[Seite 84↓]

IV  Diskussion

In der vorliegenden Arbeit wurde die Regulation der LBP-Expression auf Promotor-, RNA- und Proteinebene untersucht, wobei der Schwerpunkt auf der Promotoranalyse lag, da LBP in erster Linie transkriptionell reguliert wird. Die Regulation involvierter Signaltransduktionswege in den verwendeten Hepatomzelllinien wurde ebenfalls analysiert. Dadurch konnte die Vermittlung aktivierender Effekte und deren Interaktion, wie z.B. der Synergieeffekt von Dex und IL-6 aufgeklärt werden. Der Vermittlung des TGF-β1-Hemmeffekts auf die LBP-Expression wurde intensiv bearbeitet, da die hier beteiligten Mechanismen bisher nicht bekannt waren. So konnte die Vermittlung des TGF‑β1-Hemmeffekts im LBP-Promotor lokalisiert, und die Beteiligung des TF Gfi-1 gezeigt werden, der bis dato weder für LBP noch im Zusammenhang mit TGF-β1 beschrieben worden war.

Der überwiegende Teil der Experimente wurde in den Hepatomzelllinien HepG2 und HuH-7 durchgeführt. HepG2-Zellen stammen aus einem kindlichen Hepatoblastom, HuH-7-Zellen aus einem hepatozellulären Karzinom [185,193]. Sie haben sich schon bei der Induktion anderer Akutphaseproteine als geeignete Zelllinien erwiesen, um die Vorgänge in den Hepatozyten der humanen Leber während der Akutphase nachzubilden [194]. Kirschning konnte zeigen, dass diese Zelllinien auch für die Untersuchung der LBP-Regulation geeignet sind [195]. Unbehaun konnte diese Eignung bestätigen, indem sie zeigte, dass die Muster der LBP-mRNA-Akkumulation nach Stimulation mit IL-1, IL-6 und Dex in den Hepatomzelllinien und in isolierten primären Hepatozyten im Wesentlichen übereinstimmen [74]. Daher sind die beiden Zelllinien, soweit bekannt, gut geeignet, um die LBP-Expression zu untersuchen. Zelllinien bieten den bekannten Vorteil, dass die konstanten Kulturbedingungen besser reproduzierbare Ergebnisse liefern und dass das Zellmaterial in beliebiger Menge zur Verfügung steht, was bei primären Hepatozyten ein erhebliches Problem darstellt. Hier haben Zelllinien einen weiteren Vorteil: Auch nach sorgfältiger Aufreinigung des Lebergewebes kann nicht vollständig ausgeschlossen werden, dass die Zellkultur mit nichtparenchymatösen Zellen kontaminiert ist. Daher können Primärkulturen mit Kupfferschen Sternzellen verunreinigt sein. Kupffersche Sternzellen produzieren in erheblichem Umfang Zytokine, z.B. die für die LBP-Stimulation verwendeten IL-1 und IL-6. Außerdem verstärkt IL-6 seine eigene Expression in Kupfferzellen. Durch diese Nebeneffekte ist ein kontrollierter Versuchsaufbau in Primärkulturen nur erschwert zu erreichen.


[Seite 85↓]

1  Die Aktivierung der LBP-Expression

1.1  IL-6 als Hauptinduktor der LBP-Expression

Betrachtet man die LBP-Expression auf allen drei untersuchten Ebenen - der transkriptionellen Aktivierung, der LBP-mRNA-Akkumulation und der Proteinkonzentration in den Kulturüberständen - so wird deutlich, dass IL-6 eine herausragende Bedeutung bei der Stimulierung von LBP zukommt und dass die stimulierende Wirkung von IL-6 ausschließlich oder zumindest zum allergrößten Teil auf transkriptioneller Ebene vermittelt wird. Nach IL-1- und Dex-Inkubation konnte in Bezug auf die Promotoraktivität eine zwar geringe, aber signifikante Stimulierung nachgewiesen werden. Die hauptsächliche Bedeutung von IL-1 und Dex liegt in den synergistischen Effekten mit IL-6. Die Synergie zwischen IL-1 und IL-6 ist auf transkriptioneller Ebene stark ausgeprägt und nimmt auf Proteinebene kaum noch zu. Demnach wird dieser Effekt transkriptionell oder vorgelagert, etwa bei der Signaltransduktion, induziert. Der Synergieeffekt zwischen Dex und IL-6 dagegen ist sowohl transkriptionell als auch nachgeordnet reguliert. Auf Promotorebene zeigen IL-6 und Dex einen klaren synergistischen Effekt, auf Proteinebene ist dieser Effekt noch deutlich verstärkt, was auf posttranskriptionelle Effekte hinweist. Der erhöhte Synergieeffekt zwischen IL-6 und Dex wurde von Unbehaun schon bei der LBP-mRNA-Akkumulation beobachtet [74]. Demnach müssten Teile des Dex/IL-6-Synergieeffektes auf RNA-Ebene reguliert werden, z.B. durch Erhöhung der mRNA-Stabilität.

Das dritte potentiell aktivierende Zytokin, das untersucht wurde, ist TNF-α, dem in der Akutphase eine herausragende Bedeutung zukommt [196]. Es hat nach den vorliegenden Ergebnissen überraschenderweise keinen oder nur einen marginalen Einfluss auf die LBP-Expression. Zum Teil konnten zwar geringe stimulatorische Effekte in Einzelexperimenten beobachtet werden, diese konnten jedoch nicht reproduziert werden.

Die IL-6-Wirkung kann über zwei bekannte Signalwege vermittelt werden: Der eine Signalweg führt zum NF-IL6 (C/EBPβ) [148], der andere zu Stat-3 [196,197]. Für beide Transkriptionsfaktoren (TF) sind auf dem LBP-Promotor mehrere Bindungsstellen vorhanden, von denen einige mutiert wurden. Dadurch konnte gezeigt werden, dass sowohl die Bindungsstellen als auch die beiden Signalwege aktiv und für die LBP-Expression wichtig sind. An Hand von Kotransfektionsexperimenten mit NF-IL6 konnte die direkte transkriptionelle Aktivierbarkeit des LBP-Promotors gezeigt und damit die Bedeutung dieses Transkriptionsfaktors bzw. Signalwegs bestätigt werden. Umkehrt hemmt eine dominante Negativmutante von C/EBP-β (NF-M 229) die Aktivität des stimulierten Promotors.

Die Wirkung von IL-6 kann auch über AP-1 vermittelt werden. Die AP-1-Aktivierung kann zum einen auf die Steigerung der transkriptionellen Aktivierung von Jun- und Fos-Proteinen zurückgeführt werden [138] und zum anderen auf die Erhöhung ihrer Stabilität [136]. Bei einer Aktivierung von AP-1 durch IL-6 konnte in HepG2-Zellen eine Erhöhung der c-jun mRNA nachgewiesen werden [198]. Auf dem LBP-Promotor gibt es zahlreiche aktive AP-1-[Seite 86↓]Bindungsstellen, die nicht nur nach Stimulierung von IL-6 in Kombination mit IL-1 die Promotoraktivität erhöhen, sondern auch nach alleiniger IL-6-Inkubation.

Die herausragende Bedeutung von IL-6 für die LBP-Expression korrespondiert auch mit der großen Anzahl an IL-6-responsiven TF-Bindungsstellen auf dem LBP-Promotor. Untersucht wurden durch Mutationsexperimente insgesamt 11 Elemente: drei C/EBP-, zwei Stat-3-Bindungsstellen und sechs AP-1-Elemente. Bei sieben dieser Bindungsstellen führte die mutative Veränderung zu einer reduzierten Aktivität des Promotors. Dazu kommen noch drei Elemente, deren Aktivität bereits früher nachgewiesen wurden [73].

1.2 Die IL-1-Wirkung: Der NF-κB-Signalweg und die Synergie mit IL-6

Einerseits hat IL-1 allein nur eine geringe, aber signifikante LBP-aktivierende Wirkung. Anderseits befindet sich auf dem LBP-Promotor eine große Anzahl von AP-1-Bindungsstellen, die den Endpunkt eines wichtigen IL-1-Signalwegs darstellen [106,199]. Zusätzlich konnte gezeigt werden, dass sich zwei aktive NF-κB-Elemente auf dem LBP-Promotor befinden. NF-κB ist der TF des zweiten wichtigen IL-1-Signalwegs [200]. Die Vielzahl an Bindungsstellen könnte der Grund dafür sein, dass kein signifikanter direkter Einfluss von IL-1 auf einzelne AP-1-Elemente gezeigt werden konnte (nicht dargestellt): Verteilt sich der geringe direkte Einfluss von IL-1 auf mehrere Bindungsstellen, so wird der Effekt der einzelnen Bindungsstelle leicht von statistischen Schwankungen überlagert und ist dann möglicherweise nicht mehr signifikant nachzuweisen. Ebenso konnte keine alleinige Wirkung von IL-1 auf die beiden untersuchten NF-κB Elemente ermittelt werden (nicht dargestellt).

Die Wirkung von IL-1 auf die LBP-Expression erhält aber wie gezeigt erst durch den synergistischen Effekt mit IL-6 seine volle Bedeutung. Die Kombination beider Zytokine führte zu einem stimulierenden Effekt hinsichtlich der LBP-Expression, der weit über die Addition der beiden Einzeleffekte hinausging. Dies war auch zu beobachten, wenn zusätzlich noch mit Dex stimuliert wurde.

Wie gezeigt werden konnte, ist der NF-κB-Signalweg in den beiden Hepatomzelllinien aktiv, und es besteht zumindest bei der einen mit EMSA untersuchten potentiellen Bindungsstelle eine hohe spezifische Affinität zu NF-κB, obwohl das Element etwas von der Konsensussequenz abweicht. Wurden nun die beiden NF-κB-Bindungsstellen mutiert, zeigte sich ebenfalls, dass ihre stimulierenden Effekte über dem alleinigen Effekt von IL-1 lagen, obwohl für IL-6 allein keinerlei Indizien für eine Aktivierung des NF-κB-Signalwegs gefunden werden konnten. Diese Effekte könnten ihre Ursache im Zusammenwirken von NF-κB-Bindungsstellen mit C/EBPβ-Elementen haben. So ist das synergistische Zusammenspiel von C/EBPβ- und NF-κB-Bindungsstellen im SAA (serum amyloid A)-Promotor nachgewiesen worden [201]. Die Mutation von jeweils einer der beiden cis-agierenden C/EBPβ- und NF-κB-Bindungsstellen zeigte, dass NF-κB für die Vermittlung der IL-1-Effekte, aber auch für den Synergie-Effekt verantwortlich ist. IL-6 allein hatte auch hier keinen Einfluss auf die NF-κB-Sequenz. Die C/EBPβ-Bindungsstelle vermittelte die IL-6-Effekte, [Seite 87↓]sie hatte aber nur mäßigen Einfluss auf die Synergie. Mit Hilfe einer Kotransfektion von p65 und p50 konnte dieser NF-κB-C/EBPβ-Synergieeffekt ebenfalls am SAA-Promotor bestätigt werden [202]. Der IL-6-Promotor selbst und der IL-8-Promotor enthalten ebenfalls die beiden Bindungsstellen und zeigen Synergieeffekte [203]. Dies entspricht in etwa den Verhältnissen auf dem LBP-Promotor: NF-κB vermittelt den Synergieeffekt, aber keinen IL-6-Effekt; dieser wird von C/EBP vermittelt. Die einzelnen nachgewiesenen C/EBP-β-Effekte sind zwar schwach ausgeprägt, dies könnte aber auch hier an der großen Zahl von C/EBP-Elementen auf dem LBP-Promotor liegen.

Wie in Abschnitt 1.1 diskutiert, kann IL-6 bestimmte AP-1-Elemente sowohl transkriptionell aktivieren als auch ihre Stabilität fördern. Dieses erhöhte Angebot an AP-1 könnte nun auch zu einer effektiveren Phosphorylierung und damit Aktivierung des AP-1-Transkriptionsfaktors durch die von IL-1 angestoßene Signalkaskade führen und so den IL-6/IL-1-Synergieeffekt erklären. Jedenfalls konnte anhand der Phosphorylierung von p44/p42 und p38 gezeigt werden, dass der IL-1-Signalweg zu AP-1 hin in den Hepatomzelllinien aktiv ist.

Ein weiterer interessanter Erklärungsansatz des IL-1/IL-6-Synergieeffekts ergab sich bei der Untersuchung der Aktivierbarkeit von JNK (nicht gezeigt): Alleinige IL-1-Stimulation führte wie zu erwarten zur Phosphorylierung und damit Aktivierung von JNK und die Inkubation mit IL-6 allein zeigte keinerlei Effekte. Wurden aber die Zellen mit beiden Zytokinen gleichzeitig stimuliert, führte das zu einer verstärkten Phosphorylierung von JNK, die um ein Vielfaches über der nach Stimulation mit IL-1 allein lag. Demnach verstärkt IL-6 nicht nur die Expression und Stabilität von AP-1, sondern auch dessen Phosphorylierung, die notwendig ist, damit AP-1 als TF wirken kann. Unter Berücksichtigung dieses Ergebnisses ergeben die Effekte der AP-1-Bindungsstellen auf dem LBP-Promotor ein schlüssiges Bild: Obwohl IL-1 allein nur einen geringen Einfluss auf den LBP-Promotor als Ganzes (und die AP-1-Elemente im einzelnen) hat und IL-6 allein schon einen starken Effekt über die AP-1-Bindungsstellen vermittelt, erhöht sich der über die AP-1-Elemente vermittelte stimulierende Effekt nach gemeinsamer Inkubation der beiden Zytokine synergistisch. Die Regulation von JNK ist äußerst komplex und wird durch viele MKKKs (MAP Kinase Kinase Kinase) beeinflusst. Es sind mindestens 13 MKKKs bekannt, die JNK regulieren [204]. Ein mittel- oder unmittelbarer Einfluss von IL-6 auf JNK ist in der Leber somit durchaus möglich, konnte so aber noch nicht gezeigt werden. Schuringa hat beispielsweise den Einfluss von IL-6 auf JNK-1 in HepG2-Zellen untersucht und keine Phosphorylierung von JNK-1 detektiert [205]. Dies entspricht auch dem Ergebnis der vorliegenden Arbeit, da bei alleiniger IL-6-Stimulation ebenfalls keine JNK-Aktivierung beobachtet werden konnte (nicht gezeigt). Zauberman hat ebenfalls die Signalübertragung in HepG2-Zellen untersucht und eine Aktivierung von p38 detektiert, aber keinen Effekt auf JNK festgestellt [206]. In der gastritischen Krebszelllinie AGS konnte Lin immerhin einen direkten Einfluss von IL-6 auf JNK nachweisen. IL-6 hat hierbei allerdings die Phosphorylierung von JNK gehemmt und nicht aktiviert [207].


[Seite 88↓]

1.3  Die Vermittlung der Dex-Effekte und der Synergieeffekt von IL-6 und Dex

Glukokortikoide wirken typischerweise entzündungshemmend und dämpfen die Immunabwehr, in der Leber aber wirken sie oft verstärkend auf die Regulation von APPs, die in die Immunabwehr involviert sind [113]. So wirkt Dex auch auf die Expression des Akutphase-Proteins LBP stimulierend. Allerdings hat dabei Dex allein keinen oder nur einen geringen stimulatorischen Effekt auf die LBP-Expression, es entfaltet seine Wirkung vielmehr in Kombination mit IL-6. Dex und IL-6 aktivieren auch die Expression anderer Akutphase-Proteine in HepG2, so z.B. des „C-reactive protein“ (CRP) [208].

Dex-Effekte wurden in den Hepatomzelllinien sowohl auf Promotorebene wie auch auf Proteinebene beobachtet. Beim „Insulin-like growth factor binding protein-1“ (IGFBP-1) konnte ebenfalls in HepG2-Zellen eine Erhöhung der Expressionsrate durch Dex-Inkubation gezeigt werden, die durch eine distinkte Promotorregion, also transkriptionell vermittelt wurde [209]. Auf dem LBP-Promotor befinden sich mehrere potentielle GRE-Bindungsstellen, von denen einige mutiert wurden. Überraschenderweise zeigte sich, dass zwei dieser Elemente die LBP-Expression hemmen und die anderen die Promotoraktivität steigern. Beide Arten der Dex-Wirkung sind in der Literatur beschrieben; interessant ist dabei, dass möglicherweise Unterschiede in der Sequenz der Nukleotide die unterschiedliche Wirkung von Dex verursachen [134]. In Tabelle 8 sind verschiedene in der Literatur beschriebene Konsensussequenzen des GR dargestellt. Die Konsensussequenz nach Signalscan 4.05 (Nr. 1), die zweimal auf dem LBP-Promotor vertreten ist (GRE I und II), entspricht in etwa dem halben Palindrom (W steht für A oder T). Auch andere beschriebene GR-Bindungssequenzen haben eine hohe Ähnlichkeit mit einer Palindromhälfte (Nr. 3, 8, 9). Das Promotoranalyseprogramm MatInspector verlangt bei der GRE-Bindungsstelle (Nr. 2) als Kernregion, die für die Bindung des Transkriptionsfaktors besonders wichtig ist, TGTY, wobei Y für C oder T steht. Die angrenzenden Bereiche sind eher variabel und können, vor allem wenn der TF in Wechselwirkung mit anderen Faktoren steht, von der Konsensussequenz abweichen (GRE III – V).


[Seite 89↓]

Tab. 8: GR-Konsensussequenzen und potentielle GR-Bindungsstellen

Nr.

Referenz / Name auf LBP-Prom.

Sequenz

Effekt

Konsensussequenzen

1

[210,211]

        

W

C

 

T

G

W

T

C

T

  

2

MatInspector GRE

G

G

T

A

C

A

 

A

N

N

 

T

G

T

Y

C

T

K

 

3

MatInspector GR

N

N

N

N

C

N

 

N

T

N

 

T

G

T

N

C

T

  

4

[212]

T

G

T

A

C

A

 

G

G

A

 

T

G

T

T

C

T

  

5

[213]

   

A

C

A

 

N

N

N

 

T

G

T

 

 

 

  

6

[171]

G

G

T

A

C

A

 

N

N

N

 

T

G

T

T

C

T

 

Stimulation

7

[171]

A

T

Y

A

C

N

 

N

N

N

 

T

G

A

T

C

W

 

Hemmung

8

[214]*

           

T

G

T

S

C

C

  

9

[215]*

           

T

G

T

C

C

T

  

Potentielle Bindungsstellen auf dem LBP-Promotor

(nach 1)

1672 (+) GRE I

G

G

G

A

C

A

 

T

T

C

 

T

G

A

T

C

T

 

Hemmung

(nach 1)

108 (+) GRE II

C

T

C

A

T

C

 

C

A

C

 

T

G

A

T

C

T

 

Hemmung

(nach 2)

788 (-) GRE III

A

G

G

C

T

T

 

C

T

A

 

T

G

T

T

C

A

 

Stimulation

(nach 2)

417 (+) GRE IV

G

A

G

A

A

A

 

C

A

C

 

T

G

T

T

T

T

 

Stimulation

(nach 2)

185 (-) GRE V

A

T

T

C

A

T

 

C

A

C

 

T

G

T

T

C

A

 

Inaktiv

*Auf dem LBP-Promotor befinden sich 5 potentielle Bindungsstellen nach Nr. 8 und eine nach Nr. 9, die nicht untersucht wurden.
Fett: Die weitgehend übereinstimmenden Basen bei allen Konsensussequenzen und den untersuchten potentiellen Bindungsstellen.
Unterstrichen: Base die evtl. hemmender oder stimulierender Effekte reguliert.

Betrachtet man die Gesamtheit der verschiedenen beschriebenen Konsensussequenzen für Glukokortikoid-Rezeptor, fällt auf, dass wohl eine Hälfte des Palindroms zu genügen scheint. Bezieht man sich auf das halbe Palindrom, so haben alle Konsensussequenzen die ersten beiden Basen T und G gemeinsam. An dritter Position ist A oder T möglich, die 4. Position ist weniger festgelegt, an der 5. Position befindet sich ein C und an der 6. ein T oder A. Diese geringfügigen Unterschiede in der Sequenz könnten ausreichen, damit der Rezeptor-Hormonkomplex in einer veränderten Konfiguration bindet. Dadurch würde die aktivierende Domäne nicht mehr mit anderen Transkriptionsfaktoren interagieren und so eine inhibierende Wirkung vermitteln [134,171]. Geht man davon aus, dass die Palindromhälfte für die GR-Bindung genügt, so besteht nach Latchman der entscheidende Unterschied bei der Vermittlung von hemmender oder aktivierender Wirkung in der Bindungsstelle an der 3. Position (unterstrichen): Befindet sich an dieser Stelle ein T, so wirkt die Bindungsstelle stimulierend; befindet sich dort ein A, so wird ein hemmender Effekt vermittelt. Genau diesem Muster folgen die untersuchten GR-Bindungsstellen auf dem LBP-Promotor: Befindet sich an dieser dritten Stelle ein A, so wurde Hemmung beobachtet; befindet sich dort ein T, so wurde ein stimulatorischer Effekt gemessen. Dieser Unterschied in den untersuchten Dex-Bindungsstellen könnte demnach die Vermittlung von hemmender bzw. stimulierender Dex-Wirkung erklären.


[Seite 90↓]

Die hemmende und die aktivierende Wirkung der GR-bindenden Elemente scheinen sich im untersuchten System, also in den Hepatomzelllinien, nach alleiniger Dex-Stimulation oder in Kombination mit IL-1 und IL-6 in etwa die Waage zu halten. Die Stimulierung der Hepatomzellen mit Dex allein bewirkte nur eine geringe Erhöhung der Promotoraktivität. Der Synergieeffekt von Dex und IL-6 scheint maßgeblich nicht auf Promotorebene vermittelt zu werden, da die Überexpression von NF-IL6 in Kombination mit Dex–Stimulation zu keiner Synergie führte. Die durch den NF-IL6-Vektor verursachte NF-IL6-Expression überspringt die IL-6-Signaltransduktionskette und aktiviert direkt den LBP-Promotor. Würde der IL-6/Dex-Synergieeffekt auf der Wechselwirkung der TF GR und NF-IL6 beruhen, so sollte auch in diesem Experiment ein Synergieeffekt zu beobachten sein. Tatsächlich aber zeigte sich kein solcher Effekt.

In der A-549-Lungenepithelzelllinie führte schon die Inkubation von Dex allein zu einer starken Aktivierung der LBP-Expression. Im Gegenzug bewirkte die zusätzliche IL-6-Inkubation nicht in dem Maße einen Synergieeffekt, wie er in den Hepatomzelllinien zu beobachten war. Demnach könnte ein verändertes zelluläres Umfeld die Wirkung der hemmenden und stimulierenden Dex-Bindungsstellen zu Gunsten aktivierender Elemente verschieben. Diese an verschiedene Gewebetypen angepasste Wirkung von Dex auf die LBP-Transkription könnte auch eine Erklärung für die sich in den Leberzellen gegenseitig in ihrer Wirkung aufhebenden Dex-Bindungsstellen sein.

Der IL-6/Dex-Synergieeffekt ist in den Hepatomzelllinien schon auf Transkriptionsebene zu beobachten. Da er aber nicht direkt am Promotor vermittelt wird, muss er „upstream“ vermittelt werden, also in der Signalkette vom Rezeptor zum TF.

Schooltink hat gezeigt, dass Dex die Akkumulation der mRNA des IL-6-Korezeptors gp130 in HepG2-Zellen erhöht [216]. Dieser Einfluss von Dex auf mRNA-Ebene konnte in HepG2-Zellen auch bei anderen Proteinen gezeigt werden. Dex erhöht z.B. die mRNA-Akkumulation und Proteinausschüttung von Apolipoprotein (apo) A-I in HepG2 [217], und es reguliert die Insulin-Rezeptor-mRNA herauf [218]. Die Expression des „low density lipoprotein (LDL) receptor“ wird ebenfalls von Dex durch Erhöhung der mRNA-Akkumulation reguliert [219].

Eine Ursache für die Zunahme der mRNA-Stabilität durch Dex konnte von Diedrich gezeigt werden. Die 5’-untranslatierte Region (5’-UTL) der γ-Glutamyltransferase (GGT)-mRNA enthält ein sogenanntes „steroid hormone response element“ (HRE), das die mRNA stabilisiert und dadurch als translationaler Verstärker wirkt. In HepG2-Zellen wird durch die Bindung von Dex an diese Region deren stabilisierender Effekt verstärkt [220]. Solche oder ähnliche Effekte könnten zum einen für die Erhöhung der IL6-Rezeptor-mRNA-Akkumulation verantwortlich sein, aber auch direkt auf die LBP-mRNA wirken. Der stimulierende Dex-Effekt ist nämlich auf Protein-Ebene noch deutlich stärker ausgeprägt als auf Promotorebene, und daher sind posttranskriptionelle Effekte von Dex auf die LBP-Expression wahrscheinlich.

Die erhöhte Expression von gp130 und des eigentlichen IL-6-Rezeptors durch die Inkubation von Dex konnte direkt auf der Oberfläche der Hepatomzelllinien mit einer FACS-Analyse gezeigt [Seite 91↓]werden. Da eine Erhöhung der IL6-R-Expression nicht notwendigerweise zu einer verstärkten Aktivierung des IL-6-Signalwegs und letztlich zu der Vermittlung einer erhöhten Promotoraktivität führt, wurde die Transduktion des IL-6-Signals an Hand von Stat-1 und -3 untersucht. Die nachgewiesene verstärkte Aktivierung von Stat-3 und in geringerem Umfang auch von Stat-1 nach Dex-Inkubation schließt die Signalkette vom Rezeptor zum Promotor. Dex bewirkt demnach eine erhöhte Expression des IL-6-Rezeptors und seines Korezeptors gp130 und dies führt zu einer verstärkten Aktivierung des wichtigen IL-6-Signalwegs über Stat-3. Da ebenfalls aktive Stat-3-Bindungsstellen auf dem LBP-Promotor nachgewiesen werden konnten, wirkt der Dex/IL-6-Synergieeffekt auf die LBP-Expression zumindest zu einem relevanten Teil über die Verstärkung des IL-6-Effekts.

Zusammenfassend ergibt sich, dass sich auf dem LBP-Promotor mehrere aktive GR-Bindungsstellen befinden, wobei einige eine Stimulation und andere eine Hemmung des Promotors vermitteln. Dadurch neutralisieren sich die direkten Promotoreffekte einer Dex-Inkubation zumindest in den Hepatomzelllinien. Der beobachtete synergistische Effekt von Dex mit IL-6 wird wahrscheinlich vornehmlich durch die Dex-vermittelte Heraufregulierung des IL-6R erzielt.

2 Die Hemmung der LBP-Expression

2.1 Die Wirkung von TGF-β1 auf die LBP-Expression

Die bisher beschriebenen Wirkungen von TGF-β1 sind außerordentlich breit; Einflüsse von TGF-β1 auf verschiedene Bereiche, z.B. die Embryonalentwicklung und Gewebsdifferenzierung sind beschrieben worden [126,221]. Ob TGF-β1 die Hemmung oder Induktion der Expression bestimmter Gene vermittelt, ist nicht nur von dem jeweiligen Gewebe oder der Zellart abhängig, sondern kann selbst in einer Zelllinie variieren, je nachdem mit welchen Faktoren TGF-β1 koinkubiert wird [124,125]. Die Vermittlung der TGF-β1-Wirkung erfolgt typischerweise über die sogenannten Smads, die sowohl als Signaltransduktions- als auch als Transkriptionsfaktoren dienen [123].

Es sind verschiedene Smad-bindende DNA-Sequenzen beschrieben, wobei die palindromische SBE (Smad binding element) -Sequenz mit der Basenfolge GTCTAGAC die wichtigste Bindungsstelle darstellt, an die bevorzugt Smad4-Homodimere binden [189]. Smad-Monomere benötigen nur das halbe Palindrom, das als Smad-Box bezeichnet wird [190]. Eine weitere Smad-Bindungsstelle ist die CAGA-Box, von der auch längere Versionen, CAGAC und CAGACA als regulierende Regionen beschrieben sind [191,192,222].

Auf dem LBP-Promotor befinden sich 10 potentielle Smad-Bindungsstellen und damit mehr Elemente, als nach einer zufälligen Häufigkeit der z.T. kurzen Bindungsstellen zu erwarten wäre. Insgesamt wurden 5 potentielle Smad-Bindungsstellen mit Hilfe von EMSA und/oder [Seite 92↓]Mutationsexperimenten untersucht. Bei der Smad-Sequenz –1294 bp wurde sowohl eine Proteinbindung als auch ein spezifischer Effekt auf die LBP-Promotoraktivität nachgewiesen. Diese Bindungsstelle vermittelt allerdings einen aktivierenden TGF-β1-Effekt auf den Promotor, der sich auf geringem, aber signifikanten Niveau nach alleiniger TGF-β1-Inkubation zeigt und nach Mutation der Bindungsstelle nicht mehr nachzuweisen ist. Dieses CAGAC-Motiv wird als ein Element beschrieben, das stimulierende TGF-β1-Effekte vermittelt und daher mit den hier dargestellten Ergebnissen übereinstimmt.

Die flexible und breite Wirkung von TGF-β1 wird auf molekularer Ebene von der Wechselwirkung der Smads mit anderen Transkriptionsfaktoren bestimmt. In Xenopus z.B. bewirkt die Interaktion von Smad mit FAST-1 (forkhead activin signal transducer-1) eine Bindung an ein ARE (activin response element)-Element [223]. Andere Transkriptionsfaktoren, die ebenfalls mit Smads interagieren, sind TFE3, ATF-1, AML und AP-1 [224]. Diese häufig zu beobachtende Interaktion von Smad mit anderen TF könnte Ak-Bindungsstellen maskieren und so erklären, weshalb es nicht gelungen ist, das Protein, das im EMSA an die Smad-Bindungsstelle bei –1294 bp bindet, mit einem Supershift nachzuweisen.

Nachdem keine Smad-Bindungsstelle lokalisiert werden konnte, die den hemmenden TGF-β1-Effekt vermittelt, wurde der LBP-Promotor systematisch untersucht. Dabei konnte durch Trunkationsanalysen die Hemmwirkung von TGF-β1 auf eine kleine Region eingegrenzt werden. Dabei hat sich gezeigt, dass der TGF-β1-Hemmeffekt eng mit der Aktivierbarkeit des Promotors verbunden ist. In dem Promotorfragment, das den TGF-β1-Hemmeffekt vermittelt, liegen auch Elemente, die einen Teil der Promotoraktivität vermitteln. Mit Hilfe von Feintrunkationen und Mutationsexperimenten konnte gezeigt werden, dass unter anderem zwei AP-1-Bindungsstellen in die Vermittlung des TGF-ß1-Hemmeffekts involviert sind.

Die regulatorische Wirkung von TGF-β1 kann auf direkte und indirekte Art vermittelt werden. Zum einen binden durch TGF-β1 aktivierte Smads direkt z.B. an den PAI-1-Promotor und regulieren dadurch seine Expression [222]. Zum Anderen scheinen besonders bei der Vermittlung von Hemmeffekten andere TF beteiligt zu sein, die als Korepressoren wirken. Beispielsweise wird die Entwicklung von Th2-Zellen durch TGF-β1 unter der Mitwirkung des TF GATA-3 gehemmt [225]. Das Homeodomänen-Protein TGIF (TG3-interacting factor) bindet unter dem Einfluss von Smad an den Zielpromotor und hemmt so die Expression [226]. Das onkogene Produkt c-Ski agiert zusammen mit Smad2 ebenfalls als transkriptioneller Korepressor im TGF-β1-Signalweg [227]. TGIF und s-Ski vermitteln die Bindung der „histone deacetylase“ (HDAC) an den Smad-Komplex und hemmen so die Transkription des Zielgens [228]. Weiterhin wurde gezeigt, dass auch DEC1 in die Vermittlung von TGF-β1-Hemmeffekten involviert ist [229].

Die Kopplung von AP-1 und TGF-β1 bei der transkriptionellen Regulation konnte in jüngerer Zeit mehrmals gezeigt werden [157,158,159,230]. TGF-β1 hat in all diesen Fällen eine aktivierende Wirkung auf die Expression des entsprechenden Gens. Im Gegensatz dazu konnte in der vorliegenden Arbeit gezeigt werden, dass zwei AP-1-Bindungsstellen, bei –536 bp und ‑493 bp, [Seite 93↓]die unter stimulierenden Konditionen an einer Aktivierung des Promotors beteiligt sind, nach zusätzlicher TGF-β1-Inkubation zumindest teilweise den TGF-β1-Hemmeffekt vermitteln.

In dem eingegrenzten DNA-Abschnitt, in dem der TGF-β1-Hemmeffekt vermittelt wird, ist auch eine potentielle Gfi-1-Bindungsstelle lokalisiert, die nahezu der idealen Gfi-1-Konsensussequenz entspricht [188].

2.2 Gfi-1 als regulatorisches Element des LBP-Promotors

Überraschenderweise hat die Analyse des LBP-Promotors im Zusammenhang mit der TGF-β1-Wirkung eine herausragende Bedeutung des noch wenig beschriebenen TF Gfi-1 ergeben. Gfi-1 ist ein inhibitorisch wirkender TF mit einer Zinkfinger-Domäne, die an die DNA bindet und einer evolutionär konservierten Repressordomäne SNAG, die den Hemmeffekt am Promotor vermittelt [169,231].

Gfi-1-Bindungsstellen wurden auch in den Promotoren verschiedener APPs wie IL-1α und IL-1β, IL-4, IL-5, IL-6, IFN-γ und TNF-α gefunden. Dies lässt vermuten, dass Gfi-1 eine wichtige Rolle bei der Regulation von Zytokinen hat [167,232]. Eigene Recherchen haben ergeben, dass Gfi-1-Bindungsstellen in großer Anzahl auch im MD-2-Promotor zu finden sind. MD-2 hat eine wichtige Bedeutung im TLR-Signalweg und damit bei den Regelkreisen der angeborenen Immunität.

Auf dem LBP-Promotor befinden sich mehrere potentielle Gfi-1-Bindungsstellen, wobei sich aber das Element mit der höchsten Übereinstimmung zur Gfi-1-Konsensussequenz in dem Abschnitt befindet, in dem auch der TGF-β1-Effekt vermittelt wird. Diese potentielle Gfi-1-Bindungsstelle bei –556 bp (Gfi I) hat die Sequenz TAAATCACTGCT und korreliert mit einem core/matrix-Index von 1/0.98 fast perfekt mit der idealen Konsensussequenz. Die einzige Abweichung besteht in der letzten Base T, an deren Stelle sich in der Konsensussequenz ein A befindet [188]. Zweidler-McKay et al. haben in Selektionsexperimenten gezeigt, dass die Häufigkeit der Base A an der genannten Stelle 39 % beträgt und dass ein T mit einer Häufigkeit von 25 % vorkommt [167]. Mit diesem minimalen Unterschied zur idealen Gfi-1-bindenden Sequenz ist diese Bindungsstelle eines der „stärksten“ Elemente auf dem gesamten LBP-Promotor.

Die hier dargestellten Mutationsexperimente haben gezeigt, dass die Gfi-1-Bindungsstelle –556 bp in die Vermittlung der TGF-β1-Hemmeffekte auf den Promotor involviert ist. Sowohl Punktmutationen als auch die Deletion der Gfi-1-Bindungsstelle haben im vollständigen Promotor und noch verstärkt im trunkierten Promotor zur Reduktion des TGF-β1-Hemmeffektes geführt. Dieser Effekt ist noch deutlich stärker als bei der benachbarten AP-1-Bindungsstelle –540 bp. Die kombinierte Mutation der AP-1- und Gfi-1-Bindungsstellen hat ergeben, dass dem Gfi-1-Element eine herausragende Bedeutung bei der Regulation des Promotors zukommt. Wurde das AP-1-Motiv mutiert, reduzierte sich der TGF-β1-Hemmeffekt. Bei zusätzlicher Mutation der Gfi-1-Bindungsstelle wurde der Hemmeffekt weiter reduziert. Im Gegensatz dazu hat die Gfi-1-Stelle einen dominanten Einfluss: Die Mutation der Gfi-1-Stelle reduzierte den Hemmeffekt sehr stark, und eine zusätzliche Mutation von AP-1 zeigte keinerlei weiteren Effekt. Die Gfi-1-Bindungsstelle [Seite 94↓]scheint absolut notwendig zu sein, um den TGF-β1-Hemmeffekt zu vermitteln; das AP-1-Motiv hat dagegen nur eine nachgeordnete, quantitative Bedeutung.

Die besondere Bedeutung der Gfi-1-Bindungsstelle für die Aktivität des LBP-Promotors zeigte sich bei der Stimulierung des Promotors ohne TGF-β1-Inkubation. Die Mutation der Gfi-1-Bindungsstelle führte in stimulierten Zellen zur stärksten Reduktion der Aktivierbarkeit des Promotors, die bei einer Einzelmutation überhaupt beobachtet wurde. Die Restaktivität des Promotors entspricht in der Mutanten in etwa der Aktivität der 463 bp langen Promotortrunkation, auf der sich weder die Gfi-1-Bindungsstellen noch die beiden AP-1- (-540 und –493 bp) und das NF-κB-Element (-515 bp) befinden. Die AP-1-Bindungsstelle –540 bp und die NF-κB-Stelle vermitteln selbst eine starke und AP-1 –493 bp eine geringere Aktivierbarkeit des Promotors. Die Addition der Einzeleffekte zusammen mit dem Effekt der Gfi-1-Stelle würde zu einem Einfluss führen, der weit über 100 % liegt. Diese Bindungsstellen bzw. die Faktoren, die daran binden, stehen demnach in starker Wechselwirkung, und das sowohl bei der Promotorstimulierung als auch bei seiner Hemmung.

2.3 Die Inhibierung aktiver Promotoren

Die Vermittlung inhibierender Promotoreffekte kann nach den theoretischen Modellen verschiedene Ursachen haben. Im Folgenden sollen die möglichen Mechanismen in Bezug auf den Gfi-1-vermittelten TGF-β1-Hemmeffekt diskutiert werden.

Wird die Transkription eines (eukaryotischen) Gens eingeleitet, binden die Initiationsfaktoren, die RNA-Polymerase II und die Transkriptionsfaktoren an den Promotor. Damit ist dieser aktiviert, die Transkription wird gestartet. Dies ist unabhängig davon, ob der Promotor konstitutiv aktiv ist oder durch Faktoren induziert wird. Die Hemmung eines aktiven Promotors ist zwar ebenfalls ein aktiver Vorgang im Sinne eines streng regulierten und Energie verbrauchenden Vorgangs, es handelt sich letztlich jedoch immer um eine Be- oder Verhinderung der Transkription [132,135].

Drei grundlegende Mechanismen der transkriptionellen Repression werden unterschieden:

Der Repressor verhindert die Bindung eines Aktivators an die DNA:
Dabei kann er direkt oder überlappend an die DNA-Bindungsstelle des Aktivators binden und sie dadurch maskieren oder an den Aktivator binden und seine DNA-bindende Region blockieren.

Der Repressor behindert die Wirkung eines an die DNA gebundenen Aktivators:
Der Inhibitor bindet z.B. benachbart zum Aktivator und behindert dadurch sterisch seinen Kontakt zum Transkriptionskomplex.

Bei der so genannten „echten“ Repression behindert eine distinkte Repressionsdomäne die Ausbildung des transkriptionellen Komplexes.

Überlappungen der verschiedenen Mechanismen sind dabei des öfteren zu finden. So hemmt bei Drosophila der transkriptionelle Repressor Rb die Aktivierungsdomäne des DNA-gebundenen E2F und verfügt zusätzlich über eine aktive Repressionsdomäne, mit der er an HDAC (Histondeacetylase) bindet [233,234]. Ein anderes Beispiel ist DSP1, es hemmt bei Drosophila [Seite 95↓]sterisch die Aktivierungsdomäne des TF Dorsal und verhindert gleichzeitig die Bildung von PIC („preinitiation complex“; [235]. Verschiedene transkriptionelle Regulatoren sind in der Lage, die Transkription sowohl zu hemmen als auch zu aktiveren. Diese entgegengesetzte Eigenschaft ist z.B. bei dem Drosophila-Protein Krüppel zu finden, das in monomerer Form die Transkription aktiviert und als Dimer hemmend wirkt, da zwar die monomere Form, aber nicht die dimere Form Kontakt zu TFIIB aufnehmen kann. Umgekehrt interagiert das Dimer mit TFIIE, nicht aber das Monomer [236]. Bei anderen TF, wie z.B. Dorsal/DSP, E2F-Rb oder WT1, wird der Wechsel zwischen aktivierender und hemmender Wirkung durch die Bindung eines Kofaktors bewirkt. WT1 fungiert als Aktivator und wird zum Repressor, wenn ein löslicher nukleärer Faktor bindet (Übersichtsartikel: [135].

Jeder Hemmeffekt ist demnach eng mit aktivierenden Elementen verbunden. Die Wechselwirkung zwischen Aktivator und Inhibitor kann dabei leicht zu Störungen der Aktivierbarkeit des Promotors führen, z.B. wenn der Inhibitor selbst oder dessen Bindungsstelle Mutationen aufweisen.

Gfi-1 ist als „echter“ inhibierender TF beschrieben. Zum einen kann er mit der Zinkfingerdomäne an seine spezifische DNA-Sequenz binden, zum anderen bindet die SNAG-Region an aktivierende TF oder direkt an den Transkriptions-Startkomplex und unterbindet so die transkriptionelle Aktivierung. Eine Bindung von Gfi-1 an die DNA ist aber nicht zwingend notwendig, damit es sein inhibierendes Potential entfalten kann [169,170,231].

Die hier dargestellten Kotransfektionsexperimente mit dem pGfi-1-Plasmid bzw. mit der Mutanten pGfiZn, die nur die Zinkfingerregion trägt, und der Mutanten pGfiSNAG, die nur die SNAG-Region beinhaltet haben gezeigt, dass die SNAG-Region nur bedingt notwendig ist damit Gfi-1 seine hemmende Wirkung gegenüber dem LBP-Promotor entfalten kann: Einerseits hatte die Kotransfektion der SNAG-Region allein im Vergleich zum mock-Kontrolle zu keiner Hemmung des LBP-Promotors geführt. Dagegen führte die Transfektion von pGfiZn zu einer deutlichen Reduktion der Promotoraktivität, die allerdings nicht so stark ausgeprägt war wie nach der Transfektion des vollständigen pGfi-1-Plasmids. Demnach ist die DNA-bindende Region notwendig zur Vermittlung des Hemmeffekts, aber nicht hinreichend für die maximale Wirkung, die erst mit der SNAG-Region erreicht wird. Die Wirkung von Gfi-1 auf den LBP-Promotor entspricht also nicht der bislang beschriebenen Wirkung von Gfi-1 als ‚echtem‘ Repressor mit einer aktiv hemmenden Domäne. Im Gegensatz zu der von Rodel gezeigten DNA-unabhängigen Hemmwirkung von Gfi-1 ist bei der Wirkung auf den LBP-Promotor die DNA-bindende Domäne unverzichtbar [170].

Diese Ergebnisse decken sich mit den Mutationsexperimenten am Promotor. Auch hierbei ist die Gfi-1-bindende Region notwendig, um den Gfi-1-Effekt zu vermitteln. Die Mutation der Bindungsstelle reduziert sowohl die Hemmung durch kotransfiziertes pGfi-1, wie auch die durch TGF-β1-Inkubation sehr stark, allerdings nicht vollständig. Dabei könnten evtl. die anderen auf dem Promotor liegenden potentiellen Gfi-1-Bindungsstellen die ausfallende Haupt-Gfi-1-Stelle zum Teil ersetzen. Jedenfalls sind für die Vermittlung des Hemmeffekts sowohl die Gfi-1-Bindungsstelle auf dem Promotor als auch die DNA-bindende Domäne auf dem Gfi-1-Protein notwendig.


[Seite 96↓]

Die Gfi-1-Wirkung auf den LBP-Promotor wurde demnach durch die Behinderung aktivierender Transkriptionsfaktoren vermittelt. Die Gfi-1-Bindungsstelle bei –556 und das AP-1-Element bei –540 bp überlappen sich zwar nicht, liegen aber nur durch 4 bp getrennt sehr eng beieinander, so dass eine Behinderung der AP-1-Bindung durch gebundenes Gfi-1 vorstellbar wäre. Für die zweite AP-1-Bindungsstelle (-493 bp) und das NF-κB-Element (-515 bp) kann man eher von einer sterischen Behinderung der aktivierenden Faktoren bei der Kontaktaufnahme mit dem Transkriptionskomplex ausgehen, was im Übrigen auch für das AP-1-Element bei –540 bp zutreffen könnte.

Ein weiterer beobachteter Effekt ist, dass die Gfi-1-Bindungsstelle nicht nur inhibierende Effekte vermittelt, sondern auch für die Stimulation des LBP-Promotors notwendig ist. Die reduzierte Aktivierbarkeit des Promotors nach Deletion der Gfi-1-Bindungsstelle könnte noch durch die Verschiebung der relativen Lage von Transkriptionsfaktoren und Transkriptionskomplex und eine dadurch erzeugte Störung der Transkription erklärt werden. Die zweite Mutatione von Gfi I, bei der nur zwei Basen ausgetauscht wurden, spricht jedoch dagegen. Die Länge der DNA bleibt hierbei unverändert, die Aktivierbarkeit des Promotors geht trotzdem stark zurück.

Da Gfi-1 bislang ausschließlich als inhibierender TF beschrieben wurde, können die beobachteten Effekte nur durch komplexere Strukturen erklärt werden, die sich bei der Aktivierung bzw. Hemmung des LBP-Promotors bilden:

1. Die hemmende Wirkung von TGF-β1 könnte durch die Aktivierung der Gfi-1-Expression vermittelt werden, wobei das Gfi-1-Protein dann über die Gfi-1-Bindungstelle die Hemmung vermittelt. Bei der Aktivierung des LBP-Promotors würde nach diesem Modell ein anderes, unbekanntes Protein an die Gfi-1-Bindungsstelle binden, das den aktivierenden Effekt vermittelt. Dies entspricht auch den Beobachtungen bei den EMSA-Experimenten, bei denen nach reiner Stimulierung ohne Inkubation von TGF-β1 eine spezifische Bindung an die Gfi-1-Bindungsstelle gezeigt werden konnte. Dieses zweite Protein würde dabei ebenfalls die Gfi-1-Bindungsstelle präferieren und demnach wahrscheinlich ebenfalls eine DNA-bindende Zinkfinger-Domäne aufweisen. Außerdem müsste dieses Protein die gleiche oder annähernd gleiche Molekülgröße wie das 45 kDa große Gfi-1 aufweisen, da im Shift-Assay nach Stimulierung mit IL-1, IL-6 und Dex bzw. nach TGF-β1-Inkubation kein Unterschied in der Molekülgröße des spezifisch gebundenen Proteins zu erkennen war. Diese hohe Übereinstimmung des stimulierenden und des hemmenden Faktors legt nahe, dass es sich um ein dem Gfi-1 verwandtes Protein handelt. Das eng verwandte Protein Gfi-1B kommt -zumindest in der beschriebenen Form- nicht in Frage, da es mit etwa 37 kDa deutlich kleiner ist als Gfi-1. Möglicherweise handelt es sich um einen bislang noch unbekannten Faktor. Durchsucht man beispielsweise die Proteindatenbanken SwissProt und TrEMBL nach Proteinen mit einer hohen Übereinstimmung in der Aminosäurensequenz zu Gfi-1 erhält man über 300 Einträge (http://www.expasy.org/tools/blast/). Die Übereinstimmung bezieht sich dabei meist auf die Zinkfingerdomäne, es handelt sich dabei also um DNA-bindende Proteine. Potentiell kommt dabei jedes dieser Proteine in Frage, auch wenn es in einem anderen [Seite 97↓]Zusammenhang beschrieben wurde, es muss lediglich in etwa die gleiche Größe wie Gfi-1 aufweisen. Darüber hinaus findet man z.B. unter der „Accession Number Q9H6Z6“ den Eintrag „Hypothetical protein FLJ21628“, der auf ein potentielles noch unbekanntes Protein verweist, das in der Größe in etwa Gfi-1 entspricht. Dieses Beispiel soll zeigen, dass auch in Zeiten nach Abschluss des humanen Genomprojekts noch Spielraum zur Entdeckung unbekannter Proteine vorhanden ist. Möglich wäre auch eine alternative Gfi-1-Isoform, die aus alternativem Spleißen hervorgegangen ist, sich aber nicht wesentlich in der Größe von Gfi-1 unterscheidet. Eng verwandte Proteine, die sowohl in der Vermittlung von stimulierenden als auch hemmenden Effekten auf die Signaltransduktion und die Transkription wirken, wurden des Öfteren beschrieben. So werden z.B. bei der Smad-vermittelten TGF-β1-Signaltransduktion die auf die Transkription aktivierend wirkenden Smad2 und -3 bei Rezeptorbindung durch Phosphorylierung selbst aktiviert. Gehemmt werden diese durch die I-Smads (inhibierende Smads), die zwar auch an den Rezeptor binden und dadurch die Bindungsstelle maskieren, aber kein Signal weiterleiten können. Die I-Smads sind letztlich natürliche dominante Negativmutanten der aktivierenden Smads und diesen dadurch sehr ähnlich [237,238].

2. Gfi-1 könnte durch bestimmte induzierte Modifikationen, wie z.B. Phosphorylierung, von einem hemmenden zu einem aktivierenden TF werden bzw. umgekehrt. Signaltransduzierende Proteine oder TF werden in der Regel durch kleine oder punktuelle Modifikationen aktiviert und können dadurch ein Signal transportieren [239,240]. Daher scheint es möglich, dass Gfi-1 an die DNA bindet, aber eine zusätzliche spezifische Modifikation entscheidet, ob seine Wirkung aktivierend oder hemmend auf den LBP-Promotor ist. Dieser Erklärungsansatz würde die identische Proteingröße im EMSA-Experiment gut erklären, da sich Modifikationen, wie z.B. eine Phosphorylierung im Shift-Assay, nicht zeigen lassen.

3. Die antagonistische Wirkung von Gfi-1 könnte auch durch einen Kofaktor erklärt werden, der durch Maskierung einer hemmenden oder aktivierenden Domäne die Gfi-1-Wirkung ins Gegenteil verkehrt. Dazu passt die Beschreibung von Grimes et al., dass die repressive Wirkung der SNAG-Region von Gfi-1 die Assoziation mit einem titrierbaren Protein voraussetzt [231]. Dies könnten ein anderer TF oder basale Elemente der Transkription sein oder eben auch ein Kofaktor, der zur Vermittlung des Hemmeffekts notwendig ist.

Im Übrigen ist die Gfi-1-Wirkung, wie schon beschrieben wurde, nicht zwingend mit einer DNA-Bindung verknüpft. Rödel et al. haben gezeigt, dass Gfi-1 an PIAS3, einen Stat-3-Inhibitor, bindet und ihn dadurch blockiert [170]. Die Stat-3-Aktivität wird dadurch erhöht und damit letztlich die IL-6-Wirkung verstärkt. Dieser DNA-unabhängige Wirkmechanismus zeigt zumindest, dass weitere Gfi-1-Effekte möglich erscheinen, deren Aufklärung vielleicht auch die Gfi-1-Wirkung auf dem LBP-Promotor erklären könnte.

Obwohl der Mechanismus der Gfi-1-Wirkung im Rahmen der vorliegenden Arbeit nicht vollständig aufgeklärt werden konnte, ist die Bedeutung sowohl der Gfi-1-Bindungsstelle ‑556 bp als auch des Gfi-1-Proteins nachgewiesen worden. Zusätzlich konnten noch die konstitutiven LBP-Spiegel von Gfi-1-defizienten Mäusen gemessen werden. Auf Grund der sehr limitierten Anzahl der Mäuse [Seite 98↓]konnte keine in vivo Stimulationsexperimente durchgeführt werden. Die vorläufigen Ergebnisse auf basalem LBP-Niveau haben jedoch gezeigt, dass die LBP-Konzentration in homozygot Gfi-1-defizienten Mäusen gegenüber heterozygoten Mäusen um 100% höher liegt. Auch dieses Ergebnis bestätigt die hemmende Wirkung von Gfi-1 auf die LBP-Expression.

3 Klinische Bedeutung von LBP und seiner Regulation

LBP ist ein Lipidtransferprotein, das die spontan sehr langsam ablaufende Diffusion von LPS-Monomeren zwischen LPS-Mizellen, HDL-Partikeln und Zellmembran unter Beteiligung von sCD14 beschleunigt [241]. Der Transfer zur Zelle führt über TLR-4 und MD-2 zur Zellaktivierung, wogegen der Transport zu HDL-Partikeln zur Inaktivierung des LPS führt [39,64]. Der verstärkende LBP-Effekt wird schon innerhalb weniger Minuten über geringe, basal exprimierte LBP-Konzentrationen vermittelt. Nach einer Infektion steigt dann die LBP-Konzentration um etwa das 50-fache an. Dieser Anstieg bewirkt einen anti-inflammatorischen Effekt von LBP, der eine überschießende Dysregulation des Immunsystems zu vermeiden hilft [29]. Diese bivalente Funktion von LBP, das in geringer Konzentration die Immunantwort verstärkt und in hoher Konzentration unterdrückt, führt zu der Vorstellung, dass sowohl die vollständige Unterdrückung wie auch die Verstärkung der LBP-Expression klinisch relevant sein könnten. Da schon sehr geringe Konzentrationen von LBP ausreichen, um den LPS-verstärkenden Aspekt zu gewährleisten, könnte der Einsatz von anti-LBP-Antikörpern in Kombination mit der Unterdrückung der LBP-Neosynthese ein Weg sein, um die Inflammation therapeutisch zu beeinflussen. Andererseits könnte es in bestimmten Situationen, evtl. bei fortgeschrittenem klinischen Verlauf des septischen Schocks, durch die Verabreichung von hohen LBP-Konzentrationen zu einer schnelleren Beruhigung der überschießenden Immunantwort kommen. Daher ist es von besonderem Interesse, die Regulation der LBP-Expression im Detail zu verstehen. Die genaue Kenntnis der Wechselwirkung zwischen stimulierenden und inhibierenden Faktoren der LBP-Expression könnte möglicherweise mittelfristig einen wichtigen Beitrag zur Behandlung inflammatorischer Erkrankungen und akuter Infektionen bis hin zum septischen Schock erbringen. Die Aufklärung des TGF-β1-Hemmeffekts auf die LBP-Expression könnte Grundlage für eine Hemmung der LBP-Produktion beim Menschen sein. Die direkte Behandlung mit TGF-β1 kommt dabei kaum in Betracht, da TGF-β1 ein sehr weites Wirkungsspektrum aufweist und mit entsprechend vielen Nebenwirkungen zu rechnen wäre. Würde dagegen ein Protein aus der Signaltransduktionskette mit starker selektiver Wirkung wie Gfi-1 verabreicht, könnte möglicherweise eine verstärkte LBP-Hemmung bei reduzierten Nebenwirkungen erreicht werden. Die genauen Zusammenhänge zwischen TGF-β1, Gfi-1 und Hemmung der LBP-Expression bedürfen jedoch noch weiterer Erforschung und versprechen, weitere interessante und hilfreiche Ergebnisse zu liefern.


© Die inhaltliche Zusammenstellung und Aufmachung dieser Publikation sowie die elektronische Verarbeitung sind urheberrechtlich geschützt. Jede Verwertung, die nicht ausdrücklich vom Urheberrechtsgesetz zugelassen ist, bedarf der vorherigen Zustimmung. Das gilt insbesondere für die Vervielfältigung, die Bearbeitung und Einspeicherung und Verarbeitung in elektronische Systeme.
DiML DTD Version 4.0Zertifizierter Dokumentenserver
der Humboldt-Universität zu Berlin
HTML-Version erstellt am:
20.10.2005