Die Regulation des humanen Lipopolysaccharid Bindenden Proteins (hLBP)

Dissertation

zur Erlangung des akademischen Grades
doctor rerum naturalium
(Dr. rer. nat.)
im Fach Biologie

eingereicht an der
Mathematisch-Naturwissenschaftlichen Fakultät I
der Humboldt-Universität zu Berlin

von
Werner Hallatschek

geboren am 03.10.1961 in Öhringen (Baden-Württemberg)

Präsident der Humboldt-Universität zu Berlin
Prof. Dr. Jürgen Mlynek

Dekan: Dekan der Mathematisch-Naturwissenschaftlichen Fakultät I
Prof. Dr. Thomas Buckhout

Gutachter:
1. Prof. Dr. Ralf Schumann
2. Prof. Dr. Richard Lucius
3. Prof. Dr. Dr. Ernst Rietschel

Tag der mündlichen Prüfung: 20.10.2004

Abstrakt

Das Lipopolysaccharid Bindende Protein (LBP) ist ein überwiegend in der Leber synthetisiertes Akutphaseprotein. Es bindet den Zellwandbestandteil Lipopolysaccharid (LPS) Gram-negativer Bakterien und transportiert es zu zellulären Rezeptoren, wodurch das angeborene Immunsystem aktiviert wird.

In dieser Arbeit wird die Regulation der LBP-Expression in Interleukin (IL)-1, IL-6 und Dexamethason (Dex) stimulierten humanen Hepatomzelllinien HuH-7 und HepG2 untersucht. Der wichtigste Stimulator ist dabei IL-6, dessen Wirkung über die Transkriptionsfaktoren (TF) Stat-3, C/EBP-beta und AP-1 vermittelt wird. Für alle 3 TF konnten aktive Bindungsstellen auf dem LBP-Promotor nachgewiesen werden. Für IL-1-Effekte die u. a. über den TF NF-kappaB vermittelt werden, konnten ebenfalls aktive Bindungsstellen nachgewiesen werden. Die Wirkung von Dex wird über Glucocorticoid Responsive Elements (GREs) vermittelt. Auf dem LBP-Promotor befinden, sich wie gezeigt werden konnte, mehrere aktive GREs, wobei einige verstärkend und einige hemmend wirken. Eine zu beobachtende Synergiewirkung von Dex und IL-6 wird durch die Aufregulation des IL-6-Rezeptors durch Dex verursacht.

Die LBP-Expression kann durch TGF (Transforming Growth Factor)-beta gehemmt werden. Der TGF-beta-Signalweg über Smads ist in den Hepatomzellen aktiv, vermittelt aber nicht den TGF-beta-Hemmeffekt, sondern eine geringe stimulierende Wirkung, die bei alleiniger TGF-beta-Inkubation auftritt. Die inhibierende Wirkung von TGF-beta wird durch Gfi-1- und AP-1-Bindungsstellen vermittelt. Die Gfi-1-Bindungsstelle nimmt dabei, wie hier erstmals gezeigt werden konnte, eine herausragende Stellung ein.

Die Aufklärung der LBP-Regulation und dabei besonders die Hemmung der LBP-Expression kann mittelfristig dazu beitragen, den klinischen Verlauf von inflammatorischen und infektiösen Erkrankungen zu beeinflussen und bietet daher Potenzial für neue Therapieansätze.

Eigene Schlagworte: LPS binding protein (LBP) , Lipopolysaccharid (LPS), Interleukin-6 (IL-6), Dexamethason (Dex) , Transforming Growth Factor-beta (TGF-beta), Aktivatorprotein-1 (AP-1), (C)CAAT/enhancer binding protein-beta (C/EBP-beta), Signal transducer and activator of transcription 3 (Stat-3), Nuclear factor kappa B (NF kappa B), Glucocorticoid responsive element (GRE), Growth factor independence-1 (Gfi-1)

Abstract

Lipopolysaccharide (LPS) binding protein (LBP) is an acute phase protein with the ability to bind and transfer LPS of Gram-negative bacteria. This soluble pattern recognition molecule represents an important defense principle of the host. Regulation of the hepatic acute phase response and its termination are important mechanisms for limiting systemic inflammatory activity of the host.

Here were analyze the cooperation of Interleukin (IL)-1, IL-6, and Dexamethasone (Dex) at LBP expression in the hepatoma cell lines HuH-7 and Hep G2. The major inducer of LBP expression is IL-6. Within the LBP promoter numerously highly consensus binding sites such as AP-1, C/EBP-beta, and STAT3 are present, that confer transcriptional activity as shown by truncation and mutation experiments. Additionally, activate NF-kappaB sites activated by IL-1 were detected at the LBP promoter.

By mutation experiments of the promoter furthermore were found differentially active glucocorticoid response elements (GREs). The promoter contains GREs enhancing the activity as well as inhibitory ones. The enhancing effect towards LBP expression by Dex was mediated by IL-6. Dex stimulated the expression of the IL-6 receptor and therefore upregulated the IL-6 pathway.

Transforming Growth Factor (TGF)-beta is able to inhibit LBP expression in stimulated cells. An AP-1 binding site was identified mediating inhibitory TGF-beta effects towards LBP promoter activity. Furthermore it was shown that a growth factor independence (Gfi)-1 binding site localized near the AP-1 site is essential for mediating the TGF-beta inhibitory effect. The relevancy of the Gfi-1 site fore mediating TGF-beta effects indicates a novel mechanism for understanding inhibitory TGF-beta effects at the transcriptional level.

In summary the complex regulation of LBP were elucidate which may help to eventually develop novel intervention strategies for acute phase, sepsis, and septic shock.

Keywords: LPS binding protein (LBP) , lipopolysaccharid (LPS), interleukin-6 (IL-6), dexamethasone (Dex) , transforming growth factor beta (TGF-beta), activator protein-1 (AP-1), (C)CAAT/enhancer binding protein-beta (C/EBP-beta), signal transducer and activator of transcription 3 (Stat-3), nuclear factor kappa B (NF kappa B), glucocorticoid responsive element (GRE), growth factor independence-1 (Gfi-1)

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20.10.2005