Aus der Klinik für Neurologie
der Medizinischen Fakultät der Charité – Universitätsmedizin Berlin

Dissertation

Streptococcus pneumoniae induziert Apoptose in zerebralen Endothelzellen:

Die Rolle bakterieller Toxine

Zur Erlangung des akademischen Grades
Doctor medicinae (Dr. med.)

vorgelegt der Medizinischen Fakultät der Charité –
Universitätsmedizin Berlin

von

Annett Halle
aus Berlin

Dekan: Prof. Dr. med. Martin Paul

Gutachter:
1. Prof. Dr. Jörg Weber
2. Prof. Dr. Oliver Liesenfeld
3. Prof. Dr. Eicke Latz

Datum der Promotion: 24.1.2005

Zusammenfassung

Die bakterielle Meningitis ist trotz der Anwendung modernster Antibiotika mit einer hohen Letalität und neurologischen Spätkomplikationen verbunden. Ein entscheidendes Ereignis ist dabei der Zusammenbruch der Blut-Hirn-Schranke (BHS). Die genauen Mechanismen, die zu ihrer Schädigung führen, sind bis heute unklar. In dieser Arbeit wurde untersucht, ob lebende Pneumokokken in einem Zellkulturmodell der BHS zu einer apoptotischen Zellschädigung von zerebralen Endothelzellen, als wichtigstem zellulären Bestandteil der BHS, führen und damit zu ihrer strukturellen Schädigung beitragen. Mittels verschiedener Detektionsmethoden (TUNEL, Fluoreszenzmikroskopie, Elektronenmikroskopie) konnte nachgewiesen werden, daß Streptococcus pneumoniae zu einem apoptotischen endothelialen Zelltod führt. Eine Beteiligung von Caspasen konnte weder mit direkter Aktivitätsmessung noch mittels Inhibitionsexperimenten oder dem Nachweis von Caspase-spezifischen Substraten gezeigt werden. Insgesamt sind die Morphologie der Zellkerne und die spezifische Degradation der endothelialen DNS hinweisend für einen Apoptosis-Inducing-Factor-vermittelten Zelltod ohne Caspasenbeteiligung. Diese Form des Zelltodes ist bereits in anderen Zellmodellen, bisher jedoch nicht bei zerebralen Endothelzellen beschrieben worden. Auf Seiten des Bakteriums konnten Wasserstoffperoxid und Pneumolysin als Auslöser der Apoptose identifiziert werden. Die zytotoxische Potenz des Pneumolysins ist dabei an dessen Poren-formende Aktivität gebunden. Die Ergebnisse sind von potentieller klinischer Relevanz, da es bei einer Bakteriämie und während der Invasion der Pneumokokken in das ZNS zu einem direkten Kontakt zwischen Bakterien und zerebralen Endothelzellen kommt und sich daraus eine Möglichkeit zur Entwicklung adjuvanter Therapien ergeben könnte.

Schlagwörter: bakterielle Meningitis, Streptococcus pneumoniae, Blut-Hirn-Schranke, zerebrale mikrovaskuläre Endothelzellen

Abstract

Despite sufficient antibiotic treatment, pneumococcal meningitis has remained a disease associated with high mortality and neurological sequelae. The disruption of the blood brain barrier (BBB) is regarded a key event in the initial phase of pneumococcal meningitis. However, the exact molecular mechanisms involved in this process are still unknown. The aim of this study was to determine if living pneumococci are able to induce apoptosis in cerebral endothelial cells – the main cellular component of BBB – and therefore might contribute to its damage. Using several different detection methods (TUNEL, fluorescence and electron microscopy), induction of apoptotic cell death of endothelial cells by pneumococci could be verified. An accompanying activation of caspases was not detectable, despite the use of specific detection techniques such as inhibition experiments, direct enzyme measurements and detection of caspase-specific protein cleavage. These results as well as the specific nuclear morphology and degradation of endothelial DNA suggest an involvement of the mitochondrial protein Apoptosis inducing factor (AIF). This is the first time this specific form of apoptotic, AIF-driven cell death has been described to be engaged in endothelial cells. On the part of the bacterium, pneumolysin and hydrogen peroxide were identified as the two main inducers of apoptosis. The cytotoxic potency of pneumolysin is related to its pore-forming activity. These results are of clinical relevance since pneumococci are known to reside in close proximity to cerebral endothelial cells during bacteriemia and their entry into the CNS. These findings could contribute to the development of adjuvant treatment of bacterial meningitis.

Keywords: bacterial meningitis, Streptococcus pneumoniae, blood-brain-barrier, cerebral microvascular endothelial cells

Inhaltsverzeichnis

• 1  EINLEITUNG
  • 1.1 Bakterielle Meningitis
    • 1.1.1 Einführung
    • 1.1.2  Pathogenese und Pathophysiologie der Pneumokokkenmeningitis
  • 1.2 Virulenzfaktoren von S. pneumoniae
    • 1.2.1  Autolysin
    • 1.2.2 CbpA
    • 1.2.3 Wasserstoffperoxid (H₂O₂)
    • 1.2.4  Pneumolysin
  • 1.3 Die Blut-Hirn-Schranke
    • 1.3.1 Aufbau der Blut-Hirn-Schranke und Besonderheiten des zerebralen Endothels
    • 1.3.2 Pathophysiologie der Blut-Hirn-Schranke bei der bakteriellen Meningitis
  • 1.4  Apoptose - Der programmierte Zelltod
    • 1.4.1 Biologisches Phänomen
    • 1.4.2 Die Bedeutung des Programmierten Zelltodes
    • 1.4.3 Morphologische Kennzeichen
    • 1.4.4 Ablauf der Apoptose
      • 1.4.4.1 Termination der Apoptose
      • 1.4.4.2 Induktion und Regulation der Apoptose
    • 1.4.5  Caspasen-unabhängiger programmierter Zelltod
    • 1.4.6 Mechanismen des Caspasen-unabhängigen programmierten Zelltodes
      • 1.4.6.1  AIF
  • 1.5  Zielsetzung der Arbeit
• 2  MATERIAL UND METHODEN
  • 2.1 Kulturen der primären zerebralen Kapillarendothelzellen
  • 2.2 Bakterienkulturen
  • 2.3  Stimulation der zerebralen Endothelzellen
  • 2.4  Untersuchung der Zellkernmorphologie mit DNS-Farbstoffen (AO/EB)
  • 2.5  Untersuchung der DNS-Degradation mit der TUNEL-Methode
  • 2.6  Elektronenmikroskopische Aufnahmen
  • 2.7 Pulsfeldgelelektrophorese (PFGE)
  • 2.8 Messung der Caspaseaktivität
  • 2.9 Messung der intrazellulären Calciumkonzentration
  • 2.10  Messung des mitochondrialen Membranpotentials ΔφM
  • 2.11 Proteinbestimmung
  • 2.12 Subzelluläre Fraktionierung
  • 2.13  Western-Blot
  • 2.14 Angewandte statistische Verfahren
• 3  ERGEBNISSE
  • 3.1 Nachweis des Pneumokokken-induzierten endothelialen Zelltodes
    • 3.1.1 Lebende Pneumokokken induzieren einen programmierten Zelltod in zerebralen Endothelzellen
      • 3.1.1.1 Untersuchung der Kernmorphologie mit der Acridinorange-Ethidiumbromid-Methode
      • 3.1.1.2 Untersuchung der Zellmorphologie mit Hilfe der Elektronenmikroskopie
      • 3.1.1.3  Untersuchung der DNS-Degradation mit der TUNEL-Methode
    • 3.1.2 Der Zelltod zerebraler Endothelzellen ist direkt abhängig von Inkubationszeit und Konzentration der Pneumokokken
  • 3.2 Untersuchung der Rolle der Caspasen
    • 3.2.1 Der Pneumokokken-induzierte Zelltod ist durch den Pan-Caspase-Inhibitor zVAD-fmk nicht blockierbar
    • 3.2.2 Die Caspasen-3, -8 und -9 werden beim endothelialen Zelltod durch lebende Pneumokokken nicht aktiviert
    • 3.2.3  Beim endothelialen Zelltod kommt es nicht zur Entstehung Caspasen-abhängiger Spaltprodukte von α-Fodrin
  • 3.3  Untersuchung weiterer intrazellulärer Mechanismen
    • 3.3.1 Nach Stimulation zerebraler Endothelzellen mit Pneumokokken kommt es zu einem raschen Anstieg des intrazellulären Calciums
  • 3.4 Untersuchung der Beteiligung von Apoptosis Inducing Factor (AIF)
    • 3.4.1 Lebende Pneumokokken induzieren eine AIF-spezifische DNS-Degradation in zerebralen Endothelzellen
    • 3.4.2 Beim endothelialen Zelltod durch lebende Pneumokokken kommt es zur Freisetzung von AIF aus den Mitochondrien in das Zytosol
  • 3.5  Untersuchung der Rolle Pneumokokken-spezifischer Eigenschaften
    • 3.5.1 Kapsel- und Adhäsionseigenschaften der Pneumokokken haben keinen Einfluß auf den programmierten Zelltod zerebraler Endothelzellen
    • 3.5.2 H₂O₂ und Pneumolysin sind gemeinsam für den endothelialen Zelltod verantwortlich
    • 3.5.3 Purifiziertes Pneumolysin und H₂O₂ können jeweils einen Zelltod in zerebralen Endothelzellen auslösen
    • 3.5.4  Die Induktion des endothelialen Zelltodes durch purifiziertes Pneumolysin ist an dessen zytolytische Aktivität gebunden
• 4  DISKUSSION
  • 4.1  Pneumokokken als Auslöser von programmiertem Zelltod
  • 4.2 Nachweis des programmierten Zelltodes
  • 4.3 Fehlende Aktivierung der Caspasen
  • 4.4 Intrazelluläres Calcium und mitochondriales Membranpotential
  • 4.5 Beteiligung von Apoptosis Inducing Factor (AIF)
  • 4.6  Kapsel- und Adhärenzeigenschaften von S. pneumoniae
  • 4.7 Rolle von Wasserstoffperoxid und Pneumolysin
  • 4.8 Ausblick
• 5  ZUSAMMENFASSUNG
• LITERATURVERZEICHNIS
• Abkürzungsverzeichnis
• Danksagung
• Anhang
• Lebenslauf
• Eidesstattliche Erklärung

Tabellen

• Tabelle 1: Zusammenfassung der wichtigsten morphologischen Unterschiede zwischen apoptotischem und nekrotischem Zelltod. DNS = Desoxyribonukeinsäure
• Tabelle 2: Nukleäre Veränderungen beim AIF-induzierten Zelltod und der klassischen Apoptose im Vergleich (nach Leist, 2000). Kbp = Kilobasenpaare. DNS = Desoxyribonukleinsäure.

Bilder

• Abbildung 1: Schematische Darstellung ausgewählter Virulenzfaktoren von S. pneumoniae einschließlich ihrer Lokalisation und Funktion. H₂O₂ = Wasserstoffperoxid. CbpA = Cholin-binding protein A.
• Abbildung 2: Vereinfachte schematische Darstellung der Blut-Hirn-Schranke (nach Rubin, 1999).
• Abbildung 3: Vereinfachte schematische Darstellung des intrinsischen und extrinsischen Weges der klassischen Apoptose (nach Roy, 2000). ΔφM= Symbol für das Mitochondriale Membranpotential. APAF-1 = Apoptosis activating protease-1. Cyt c = Cytochrom c. FADD = Fas-associated death domain.
• Abbildung 4: Schematische Darstellung des Proteins Pneumolysin. Durch Punktmutation entstanden Pneumolysin-Proteine mit veränderten Eigenschaften. Bei D385N ("Komplement-") führte der Austausch von Aspartat durch Asparagin an Stelle 385 zum Verlust der Komplementaktivierung, bei W433F ("Zytolyse-") kam es durch den Austausch von Tryptophan durch Phenylalanin an Stelle 433 zu einem Verlust der zytolytischen Aktivität.
• Abbildung 5: Färbung zerebraler Endothelzellen mit Acridinorange und Ethidiumbromid nach 12-stündiger Inkubation mit S. pneumoniae (Stamm R6, 107 cfu/ml) [A], Staurosporin (1µM) [B] oder PBS (Kontrolle) [C]. Fluoreszenzmikroskop, Vergrößerung 1:400. Balken = 10 µm. Die Pfeile markieren apoptotische Körperchen.
• Abbildung 6: Elektronenmikroskopische Aufnahme zerebraler Endothelzellen nach 4-stündiger Inkubation mit Pneumokokken (R6, 107 cfu/ml) [A] oder PBS (Kontrolle) [B]. Vergrößerung 1:4400. Der Balken entspricht 1,4 µm. Die Pfeile markieren das „Blebbing“ der Kernmembran. N = Nukleus, M = Mitochondrium.
• Abbildung 7: EM-Aufnahme zerebraler Endothelzellen mit Darstellung des Chromatins. Vergrößerung 1:12.000. Der Balken entspricht einer Länge von 0,6 µm. Die Pfeile markieren die periphere Kondensation des Chromatins. N = Nukleus.
• Abbildung 8: EM-Aufnahme der Mitochondrien von Endothelzellen 4 h nach Inkubation mit Pneumokokken (Stamm R6, 107 cfu/ml) [A] oder PBS [B]. Vergrößerung 1:12000. Balken = 0,6 µm. N = Nukleus, M = Mitochondrium .Die Pfeile markieren die Mitochondrien.
• Abbildung 9: TUNEL-Färbung (Tdt mediated dUTP Nick End Labeling). Zerebrale Endothelzellen wurden 12 h mit Pneumokokken (Stamm R6, 107 cfu/ml) [A] oder PBS (Kontrolle) [B] inkubiert, mit der TUNEL-Methode gefärbt und unter einem Lichtmikroskop (Vergrößerung 1:100) betrachtet. Der Balken entspricht einer Länge von 50 µm.
• Abbildung 10: Kinetik des Zelltodes zerebraler Endothelzellen nach Inkubation mit S. pneumoniae (R6, 107 cfu/ml). Prozentuale Darstellung der lebenden Zellen (grau), der Zellen mit typischer Morphologie eines programmierten Zelltodes [Apoptose] (schwarz) und nekrotischen Zellen (weiß). Acridinorange-Ethidiumbromid-Methode. n = 9 bei 3 unabhängigen Experimenten.
• Abbildung 11: Konzentrationsabhängigkeit des Zelltodes zerebraler Endothelzellen nach Inkubation mit S. pneumoniae (106, 107, 108 cfu/ml) oder PBS (Negativkontrolle). n = 9 bei 3 unabhängigen Experimenten.
• Abbildung 12: Hemmbarkeit der Staurosporin-induzierten sowie fehlende Hemmbarkeit des Pneumokokken-induzierten Zelltodes durch den Pan-Caspase-Inhibitor zVAD-fmk (100 µM). Acridinorange-Ethidiumbromid-Methode. n = 9 bei 3 unabhängigen Experimenten. Statistische Signifikanz markiert mit * für p<0,001 (ungepaarter t-Test).
• Abbildung 13: Caspase-3-Aktivität in zerebralen Endothelzellen. Die Zellstimulation erfolgte mit Staurosporin (12 h, 1 µM), S. pneumoniae (R6, 107 cfu/ml) oder PBS (Kontrolle). n = 9 bei 3 unabhängigen Experimenten. Statistische Signifikanz markiert mit * für p<0,001 (ungepaarter t-Test).
• Abbildung 14: Aktivitäten der Caspase-8 (links) und der Caspase-9 (rechts) in zerebralen Endothelzellen. Die Zellstimulation erfolgte mit Staurosporin (12 h, 1 µM), S. pneumoniae (R6, 107 cfu/ml) oder PBS (Kontrolle). n = 9 bei 3 unabhängigen Experimenten. Statistische Signifikanz bei * für p<0,001 (ungepaarter t-Test).
• Abbildung 15: Fehlende Spaltung des Zytoskelettproteins α-Fodrin (240 kDa) in seine Caspasen-spezifischen Spaltprodukte (140 und 120 kDa). Zerebrale Endothelzellen wurden 3 und 6 h mit Staurosporin (1µM), 1, 3 und 7 h mit S. pneumoniae (R6, 107 cfu/ml) oder PBS (Kontrolle) inkubiert und ein Western-Blot mit einem Anti-α-Fodrin-Antikörper durchgeführt. KDa = Kilo-Dalton. Stauro = Staurosporin
• Abbildung 16: Kinetik des intrazellulären Calciums nach Stimulation mit lebenden Pneumokokken (R6, 107 cfu/ml). Die Messung des intrazellulären Calciumgehaltes erfolgte mit dem fluoreszierenden Farbstoff Fluo-4 AM nach verschiedenen Stimulationszeiten. n=9, aus 3 unabhängigen Experimenten.
• Abbildung 17: Hemmung der endothelialen Zelltodrate durch Präinkubation mit dem Calcium-Chelator BAPTA-AM (5 µM). 12 h Inkubation der Zellen mit R6, PBS (Kontrolle) mit oder ohne BAPTA-AM. n = 9 bei 3 unabhängigen Experimenten. Statistische Signifikanz bei * für p<0,001 (ungepaarter t-Test).
• Abbildung 18: Kinetik des mitochondrialen Membranpotentials ΔφM nach Inkubation von zerebralen Endothelzellen mit lebenden Pneumokokken (R6, 107 cfu/ml). Die Messung erfolgte mit dem Farbstoff Tetramethylrhodaminester (TMRE). n = 9, aus 3 unabhängigen Experimenten.
• Abbildung 19: Nachweis einer large scale fragmentation in 50-kbp-Fragmente. Endothelzellen wurden mit S. pneumoniae (R6, 107 cfu/ml) oder PBS (Kontrolle) inkubiert. Anschließend erfolgte eine Auftrennung der DNS mit Hilfe einer Pulsfeldgelelektrophorese. Ko=Kontrolle, M=Marker, kbp=Kilobasenpaare.
• Abbildung 20: Translokation von AIF aus den Mitochondrien in das Zytosol. Die Endothelzellen wurden mit S. pneumoniae (Stamm R6, 107 cfu/ml) oder PBS (Kontrolle) inkubiert und eine zytosolische und mitochondriale Fraktion hergestellt. Anschließend wurde ein Western Blot mit einem spezifischen Anti-AIF-Antikörper durchgeführt. Ko = Kontrolle, kDa = Kilodalton
• Abbildung 21: Kinetik des Zelltodes durch R6 (unbekapselt) und D39 (bekapselt). Zerebrale Endothelzellen wurden mit R6 (107 cfu/ml), D39 (107 cfu/ml) oder PBS (Kontrolle) inkubiert. Acridinorange-Ethidiumbromid-Methode. n = 9 bei 3 unabhängigen Experimenten.
• Abbildung 22: Rate des Zelltodes durch R6 (unbekapselter Pneumokokkenstamm) und CbpA- (Derivat von R6 mit fehlendem Choline-binding protein A). Zerebrale Endothelzellen wurden mit R6 (107 cfu/ml), CbpA- (107 cfu/ml) oder PBS (Kontrolle) für 12 h inkubiert. Acridinorange-Ethidiumbromid-Methode. n = 9 bei 3 unabhängigen Experimenten.
• Abbildung 23: Die gemeinsame Blockierung von Pneumolysin und Wasserstoffperoxid führt zur Inhibierung des S. pneumoniae-induzierten Zelltodes. Inkubation der Zellen mit D39, PlnA- (je 107 cfu/ml) oder PBS mit oder ohne Katalase (1250 U/ml) für 12 h und Färbung mit TUNEL (A-E) sowie mit Acridinorange und Ethidiumbromid (F-J). Balken = 50 µm.
• Abbildung 24: Die gemeinsame Blockierung von Pneumolysin und Wasserstoffperoxid führt zur Inhibierung des Zelltodes. 12 h Inkubation der Zellen mit D39, dem Pneumolysin-defizienten Stamm PlnA- (je 107 cfu/ml) oder PBS (Kontrolle) mit oder ohne Katalase (1250 U/ml). Acridinorange-Ethidiumbromid-Färbung. n=9 bei 3 unabhängigen Experimenten. Statistische Signifikanz bei * für p<0,001 (ungepaarter t-Test).
• Abbildung 25: Der Pneumolysin- und H₂O₂-defiziente Stamm PlnA-/SpxB- führt zur Inhibierung des endothelialen Zelltodes. 12-stündige Inkubation der Zellen mit D 39, dem Pneumolysin- und H₂O₂-defizienten Stamm PlnA-/SpxB- (je 107 cfu/ml) oder PBS (Kontrolle). Acridinorange-Ethidiumbromid-Methode. n = 9 bei 3 unabhängigen Experimenten.
• Abbildung 26: Zelltod zerebraler Endothelzellen nach Inkubation mit H₂O₂ (20-2000 µM) für 12 h. Prozentuale Darstellung der lebenden Zellen (grau), nekrotischen Zellen (weiß) und Zellen mit typischer Morphologie für programmierten Zelltod (grau). Acridinorange-Ethidiumbromid-Methode. n = 9 bei 3 unabhängigen Experimenten
• Abbildung 27: Kinetik des Zelltodes zerebraler Endothelzellen nach Stimulation mit purifiziertem Pneumolysin (0,1 µg/ml). Quantifizierung mit der Acridinorange-Ethidiumbromid-Methode. n=6, bei drei voneinander unabhängigen Experimenten.
• Abbildung 28: Vergleich der Rate des Zelltodes nach 12 h Inkubation mit unverändertem Pneumolysin (Pln wt), Zytolyse-defizientem (Pln Zyt^-) und Komplement-defizientem Pneumolysin (Pln Kompl^-). n = 9, bei drei unabhängigen Experimenten.
• Abbildung 29: Schematische Zusammenfassung der Mechanismen beim S. pneumoniae-induzierten endothelialen Zelltod. AIF = apoptosis inducing factor. H₂O₂ = Wasserstoffperoxid. BAPTA-AM (Bis-ethyleneglycol-tetraacetic acid, tetraacetoxymethyl ester) = intrazellulärer Calciumchelator. Endo G = Endonuklease G