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1  EINLEITUNG

1.1 Bakterielle Meningitis

1.1.1 Einführung

Eine frühe Beschreibung der Meningitis geht auf Hippokrates zurück. Er schreibt in De morbis:

„Wenn das Hirn unter dem Druck der Entzündung an Volumen zunimmt, gibt es Kopfschmerzen. Die Blutgefäße sind gespannt und sie klopfen. Fieber und Schauer tun sich kund, doch der Schmerz nimmt nicht ab, er lässt nur nach, wenn sich das Fieber ausbreitet. Wenn sich Wasser im Hirn bildet, entstehen heftige Schmerzen in den Schläfen und anderen Teilen des Kopfes. Die Gegend der Augen ist schmerzhaft, die Sicht verdunkelt, die Pupille deformiert. Erhebt sich der Kranke, so bekommt er Schwindelgefühle. Er erträgt weder Wind noch Licht. Diese Krankheit ist verhängnisvoll. Man kann nicht beurteilen, an welchem Tag der Tod eintritt.“ (Schreiber und Mathys, 1986).

Neben einigen typischen klinischen Symptomen – Kopfschmerzen, Fieber, Photophobie – weist Hippokrates bereits auf eine Mitbeteiligung der zerebralen Gefäße sowie auf die Bedeutung des Hirnödems hin – und nicht zuletzt auch auf die Fatalität dieser Erkrankung.

Bis Mitte des 20. Jahrhunderts endete eine bakterielle Meningitis in nahezu allen Fällen tödlich. Es ist letztlich der Antibiotikatherapie zu verdanken, daß die Letalität von fast 100 % auf 10 bis 30% gesenkt werden konnte (Durand et al., 1993; Aronin, 1998). Dennoch ist die bakterielle Meningitis heute noch eine der zehn häufigsten Infektions-assoziierten Todesursachen (Kim, 2003).

Streptococcus pneumoniae (S. pneumoniae) ist bei Erwachsenen und Kindern der häufigste und zugleich aggressivste Erreger der bakteriellen Meningitis (Schuchat et al., 1997; Aronin et al., 1998; de Gans und Beek, 2002). Nicht nur die Letalität ist bei der Pneumokokkenmeningitis mit 28% bis 34% höher als bei den anderen Erregern, auch bezüglich bleibender Schäden sind Patienten mit Pneumokokkenmeningitis häufig schwerer betroffen (Pfister et al., 1993; Schuchat et al., 1997; de Gans und Beek, 2002). Bis zu 54% der Überlebenden behalten Spätschäden mit zum Teil schwersten neurologischen und neuropsychologischen Defiziten zurück (Kragsbjerg et al., 1994; Aronin et al., 1998).

Diese vergleichsweise schlechte Prognose steht im Gegensatz zur raschen Entwicklung potenter Antibiotika und intensivmedizinischer Therapiemöglichkeiten. Die Gründe dafür werden kontrovers diskutiert.


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Von Bedeutung ist einerseits, daß in den letzten Jahren eine zunehmende Antibiotikaresistenz bei S. pneumoniae beobachtet wurde. Beispielsweise haben sich die Resistenzraten gegenüber Penicillin in Nordamerika von unter 0,02% im Jahre 1987 auf 3 % im Jahre 1994 und über 30% in manchen Kommunen der USA vervielfacht (Breiman et al., 1998).

Es ist davon auszugehen, daß Bakterien durch diese fulminante Resistenzentwicklung (Stanek und Mufson, 1999) trotz antibiotischer Therapie länger im Körper des Patienten überleben werden und daher bakterielle Toxine, die von diesen prokaryonten Organismen freigesetzt werden, von größter Bedeutung sind (Fiore et al., 2000; McCullers et al., 2000).

Zusätzlich führt gerade die Antibiotikatherapie zu einer massiven Freisetzung von Zellwandbestandteilen von S. pneumoniae, die durch die Initiation einer Inflammationskaskade für einen großen Teil der Schädigung verantwortlich gemacht werden (Tomasz, 1989; Tuomanen et al., 1985).

Aus diesem Grunde wäre es wichtig, neben der Antibiotikatherapie über weitere, adjuvante Behandlungsmöglichkeiten zu verfügen. Diese sollten eine spezifischere Wirkung aufweisen als Kortikoide, die heute schon in klinischen Studien bei der bakteriellen Meningitis eingesetzt worden sind (de Gans und Beek, 2002; Molyneux et al., 2002).

Hierfür ist ein tieferes Wissen über den Pathomechanismus der bakteriellen Meningitis notwendig. Im Mittelpunkt dabei steht die Blut-Hirn-Schranke, deren Schädigung ein zentrales Ereignis im Rahmen einer Meningitis ist und zu den typischen Veränderungen, wie Hirnödem, Einwanderung von Leukozyten und Erhöhung der Proteinkonzentrationen im Liquor führt (Pfister et al., 1994). Die daraus resultierende intrazerebrale Drucksteigerung wird neben möglicher direkter Effekte von S. pneumoniae auf die Neuronen (Braun et al., 1999) für die permanenten Schäden des Gehirns verantwortlich gemacht (Pfister et al., 1994; Durand et al., 1993).

Neben der bereits nachgewiesenen Schädigung der Blut-Hirn-Schranke durch inflammatorische Prozesse könnten auch noch direkte, von den Bakterien selbst ausgehende Mechanismen bei der Pathogenese eine Rolle spielen.

Deshalb werden in der vorgelegten Arbeit die Effekte lebender Pneumokokken und deren Toxine auf zerebrale Endothelzellen, dem zellulären Hauptbestandteil der Blut-Hirn-Schranke, untersucht.

Es ging insbesondere um die Frage, ob der programmierte Zelltod (Apoptose) dabei von Bedeutung ist, da ein programmierter Ablauf des Zelltodes auch immer die Möglichkeit der Hemmung und damit eine potentielle Entwicklung von Therapeutika beinhaltet.


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1.1.2  Pathogenese und Pathophysiologie der Pneumokokkenmeningitis

Die Übertragung von Pneumokokken erfolgt aerogen und führt zunächst zu einer Besiedelung des Nasen-Rachen-Raumes. Eine asymptomatische Kolonisierung kommt bei bis zu 40% gesunder Erwachsener und Kinder vor (Gray et al., 1986).

Durch eine kontinuierliche Ausbreitung können typische Infektionen, wie Sinusitis, Otitis media, ambulant erworbene Pneumonie und akute Exazerbation einer chronischen Bronchitis entstehen. Infektionen des ZNS und sehr selten auch der Gelenke, der Herzklappen, der Peritonealhöhle und des Knochensystems werden dagegen meist durch eine hämatogene Ausbreitung verursacht. Das Risiko, an einer Infektion durch S. pneumoniae zu erkranken, ist durch eine geschwächte Abwehrlage des Organismus erhöht, z.B. bei Milzdysfunktionen, Zustand nach Splenektomie, Alkoholismus, Herzinsuffizienz, Neoplasien und den verschiedenen Immundefizienzsyndromen, einschließlich AIDS (Bruyn et al., 1991; Turett et al., 2001).

Ausgangspunkt für eine Pneumokokkenmeningitis ist in der Regel eine Kolonisierung des Nasopharynx durch den Erreger. Dafür sind bestimmte bakterielle Oberflächenproteine verantwortlich, die die Interaktion mit der Wirtszelle erleichtern. S. pneumoniae besitzt über 500 Oberflächenproteine (Wizemann et al., 2001), wobei die Beteiligung einiger dieser Proteine bereits gezeigt werden konnte (Koedel et al., 2002).

Begünstigt durch Schleimhautdefekte, z.B. als Folge von Virusinfektionen oder Austrocknung, kann es dem Bakterium gelingen, die Mukosa zu durchdringen und eine Bakteriämie auszulösen. Danach muß S. pneumoniae weitere Abwehrmechanismen des Wirtes überstehen, um im Blutstrom zu überleben und anschließend die Blut-Hirn-Schranke zu überqueren. Die Polysaccharidkapsel ist dafür ein wesentliches Virulenzmerkmal, da sie die Aktivierung des alternativen Komplementsystems und des Komplementfaktors C3b an Phagozyten verhindert (Morona et al., 2000). Nach Übertritt über die Blut-Hirn-Schranke kommt es bei weitgehend fehlenden Abwehrmechanismen zu einer Vermehrung der Pneumokokken und zur Freisetzung von Zellwandbestandteilen, die einwandernde Leukozyten aktivieren, die Freisetzung von proinflammatorischen Zytokinen induzieren und so zu einer Zunahme der Entzündung und Veränderung der Gefäßdurchlässigkeit beitragen (van Furth et al., 1996).

Über einen Zeitraum von einigen Stunden werden nun Räume zwischen den zerebralen Endothelzellen geöffnet, Leukozyten wandern ein und die zytochemischen Parameter des Liquors verändern sich (Tuomanen et al., 1985). Die fortschreitende Störung der Blut-Hirn-Schranke fördert die Entstehung eines Hirnödems, das über einen erhöhten intrakraniellen Druck und gleichzeitigen Verlust der Autoregulation des zerebralen Blutflusses zur Ischämie führt (Pfister et al., 1994). Eine Kombination von bakteriellen Faktoren und inflammatorischen [Seite 4↓]Mediatoren bewirkt nun nicht nur die Schädigung von Haarzellen des Innenohrs und damit die häufig auftretenden Hörstörungen nach Pneumokokkenmeningitis, sondern auch eine Schädigung des Gehirns. Hier ist insbesondere der Gyrus dentatus des Hippocampus betroffen, eine Gehirnstruktur, die für das Lernen und das Gedächtnis von Bedeutung ist. Im Tiermodell konnte gezeigt werden, daß das Ausmaß der Schädigung in dieser Region mit dem Ausmaß der Lernstörung korreliert. Damit könnte dieser spezielle Hirnschaden nach Meningitis möglicherweise für die vor allem bei Kindern auftretenden Lern- und Intelligenzstörungen verantwortlich sein (Loeffler et al., 2001a).

1.2 Virulenzfaktoren von S. pneumoniae

S. pneumoniae ist ein 1-3 μm langes, in Diplokokkenform wachsendes, grampositives Bakterium, das zur Gruppe der α-hämolysierenden Streptokokken gehört.

Es besitzt eine Vielzahl von gut charakterisierten Virulenzmerkmalen. Wie in Abbildung 1 schematisch dargestellt, gehören zu ihnen neben der schon erwähnten externen Polysaccharidkapsel bestimmte Oberflächenproteine, z.B. Autolysin und das Choline-binding proteine A (CbpA) sowie intrazelluläre Toxine, wie Pneumolysin und Wasserstoffperoxid (H2O2) (Mitchell, 2000).

Abbildung 1: Schematische Darstellung ausgewählter Virulenzfaktoren von S. pneumoniae einschließlich ihrer Lokalisation und Funktion. H2O2 = Wasserstoffperoxid. CbpA = Cholin-binding protein A.


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1.2.1  Autolysin

Autolysin ist ein Enzym, das an der Kapsel lokalisiert und normalerweise inaktiv ist. Kommt es jedoch zum Abbruch der Zellwandbiosynthese z.B. bei Behandlung mit Penizillinen oder Fehlen von Nährstoffen, wird Autolysin aktiviert und die Bakterienzelle lysiert (Mitchell, 2000). Dadurch werden Zellwandprodukte und intrazelluläre Toxine wie Pneumolysin freigesetzt. Dies ist der Grund dafür, daß in Tiermodellen Autolysin-negative Mutanten von S. pneumoniae eine deutlich herabgesetzte Virulenz zeigen (Mitchell, 2000).

1.2.2 CbpA

Das Choline-binding protein A (CbpA) ist für die Adhärenz von S. pneumoniae an Wirtszellen mitverantwortlich. Es ist in der Lage, ein Brückenelement zwischen Zytokin-aktivierten humanen Zellen und bestimmten Bestandteilen der Pneumokokkenzellwand zu bilden (Jedrzejas, 2001). Dadurch und aus Experimenten mit CbpA-negativen Pneumokokken ist bekannt, daß dieses Oberflächenprotein für die Kolonisation von Pneumokokken im Nasopharynx und für deren Invasion wichtig ist (Mitchell, 2000; Jedrzejas, 2001). Außerdem wurde nachgewiesen, daß CbpAsektretorisches IgA binden kann, so daß neben der Adhärenzfunktion auch eine inhibitorische Wirkung gegen IgA vermutet wird (Mitchell, 2000).

1.2.3 Wasserstoffperoxid (H2O2)

S. pneumoniae ist das einzige Bakterium unter den Erregern der bakteriellen Meningitis, dem das wichtige Wasserstoffperoxid-abbauende Enzym Katalase fehlt. Es bildet deshalb hohe H2O2-Konzentrationen, etwa mit der von neutrophilen Granulozyten vergleichbar, von denen bekannt ist, daß sie H2O2 als Zytotoxin einsetzen (Braun et al., 2002; Duane et al., 1993). In Pneumokokken-Pneumonie-Modellen konnte bereits die pathogenetische Bedeutung des freigesetzten H2O2 für alveoläre Epithelzellen und den Zilienschlag des respiratorischen Epithels nachgewiesen werden (Duane et al., 1993; Hirst et al., 2000). Es wird vermutet, daß H2O2 von der bakteriellen Membran in die Wirtszelle diffundieren und dort über einen oxidativen Schaden Apoptose induzieren kann (Cochrane, 1991; Chandra et al., 2000).


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1.2.4  Pneumolysin

Pneumolysin ist ein Toxin, das im Zytoplasma von S. pneumoniae lokalisiert ist (Paton et al., 1983). Durch das Fehlen einer sekretorischen Signalsequenz, wird Pneumolysin nicht aktiv vom Bakterium sezerniert, sondern erst nach Autolyse des Bakterium durch das schon oben beschriebene Enzym Autolysin entweder in einer späten Phase des Wachstums oder nach Antibiotikabehandlung passiv aus dem Zytosol freigesetzt (Cockeran et al., 2002).

Es besitzt mindestens zwei wichtige biologische Aktivitäten, die für die Virulenz wichtig sind: einerseits die Fähigkeit zur Lyse von Zellen und andererseits die Fähigkeit, das klassische Komplementsystem durch die Bindung an den Fc-Teil von IgG zu aktivieren (Mitchell, 2000).

Mit seiner zytolytischen Aktivität gehört Pneumolysin zu einer Klasse von Toxinen, den „thiol-aktivierte Zytolysinen“, die von verschiedenen grampositiven Bakterien produziert werden. Diese Zytolysine funktionieren alle in ähnlicher Weise. Zuerst kommt es zu einer Bindung des Toxins an das Cholesterol der Zielzellmembran und zu einer Insertion des Toxins zwischen die beiden Lipidschichten. Nach Zusammenlagerung von 20-80 Pneumolysin-Molekülen bildet sich eine Pore, die die Zellmembran der Zielzelle durchdringt und damit die Zellintegrität zerstört (Bhakdi et al., 1986). Durch diese Pore wird das intrazelluläre Milieu der angegriffenen Zelle irreversibel geschädigt. Zusätzlich führt Pneumolysin zu einer Aggregation und Fusion der betroffenen Zellen (Bonev et al., 2001).

Beide Eigenschaften, die Fähigkeit zur Zell-Lyse und die zur Komplementaktivierung, sind für die Virulenz von S. pneumoniae von Bedeutung. Dies konnte in zahlreichen experimentellen Modellen gezeigt werden, indem durch Punktmutationen veränderte Varianten von Pneumolysin hergestellt wurden, denen entweder die lytische oder die Komplement-aktivierende Wirkung fehlten (Mitchell und Andrew, 1997). Genetisch verändertes Pneumolysin, dem die Fähigkeit zur Komplementaktivierung oder zur Zytolyse fehlt, wurde auch in dieser Arbeit verwendet.

1.3 Die Blut-Hirn-Schranke

1.3.1 Aufbau der Blut-Hirn-Schranke und Besonderheiten des zerebralen Endothels

Die Hauptaufgabe der Blut-Hirn-Schranke besteht in der Aufrechterhaltung und Regulation der neuronalen Umgebung. Durch sie bildet das Gehirn ein eigenes, gegenüber dem Blutstrom abgeschlossenes Kompartiment, wodurch für die Neuronen ein stabiles, von den Schwankungen der Blutzusammensetzung unabhängiges inneres Milieu geschaffen wird.


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Die Blut-Hirn-Schranke wird – wie vereinfacht in Abbildung 2 dargestellt - von einem komplexen zellulären System aus zerebralen mikrovaskulären Endothelzellen, Astroglia, Perizyten, perivaskulären Makrophagen und einer Basalmembran gebildet (Rubin und Staddon, 1999; Li et al., 2001).

Abbildung 2: Vereinfachte schematische Darstellung der Blut-Hirn-Schranke (nach Rubin, 1999).

Dabei sind die zerebralen Endothelzellen das hauptsächliche zelluläre Substrat. Sie unterscheiden sich von Endothelzellen anderer Gewebe durch drei bedeutende Aspekte: 1. durch tightjunctions mit extrem hohem elektrischen Widerstand, die die parazelluläre Permeabiltät stark begrenzen; 2. durch eine fast fehlende pinozytotische Aktivität und daher geringem transzellulären Flux und 3. durch ein spezifisches Carrier- und Transportsystem. Durch die Kombination dieser drei Faktoren wird der unspezifische Transport von Ionen, Proteinen, Zellen und Erregern in das ZNS stark eingeschränkt (Pardridge et al., 1999; Kniesel et al., 2000, Gloor et al., 2001).

Die Permeabilität der Blut-Hirn-Schranke wird außerdem von Astrozyten und deren Faktoren mitbestimmt, die Transporteigenschaften und Organisation der tight junctions regulieren (Abbott, 2002).

1.3.2 Pathophysiologie der Blut-Hirn-Schranke bei der bakteriellen Meningitis

Durch die Blut-Hirn-Schranke können neben bestimmten Stoffen und Mikroorganismen auch Blutzellen nur schwer in das ZNS gelangen. Aus diesem Grund existiert im ZNS ein besonderer [Seite 8↓]Immunstatus, der durch eine geringe Leukozyten-Präsenz, niedrige Immunglobulinkonzentration sowie mangelnde opsonierende Aktivität gekennzeichnet ist (Stahel et al., 1997). Das ZNS ist daher auch als Gebiet mit einer lokalisierten Immunschwäche bezeichnet worden (Koedel et al., 2002).

Bei der bakteriellen Meningitis stellt der Zusammenbruch der Blut-Hirn-Schranke ein elementares Ereignis der Pathogenese dar. Es kommt plötzlich zu einem Übertritt von höhermolekularen Plasmabestandteilen und einem Verlust der zerebrovaskulären Autoregulation, die unter normalen Umständen einen konstanten zerebralen Perfusionsdruck gewährleistet. Dies führt zur Erhöhung des intrazerebrales Blutvolumen und zur Entwicklung eines Hirnödems. Klinisch kommt dies durch einen Anstieg des Hirndrucks und durch eine sogenannte Schrankenstörung, also einer Erhöhung der Proteinkonzentration im Liquor zum Ausdruck. Was sind die Mechanismen des Zusammenbruchs und wie kann es überhaupt zum Überschreiten von Bakterien über die Endothelzellen mit tightjunctions kommen?

Zwar ist bekannt, daß eine hochgradige Bakteriämie Voraussetzung dafür ist, damit Mikroorganismen in den Subarachnoialraum übertreten können (Tuomanen et al., 1996), jedoch ist der präzise Eintrittsort der Meningitiserreger in den Liquor noch immer weitgehend unklar. Für S. pneumoniae existieren viele Hinweise, daß die Invasion in das Gehirn über das zerebrale Endothel - und nicht über das choroidale Ependym - erfolgt (Koedel et al., 2002). Deshalb wurden in dieser Arbeit zerebrale mikrovaskuläre Endothelzellen als Zellkulturmodell der Blut-Hirn-Schranke bei Pneumokokkenmeningitis eingesetzt.

Wie genau S. pneumoniae die Blut-Hirn-Schranke überwindet, ist unzureichend bekannt. Es wird spekuliert, daß das Bakterium mehrere Strategien benutzen könnte: 1. Transport durch die Endothelzellen durch aktive oder passive Transzytose; 2. Überqueren der Barriere zusammen mit oder im Inneren von Leukozyten und 3. parazelluläre Passage durch Sprengung der tightjunctions und/oder Schädigung des Endothels (Tuomanen et al., 1996).

Die tatsächliche Relevanz einiger dieser Mechanismen konnte bereits nachgewiesen werden.

So kann S. pneumoniae durch intakte Endothelzellen (der ersten Strategie entsprechend) transportiert werden (Ring et al., 1998). Nach Anlagerung der Bakterien an die Zelloberfläche durch verschiedene Glukokonjugate (Cundell et al., 1994), werden die Endothelzellen aktiviert. Dabei werden Platelet-activating-factor-(PAF)-Rezeptoren an der Oberfläche der Endothelzellen verstärkt exprimiert, die wiederum Phosphorylcholin der Pneumokokkenzellwand binden [Seite 9↓] (Cundell et al., 1995). Nach dieser Interaktion kommt es zur schnellen Internalisierung des Rezeptors. Hierdurch gelangen die Pneumokokken zusammen mit den PAF-Rezeptoren in die Vakuolen der Zelle, wo sie sterben oder durch die Zelle transportiert werden (Ring et al., 1998).

Die zweite beschriebene Strategie trifft insbesondere für intrazellulären Bakterien, wie Mycobacterium tuberculosis und Listeria monocytogenes zu. Sie können in die Meningen eindringen, indem sie infizierte Leukozyten als „Trojanisches Pferd“ verwenden (Drevets und Leenen, 2000). Diese Strategie scheint jedoch bei Pneumokokken nur von untergeordneter Bedeutung zu sein.

Bei Pneumokokkenmeningitis kommt es, wie in der dritten Strategie vermutet, zu Veränderungen der tightjunctions, was zum Teil auf die Freisetzung proinflammatorischer Zytokine, wie Interleukin 6 und 1 sowie TNFα, zurückgeführt wird (Wispelwey et al., 1988). Im Liquor von Patienten mit einer Pneumokokkenmeningitis sind diese Zytokine erhöht (Täuber et al., 1999). Die Liquorkonzentration von TNFα korreliert mit der Schwere der Schädigung der Blut-Hirn-Schranke (Sharief et al., 1992). In experimentellen Meningitis-Modellen konnte zudem gezeigt werden, daß auch die alleinige Injektion von TNFα zu einer schnellen Zunahme der Permeabilität der Blut-Hirn-Schranke führt (Kim et al., 1992). Umgekehrt kann in einem in-vivo-Modell einer hämatogenen Pneumokokkenmeningitis durch die Blockade von TNFα mit einem neutralisierenden Antikörper die Störung der Blut-Hirn-Schranke und die Invasion von S. pneumoniae in das Gehirn verringert werden (Tsao et al,. 2002). Wahrscheinlich tragen unterschiedliche Mechanismen zur Wirkung von TNFα bei, wobei u.a. Metalloproteinasen, Adhäsionsmoleküle, NO-Produktion und der Cyclooxygenase-Signalweg eine Rolle spielen (Mayhan, 2002).

Interessant ist in diesem Zusammenhang, daß neben den Immunzellen auch die Endothelzellen selbst zur inflammatorischen Immunantwort durch die Bildung von TNFα beitragen (Freyer et al., 1999). Ob zerebrale Endothelzellen allerdings von Pneumokokken bzw. ihren Bestandteilen nur aktiviert werden oder ob es auch zu einer Zellschädigung kommt, wurde bisher nicht genauer untersucht. Das Bakterium wäre damit nicht nur durch die Initiation einer Inflammationskaskade, sondern ganz direkt durch zytotoxische Mechanismen an der Destruktion der Blut-Hirn-Schranke beteiligt.


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1.4  Apoptose - Der programmierte Zelltod

1.4.1 Biologisches Phänomen

Vielzellige Lebewesen sind darauf angewiesen, überschüssige und gefährliche Zellen beseitigen zu können. Dies trifft in besonderer Weise auf den Menschen zu, dessen komplex aufgebauter Organismus nur mit Hilfe einer Homöostase zwischen Zellproliferation und Zelltod Bestand haben kann. Dies wird eindrucksvoll durch die Rechnung illustriert, daß ein 80 Jahre alter Mensch ohne die Balance zwischen Zellteilung und natürlicher Absterberate der Zellen zwei Tonnen Knochenmark und Lymphknotengewebe sowie einen 16 km langen Darm hätte (Melino, 2001). Aus diesem Grund entstand früh in der evolutionären Entwicklung ein genetisch verankertes Programm des natürlichen Zelltodes, auch „Programmierter Zelltod“ genannt.

John Kerr beobachtete in den frühen siebziger Jahren mit Hilfe von elektronenmikroskopischen Untersuchungen, daß es bei bestimmten Formen des Zelltodes zu einem geordneten Untergang der Zelle kommt, bei dem die intakten Zellorganellen in Membranvesikel eingeschnürt werden und die sterbende Zelle schließlich von Phagozyten inkorporiert und abgebaut wird (Kerr et al., 1972). Er schlug eine Einteilung des Zelltodes in zwei große Kategorien vor. Entsprechend diesem Vorschlag wurde der Begriff Necrosis, der bis zu diesem Zeitpunkt für alle Formen des Zelltodes benutzt worden war, neu definiert und nur für solche Ereignisse verwendet, die „gewalttätig sind und rapide zu einem Kollaps der inneren Homöostase führen“ (Kerr et al., 1972). Der Begriff Apoptosis wurde geprägt, um eine Kategorie des Zelltodes zu beschreiben, die „eine ergänzende aber gegensätzliche Rolle zur Mitose in einer Zellpopulation spielt und deren morphologische Merkmale für ein aktives, vererbtes Phänomen spricht, das durch verschiedene, sowohl physiologische als auch pathologische Stimuli der Umwelt ausgelöst und inhibiert werden kann“ (Kerr et al., 1972). Apoptosis, abgeleitet von apo (ab, weg, los) und ptosis (Senkung, Fallen), sollte die Ähnlichkeit des programmierten Zelltodes mit dem Abfallen der Blätter eines Baumes verdeutlichen, da nur einzelne Zellen eines Zellverbandes zu Grunde gehen.

1.4.2 Die Bedeutung des Programmierten Zelltodes

Seit Kerrs Entdeckung wurden apoptotische Zelluntergänge für eine ganze Reihe physiologischer Mechanismen beschrieben. Zu diesen gehören beispielsweise die Modellierung [Seite 11↓]der Organe und Entstehung der Finger- und Zehenzwischenräume während der Embryogenese oder die Zellmauserung von Geweben mit hohem Zellumsatz (Renehan et al., 2001).

Eine weitere wichtige Funktion der Apoptose besteht in der Entsorgung geschädigter Zellen. Dabei ist eine Kontrolle der Apoptose wichtig, da einerseits eine übersteigerte apoptotische Antwort das Risiko von degenerativen Erkrankungen und andererseits eine zu geringe Sensitivität gegenüber apoptotischen Stimuli das Risiko von malignen Neubildungen erhöhen würde. Fehler in der Apoptoseregulation spielen daher eine wesentliche Rolle in der Pathogenese von Krankheiten (Renehan et al., 2001). Zu den Krankheiten, für die eine erhöhte Apoptoserate charakteristisch ist, zählen AIDS, neurodegenerative Krankheiten (Morbus Alzheimer, Morbus Parkinson, Amyotrophe Lateralsklerose) und ischämische Ereignisse (Herzinfarkt oder Schlaganfall). Andere Erkrankungen sind mit einer verminderten Apoptose assoziiert. Hierzu gehören Virusinfektionen sowie Autoimmun- und Tumorerkrankungen (Renehan et al., 2001; Hotchkiss et al., 2002).

1.4.3 Morphologische Kennzeichen

Die Unterscheidung der beiden Formen des Zelltodes - Apoptose und Nekrose – erfolgt durch morphologische und biochemische Kriterien. Apoptose ist nach dieser Definition ein Vorgang, der morphologisch mit einer Schrumpfung (Pyknosis) und Fragmentierung (Karyorrhexis) des Zellkernes, Veränderungen und Blasenbildung der Membranen (Membran-Blebbing) und der Bildung von so genannten apoptotischen Körperchen (membranumschlossene Vesikel) verbunden ist (Wyllie, 1997). Durch das letztgenannte Merkmal bleibt eine Inflammationsantwort aus, da die Zellfragmente umhüllt bleiben und durch Makrophagen und benachbarten Zellen rasch abgebaut werden können. Die beschriebenen Prozesse sind energieabhängig. Lange vor dem Abschluß dieser Prozesse werden spezifische Phagozytosesignale auf der Zelloberfläche exprimiert (Savill et al., 2000; Strasser et al., 2000). Diese entstehen in eukaryonten Zellen durch die Externalisierung von Phosphatidylserin in der Membran-Doppelschicht (Fadok et al., 1992).

Nekrose ist dagegen durch ein Anschwellen der Zelle und des Zellkernes, durch eine wahllose, ungeordnete Degradation des Chromatins und durch den frühen Verlust der Membranintegrität gekennzeichnet. Frühe Phagozytosesignale fehlen und durch die Lyse der Zelle mit Freisetzung von Zellbestandteilen wird eine entzündliche Reaktion ausgelöst (Haslett, 1992). Insgesamt handelt es sich um ein akzidentielles Ereignis, das nur durch die Aufhebung des auslösenden pathologischen Stimulus` verhindert werden kann (Leist und Jäättelä, 2001).


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Tabelle 1: Zusammenfassung der wichtigsten morphologischen Unterschiede zwischen apoptotischem und nekrotischem Zelltod. DNS = Desoxyribonukeinsäure

Morphologisches Merkmal

Apoptose

Nekrose

Membranöse Vesikel

+

-

Kondensation des Chromatins

+

-

DNS-Fragmentierung

+

-

Membran-Blebbing

+

-

Zytoplasmatische Vakuolen

-

+

Anschwellen der Zelle

-

+

   

1.4.4 Ablauf der Apoptose

Die zur Apoptose erforderlichen Proteine sind in jeder Körperzelle vorhanden. Eine spontane, unkontrolliert ausgelöste Apoptose wird dadurch verhindert, daß diese Proteine entweder als inaktive Vorstufen vorliegen oder sich in abgeschlossenen Zellorganellen befinden, wo sie nicht wirksam werden können. Die Auslösung der Apoptose erfolgt durch spezifische Stimuli, wobei der zeitliche Ablauf schematisch in drei nacheinander ablaufende Schritte eingeteilt werden kann: Induktions-, Regulations- und Terminationsphase. Zunächst soll die gemeinsame Endstrecke aller Apoptosewege, die Terminationsphase, besprochen werden.

1.4.4.1 Termination der Apoptose

Die Apoptose endet in den bereits aufgelisteten morphologischen Veränderungen der Zelle (s. Tabelle 1). Diese werden durch spezifische Enzyme hervorgerufen, die Cystein-Aspartat-Proteasen (Caspasen) genannt werden. Jede Säugetierzelle enthält eine ganze Anzahl von Caspasen. Insgesamt sind 14 verschiedene Caspasen identifiziert worden, zu denen 12 humane Homologe bekannt sind (Nicholson, 1999; Earnshaw, 1999; Nicholson 2000). Sie sind auch deshalb interessant, weil die Möglichkeit ihrer Inhibierung ein wichtiger Ansatzpunkt in der Entwicklung neuer Medikamente ist, die sich zum Teil bereits im Stadium der vorklinischen und klinischen Erprobung befinden (Nicholson, 2000).

Bis zu ihrer Aktivierung liegen die Caspasen als ungespaltene Proenzyme in der Zelle vor. Durch proteolytische Prozesse können sie aktiviert werden.


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Funktionell unterteilen sich die Caspasen in zwei große Familien. Die erste besteht aus Mitgliedern, die mit Caspase-1 verwandt sind. Dies ist eine Caspase, die auch ICE (Interleukin-1β-Converting enzyme) genannt wird, weil sie für die proteolytische Reifung des proinflammatorischen Zytokins Interleukin-1β eine Rolle spielt (Thornberry, 1992; Cerretti, 1992). Neben Caspase-1 sind dies Caspase-4 und -5. Ihre Funktion besteht zum überwiegenden Teil, wenn nicht sogar ausschließlich, aus der Prozessierung von Zytokinen.

Die andere Familie ist an der Regulation und Ausführung von Apoptose beteiligt. Sie lässt sich in die Initiator-Caspasen (z.B. Caspase-8, -9 und -10), die auf proapoptotische Stimuli reagieren und in die Effektor-Caspasen (z.B. Caspase-3, -6 und -7) unterteilen.

Die letztgenannten führen durch die Spaltung von über 100 zellulären Proteinen zu den für die Apoptose typischen Veränderungen der Zelle (Nicholson, 2000). Eine wichtige Substratgruppe der Caspasen sind dabei Zytoskelettproteine, zu denen zum Beispiel Aktin (Mashima, 1997), Gelsolin (Kamada, 1998) und α-Fodrin (Martin, 1996) gehören.

Auch die morphologischen Veränderungen des Zellkernes mit der typischen Kondensation und Fragmentation des Chromatins sind an eine Aktivierung der Caspasen gekoppelt. Durch die Caspasen-abhängige Desoxyribonuklease (CAD) wird die DNS zwischen den Nukleosomen spezifisch gespalten, so daß 180 Basenpaare (bp) umfassende Fragmente entstehen, die bei Auftrennung in einem Agarosegel zum Bild einer Apoptoseleiter führen (Sakahira, 1998). Dieses, auch als Stadium II bezeichnete Endstadium der nukleären Apoptose ist durch eine sehr kompakte Kondensation des Chromatins ohne (IIa) oder mit (IIb) Bildung apoptotischer Körperchen gekennzeichnet (Loeffler et al., 2001b; Daugas et al., 2000). Ihr voran geht das Stadium I der nukleären Apoptose, für das eine periphere Chromatinkondensation sowie eine Spaltung der DNS in größere 50 kbp-Fragmente charakteristisch ist. Im Gegensatz zum Stadium II ist Stadium I ein von Caspasen unabhängiger Prozeß, der an eine Translokation des mitochondrialen Proteins apoptosis inducing factor (AIF) in den Kern gebunden ist (Daugas et al., 2000).

1.4.4.2 Induktion und Regulation der Apoptose

Zwei große Regulationswege können zur Induktion der Apoptose führen: ein extrinsischer Weg durch so genannte Todesrezeptoren und ein intrinsischer Weg, bei dem das Mitochondrium die zentrale Rolle spielt (Roy und Nicholson, 2000) [s. Abbildung 3].


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Abbildung 3: Vereinfachte schematische Darstellung des intrinsischen und extrinsischen Weges der klassischen Apoptose (nach Roy, 2000). ΔφM= Symbol für das Mitochondriale Membranpotential. APAF-1 = Apoptosis activating protease-1. Cyt c = Cytochrom c. FADD = Fas-associated death domain.

Die intrinsische Signaltransduktion wird durch sehr unterschiedliche Stimuli, wie Sauerstoffradikale, Strahlung und Chemotherapeutika in Gang gesetzt (Hotchkiss et al., 2002). Eigentlicher Auslöser der Apoptose ist das Mitochondrium, das hierbei als allgemeiner Schadenssensor und Monitor des metabolischen Zustandes der Zelle fungiert. Nach der Freisetzung eines proapoptotischen Proteins (Cytochrom c) aus dem Mitochondrium, wird der Zelltod durch die Bildung eines makromolekularen Komplexes (Apoptosom) initiiert, indem durch die proteolytische Funktion eines in diesem Komplex enthaltenen Enzyms (APAF-1) Caspase-9 aktiviert wird (Green, 2000).

Der zweite, extrinsische Weg leitet Signale von extrazellulären Todes-Liganden, die meist zur TNF-Superfamilie gehören (z.B. TNFα und Fas-Ligand), weiter. Durch Bindung dieser Liganden an vorbestehende Rezeptorkomplexe wird letztlich die Aktivierung von Caspase-8 durch ein spezielles Adaptermolekül (Fas-associated death domain [FADD]) eingeleitet (Siegel et al., 2000).

Sowohl Caspase-8 des extrinsischen Weges als auch Caspase-9, die durch den intrinsischen Weg aktiviert wird, können nun in einem gemeinsamen Endweg die bereits erwähnten Effektor-[Seite 15↓] Caspasen (Caspase-3/7) aktivieren und so die endgültige Exekution der klassischen Apoptose bewirken (Roy und Nicholson, 2000).

1.4.5  Caspasen-unabhängiger programmierter Zelltod

Neuere Erkenntnisse haben zu einer Lockerung der beschriebenen strikten Trennung zwischen Apoptose und Nekrose geführt. Es gibt verschiedene Argumente, die dafür sprechen, daß neben der klassischen (Caspasen-abhängigen) Apoptose auch andere Varianten des programmierten Zelltodes existieren, die mit ihr neben einigen wichtigen morphologischen Kriterien eben auch den programmierten Ablauf und damit die potentielle Hemmbarkeit gemeinsam haben.

So zeigte sich, daß verschiedene Zellen nach einer Aktivierung von proapoptotischen Caspasen überleben (Wright et al., 1997; Jäättelä et al., 1998; Foghsgaard et al., 2001). Auch konnten in einem bestimmten Apoptosemodell typische Apoptosemerkmale wie Chromatinkondensation und Membran-Blebbing durch eine Blockierung von Caspasen nicht vollständig verhindert werden (Xiang et al., 1996). In anderen Modellen konnte nachgewiesen werden, daß für einen programmierten Zelltod mit klaren morphologischen Kriterien der Apoptose eine Aktivierung von Caspasen nicht unbedingt nötig ist (Joza et al., 2001). Zudem scheint auch die rasche Entsorgung der Reste der sterbenden Zelle nicht von einer Aktivierung der Caspasen abhängig zu sein (Chung et al., 2000; Hirt et al., 2000).

Die genannten Gründe machen eine differenziertere Definition des Zelltodes nötig, in der der Begriff „Programmierter Zelltod“ nicht mit „Klassischer Apoptose“ und mit der Aktivierung von Caspasen gleichgesetzt wird, sondern vielmehr auf der Morphologie und dem Schicksal der sterbenden Zellen basiert. Dies soll auch in der vorliegenden Arbeit berücksichtigt werden.

1.4.6 Mechanismen des Caspasen-unabhängigen programmierten Zelltodes

Während die molekularen Mechanismen der klassischen Apoptose in den letzten Jahren bis ins Detail erforscht wurden, ist bei den meisten alternativen Wegen des programmierten Zelltodes meist nur wenig bekannt, was über morphologische Kriterien hinausgeht.

Man weiß jedoch, daß ähnlich wie bei der klassischen Apoptose bestimmte Proteasen - vergleichbar den Caspasen - eine Rolle spielen und daß der alternative Zelltod analog zum oben beschriebenen extrinsischen und intrinsischen Weg der klassischen Apoptose durch Todesrezeptoren oder mitochondriale Veränderungen ausgelöst werden kann (Leist und Jäättelä, 2001).


[Seite 16↓]

Ein in den letzten Jahren verstärkt untersuchtes Protein, der bereits erwähnte apoptosis inducing factor (AIF), ist an der Regulation eines großen Teils der publizierten Formen des Caspasen-unabhängigen Zelltodes beteiligt. Aus diesem Grund soll es im folgenden Abschnitt näher vorgestellt werden.

1.4.6.1  AIF

AIF nimmt in der intakten Zelle wahrscheinlich zwei wichtige Funktionen wahr. Zum einen ist dieses Protein ein Radikalfänger, der in der Lage ist, Wasserstoffperoxid abzubauen (Klein et al., 2002) und zum anderen wird eine Funktion in der Atmungskette als Redoxpartner von NADH diskutiert (Mate et al., 2002).

Neben diesen Funktionen in der lebenden Zelle ist das 57 kDa große Protein auch an der Regulation des Caspasen-unabhängigen Zelltodes beteiligt.

So konnte gezeigt werden, daß AIF in einem bestimmten Modell die frühe Phase der Apoptose kontrolliert und alle morphologischen Merkmale der Apoptose durch die Ausschaltung von AIF verhindert werden können (Joza et al,. 2001). Zur Erlangung der vollen Funktion wird es aus dem Mitochondrium in das Zytosol freigesetzt und in den Zellkern transloziert. Hier induziert AIF eine Spaltung des Chromatins in große (50 kbp-) Fragmente sowie eine periphere Chromatinkondensation, und damit eine Veränderung und Kondensation des Zellkerns, die für den alternativen programmierten Zelltod typisch sind und dem nukleären Apoptosestadium I entsprechen (van Gurp et al., 2003). Die Spaltung der DNS in kleine oligonukleosomale 180 bp-Fragmente und eine kompaktere Chromatinkondensation ist, wie bereits erwähnt, typisch für die klassische Apoptose und eine Aktivierung von Caspasen (Susin et al., 1999). Dieser Unterschied drückt sich in der Form des Chromatins aus: durch AIF lagert sich das Chromatin peripher am Kern an, bei der klassischen Apoptose dagegen entstehen kleine kompakte Chromatinstrukturen (s. Tabelle 2).

Wie AIF genau in der Lage ist, DNS zu degradieren, ist unbekannt, denn das Protein selbst besitzt keine intrinsische Nuklease-Aktivität (Miramar et al., 2001; van Gurp et al., 2003). Es gibt jedoch Hinweise, daß AIF mit der Endonuclease G, einem weiteren mitochondrialen Protein, das unabhängig von Caspasen DNS degradieren kann, interagiert (Wang et al., 2002; Hansen und Nagley, 2003).

Neben den Veränderungen des Kernes löst AIF auch weitere, für den apoptotischen Zelltod typische Veränderungen in der Zelle aus, wie die Exposition des Phagozytosesignals [Seite 17↓] Phosphatidylserin an der Zelloberfläche oder den Verlust des mitochondrialen Membranpotentials (Ravagnan et al., 2002; van Gurp et al., 2003).

Insbesondere für neuronale Systeme, zum Beispiel bei traumatischem Hirnschaden (Zhang et al., 2002), zerebraler Ischämie (Zhu et al., 2003) sowie interessanterweise bei Pneumokokkeninfektion (Braun et al., 2001) konnte nachgewiesen werden, daß AIF als wichtigster auslösender Faktor ohne jegliche Aktivierung von Caspasen zum programmierten Zelltod führt. Dabei konnte der induzierte Zelltod durch eine Inhibierung von AIF komplett blockiert werden.

Für den Zelltod zerebraler Endothelzellen wurde bisher nicht gezeigt, daß AIF ein entscheidender oder alleiniger Auslöser von Zelltod sein könnte, so daß dies ein neuer Ansatz wäre, der in der vorliegenden Arbeit untersucht werden soll.

Tabelle 2: Nukleäre Veränderungen beim AIF-induzierten Zelltod und der klassischen Apoptose im Vergleich (nach Leist, 2000). Kbp = Kilobasenpaare. DNS = Desoxyribonukleinsäure.

 

 

Lebende

Zellen

 

AIF-induzierter Zelltod

 

 

Klassische

Apoptose

DNS-Fragmentierung

keine

große

50–kbp-Fragmente

oligonukleosomale 180-bp-Fragmente

Chromatin

homogene Verteilung

periphere Kondensation

(=Stadium I)

kompakte Kondensation,

(=Stadium II)

Kernmorphologie

(Elektronen-mikroskopie)


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1.5  Zielsetzung der Arbeit

Die Schädigung der Blut-Hirn-Schranke ist ein wichtiges Ereignis in der Pathophysiologie der bakteriellen Meningitis, da das entstehende Hirnödem und die intrazerebrale Drucksteigerung für die immer noch hohe Letalität und Morbidität der bakteriellen Meningitis hauptsächlich verantwortlich sind.

Es konnte gezeigt werden, daß Inflammationsprozesse zu einer Schädigung der Blut-Hirn-Schranke beitragen. Mögliche direkte toxische Effekte von S. pneumoniae auf die Blut-Hirn-Schranke wurden bisher jedoch nicht untersucht. Dies ist deshalb relevant, da während einer bakteriellen Meningitis ein direkter Kontakt zwischen S. pneumoniae und zerebralen Endothelzellen, dem Hauptbestandteil der Blut-Hirn-Schranke, besteht (Leib und Täuber, 1999).

Wichtige Toxine, die zu einer solchen direkten Schädigung von zerebralen Endothelzellen führen könnten, sind Pneumolysin und H2O2, von denen nachgewiesen wurde, daß sie eine toxische Wirkung auf alveoläre Epithelzellen besitzen (Duane et al., 1993; Rubins et al., 1993).

Der programmierte Zelltod ist neben anderen wichtigen Erkrankungen an der Pathophysiologie von Infektionen und Sepsis beteiligt (Hotchkiss, 2002). Auch S. pneumoniae ist in der Lage, einen programmierten Zelltod in unterschiedlichen Zellsystemen zu induzieren. In Mikrogliazellen und Neuronen kommt es, begleitet von einer Freisetzung von apoptosis inducing factor (AIF), zu einem raschen Eintritt von Zelltod (Braun et al., 2001).

Um zu überprüfen, ob lebende Pneumokokken bzw. ihre Toxine über die Initiation von programmiertem Zelltod zu einem Untergang der die Blut-Hirn-Schranke bildenden Endothelzellen führen, wurden in einem in-vitro-System Kulturen zerebraler mikrovaskulärer Endothelzellen mit lebenden Pneumokokken inkubiert und der Einfluss auf Morphologie und Viabilität mittels verschiedener biochemischer und morphologischer Verfahren getestet.

Die Arbeitshypothesen zu Beginn der Untersuchungen lauteten:

  1. Lebende Pneumokokken induzieren einen programmierten Zelltod (Apoptose) in Kulturen zerebraler mikrovaskulärer Endothelzellen.
  2. Beim Pneumokokken-induzierten endothelialen Zelltod kommt es zu einer Aktivierung von Caspasen.
  3. Die Virulenzfaktoren Pneumolysin, H2O2 und das Adhärenzprotein CbpA sind für die Induktion des endothelialen Zelltodes entscheidend.


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09.03.2005