebildete Mutation wurde sowohl in den vollständigen Promotor (-1780 bp) als auch in eine Trunkation mit –570 bp Länge integriert. Die Untersuchung der Mutationen mit Hilfe des Luciferase-Reportergen-Assays bestätigt, dass die AP-1 Site (-540 bp) an der Vermittlung des TGF-β1 Hemmeffekts beteiligt ist. Vor allem in dem trunkierten LBP-Promotor/Luciferase-Konstrukt ist nach Mutation dieser Sequenz der TGF-β1-Hemmeffekt mit über 50 % deutlich herabgesetzt.

	Abb. 33 : Die Bindungsstelle AP VII ist in die Vermittlung des TGF-β1-Hemmeffekts involviert Die AP-1-Bindungsstelle (-540 bp) wurde in der angegebenen Weise durch Deletion einiger Basenpaare sowohl auf dem vollständigen LBP-Promotor (-1780 bp) als auch auf dem trunkierten Promotorfragment 570 bp mutiert und in HepG2 Zellen transfiziert. Die Zellen wurden mit 500 U/ml IL-6 und +/- 5 ng/ml TGF-β1 inkubiert. Dargestellt ist die Promotoraktivität mit TGF-β1-Inkubation im Verhältnis zur Promotoraktivität ohne TGF-β1.

Die Beteiligung dieser AP-1-Bindungsstelle (-540 bp) an der Vermittlung der TGF-β1-Effekte konnte des Weiteren durch Gelshift-Analysen bestätigt werden. Nach Inkubation mit TGF-β1 von 0,5 bis 48 Stunden in HuH-7-Zellen konnte eine mit der Inkubationsdauer zunehmende Proteinbindung an ein Oligonukleotid, das die AP-1-Bindungsstelle repräsentiert, beobachtet werden (Abb. 34).

Nach Stimulation der Zellen mit IL-1, IL-6 und Dex für 4 Stunden wurde ebenfalls eine erhöhte Proteinbindung im Vergleich zu unstimulierten Zellen detektiert. Wurden die Zellen noch zusätzlich mit TGF-β1 behandelt, führte das zu einer weiteren sehr starken Proteinbindung. Wurden die Zellen für 24 Stunden stimuliert, so zeigte sich auch ohne TGF-β1 eine starke Proteinbindung, die sich dann aber nach zusätzlicher TGF-β1-Inkubation wieder abschwächte. Mit Hilfe von [Seite 70↓]Kompetitionsexperimenten konnte nachgewiesen werden, dass die Proteinbindung spezifisch für die AP-1-Bindungsstelle ist (nicht dargestellt).

	Abb. 34 : TGF-β1-Inkubation führt zu spezifischen Effekten an der AP-1-Bindungsstelle AP VII HuH-7-Zellen wurden mit TGF-β1 (5 ng/ml), IL-1 (50 U/ml), IL- 6 (500 U/ml) und Dex (1 µM) inkubiert. Anschließend wurden die nukleären Proteine isoliert und mit einem Oligonukleotid inkubiert, das die Sequenz des LBP-Promotors an der AP-1 Bindungsstelle bei –537 bp repräsentiert. Linke Teilabbildung: Die Zellen wurden nur mit TGF-β1 für 30 min bis 48 Stunden inkubiert. Rechts: Die Zellen wurden mit IL-1, IL-6 und Dex +/- TGF-β1 für 4 oder 24 Stunden inkubiert.

Als nächstes wurde die Bedeutung der Gfi-1-Bindungsstelle (-556 bp) durch Mutagenese und Reportergen-Assay untersucht. Sie wurde dazu zweimal mutiert, erstens durch den Austausch zweier Basen (Gfi Ia) und zweitens durch Deletion der Bindungsstelle (Gfi Ib), wie in Abb. 35A dargestellt. Beide Mutationen wurden sowohl in den vollständigen Promotor als auch in die 570 bp lange Trunkation (Gfi Ia^trunk und Gfi Ib^trunk) integriert.

	Abb. 35 : Mutation der Gfi-1-Bindungsstelle und die Wirkung auf den TGF-β1-Hemmeffekt Die Gfi-1-Bindungsstelle wurde insgesamt 4x mutiert: Erstens durch den Austausch zweier Basen (Gfi Ia) und zweitens durch die Deletion von 9 Basen (Gfi Ib). Beide Mutationen wurden sowohl am vollständigen Promotor mit 1780 bp als auch am trunkierten Promotor mit 570 bp (trunk) durchgeführt. Die mit den Konstrukten transfizierten HepG2-Zellen wurden für 48 Stunden stimuliert und mit/ohne TGF-β1 inkubiert. A: Stimulierung mit 50 U/ml IL-1, 500 U/ml IL-6, 1 µM Dex B oder mit 500 U/ml IL-6. Dargestellt ist der relative TGF-β1-Hemmeffekt nach Stimulation (+TGF-β1/-TGF-β1). In Abb. 35B sind die Mutationsexperimente mit dem vollständigen Promotor (1780 bp) aus Abb. 35A als β-Gal-normalisierte Luciferaseaktivität (relative Luciferaseaktivität, RLA) dargestellt.

Der Basentausch (Gfi Ia) führte beim vollständigen Promotor zu einer signifikanten Reduktion des TGF-β1-Hemmeffekts, die im trunkierten Promotor noch deutlicher zu beobachten war (Gfi Ia^trunk). Dies war sowohl nach IL-6 Stimulierung als auch nach maximaler Stimulation mit IL-1, IL-6 und Dex zu beobachten. Wurde die Gfi-1-Bindungsstelle durch Deletion vollständig zerstört, so reduzierte sich der Hemmeffekt noch deutlicher. Im Promotor mit der Mutation Gfi Ib^trunk konnte nach maximaler Stimulierung kaum noch ein TGF-β1-Hemmeffekt beobachtet werden. (Abb. 35A).

Die reduzierte Hemmbarkeit des Gfi-1 mutierten Promotors durch TGF-β1 ging einher mit einer dramatisch reduzierten Induzierbarkeit des Promotors nach Stimulation. Beide Gfi-1-Mutationen, Gfi Ia und Gfi Ib, reduzierten die Aktivierbarkeit des Promotors um etwa 80 % gegenüber dem wt. Dies war sowohl nach maximaler Stimulierung mit 50 U/ml IL-1, 500 U/ml IL-6 und 1 µM Dex als auch nach moderater Stimulierung mit 500 U/ml IL-6 der Fall (Abb. 35B).

Die Wirkung der TGF-β1-Inkubation auf die Gfi-1-Bindungsstelle wurde ebenfalls mit der EMSA-Technik untersucht. Dabei konnte eine komplexe Wechselwirkung zwischen Stimulation und Hemmung beobachtet werden. Nach kurzer Stimulationsdauer von bis zu zwei Stunden wirkte das zusätzlich zu den Stimulanzien inkubierte TGF-β1 verstärkend auf die Proteinbindung an die Gfi-1-Bindungsstelle (Abb. 36A). In einem Zeitfenster von 4 bis 8 Stunden wurde bei zusätzlicher TGF-β1-Inkubation die Proteinbindung gehemmt. Nach einer Stimulationsdauer von 24 Stunden führte die zusätzliche TGF-β1-Inkubation zu keiner Veränderung in der Proteinwirkung. Nach Zellstimulation ohne TGF-β1-Inkubation, zeigte sich eine kontinuierliche Zunahme der Proteinbindung, die nach 8 Stunden ihr Maximum erreicht hatte und dann wieder leicht abgefallen war.

Zum Nachweis der spezifischen Proteinbindung wurden die Zellen zusammen mit 5ng/ml TGF-β1 maximal stimuliert. Die anschließende Inkubation der isolierten nukleären Proteine mit spezifischen bzw. unspezifischen Oligonukleotiden zeigte klar eine sequenzspezifische Bindung des nukleären Proteins (Abb. 36B).

	Abb. 36 : Spezifische Bindung nukleärer Proteine an die Gfi-1-Bindungsstelle –556 bp A: HuH-7 Zellen wurden maximal mit 50 U/ml IL-1, 500 U/ml IL-6 und 1 µM Dex über die angegebenen Zeitspannen stimuliert und gleichzeitig mit 5 ng/ml TGF-β1 inkubiert. Die isolierten nukleären Extrakte wurden mit einem Oligonukleotid inkubiert, das die Sequenz der Gfi-1 Bindungsstelle vom LBP-Promotor bei –556 bp trägt. B: TGF-β1 -Inkubation (2 ng/ml) und maximale Stimulation erfolgten für 4 Stunden. B: Die Zellen wurden für 15 Stunden mit 5 ng/ml TGF-β1 inkubiert und für den gleichen Zeitraum maximal stimuliert. Die Kompetition erfolgte mit einem unspezifischen bzw. dem spezifischen Oligonukleotid ohne 32P-Markierung im 40-fachen Überschuss.

Weitere Mutationsexperimente sollten zeigen, inwieweit die AP-1-(-540 bp) und die Gfi-1-(-556 bp) Bindungsstellen, die beide in die Vermittlung der TGF-β1-Hemmeffekte involviert sind, interagieren. Dazu wurden die oben beschriebenen Deletionen von Gfi-1 und AP-1 in einem Promotor kombiniert. Wie aus der Abb. 37 hervorgeht, führt die Mutation der AP-1-Bindungsstellen zur Reduktion der TGF-β1-Hemmung, die bei der Mutation der Gfi-1-Bindungsstelle noch stärker ausgeprägt ist. Wurden nun beide Bindungsstellen gleichzeitig auf dem Promotor mutiert, so ergab sich keine weitere Reduktion des TGF-β1-Hemmeffektes verglichen mit der alleinigen Gfi-1-Mutation.

	Abb. 37 : Die Wechselwirkung von Gfi-1 (-556 bp) und AP-1 (-540 bp) Die Mutationen Gfi Ib und AP VII wurden einzeln und in Kombination in den LBP-Promotor integriert, HuH-7-Zellen damit transfiziert und die Zellen anschließend für 48 Stunden maximal stimuliert (50 U/ml IL-1, 500 U/ml IL-6 und 1 µM Dex) und mit und ohne 5 ng/ml TGF-β1 behandelt. Dargestellt ist das Verhältnis der Promotoraktivität mit TGF-β1-Inkubation zur Aktivität ohne TGF-β1-Inkubation.

Als nächstes wurden die NF-κB-Bindungsstelle bei -515 bp und die AP-1 Stelle (-493 bp) allein und in Kombination mit Gfi-1 mutiert. Hier wurde der 570 bp lange trunkierte Promotor verwendet, um evtl. vorhandene geringe Effekte deutlicher darstellen zu können (Abb. 38).

Wie in Abschnitt 2.4 gezeigt ist die NF-κB-Stelle bei –515 bp aktiv und trägt zur Stimulierbarkeit des LBP-Promotors bei. Die Mutation der NF-κB-Bindungsstelle führt aber zu keiner reproduzierbaren, signifikanten Änderung der TGF-β1-Wirkung auf den Promotor. Entsprechend ist die Reduktion des Hemmeffekts im Promotor mit der Gfi-1- und NF-κB-Mutation auf demselben Niveau wie nach alleiniger Gfi-1-Mutation. Die AP-1-Bindungsstelle (-493 bp) hat einen geringen, aber klaren Einfluss auf die Hemmwirkung von TGF-β1; sowohl die alleinige Mutation als auch die Kombination mit der mutierten Gfi-1-Bindungsstelle reduzierte den Hemmeffekt von TGF-β1.

	Abb. 38 : Der Einfluss der NFkB II- und der AP IV- Bindungsstelle auf den TGF-β1-Hemmeffekt Die NF-κB Bindungsstelle an Position –515 bp und die AP-1-Bindungsstelle bei –493 bp wurden in der dargestellten Form im trunkierten –570 bp langen Promotor mutiert. Zusätzlich wurden diese Mutationen mit der Mutation Gfi Ib an der Gfi-1-Bindungsstelle bei –556 bp kombiniert. Die transfizierten Zellen wurden mit 50 U/ml IL-1, 500 U/ml IL-6, 1 µM Dex und mit oder ohne TGF-β1 für 48 Stunden inkubiert. Dargestellt ist der Quotient aus Luciferaseaktivität nach TGF-β1-Inkubation und Luciferaseaktivität ohne TGFβ1-Inkubation.

Auf dem LBP-Promotor befinden sich noch weitere DNA-Sequenzen, die eine hohe Übereinstimmung mit der Gfi-1-Konsensussequenz aufweisen. Drei dieser Sequenzen wurden durch Einfügung von Punktmutationen untersucht.

Zunächst wurde analysiert, wie sich die Gfi-1-Elemente auf die Aktivierbarkeit des Promotors auswirken. Die mutierten LBP-Promotoren und die korrespondierenden wt-Konstrukte wurden in HuH-7-Zellen transfiziert und anschließend maximal stimuliert. Bei zwei Mutationen (Gfi II bei -1167 bp und Gfi III bei -805 bp) hatte die Promotoraktivität gegenüber den wt-Promotoren gering, aber signifikant zugenommen. Bei der dritten Mutante (+60 bp) konnte kein Einfluss auf die Aktivierbarkeit des Promotors festgestellt werden (nicht dargestellt).

Nach Transfektion, Stimulation und TGF-β1-Inkubation von HuH-7-Zellen konnte gezeigt werden, dass die drei mutierten Gfi-1-Bindungsstellen keinen signifikanten Einfluss auf die Wirkung von TGF-β1 haben (Abb. 39). Die beiden Elemente bei –1667 bp und –839 bp zeigen keinerlei Effekte auf die TGF-β1-vermittelte Hemmung des Promotors. Die Gfi-IV-Mutation bei +60 bp wurde in eine nur 133 bp lange Trunkation eingefügt. Die kurzen Fragmente führen, wie schon in Abschnitt 5.2 gezeigt, zu einer Aktivierung des Promotors durch TGF-β1, unabhängig davon ob die Zellen zusätzlich stimuliert wurden oder nicht. In wiederholten Versuchen führte das Einfügen der Gfi IV-Mutation zu einer Verringerung dieses Effektes. Diese Reduktion der Aktivität war aber nicht konsistent signifikant (wie auch in Abb. 39 gezeigt), so dass eine Aktivität dieser potentiellen Gfi-1-Bindungsstelle in Frage steht.

	Abb. 39 : Der Wirkung der Gfi-1-Bindungsstellen Gfi II, Gfi III und Gfi IV auf TGF-β1-Effekte Die LBP-Promotoren mit den wie dargestellt eingefügten Mutationen Gfi II, Gfi III und Gfi IV und entsprechende wt-Kontrollen wurden in HuH-7-Zellen transfiziert und die Zellen anschließend mit 50 U/ml IL-1, 500 U/ml IL-6 und 1 µM Dex für 48 Stunden maximal stimuliert und zusätzlich +/- TGF-β1 inkubiert. Bei der anschließend gemessenen Luciferaseaktivität wurden die Ergebnisse mit TGF-β1-Inkubation durch die Messwerte ohne TGF-β1-Inkubation dividiert.

Um neben den Gfi-1-Bindungsstellen auch die Wirkung des Gfi-1-Proteins untersuchen zu können, wurde ein Gfi-1-Expressionsvektor (pGfi-1) in die Hepatomzelllinien transfiziert, der freundlicherweise von der Arbeitsgruppe Prof. Möröy, Universitätsklinikum Essen zur Verfügung gestellt wurde.

	Abb. 40 : Die Expression des Gfi-1-Proteins hemmt die LBP-Promotoraktivität HepG2-Zellen wurden mit dem LBP-Promotor/Luciferase-Konstrukt transfiziert und mit 1 µg/Ansatz pGfi-1 Expressionsvektor kotransfiziert. Am Tag danach wurden die Zellen maximal, d.h. mit 50 U/ml IL-, 500 U/ml IL-6 und 1 µM Dex für 48 Stunden stimuliert. (RLA, relative Luciferaseaktivität).

Die Kotransfektion des pGfi-1-Vektors mit dem LBP-Promotor/Luciferase-Konstrukt verursachte dabei eine sehr starke Hemmung des aktivierten LBP-Promotors (Abb. 40).

Der zum Vergleich transfizierte Kontrollvektor mit einer unspezifischen Sequenz führte dagegen nur zu einer relativ geringen Änderung der Promotoraktivität. Selbst in unstimulierten Zellen wurde nach pGfi-1-Kotransfektion die geringe, konstitutive LBP-Expression unterdrückt.

Weiterhin wurde untersucht, ob die Mutation der Gfi-1-Bindungsstelle bei –556 bp einen Einfluss auf diesen Hemmeffekt hat. Dazu wurden die Promotoren mit den mutierten Gfi‑1-Mutationen Gfi Ia^trunk und Gfi Ib^trunk zusammen mit dem pGfi-1-Vektor kotransfiziert. In Abb. 41 ist der relative Hemmeffekt nach Kotransfektion von pGfi-1 im Verhältnis zum Effekt eines Kontrollplasmids dargestellt. Im trunkierten Promotorelement mit einer Länge von 570 bp beträgt die relative Hemmung in etwa 80 %. Wurde die Promotortrunkation mit der mutierten Gfi Ia^trunk –Bindungsstelle bei –556 bp verwendet, so reduzierte sich der Hemmeffekt durch die Kotransfektion auf 50 % (Gfi Ia). Wurde der Promotor mit der vollständig deletierten Gfi-1-Bindungsstelle verwendet (Gfi Ib^trunk), reduzierte sich der Hemmeffekt weiter auf 30 %.

	Abb. 41 : Die Wirkung des pGfi-1-Vektors auf die Gfi-1-Bindungsstelle bei –556 bp (Gfi I) HepG2-Zellen wurden mit dem trunkierten LBP-Promotor/Luciferase-Konstrukt –570 bp und den beiden mutierten Promotoren Gfi Iatrunk. und Gfi Ibtrunk. transfiziert und mit dem Expressionsvektor pGfi-1 bzw. einer Kontrolle ohne das Gfi-1-Gen kotransfiziert. Am Tag darauf wurde für 48 Stunden mit 50 U/ml IL-1, 500 U/ml IL-6 und 1µM Dex stimuliert. Abgetragen ist der relative Hemmeffekt nach pGfi-1-Kotransfektion im Vergleich zum Effekt des Kontrollvektors in den stimulierten Zellen.

Wurden die Promotoren, welche die Gfi-1 Mutanten Gfi II, Gfi III und Gfi IV tragen, mit dem pGfi-1-Expressionsvektor kotransfiziert, konnte kein Effekt nachgewiesen werden. Es bestand zwar ein Trend zu einer Abschwächung des pGfi-1-vermittelten Hemmeffekts, dieser war aber nicht signifikant (nicht dargestellt). Im Übrigen führte die pGfi-1-Kotransfektion mit kurzen LBP-Promotorfragmenten (463 bp Länge oder kürzer) nicht zu einer Aktivierung des Fragments wie sie bei TGF-β1-Inkubation zu beobachten war. Im Trend wurde eher eine Hemmung des aktivierten Promotors beobachtet (nicht dargestellt).

Außer dem wt-Gfi-1-Expressionsvektor wurden uns von Prof. Möröy zwei Mutationen des Gfi-1-Gens zur Verfügung gestellt: Die erste Mutante exprimiert nur die C-terminale DNA-bindende Zinkfingerdomäne von Gfi-1 (pGfi^Zn), die zweite Mutation enthält die N-terminale SNAG-Region, die Protein-Protein-Interaktionen vermittelt (pGfi^SNAG).

	Abb. 42 : Die Wirkung von pGfiZn und pGfiSNAG auf den LBP-Promotor HuH-7 Zellen wurden mit einem pGfi-1-Vektor, der nur die Zinkfingerdomäne trägt (pGfiZn, DNA-bindende Region), und mit einem Vektor, der nur die SNAG-Region enthält (pGfiSNAG, Protein-Protein-Interaktion), kotransfiziert und für 48 Stunden mit 50 U/ml IL-1, 500 U/ml IL-6 und 1 µM Dex stimuliert. Aufgetragen sind die β-Gal-normalisierten Luciferasemesswerte (RLA, relative Luciferaseaktivität) aus stimulierten und unstimulierten Zellen in unterschiedlicher Skalierung, da die Werte aus den unstimulierten Zellen sehr niedrig waren.

Wurden die Zellen mit pGfi^SNAG transfiziert, zeigte sich in stimulierten Zellen, verglichen mit der Transfektionskontrolle, kein Einfluss auf die Aktivierbarkeit des LBP-Promotors. Die Gif-1-Mutante pGfi^Zn übte dagegen einen deutlich hemmenden Einfluss auf die Aktivität des LBP-Promotors aus (Abb. 42 rechte Teilabbildung). In unstimulierten Zellen war ebenfalls keine Wirkung nach pGfi^SNAG zu beobachten; wurde mit pGfi^Zn kotransfiziert, zeigte sich ein schwacher stimulatorischer Effekt.

Bis dato wurden die Ergebnisse der Luciferasemessungen immer mit der Aktivität eines kotransfizierten β-Gal-Plasmids abgeglichen, um eventuelle Schwankungen, die im Zusammenhang mit der Transfektion auftreten, auszugleichen. Es zeigte sich jedoch, dass pGfi^Zn+ ebenfalls einen starken hemmenden Effekt auf die β-Gal-Aktivität ausübt, so dass sich nach dem β-Gal-Abgleich der pGfi^Zn+-Hemmeffekt schwächer darstellte, als er tatsächlich war. Daher wurden alternativ die Luciferasemesswerte gegen die Gesamtproteinkonzentration der lysierten Zellen abgeglichen. Diese früher übliche Methode gleicht Fehler aus, die sich aus unterschiedlichem Zellwachstum ergeben. Nach diesen Ergebnissen ging die Aktivität des maximal stimulierten Promotors bei pGfi^Zn-Transfektion um über 90 % zurück, also etwa in der gleichen Stärke wie nach der wt-pGfi-1-Transfektion (nicht dargestellt).

Da die Expression von Gfi-1 in Leberzellen bzw. in der Hepatomzelllinie HepG2 in der Literatur bislang noch nicht beschrieben wurde, dies aber die Grundvoraussetzung für die Vermittlung von TGF-β1-Effekten durch Gfi-1 ist, wurde eine Gfi-1-spezifische rtPCR etabliert.

	Abb. 43 : Gfi-1 mRNA-Akkumulation in HepG2-Zellen HepG2-Zellen wurden mit TGF-β1 (5ng/ml) und IL-6 (500 U/ml) für 4 Stunden inkubiert. Gesamt-RNA wurde isoliert und mit Gfi-1-spezifischen Primern rtPCR durchgeführt. Die Negativkontrolle ist die sogenannte Wasserkontrolle (keine Primer, kein Mastermix). Bei der Positivkontrolle wurden die Zellen mit dem Expressionsvektor pGfi-1 transfiziert. Dem Nachweis der Integrität der RNA und dem internen Abgleich dient GAPDH.

Wie in Abb. 43 gezeigt, konnte sowohl in unstimulierten HepG2-Zellen als auch nach TGf‑β1- bzw. IL-6-Inkubation eine starke Gfi-1 mRNA- Transkriptakkumulation nachgewiesen werden. Evtl. führt die Inkubation von TGF-β1 und IL-6 zu einer Reduktion der Gfi-1 mRNA-Akkumulation im Vergleich zu unstimulierten Zellen, zumindest aber scheint die TGF-β1-Wirkung nicht über die Aufregulation der Gfi-1 mRNA-Konzentration vermittelt zu werden.

Um zu bestätigen, dass Gfi-1 eine wichtige Rolle in der LBP-Regulation spielt, wurde der LBP-Spiegel im Serum von Gfi1-defizienten Mäusen untersucht, das dankenswerterweise ebenfalls von Prof. Möröy zur Verfügung gestellt wurde. Von den insgesamt 19 Mäusen waren 5 Wildtyp-Kontrollmäuse (+/+), 5 heterozygote Mäuse (-/+) und die restlichen 9 homozygot (-/-) Gfi-1-defizient. Mit einem murinen LBP-ELISA wurde die konstitutiven LBP-Konzentrationen der allesamt unstimulierten Mäuse gemessen (Abb. 44). Die LBP-Konzentrationen in den Wildtyp-Mäusen zeigten große Schwankungen, lagen aber im Mittel bei etwa 1,2 µg/ml LBP. In den heterozygoten Mäusen wurde im Mittel annähernd die gleiche LBP-Konzentration gemessen. In den monozygot Gfi-1-defizienten Mäusen lag die LBP-Konzentration mit etwa 2 µg/ml deutlich darüber und war im Vergleich zu den heterozygoten Mäusen signifikant erhöht.

	Abb. 44 : LBP-Serumkonzentrationen in unstimulierten Gfi-1-defizienten Mäusen Im Serum von wt-Mäusen (5) und heterozygot (5) und monozygot (9) Gfi-1-defizienten Mäusen wurde die LBP-Konzentration mit einem murinen LBP-ELISA gemessen. Aufgetragen sind die Mittelwerte mit Standardabweichung. *Signifikant erhöht gegenüber heterozygoten Mäusen.

Der hauptsächliche Syntheseort von LBP ist die Leber, aber es wird auch in anderen Organen exprimiert, z.B. in Lungen- oder Darmepithelzellen. Hier werden Versuche dargestellt, die mit den Lungenepithelzelllinie A-549 durchgeführt wurden. Diese Zelllinie exprimiert LBP und wurde verwendet, um einige zuvor erzielte Ergebnisse zu überprüfen bzw. um zu untersuchen, ob sich die LBP-Expression in Zelllinien aus verschiedenen Geweben unterscheidet.

Die LBP-Expression der Lungenzelllinie war ebenfalls mit IL-1, IL-6 und Dex stimulierbar, wobei IL-1 und IL-6 einen geringeren Effekt zeigten als in den Leberzelllinien. Die Aktivierung der Zellen wurde überraschenderweise vor allem durch Dex angeregt: Die alleinige Gabe von Dex führte schon zu einer starken Zunahme der LBP-Expression, die in den Hepatomzelllinien nicht zu beobachten war. Von diesem hohen Niveau ausgehend war der Synergieeffekt mit IL-6 entsprechend geringer. Die stimulierende Wirkung von IL-6 allein war gering, außerdem war kein Synergieeffekt zwischen IL- und IL-6 zu beobachten (Abb. 45).

	Abb. 45 : IL-1- IL-6- und Dex-Effekte auf die LBP-Expression in A-549 -Zellen Die Lungenepithelzelllinie A-549 wurde wie angezeigt mit IL-1, IL-6 und Dex für 48 Stunden stimuliert. Danach wurde in den Kulturüberständen mit Hilfe des hLBP-ELISA die LBP-Konzentration bestimmt.

Die Lungenzellen reagierten auch sensibler auf Dex im Vergleich zu den Hepatomzellen. Bei Inkubation mit einer Dex-Konzentrationenreihe von 0 / 0,1 / 1 und 10 µM Dex genügten schon 0,1 µM Dex, um die maximale Expression von LBP zu bewirken. Es war also, verglichen mit den Leberzellen, nur ein Zehntel der Dex-Konzentration für den maximalen stimulatorischen Effekt notwendig (Abb. 46).

	Abb. 46 : Der Einfluss von Dex auf die LBP-Expression in A-549 -Zellen A-549-Zellen wurden wie angezeigt mit 50 U/ml IL-1, 500 U/ml IL-6 und mit ansteigenden Dex-Konzentrationen stimuliert. Nach 48 Stunden Stimulation wurde in den Kulturüberständen die LBP-Konzentration mit dem hLBP-ELISA gemessen.

Die TGF-β1-induzierte Hemmung des mit 50 U/ml IL-1, 500 U/ml IL-6 und 1 µM Dex aktivierten LBP-Promotors konnte an den A-549-Zellen ebenfalls nachgewiesen werden. Bei zunehmender TGF-β1-Konzentration konnte eine klare Dosis-Wirkungsabhängigkeit auf die Inhibition des aktiven LBP-Promotors gezeigt werden (Abb. 47A). Die Inkubation von IL-10 zeigte auch hier wie in den HepG2- und HuH-7-Zellen keine messbaren Hemmeffekte auf die LBP-Expression (Abb. 47B).

	Abb. 47 : Die Wirkung von TGF-β1 und IL-10 auf die induzierte LBP-Expression in A-549-Zellen A-549-Zellen wurden mit 50 U/ml IL-1, 500 U/ml IL-6 und 1µM Dex maximal stimuliert, zusätzlich wurde TGF-β1 in zunehmender Konzentration zusammen mit den Stimulanzien inkubiert (A). Die maximal stimulierten Zellen wurden mit 10 oder 100 ng/ml IL-10 inkubiert (B). Nach 48 Stunden wurde die LBP-Konzentration in den Kulturüberständen bestimmt.

In der nachfolgenden Abbildung (Abb. 48) sind die Ergebnisse in einer Übersicht zusammengefasst.

Die komplette Sequenz des LBP-Promotors mit den untersuchten potentiellen Bindungsstellen ist in Material und Methoden Abschnitt II 4.3 zu finden (Tabelle 3).

	Abb. 49 (nachfolgende Seite) In den horizontalen Felder sind oben die für die Inkubation verwendeten Substanzen und unten die transfizierten Vektoren dargestellt. In den Feldern dazwischen sind die Ergebnisse nach den verwendeten Untersuchungsmethoden sortiert, dabei wird auf die dazugehörigen Abbildungen im Ergebnissteil verwiesen. Nachgewiesene stimulierende Effekte sind grün und inhibierende Effekte rot dargestellt. Unten in der Abbildung ist eine Übersicht der einzelnen untersuchten potentiellen Bindungsstellen mit der jeweiligen stimulierenden oder inhibierenden Wirkung, soweit nachgewiesen, dargestellt.