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2  MATERIAL UND METHODEN

2.1 Kulturen der primären zerebralen Kapillarendothelzellen

Die Zellkulturmedien, fötales Kälberserum (FKS) und sonstige Zusatzlösungen wurden von Biochrom KG, Berlin, bezogen. Vom FKS wurde über den gesamten Zeitraum die gleiche Charge verwendet und vor Gebrauch eine Hitze-Inaktivierung vorgenommen. Als Standardpuffer diente, wenn nicht anders bezeichnet, grundsätzlich Dulbecco´s Phosphat-gepufferte Salzlösung (PBS) ohne Ca2+/Mg2+ (Life Technology, Karlsruhe). Kollagenase/Dispase, Desoxyribonuklease (DNAse), E.C.3.1.21.1 und Endothelzell-Wachstumsfaktor (ECGF) wurden von Böhringer/Mannheim, Mannheim, Kollagenase von SERVA, Heidelberg und Rinderserumalbumin (BSA) von PAA, Cölbe, bezogen.

Die Primärkulturen wurden von Wistar-Ratten, die vom Bundesinstitut für gesundheitlichen Verbraucherschutz und Veterenärmedizin (BgVV) Berlin geliefert wurden, gewonnen. Die Narkotisierung der Tiere erfolgte mit Narkoseether der Hoechst AG, Frankfurt M. Die für die Zellkultur verwendeten sterilen Plastikartikel wurden von den Firmen Becton Dickinson, Heidelberg, und Nunc GmbH, Wiesbaden, bezogen.

Medien und Lösungen

Wachstumsmedium

HAM´S F10 (mit 1,2 g/l NaHCO3) mit den nachfolgend aufgeführten Zusätzen:

Präparationsmedium (DMEM mit den Zusätzen:)

  • 10 % FKS

  • 2 mM L-Glutamin

  • 1 % Penicillin/Streptomycin

 

[Seite 20↓]Kollagenase

Vom Lyophilisat wurde eine Stammlösung mit einer Konzentration von 25 U/ml in DMEM hergestellt. Diese wurde steril filtriert und in Aliquots zu je 2 ml bei -20 °C gelagert. Die Endkonzentration betrug 2,5 U/ml.

Kollagenase/Dispase

100 mg Lyophilisat wurden in 1 ml destilliertem Wasser aufgenommen, mit PBS auf 10 ml aufgefüllt, steril filtriert und in Aliquots zu je 1 ml bei -20 °C gelagert. Das Enzymgemisch wurde in einer Endkonzentration von 0,1 U/ml (Kollagenase) bzw. 0,8 U/ml (Dispase) verwendet.

BSA (Albumin bovine Fraction V, pH 7,0)

25 g BSA wurden in 75 ml PBS aufgelöst, mit Sterilfilter easy-flow 0,45 µm filtriert und bei 4 °C im Kühlschrank aufbewahrt.

DNAse

8 mg Trockensubstanz wurden in 10 ml PBS aufgelöst, steril filtriert, aliquotiert zu je 250 µl und bei -20 °C aufbewahrt. Die DNAse wurde in einer Endkonzentration von 10 U/ml verwendet.

Präparation und Kultivierung

Drei bis vier Wochen alte Wistar-Ratten wurden narkotisiert und danach dekapitiert. Das Gehirn wurde sofort entfernt und in eiskaltem PBS gelagert. Alle weiteren Arbeitsschritte erfolgten unter sterilen Bedingungen. Die Kortizes wurden präpariert und die Meningen durch Abrollen auf einem sterilen Löschpapier sorgfältig entfernt. Anschließend erfolgte mit Hilfe eines Skalpells und durch mehrmaliges Aufziehen in einer 2 ml-Spritze eine mechanische Zerkleinerung des Gewebes. Das homogenisierte Gewebe wurde in ein 50 ml-Zentrifugenröhrchen überführt, mit Präparationsmedium auf 18 ml aufgefüllt und Kollagenase (2,5 U/l) zugegeben. Es folgten eine einstündige Kollagenase-Verdauung bei 37 °C im Wasserbad und eine 30-minütige Inkubation auf Eis. Im Anschluss wurde das Gewebehomogenisat mit kalter 25 %iger BSA-Lösung in einem Verhältnis von 1:1 aufgefüllt und gut durchmischt. Nach einer 25-minütigen Zentrifugation bei 1400 g und 4 °C wurde das entstandene Pellet in 10 ml Präparationsmedium resuspendiert und Kollagenase/Dispase zugegeben. Nach einer 30-minütigen Inkubation bei 37 °C wurde das Homogenisat bei 4 °C und 550 g für 10 min zentrifugiert, und das Pellet in 5 ml Präparationsmedium resuspendiert. Der Zugabe von 125 µl DNAse und kurzer Inkubation folgte eine erneute 10-minütige Zentrifugation [Seite 21↓]bei 550 g und 4 °C. Das Pellet wurde in 10 ml Präparationsmedium resuspendiert, nochmals bei 550 g abzentrifugiert, in Wachstumsmedium aufgenommen und sorgfältig homogenisiert. Diese Suspension von zerebralen Mikrokapillaren wurde in die beschichteten Kulturgefäße ausgesät. Dies erfolgte abhängig vom Experiment in Multischalen mit 6, 24 oder 96 Vertiefungen. Die Kulturgefäße wurden am Tag der Präparation mit Kollagen G, das zuvor in PBS mit Ca2+/Mg2+ 1:6 verdünnt wurde, beschichtet. Nach einer Einwirkzeit von 2-3 min wurde zweimal mit PBS mit Ca2+/Mg2+ gewaschen. Nach 2-3 h erfolgte der erste Mediumwechsel, danach wurde täglich das Medium erneuert. Ab dem 3. Tag nach Präparation wurde beim Mediumwechsel zusätzlich mit PBS gespült. Die Kulturen wurden bei 5 % CO2/95 % Luft, 95 % Luftfeuchtigkeit und einer Temperatur von 37 °C gehalten. Nach 6-8 d bildeten die Kulturen einen konfluenten Monolayer und wurden für die Experimente verwendet.

In Anlehnung an Freyer et al. (1999) wurde die Reinheit der Endothelzellkulturen mit Hilfe von Antikörpern nachgewiesen, die gegen die Gliamarker saures Gliafaser-Protein (Dako, Hamburg), OX-42 (Genzyme, Cambridge, USA) und CD14 (Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, USA) gerichtet waren. Endothelzellen wurden durch Antikörper gegen von-Willebrandt-Faktor VIII (Dako, Hamburg) identifiziert. Die Darstellung der Zellen erfolgte mit HRP-konjugierten sekundären Antikörpern (Dako, Hamburg). Zur Auswertung wurden die Zellmonolayer von zwei erfahrenen Untersuchern lichtmikroskopisch (Vergrößerung 200-fach) untersucht, wobei die Gliamarker-positiven zu den von-Willebrandt-Faktor-positiven Zellen in Relation gesetzt wurden. Anschließend wurden die Zellen trypsiniert und in einer Fuchs-Rosenthal-Kammer gezählt. 0,05 % der Zellen waren GFAP-positiv, und 1 % der Zellen ließ sich mit Antikörpern gegen OX-42 und CD 14 anfärben. 99 % der Zellen zeigten eine positive Färbung für den von-Willebrandt-Faktor VIII.

2.2 Bakterienkulturen

Bakterienstämme ( S. pneumoniae )

Medien und Lösungen


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C+Y-Medium

 

  • 400 ml Prä C Medium

  • 10 ml Adams III Lösung

  • 13 ml Ergänzungsmedium

  • 10 ml Hefe (5 %)

  • 5 ml Pyruvat (2 %)

  • 10 ml Glutamin (1 mg/ml)

  • 15 ml Kaliumphosphatpuffer (1M)

 

Prä C Medium (ph 7.4)

3-fach-Salzlösung

  • 1,45 g Natriumacetat

  • 10 g MgCl2

  • 6 mg L-Tryptophan

  • 50 mg CaCl2

  • 60 mg L-Cystein

  • 20 µl MnSO4

  • 6 g Casamino Acids

  • 100 ml H2O

  • 1,2 l H2O

 

Ergänzungsmedium

Adams I Lösung

  • 60 ml 3-fach Salzlösung

  • 60 µl Biotin (0.5 mg/ml)

  • 120 ml Glucose (20 %)

  • 30 mg Nikotinsäure

  • 6 ml Sucrose (50 %)

  • 35 mg Pyridoxin

  • 120 ml Adenosin (2 mg/ml)

  • 120 mg Ca-pentithotat

  • 120 ml Uridin (2 mg/ml)

  • 32 mg Thiamin

  • 14 mg Riboflavin

 
  

Adams II Lösung

Adams III Lösung

  • 64 ml Adams I Lösung

  • 50 mg FeSO4

  • 16 ml Adams III Lösung

  • 50 mg CuSO4

  • 800 mg Asparagin

  • 50 mg ZnSO4

  • 80 mg Cholin

  • 20 mg MgCl2

  • 0,64 ml CaCl2 (1%)

  • 1 ml HCl

  • 400 ml H2O

  • 100 ml H2O

Durchführung

Die Pneumokokkenstämme wurden in C+Y-Medium und 15 % Glycerol bei - 80 °C aufbewahrt. Zur Durchführung der Experimente wurden in Anlehnung an Braun et al. (2002) 4 ml C+Y-Medium mit der jeweiligen tiefgefrorenen Bakteriensuspension beimpft und über Nacht in einem Brutschrank bei 37 °C und 5 % CO2 inkubiert. Zur Anzucht der Mutanten wurde das Medium mit Erythromycin in einer Endkonzentration von 1,5 µg/ml versetzt, die Doppelmutante zusätzlich mit Chloramphenicol (Endkonzentration 2 µg/ml). Am nächsten Morgen erfolgte eine Rückverdünnung der Pneumokokkensuspension mit 3 ml frischem Medium auf 1 ml Bakteriensuspension, wobei die Optische Dichte (OD), gemessen im Helios Σ Spectrometer von Thermospectronic bei einer Wellenlänge von 620 nm, unter 0,2 betragen sollte. Die Bakterienkulturen wurden daraufhin im Brutschrank bis zu einer OD von 0,5-0,6 inkubiert. Bei dieser Dichte kann von einer linearen Phase des Wachstums der Bakterien ausgegangen werden. Danach wurden sie in ein Eppendorfgefäß überführt und bei 8000 rpm in einer Zentrifuge (Eppendorf Centrifuge 5415 D) für 3 min zentrifugiert. Das Pellet wurde anschließend in 1400 µl Zellstimulationsmedium ohne Antibiotika vorsichtig resuspendiert und durch Verdünnung mit Zellstimulationsmedium auf eine OD von 0,1 eingestellt. Diese Optische Dichte korrespondiert mit einer Pneumokokkenkonzentration von 108 colony forming units pro ml (cfu/ml). Dies wurde durch entsprechende Verdünnungen und das Ausstreichen auf Blutagarplatten verifiziert. Durch weiteres Verdünnen mit Zellstimulationsmedium wurde die jeweils benötigte Pneumokokkenkonzentration eingestellt und zur Stimulation auf die vorbereiteten Endothelzellen pipettiert.


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2.3  Stimulation der zerebralen Endothelzellen

Medien und Chemikalien

Zellstimulationsmedium

Die Stimulation der Zellkulturen erfolgte in Wachstumsmedium (s. oben), dem keine Antibiotika zugesetzt wurden. Es kam nur Medium mit einem Endotoxingehalt < 0,01 ng/ml zum Einsatz.

Caspaseninhibitor

Der Caspaseninhibitor zVAD-fmk (irreversibler Pan-Caspase Inhibitor, Calbiochem, Heidelberg) wurde in einer 10 mM Stammlösung in DMSO angesetzt und in einer Endkonzentration von 100 µM angewendet. Die Stammlösung wurden bei -20°C gelagert.

Pneumolysin

Durch eine Punktmutation im Pneumolysin-Gen in der Domäne für Komplementaktivierung (D385N) sowie für die zytolytische Aktivität (W433F) entstanden in ihren Eigenschaften veränderte Pneumolysin-Proteine. Die Herstellung und Testung der Eigenschaften erfolgte nach Mitchell et al. (1997). In Abbildung 4 sind die Eigenschaften der veränderten Pneumolysin-Proteine zusammengefaßt.


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Abbildung 4: Schematische Darstellung des Proteins Pneumolysin. Durch Punktmutation entstanden Pneumolysin-Proteine mit veränderten Eigenschaften. Bei D385N ("Komplement-") führte der Austausch von Aspartat durch Asparagin an Stelle 385 zum Verlust der Komplementaktivierung, bei W433F ("Zytolyse-") kam es durch den Austausch von Tryptophan durch Phenylalanin an Stelle 433 zu einem Verlust der zytolytischen Aktivität.

Durchführung

Die Endothelzellen wurden nach 7-tägiger Kultivierung in Zellkulturplatten mit 6, 24 oder 96 Vertiefungen 2 x mit sterilem PBS gespült, um das antibiotikahaltige Wachstumsmedium vollständig zu entfernen. Anschließend wurde die in Stimulationsmedium verdünnte Pneumokokkensuspension in der gewünschten Konzentration (106, 107 oder 108 cfu/ml) auf die Zellen gegeben und im Brutschrank bis zum jeweiligen Zeitpunkt (z.B. 3, 6, 9, 12 h) inkubiert. Als Negativkontrolle erfolgte die Zugabe der gleichen Menge PBS. In den Zellkulturschalen kam es zu einem weiteren langsamen Wachstum der Pneumokokken mit einer Vermehrung von etwa 1 log pro 6 h. Zur Kontrolle der Konzentration und der Kultur wurde die Bakteriensuspension verdünnt und auf einer Blutagarplatte ausgestrichen. Dabei zeigten die miteinander verglichenen Bakterienstämme jeweils eine vergleichbare Wachstumskurve. Nach 24-stündiger Inkubation bei 37 °C und 5 % CO2 konnten die gewachsenen Kolonien gezählt und mit der Ausgangskonzentration korreliert werden. Für die Experimente mit dem Caspaseninhibitor wurden die Zellen mit zVAD-fmk in Stimulationsmedium (ohne Antibiotika) 1 h präinkubiert. Daraufhin erfolgte die Zugabe von einer so großen Menge Pneumokokkensuspension, daß eine Endkonzentration von 107 cfu/ml Pneumokokken entstand. Zum gleichen Zeitpunkt wurde Katalase in einer Endkonzentration von 1250 U/ml zugegeben. Die Inkubation der Zellen mit Staurosporin (Endkonzentration: 1 µM), Wasserstoffperoxid und dem gereinigten Pneumolysin in der jeweiligen Konzentration wurde ebenfalls im Brutschrank bis zum gewünschten Zeitpunkt durchgeführt.


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2.4  Untersuchung der Zellkernmorphologie mit DNS-Farbstoffen (AO/EB)

Chemikalien und Lösungen

Durchführung

Ethidiumbromid und Acridinorange sind fluoreszierende, interkalierende DNS-Farbstoffe. Acridinorange wird als Lebendfarbstoff von vitalen Zellen aufgenommen und färbt gesunde Zellkerne grün. Ethidiumbromid wird von der Zelle nur durch eine geschädigte Zellmembran aufgenommen und färbt den Zellkern rot bzw. orange. Die Doppelfärbung mit Ethidiumbromid und Acridinorange erlaubt eine Differenzierung zwischen verschiedenen Zustandsformen der Zelle:

Acridinorange (AO) und Ethidiumbromid (EB) wurden als Stammlösung in einer Konzentration von 1 mg/ml angesetzt. Die zu Versuchende benutzte Endkonzentration des Doppelfarbstoffes betrug 2 µg/ml und wurde durch Verdünnung der Stammlösung mit PBS erreicht. Die Acridinorange/Ethidiumbromid-Färbung wurde in Platten mit 96 Vertiefungen durchgeführt. Nach Inkubation mit Bakterien oder anderen Apoptose induzierenden Reagenzien wurden 2 x mit PBS gewaschen und jeweils 2 µg/ml AO und 2 µg/ml EB in 100 µl PBS pro Vertiefung auf die Zellen gegeben. Nach einer 5-minütigen Inkubationszeit wurden die Zellen unter einem Fluoreszenzmikroskop in einer 400-fachen Vergrößerung begutachtet und die einzelnen Zellen nach oben genannten Kriterien differenziert und gezählt. Die Auswertung der Versuche erfolgte unter prozentualer Angabe der lebenden, apoptotischen und nekrotischen Zellen in Bezug auf die Gesamtzellzahl.


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2.5  Untersuchung der DNS-Degradation mit der TUNEL-Methode

Material

Durchführung

Die zerebralen Endothelzellen wurden in kleinen Petrischalen mit einem Parafinring ausgesät und wie oben beschrieben über 7 Tage in Endothelzellmedium kultiviert. Die Zellstimulation erfolgte anschließend mit lebenden Pneumokokken (R6, D39 oder PlnA-) in einer Konzentration von 107 cfu/ml und/oder Katalase (1250 U/ml) bzw. gleicher Menge PBS. 12 h nach Inkubationsbeginn wurden die Zellen 2 mal mit PBS gespült und anschließend die gesamte Flüssigkeit abgesaugt. Die Zellen blieben danach zum Trocknen unter dem Abzug stehen. Die Fixierung der Zellen erfolgte für 30 min mit 4 % PFA-Lösung. Nach dreimaligem Spülen mit PBS wurden die Zellen für 8 min mit Proteinase K (20 mg/ml in TrisHCl) inkubiert. Nach erneuter Spülung mit PBS (3 x 5 min) erfolgte eine 15-minütige Inkubation mit Na Azide (0,1 M, H2O2 0,1 %, Triton X 0,3 %). Die Zellen wurden wiederum mit PBS (3 x 5 min) gespült und kurz (30 s) mit Äquilibrierungspuffer inkubiert. Anschließend erfolgte eine 60-minütige Inkubation der Zellen mit TdT-Enzym bei 37 °C in einer feuchten Kammer. Die Petrischale wurde dazu mit einem Deckel versehen, in eine Schachtel mit angefeuchtetem Zellstoff gestellt und mit Parafilm abgedichtet. Daraufhin wurde eine 10-minütige Inkubation mit Stop/Wasch-Puffer und eine weitere Spülung mit PBS (3 x 5 min) durchgeführt. Die Inkubation mit dem Alpha Digoxigenin Peroxidase-Konjugat fand danach für 30 min bei Raumtemperatur statt. Nach erneuter Spülung mit PBS (3 x 5 min) wurde das Substratgemisch, bestehend aus einem Tropfen Reagenz (Nickel) und 2,5 ml dH2O gemischt und auf die Zellen gegeben. Die Inkubationszeit betrug etwa 2 min. Nach einem erneuten Waschschritt mit dH2O (3 x 5 min) wurde der Parafinring vorsichtig abgekratzt und ein Tropfen Einbettmedium auf die gefärbten Zellen gegeben. Nachdem ein Deckglas vorsichtig auf den Zellen platziert wurde, erfolgte das Trocknen über Nacht. Am nächsten Tag wurden die Zellen unter einem Lichtmikroskop begutachtet und in einer Vergrößerung von 1:100 fotografiert.


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2.6  Elektronenmikroskopische Aufnahmen

Chemikalien

Durchführung

Die EM-Bilder wurden nach einem modifizierten Protokoll von Schulz (1977) hergestellt.

Dazu wurden zerebrale Endothelzellen in Kulturplatten mit 6 Vertiefungen kultiviert, mit Pneumokokken oder PBS inkubiert, 2 x mit PBS gespült und mit jeweils 3% PFA und Glutaraldehyd in PBS bei einem pH von 7,4 und einer Temperatur von 4°C über Nacht fixiert. Anschließend wurden die Zellen für 3 x 10 min mit Phosphatpuffer (0,1-0,2 M) gespült und mit Osmiumtetroxid in einer 1%igen Lösung in Phosphatpuffer mit 6% Saccharose für 1 h inkubiert. Nach vorsichtigem Absaugen wurde wiederholt mit Phosphatpuffer gespült. Die Zellen wurden nun entwässert und dazu in eine aufsteigenden Alkoholreihe getaucht, beginnend bei 50 % für 5 min, dann 70 % für eine Stunde, 90 % für 5 min, 96 % für 5 min und zum Schluß in 100 %igem Alkohol für 2 x 10 min. Um die Löslichkeit des Epons zu erhöhen, wurden die Zellen für 2 x 10 min in Hydroxypropylmetacrylat (HPMA) getaucht und anschließend für 1 h mit HPMA-Epon (1:1) inkubiert. Nach sorgfältigem Entfernen des Gemisches erfolgte eine erneute Inkubation mit HPMA-Epon über Nacht. Durch das Verdampfen des HPMA kam es dabei zu einer allmählichen Eindickung des Epon. Diese Masse wurde erneut entfernt und Epon 812 (mit Aktivator- und Beschleunigerzusätzen) auf die Zellen gegeben. Dieser Vorgang wurde 2 x wiederholt, wobei das Epon je 1 h auf den Zellen belassen wurde. Als letzter Schritt wurde Epon so dünn wie möglich auf die Zellen gegeben und bei 60°C für 24 bis 48 h auspolymerisieren lassen. Die Platte konnte nun rückwärtig mit einem Spezialbohrer angebohrt werden. Das herausgebohrte Stück wurde getrennt und der Kunststoff vom Zellrasen am Epon gelöst. Eine leere Gelatinekapsel wurde mit Epon gefüllt und oben abgeschnitten. Auf diese Stelle wurde ein wenig Sekundenkleber gegeben und das Stück Epon und Zellrasen mit der Eponseite auf der Kapsel befestigt. Mit einem Schnittgerät (Ultra Cut S) wurden nun ca. 600 nm dünne Schnitte hergestellt. Die Schnitte konnten aus destilliertem Wasser auf so genannte Grids (Plano GmbH, [Seite 29↓]Wetzlar) einzeln mit einer Pinzette aufgenommen werden. Danach wurden die Schnitte mit Schwermetallionen (Uranylacetat und Bleicitrat) nach einem festgelegten Programm in einem Schnittkontrastierungs-Automaten von Leica kontrastiert. Die Grids wurden getrocknet und bis zum Einschleusen in das Elektronenmikroskop in abgeschlossenen Boxen aufbewahrt. Zum Herstellen der Aufnahmen wurde ein EM 900 der Firma Zeiss benutzt. Die Präparate wurden bei durchschnittlich 80 kV betrachtet. Vergrößerungen waren bis 50 000-fach einstellbar.

2.7 Pulsfeldgelelektrophorese (PFGE)

Puffer und Chemikalien

5 x TBE

NDS Puffer

  • 500ml Aqua bidest

  • 0,5 M EDTA pH 7,5

  • 54g Trisbase

  • 1 % Laurylsarcosin

  • 27,5 g BorAcid

  • 1 mg/ml Proteinase K

  • 3,802 g EDTA

 

Durchführung

In Platten mit 6 Vertiefungen kultivierte zerebrale Endothelzellen wurden nach Stimulation mit Pneumokokken oder PBS 2 x mit PBS gewaschen, in PBS vorsichtig abgekratzt und zentrifugiert. Das Pellet wurde in 75 µl PBS resuspendiert. 60 mg InCert Agarose wurden in 4 ml PBS gelöst (Konzentration 1,5 %), im Wasserbad bei ca. 65 °C geschmolzen und danach bei 50 °C warmgehalten. Inzwischen wurde die Form für die Blöckchen (Geiger Handling GmbH, Dornhan) gründlich mit destilliertem Wasser gespült und mit Tesafilm abgeklebt. Nach Zusammenpipettieren und Mischen von 75 µl Zellsubstrat und 75 µl der erwärmten 1,5 %igen InCert Agarose konnte das Zell-Agarose-Gemisch in die Form gefüllt werden und bei 4 °C für 30 min abkühlen. Danach erfolgte ein Proteinverdau der entstandenen Zell-Agarose-Blöckchen mit NDS Puffer für 36-48 h bei 50 °C.

Ein 1 %-iges Agarosegel in 0,5 x TBE wurde gegossen und für 1 h auspolymerisiert. Die Blöckchen wurden 3 x mit TBE gewaschen, aus der Form genommen und in die Taschen des [Seite 30↓]Agarosegels gefüllt, die anschließend mit Agarose versiegelt wurden. Als Elektrophoresepuffer wurden 2,5 l 0,5 x TBE verwendet. In einem Bio-Rad CHEF-DR II-Gerät (Richmond, CA) erfolgte eine 24-stündige Elektrophorese bei 190 V und einer Pulsrichtungsveränderung alle 60 s im Winkel von 120 °. Das Gel wurde in einem Ethidiumbromid-Bad für 30 min gefärbt, in TBE wieder entfärbt und in einem Typhoon-Gerät gescannt und ausgewertet. Als kb-Marker wurde der Lamda Ladder PFG Marker (New England Biolabs, USA) benutzt.

2.8 Messung der Caspaseaktivität

Material

Caspasesubstrate (Calbiochem, Heidelberg)

Durchführung

Zur Bestimmung der Aktivität von Caspasen in Extrakten, wurden diese mit Tetrapeptidsubstraten für Caspasen versetzt. Der Umsatz dieser Substrate lässt sich durch die Freisetzung einer fluorophoren (Aminotrifluoromthylcoumarin, AFC bzw. Aminomethylcoumarin, AMC) Gruppe, die an Position 1 des Tetrapeptids gekoppelt ist, quantifizieren. Die Aktivität berechnet sich aus der freigesetzten Gruppe (AFC bzw. AMC) in pmol der Inkubationszeit (in min) und der eingesetzten Gesamtproteinmenge (in mg) nach folgender Formel:

Aktivität = Produktmenge (pmol) / Proteinmenge (mg) x Inkubationszeit (min).

In Anlehnung an Braun et. al (2001) wurden die Caspaseaktivitätsbestimmungen als Einzeitmessungen nach 60 min durchgeführt. Diese Vorgehensweise wurde gewählt, weil in diesem Zeitraum auch für höhere Caspasekonzentrationen eine nahezu lineare Korrelation zwischen Reaktionszeit und gemessener Fluoreszenz (Emission) angenommen werden kann, wie Implementierungsversuche in unserem Labor sowie Namura et al. (1998) zeigten.


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Die Endothelzellen wurden stimuliert, 2 x mit PBS gewaschen und anschließend in PBS abgekratzt. Die Zellsuspension wurde in vorgekühlte 2 ml Eppendorfröhrchen überführt und zentrifugiert (5 min/1000 g/4 C°). Der Überstand wurde verworfen und das trockene Pellet schnell auf Trockeneis überführt und bei -80C° gelagert. Das Pellet wurde in 180µl kaltem Lysepuffer resuspendiert, 5 min auf Eis inkubiert und gut durchmischt. Nach einer Zentrifugation (10 min/23000 g/4 C°) wurde das Zellysat auf Eis gestellt und das Pellet verworfen. Im Anschluß wurden folgende Substanzen in eine Vertiefung einer 96-ger Platte pipettiert:

Die Platte wurde mit Parafilm oder Alufolie abgedichtet und für 1h bei 37 °C inkubiert.

Die Messung der Caspaseaktivität erfolgte in einem Fluoreszenzreader (Cyto Fluor, Per Septive Biosystems, Framingham, USA). Jede Platte wurde bei verschiedenen Lichtstärken (gains) gemessen. Die Exzitations-Emissionsspektren betrugen für AMC-gekoppelte Substrate 360/40-400/30 und für AFC-gekoppelte Substrate 400/30-508/20. Standard-7-Amino-4-Methyl-Coumarin- und -7-4-Trifluoromethyl-Coumarin-Lösungen wurden als Standards zur Berechnung der Caspaseaktivität nach oben beschriebener Formel eingesetzt. Die Proteinmengen wurden mit der BCA-Methode quantifiziert.

2.9 Messung der intrazellulären Calciumkonzentration

Material

Fluo-4 AM (Molecular Probes-Mobitec, Heidelberg) 50 µg in 45 µl DMSO (Stamm:1mM)

Durchführung

Die in Platten mit 24 Vertiefungen ausgesäten primären Endothelzellen wurden zu verschiedenen Zeitpunkten mit Pneumokokken 107 cfu/ml bzw. PBS (Kontrollen) behandelt. Nach Abschluß der Stimulation wurde das Zellkulturmedium verworfen und die Endothelzellen mit dem Fluoreszenzfarbstoff Fluo-4 AM in einer Endkonzentration von 5 µM (in Zellkulturmedium) inkubiert (45 min/37 C°). Im Anschluß an die Inkubation wurden die Zellen vorsichtig 2-3 x mit 400 µl PBS gespült und vor der Messung für 10 min bei einer Temperatur von 37°C gelagert. Die Messung der intrazellulären Calciumkonzentration erfolgte in 400 µl PBS in einem Fluoreszenzreader bei einer Exzitation von 485 nm und einer Emission von 530 nm.


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2.10  Messung des mitochondrialen Membranpotentials ΔφM

Material

Tetramethylrhodaminethylester TMRE (Molecular Probes-Mobitec, Heidelberg)

Durchführung

Die in Platten mit 24 Vertiefungen ausgesäten primären Endothelzellen wurden zu verschiedenen Zeitpunkten mit Pneumokokken 107 cfu/ml bzw. PBS (Kontrollen) behandelt. Nach Abschluß der Stimulation wurde das Zellkulturmedium verworfen, die Zellen 2 x mit PBS gespült und anschließend für 35 min mit dem Fluoreszenzfarbstoff TMRE in einer Endkonzentration von 100 nM (in Zellkulturmedium) inkubiert. Im Anschluß an die Inkubation wurden die Zellen vorsichtig mit PBS gespült und vor der Messung für 10 min bei einer Temperatur von 37°C gelagert. Die Messung des mitochondrialen Membranpotentials erfolgte in 400µl PBS bei einer Exzitation von 530 nm und Emission von 580 nm.

2.11 Proteinbestimmung

Zur Proteinbestimmung wurde die von Detergentien nicht-beeinflußbare BCA-Methode (Bicinchoninsäure-Methode) verwendet. Die dazu benötigten Lösungen wurden als "BCA Protein Assay Reagentkit" (Pierce, Rockford, IL, USA) bezogen. Die Durchführung erfolgte nach Firmenvorschrift.

2.12 Subzelluläre Fraktionierung

Lösungen und Chemikalien

RIPA-Puffer

Puffer A (pH 7,4)

  • 150 mM NaCl

  • Sucrose 0,25 M

  • 50 mM Tris (pH 7,4)

  • Imidazol 3 mM

  • 1% Triton X-100

  • Aqua bidest

  • 0,1% SDS

 

  • 1% NaDeoxycholat

 

[Seite 33↓]Durchführung

Die Auftrennung der Zellen in ihre subzellulären Bestandteile (zytosolische und mitochondriale Fraktion) wurde nach einem leicht modifizierten Protokoll nach Bronfman et al. (1998) durchgeführt. Diese Methode basiert einerseits auf der spezifischen Digitonin-induzierten Freisetzung von zellulären löslichen Enzymen und Komponenten zur Gewinnung der cytosolischen Fraktion und andererseits auf einer Differential-Zentrifugation zur Trennung der weiteren subzellulären Bestandteile.

Alle Schritte wurden, wenn nicht anders beschrieben, auf Eis durchgeführt. Nach Inkubation der Endothelzellen mit lebenden Pneumokokken bzw. PBS für 2, 3 und 5h wurden die Zellen 2 x mit PBS gespült, anschließend in PBS abgekratzt, in ein 1,5 ml Eppendorfgefäß überführt und bei 370 g für 5 min zentrifugiert. Der Überstand wurde verworfen und das Pellet gewogen. Das Pellet wurde daraufhin in je 400 µl Puffer A resuspendiert und bei 16.000 g für 20 s zentrifugiert. Nach erneutem Verwerfen des Überstandes wurde 0,25 mg/ml Digitonin in Puffer A (10µl/mg Pellett) zupipettiert. Es folgte eine erneute Zentrifugation bei 16.000 g für 20 s. Der Überstand, der für 20 min bei 62.000 g zentrifugiert wurde, enthält nun alle löslichen Komponenten und Enzyme der Zelle und stellt damit die zytosolische Fraktion der Zellen dar. Die zytosolische Fraktion wurde in ein Eppendorfgefäß überführt und bis zur weiteren Verarbeitung bei -80 °C eingefroren. Das verbliebene Pellet wurde in 350 µl Puffer A resuspendiert und mit 30 Hüben in einem dounce Homogenisatorhomogenisiert. Nach einer Zentrifugation von 10 min bei 200 g wurde der Überstand in ein anderes Röhrchen verbracht und erneut für 10 min bei 800 g zentrifugiert. Um die mitochondriale Fraktion zu erhalten, wurde der Überstand für 30 min bei 13200 g zentrifugiert und das Pellet in 50 µl RIPA-Puffer aufgenommen. Auch diese Probe wurde bis zur weiteren Verarbeitung bei –80 °C aufbewahrt. Die Proteine der erhaltenen zytosolischen und mitochondrialen Fraktionen wurden in ihrer Konzentration quantifiziert (siehe 2.11.) und einem Western-Blot-Verfahren zugeführt. Dabei erfolgte der Nachweis von AIF unter Verwendung eines Anti-AIF-Antikörpers von Santa Cruz.


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2.13  Western-Blot

Lyse der Zellen

Lysepuffer

Durchführung

Zur Lyse wurden die Zellen zuerst mit eiskaltem PBS gewaschen und dann mit 300 µl eiskaltem Lysepuffer lysiert. Das Zellhomogenat wurde mit einem Zellschaber abgekratzt und für 30 min in einem Eppendorfgefäß auf Eis inkubiert. Nach Zentrifugation (20 min, 23000 g) befanden sich im Überstand die gelösten Proteine.

SDS-Polyacrylamid-Gelelektrophorese

Puffer und Lösungen:

5 x SDS/Glycine-Laufpuffer (pH 8,3)


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Probenpuffer (1 x)

Puffer A

  • 60 mM TrisHCl, pH 6,8

  • 30 % (w/v) Acrylamid

  • 5 % (w/v) 2-Mercaptopropandiol

  • 0,8 % (w/v) Bis

  • 0,003 % (w/v) Bromphenolblau

 

  • 10 % (w/v) Glycerin

 

  • 3 % (w/v) SDS

 

Puffer C

Puffer B (Trenngelpuffer)

  • 1,5 M Tris-HCl, ph 8,8

  • 0,5 M Tris-HCl, ph 6,8

  • 0,2 % (w/v) SDS

  • 0,2 % (w/v) SDS

Gelansätze

 
 

Trenngel (je 10 ml) 10 %

Sammelgel (je 10 ml) 4 %

  • Puffer A (ml)

3,3

1,0

  • Puffer B (ml)

2,5

-

  • Aqua bidest (ml)

4,2

6,5

  • Puffer C (ml)

-

2,5

  • APS (10 %) (µl)

50

40,0

  • TEMED (µl)

5,0

10,0

Durchführung

Die SDS-Polyacrylamid-Gelelektrophorese (SDS-PAGE) wurde in Anlehnung an Laemmli (1970) durchgeführt.

Es wurden kleine Gele (9 x 8 cm bei 0,75 mm Dicke; BioRad, München) verwendet. Die Lösungen für das Trenngel (5 ml für ein kleines Gel) wurden auf Eis gemischt, bis kurz unter den Rand der zusammengebauten Glasplatten gegossen und vorsichtig mit Aqua bidest überschichtet. Nach der Polymerisation wurde dieses Wasser entfernt und das Sammelgel auf das Trenngel gegossen. Durch die Benutzung eines Kammes konnten im Sammelgel Auftragtaschen für die Proben geformt werden. Für die SDS-PAGE unter reduzierenden und denaturierenden Bedingungen wurden die Proben (bis zu 30 µl im kleinen Gel) mit Probenpuffer (1:1 mit dem 1 x Probenpuffer) für 5 min im Wasserbad gekocht und danach in die Taschen des auspolymerisierten Sammelgels gefüllt. Die Gele wurden mit Laufpuffer überschichtet und in die Elektrophoresekammer eingebaut. Die Elektrophorese wurde mit konstanter Spannung bei 180 V gefahren, bis die Bromphenolblaubande das untere Ende des Trenngels erreicht hatte. Jeweils eine Bahn eines Polyacrylamidgels wurde mit Markern zur Bestimmung der Molekulargewichte (Precision protein standard, BioRad, München) beschickt.

[Seite 36↓]Transfer

Transfer-Puffer

  • 0,37 g SDS

  • 800 ml dH2O

  • 2,9 g Glycine

  • 200 ml Methanol

  • 5,8 g Tris-HCl

 

Durchführung

Der Transfer der elektrophoretisch aufgetrennten Proteine auf die Blotmatrices wurde im Semi-Dry-Verfahren durchgeführt. 5 min vor Abschluß der SDS-PAGE wurde die PVDF-Membran (BioRad, München) in Methanol getränkt und anschließend für weitere 5 min in Transfer-Puffer äquilibriert. Bei Verwendung von Nitrocellulose-Membranen (Phosphorylcholin-Western-Blot) wurde auf eine Behandlung mit Methanol verzichtet und die Membran ausschließlich in Transfer-Puffer äquilibriert. Das Blot-Sandwich wurde nach Beendigung der Elektrophorese luftblasenfrei mit Hilfe von Whatman-Papieren (BioRad, München) zusammengesetzt, wobei die PVDF- bzw. Nitrocellulose-Membran zur Anode, das Gel zur Kathode gerichtet waren. Der Transfer fand bei Raumtemperatur statt. Die kleinen Gele wurden für 30 min bei einer konstanten Spannung von 15 V transferiert.

Immunblot

Antikörper und Lösungen

Waschpuffer

Blockierungspuffer

  • 0,1 % (v/v) Twen 20

  • 5 % Trockenmilch (Roth, Karlsruhe)

  • in TBS, pH 7,2

  • in Waschpuffer

[Seite 37↓]Durchführung

Nach dem Proteintransfer wurde die PVDF- bzw. Nitrocellulose-Membran mit Blockierungspuffer bei RT für 1 h geschüttelt und danach bei 4 °C über Nacht mit dem ersten Antikörper inkubiert (Anti-AIF 1:800, Anti-Fodrin 1: 500). Am nächsten Tag wurde der Blot 3 x 10 min mit PBS gewaschen und mit Peroxidase-gekoppelten Rabbit-Anti-Goat-Antikörpern, die zuvor 1:1000 in Blockierungspuffer verdünnt worden waren, für 1 h bei RT inkubiert. Nach sorgfältigem Waschen (4 x 10 min in Waschpuffer) wurde der Blot auf eine Plastikfolie gelegt, mit Filterpapier getrocknet und unter Rotlicht für 1 min mit 4 ml ECL-Luminol (je 2 ml Enhancer und Developer, Pierce, Rockford, Il, USA) bedeckt. Erneut wurde der Blot sorgfältig getrocknet und mit einer zweiten Lage Plastikfolie bedeckt, um anschließend auf einen Kodak X-Omat-Film gelegt zu werden. Üblicherweise wurden mehrere Belichtungszeiten (15 s, 1 min, 3 min) gewählt, um das bestmögliche Verhältnis von Sensitivität und Auflösung/Hintergrund zu erreichen. Der Film wurde anschließend durch übliche fototechnische Methoden entwickelt.

2.14 Angewandte statistische Verfahren

Mit dem Kolmogoroff-Smirnoff-Test für die Güte der Anpassung wurde die Normalverteilung der Meßwerte überprüft. Die statistische Signifikanz der Meßwerte wurde anschließend entweder mit dem ungepaarten t-Test, dem One-Way-ANOVA-Test oder dem Student-Newman-Keuls-Test bestimmt. Die Fehlerbalken in den Abbildungen zeigen in dieser Arbeit durchgehend die Standardabweichung (SD) an.


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09.03.2005