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3  ERGEBNISSE

3.1 Nachweis des Pneumokokken-induzierten endothelialen Zelltodes

3.1.1 Lebende Pneumokokken induzieren einen programmierten Zelltod in zerebralen Endothelzellen

Ausgehend von der Hypothese, daß lebende Pneumokokken in zerebralen Endothelzellen, dem wichtigsten zellulären Bestandteil der Blut-Hirn-Schranke, einen programmierten Zelltod induzieren, wurden primäre zerebrale Endothelzellen aus Ratten präpariert und unter Zellkulturbedingungen für 6-8 Tage kultiviert. Nach dieser Zeit bildeten die Zellen einen vollständig konfluenten Monolayer. In Anlehnung an Freyer et al. (1999) wurde eine etwa 99%-ige Reinheit der Endothelzellkulturen nachgewiesen.

Die zerebralen Endothelzellen wurden mit lebenden Pneumokokken (unbekapselter Stamm R6) in einer Konzentration von 107 colony forming units pro ml (cfu/ml) inkubiert. Diese Konzentration wurde gewählt, da sie etwa der Bakterienkonzentration entspricht, die im Liquor von Patienten mit Pneumokokkenmeningitis vorliegt (Mariani-Kurkdijan et al., 1999).

Zum Nachweis des programmierten Zelltodes in zerebralen Endothelzellen wurden drei verschiedene Detektionsverfahren angewandt.

3.1.1.1 Untersuchung der Kernmorphologie mit der Acridinorange-Ethidiumbromid-Methode

Die erste Nachweismethode erfolgte durch die Färbung der Zellkerne mit den fluoreszierenden DNS-Farbstoffen Acridinorange und Ethidiumbromid.

Acridinorange wird als Lebendfarbstoff von vitalen Zellen aufgenommen und färbt die Zellkerne grün. Ethidiumbromid dagegen wird von der Zelle nur durch eine geschädigte Zellmembran aufgenommen und färbt den Zellkern orange. Bei Rotfärbung der Zellen liegt entweder Nekrose oder Apoptose in einem späten Stadium vor. Eine Unterscheidung von Nekrose und Apoptose ist anhand der Morphologie der Zellkerne möglich. Apoptotische Zellkerne sind geschrumpft und kondensiert; Kerne nekrotischer Zellen dagegen sind balloniert und größer als Zellkerne intakter, lebender Zellen.

Als Positivkontrolle wurden Endothelzellen mit Staurosporin (1 µM), einem pflanzlichen Zytotoxin, das in den verschiedensten Zellkultursystemen als Induktor des intrinsischen Weges der klassischen Apoptose eingesetzt wird (Leist und Jäättelä, 2001), inkubiert.


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Bei der Inkubation von zerebralen Endothelzellen mit Staurosporin zeigten sich typische Merkmale der klassischen Apoptose, wie das Schrumpfen der Zelle und die Kondensation des Zellkernes. Es bildeten sich so genannte apoptotische Körperchen, d.h. von Membran umschnürte fragmentierte DNS-Bruchstücke (Abbildung 5 B), die Zellmembran blieb zunächst intakt (grüne Färbung), erst in einem späteren Stadium kam es zu einem Verlust der Integrität der Zellmembran (rote Färbung).

Mit S. pneumoniae inkubierteZellen zeigten eine ähnliche Morphologie. Auch hier waren die Zellen insgesamt deutlich kleiner als die Kontrollzellen, die Zellkerne geschrumpft, kondensiert und im frühen Stadium grün gefärbt, was auf die Integrität der Zellmembran hinweist. Im Gegensatz zum Staurosporin-induzierten Zellschaden kam es nicht zur vollständigen Fragmentierung des Kernes oder zur Bildung apoptotischer Körperchen (Abbildung 5 A).

Abbildung 5: Färbung zerebraler Endothelzellen mit Acridinorange und Ethidiumbromid nach 12-stündiger Inkubation mit S. pneumoniae (Stamm R6, 107 cfu/ml) [A], Staurosporin (1µM) [B] oder PBS (Kontrolle) [C]. Fluoreszenzmikroskop, Vergrößerung 1:400. Balken = 10 µm. Die Pfeile markieren apoptotische Körperchen.

3.1.1.2 Untersuchung der Zellmorphologie mit Hilfe der Elektronenmikroskopie

Die zweite Detektionsmethode des programmierten Zelltodes erfolgte mit Hilfe von elektronenmikroskopische Aufnahmen. Durch stärkere Vergrößerungen konnten dabei auch Veränderungen auf subzellulärer Ebene z.B. der Mitochondrien oder des Zellkernes berücksichtigt werden.

In der ersten EM-Aufnahme (Abbildung 6 A und B, Vergrößerung 1:4400) ist eine Endothelzelle nach Inkubation mit S. pneumoniae im Vergleich zu einer unbehandelten Kontrollzelle dargestellt, in der typische Merkmale des programmierten Zelltodes erkennbar sind. Die Gesamtgröße der Pneumokokken-behandelten Zelle ist im Vergleich zur Negativkontrolle [Seite 40↓]geringer und der geschrumpfte, pyknotische Zellkern erscheint kondensiert. Zudem zeigt sich an der Kernmembran ein sogenanntes Membran-Blebbing. Es handelt sich dabei um eine Blasenbildung oder Ausstülpung der Kernmembran - ein typisches Merkmal des programmierten Zelltodes.

Abbildung 6: Elektronenmikroskopische Aufnahme zerebraler Endothelzellen nach 4-stündiger Inkubation mit Pneumokokken (R6, 107 cfu/ml) [A] oder PBS (Kontrolle) [B]. Vergrößerung 1:4400. Der Balken entspricht 1,4 µm. Die Pfeile markieren das „Blebbing“ der Kernmembran. N = Nukleus, M = Mitochondrium.

In einer noch stärkeren Vergrößerung (1:12000) konnte die Anordnung des Chromatins im Zellkern beurteilt werden (Abbildung 7). Hier fiel auf, daß das Chromatin in der mit S. pneumoniae behandelten Zelle im Gegensatz zur Kontrolle nicht gleichmäßig und homogen im Kern verteilt war, sondern an den Rand gedrängt (marginalisiert) und kondensiert, ohne in kompakte, abgeschlossene Einheiten eingeteilt zu sein, wie dies bei der klassischen Apoptose der Fall wäre. Insgesamt erinnerte die Anordnung des Chromatins in dieser Aufnahme an die inkomplette Kondensation des Chromatins durch apoptosis inducing factor (AIF), die auch dem nukleären Apoptosestadium I entspricht (Daugas et al., 2000) [zum Vergleich s. Tabelle 2].


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Abbildung 7: EM-Aufnahme zerebraler Endothelzellen mit Darstellung des Chromatins. Vergrößerung 1:12.000. Der Balken entspricht einer Länge von 0,6 µm. Die Pfeile markieren die periphere Kondensation des Chromatins. N = Nukleus.

Abbildung 8: EM-Aufnahme der Mitochondrien von Endothelzellen 4 h nach Inkubation mit Pneumokokken (Stamm R6, 107 cfu/ml) [A] oder PBS [B]. Vergrößerung 1:12000. Balken = 0,6 µm. N = Nukleus, M = Mitochondrium .Die Pfeile markieren die Mitochondrien.

Die Mitochondrien Pneumokokken-stimulierter Endothelzellen zeigen im EM-Bild ebenfalls Veränderungen, die für programmierten Zelltod und eine frühe Schädigung typisch sind (Abbildung 8). Man erkennt deutlich eine Größenzunahme und Ballonierung der Mitochondrien.


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3.1.1.3  Untersuchung der DNS-Degradation mit der TUNEL-Methode

In einem nächsten Schritt wurde das Vorliegen von programmiertem Zelltod mit Hilfe der TUNEL-Methode überprüft. Bei dieser sehr sensitiven Methode werden modifizierte Nukleotide enzymatisch mittels Tdt (Terminaldeoxynucleotid transferase) an DNS-Einzel- und Doppelstrangbrüche gebunden und dadurch angefärbt. Auf diese Weise können Zellkerne mit DNS-Brüchen, die beim programmierten Zelltod typischerweise entstehen, mikroskopisch dargestellt werden.

Die in Abbildung 9 dargestellten Endothelzell-Präparate wurden 12 h nach Inkubation mit lebenden Pneumokokken (107 cfu/ml) oder mit gleicher Menge PBS als Negativkontrolle angefertigt. Zu diesem Zeitpunkt zeigten in den mit Pneumokokken stimulierten Endothelzellen fast alle Kerne eine positive Reaktion (dunkel gefärbte Zellkerne). Dagegen ließen sich in den Endothelzellen der Kontrollgruppe nur sehr wenige Kerne durch die TUNEL-Methode anfärben.

Abbildung 9: TUNEL-Färbung (Tdt mediated dUTP Nick End Labeling). Zerebrale Endothelzellen wurden 12 h mit Pneumokokken (Stamm R6, 107 cfu/ml) [A] oder PBS (Kontrolle) [B] inkubiert, mit der TUNEL-Methode gefärbt und unter einem Lichtmikroskop (Vergrößerung 1:100) betrachtet. Der Balken entspricht einer Länge von 50 µm.

3.1.2 Der Zelltod zerebraler Endothelzellen ist direkt abhängig von Inkubationszeit und Konzentration der Pneumokokken

Nachdem nachgewiesen wurde, daß es nach Inkubation von zerebralen Endothelzellen mit S. pneumoniae zu einem programmierten Zelltod kommt, sollte der Frage nachgegangen werden, in welcher Zeit der Zelltod induziert wird und ob eine direkte Abhängigkeit von der Konzentration [Seite 43↓]der Pneumokokken als potentielle Produzenten zytotoxischer Stoffe besteht. Um diese Frage zu beantworten, wurden zerebrale Endothelzellen mit lebenden Pneumokokken (Stamm R6, 107 cfu/ml) für 3, 6, 9 oder 12 h inkubiert. Danach wurden sie mit den fluoreszierenden DNS-Farbstoffen Acridinorange und Ethidiumbromid gefärbt und unter dem Fluoreszenzmikroskop nach den genannten Kriterien in lebende und nekrotische Zellen sowie Zellen mit einer für den programmierten Zelltod typischen Kernmorphologie eingeteilt, quantifiziert und der prozentuale Anteil ermittelt.

Abbildung 10: Kinetik des Zelltodes zerebraler Endothelzellen nach Inkubation mit S. pneumoniae (R6, 107 cfu/ml). Prozentuale Darstellung der lebenden Zellen (grau), der Zellen mit typischer Morphologie eines programmierten Zelltodes [Apoptose] (schwarz) und nekrotischen Zellen (weiß). Acridinorange-Ethidiumbromid-Methode. n = 9 bei 3 unabhängigen Experimenten.

Aus Abbildung 10 ist ersichtlich, daß bereits nach 3 h ein Anstieg des Anteils von Zellen mit kondensierten Zellkernen als Zeichen für einen programmierten Zelltod zu beobachten war, der mit fortgesetzter Inkubationszeit weiter anstieg und nach 12 h mit 79,5 ± 3,34% bei inkubierten Zellen im Vergleich zu 6,2 ± 2,01% zu Versuchsbeginn den Höhepunkt erreichte. Insgesamt machte der programmierte Zelltod mit kondensierten Zellkernen im Vergleich zum nekrotischen Zelltod mit normal großen oder ballonierten Zellkernen den weitaus größeren Anteil aus. In einem weiteren Experiment wurden die Endothelzellen mit 106 bzw. 108 cfu/ml behandelt und wiederum die Rate der kondensierten Kerne als Zeichen des programmierten Zelltodes mit Hilfe der Acridinorange-Ethidiumbromid-Methode quantifiziert. Abbildung 11 zeigt, daß die Erhöhung bzw. Erniedrigung der Bakterienkonzentration um 1 log zu einer Beschleunigung bzw. Verzögerung der Zelltod-Induktion von etwa 3 h führte, was auf eine klare Abhängigkeit von der bakteriellen Konzentration hindeutet.


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Abbildung 11: Konzentrationsabhängigkeit des Zelltodes zerebraler Endothelzellen nach Inkubation mit S. pneumoniae (106, 107, 108 cfu/ml) oder PBS (Negativkontrolle). n = 9 bei 3 unabhängigen Experimenten.

3.2 Untersuchung der Rolle der Caspasen

3.2.1 Der Pneumokokken-induzierte Zelltod ist durch den Pan-Caspase-Inhibitor zVAD-fmk nicht blockierbar

Im Zuge der klassische Apoptose kommt es zu einer Aktivierung von Caspasen. Im Gegensatz dazu steht der AIF-induzierte programmierte Zelltod, bei dem eine Apoptoseexekution ohne die Beteiligung von Caspasen ablaufen kann. Welche Proteasen und Nukleasen dabei eine Rolle spielen, ist noch weitgehend unbekannt (Leist und Jäättelä, 2001).

Um zu überprüfen, ob der endotheliale Zelltod von einer klassischen Caspasenaktivierung begleitet wird, wurde zunächst ein Blockierungsversuch mit dem Caspaseninhibitor zVAD-fmk, einem irreversiblen Breitspektrumhemmer aller Caspasen durchgeführt. ZVAD-fmk ist ein synthetisches Peptid und fungiert als Pseudosubstrat. Damit hemmt es einerseits die Prozessierung einer Pro-Caspase in eine aktivierte Caspase und andererseits bindet es an bereits aktivierte Stufen und hemmt somit ihre proteolytische Aktivität.

Zerebrale Endothelzellen wurden zur Sicherstellung einer vollständigen Blockierung der Caspasen-Aktivität 1 h mit zVAD-fmk (100µM) präinkubiert und anschließend mit S. pneumoniae (Stamm R6, 107 cfu/ml), Staurosporin (Postivkontrolle, 1 µM) bzw. PBS behandelt.


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Die Zelltod-Detektion und –quantifizierung erfolgte mit Hilfe der Acridinorange-Ethidiumbromid-Methode. Hierbei kam es, wie in Abbildung 12 dargestellt, in den Staurosporin-behandelten Zellen durch den Zusatz von zVAD-fmk zu einer signifikanten Verringerung der Zelltodrate von 68,3 ± 6,6% auf 22,01 ± 2,17%. Im Gegensatz dazu führte die Präinkubation mit zVAD-fmk bei den R6-behandelten Zellen nicht zu einer signifikanten Reduktion des Zelltodes (81,4 ± 3,54% versus 83,25 ± 1,69%).

Abbildung 12: Hemmbarkeit der Staurosporin-induzierten sowie fehlende Hemmbarkeit des Pneumokokken-induzierten Zelltodes durch den Pan-Caspase-Inhibitor zVAD-fmk (100 µM). Acridinorange-Ethidiumbromid-Methode. n = 9 bei 3 unabhängigen Experimenten. Statistische Signifikanz markiert mit * für p<0,001 (ungepaarter t-Test).

3.2.2 Die Caspasen-3, -8 und -9 werden beim endothelialen Zelltod durch lebende Pneumokokken nicht aktiviert

Nachdem durch die fehlende Blockierbarkeit des Zelltodes durch einen Caspaseninhibitor ein erster Hinweis gegeben war, daß der endotheliale Zelltod unabhängig von einer Aktivierung von Caspasen sein könnte, wurde als nächster Schritt die Aktivität von 3 Hauptvertretern der Caspasefamilie (Caspasen-3, -8 und -9) mit Hilfe eines Aktivitätsassays direkt gemessen. Dazu wurden zerebrale Endothelzellen erneut mit 1 µM Staurosporin (Positivkontrolle), Pneumokokken (Stamm R6, 107 cfu/ml) oder PBS (Negativkontrolle) inkubiert und die Caspaseaktivität nach verschiedenen Zeitpunkten gemessen. Zur Bestimmung der Aktivität von Caspasen in Extrakten, wurden diese mit Tetrapeptidsubstraten für Caspasen versetzt. Der Umsatz der Substrate läßt sich durch die Freisetzung einer an das Substrat gekoppelten fluorophoren Gruppe (Aminotrifluoromthylcoumarin, AFC bzw. Aminomethylcoumarin, AMC) [Seite 46↓]quantifizieren. Die Aktivität berechnet sich aus der freigesetzten Gruppe (AFC bzw. AMC) in pmol pro Inkubationszeit (min) und der eingesetzten Gesamtproteinmenge (mg). Zu keinem Zeitpunkt und bei keiner der gemessenen Caspasen kam es zu einem relevanten Anstieg der Aktivität. Eine signifikante Caspasenaktivierung war lediglich bei der Positivkontrolle mit Staurosporin zu beobachten (s. Abbildungen 13 und 14).

Abbildung 13: Caspase-3-Aktivität in zerebralen Endothelzellen. Die Zellstimulation erfolgte mit Staurosporin (12 h, 1 µM), S. pneumoniae (R6, 107 cfu/ml) oder PBS (Kontrolle). n = 9 bei 3 unabhängigen Experimenten. Statistische Signifikanz markiert mit * für p<0,001 (ungepaarter t-Test).

Abbildung 14: Aktivitäten der Caspase-8 (links) und der Caspase-9 (rechts) in zerebralen Endothelzellen. Die Zellstimulation erfolgte mit Staurosporin (12 h, 1 µM), S. pneumoniae (R6, 107 cfu/ml) oder PBS (Kontrolle). n = 9 bei 3 unabhängigen Experimenten. Statistische Signifikanz bei * für p<0,001 (ungepaarter t-Test).


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3.2.3  Beim endothelialen Zelltod kommt es nicht zur Entstehung Caspasen-abhängiger Spaltprodukte von α-Fodrin

Aktivierte Caspasen führen im Rahmen der klassischen apoptotischen Signalkaskade zu einer Spaltung von Proteinen, die z.B. eine Rolle bei DNS-Reparaturvorgängen oder im Aufbau des Zytoskelettes spielen. Ein Protein, das zum Nachweis einer Aktivierung der Caspasen häufig bestimmt wird, ist das Zytoskelettprotein α-Fodrin. Das 213 kDa große Protein wird durch aktivierte Caspasen spezifisch in eine 140 kDa- und eine 120 kDa-Untereinheit gespalten.

Um zu überprüfen, ob im Rahmen des endothelialen Zelltodes übereinstimmend mit den bisherigen Ergebnissen eine Caspasenaktivierung und damit spezifische Spaltung des Zytoskelettproteins α-Fodrin ausbleibt, wurden zerebrale Endothelzellen mit 1 µM Staurosporin, S. pneumoniae (107 cfu/ml) oder PBS behandelt und das zu untersuchende Protein in einem Western-Blot-Verfahren mit Hilfe eines spezifischen Anti-α-Fodrin-Antikörper nachgewiesen.

In Abbildung 15 ist erkennbar, daß es zwar bei den Staurosporin-behandelten, nicht jedoch bei den Pneumokokken- oder PBS-behandelten Proben zu einer Spaltung von α-Fodrin in seine spezifischen Untereinheiten kam.

Abbildung 15: Fehlende Spaltung des Zytoskelettproteins α-Fodrin (240 kDa) in seine Caspasen-spezifischen Spaltprodukte (140 und 120 kDa). Zerebrale Endothelzellen wurden 3 und 6 h mit Staurosporin (1µM), 1, 3 und 7 h mit S. pneumoniae (R6, 107 cfu/ml) oder PBS (Kontrolle) inkubiert und ein Western-Blot mit einem Anti-α-Fodrin-Antikörper durchgeführt. KDa = Kilo-Dalton. Stauro = Staurosporin

Zusammenfassend konnte somit mit drei verschiedenen Methoden nachgewiesen werden, daß den Caspasen bei der Exekution des endothelialen Zelltodes durch lebende Pneumokokken keine entscheidende Funktion zukommt.


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3.3  Untersuchung weiterer intrazellulärer Mechanismen

3.3.1 Nach Stimulation zerebraler Endothelzellen mit Pneumokokken kommt es zu einem raschen Anstieg des intrazellulären Calciums

Um die intrazelluläre Schadenskaskade noch genauer zu beschreiben, wurde zusätzlich untersucht, ob es bei Inkubation von zerebralen Endothelzellen mit lebenden Pneumokokken zu einer Erhöhung des intrazellulären Calciums kommt. Die Endothelzellen wurden nach unterschiedlich langer Stimulation mit S. pneumoniae (107 cfu/ml) oder PBS für 45 min mit dem Calcium-Indikator Fluo-4 AM (5 µM) inkubiert. Durch eine Bindung des Calciums an den fluoreszierenden Indikator Fluo-4 AM wird dessen Fluoreszenzsignal verstärkt, was zu einer erhöhten, im Fluoreszenz-Reader meßbaren Extinktion bei 488 nm führt.

Abbildung 16 zeigt die Veränderungen des intrazellulären Calciums in zerebralen Endothelzellen während der Inkubation mit lebenden Pneumokokken. Es ist zu erkennen, daß es bereits nach 60 min zu einem ersten Anstieg des Calciums kommt, der nach weiteren 60 min nochmals zunimmt. In einem weiteren Experiment wurden die Endothelzellen mit dem intra- und extrazellulären Calciumchelator BAPTA-AM in einer Konzentration von 5 µM vorinkubiert und anschließend mit Pneumokokken behandelt. Hierbei konnte eine signifikante Reduktion der Zelltodrate nach 12 Stunden festgestellt werden (s. Abbildung 17).

Abbildung 16: Kinetik des intrazellulären Calciums nach Stimulation mit lebenden Pneumokokken (R6, 107 cfu/ml). Die Messung des intrazellulären Calciumgehaltes erfolgte mit dem fluoreszierenden Farbstoff Fluo-4 AM nach verschiedenen Stimulationszeiten. n=9, aus 3 unabhängigen Experimenten.


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Abbildung 17: Hemmung der endothelialen Zelltodrate durch Präinkubation mit dem Calcium-Chelator BAPTA-AM (5 µM). 12 h Inkubation der Zellen mit R6, PBS (Kontrolle) mit oder ohne BAPTA-AM. n = 9 bei 3 unabhängigen Experimenten. Statistische Signifikanz bei * für p<0,001 (ungepaarter t-Test).

Beim Pneumokokken-induzierten Zelltod kommt es früh zu einem Abfall des mitochondrialen Membranpotentials ΔφM

In weiteren Experimenten sollte herausgefunden werden, ob und wann es zu einem Abfall des mitochondrialen Membranpotentials ΔφM in zerebralen Endothelzellen kommt, da sowohl bei der klassischen Apoptose als auch für den Caspasen-unabhängigen programmierten Zelltod eine Abnahme des mitochondrialen Membranpotentials ΔφM als Zeichen für eine mitochondriale Schädigung typisch sind.

Abbildung 18: Kinetik des mitochondrialen Membranpotentials ΔφM nach Inkubation von zerebralen Endothelzellen mit lebenden Pneumokokken (R6, 107 cfu/ml). Die Messung erfolgte mit dem Farbstoff Tetramethylrhodaminester (TMRE). n = 9, aus 3 unabhängigen Experimenten.


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Zerebrale Endothelzellen wurden dazu mit S. pneumoniae (107 cfu/ml) inkubiert und nach unterschiedlicher Zeit der mitochondriale Indikator Tetramethylrhodaminethylester (TMRE) zugegeben. Die Änderungen des Fluoreszenzsignals wurden bei einer Exzitation von 530 nm und einer Emission von 580 nm gemessen. In Abbildung 18 ist die Abnahme des mitochondrialen Membranpotentials in Abhängigkeit von der Stimulationszeit dargestellt. Man erkennt, daß es innerhalb von 210 min fast zu einer Halbierung des Fluoreszenzsignals kommt.

3.4 Untersuchung der Beteiligung von Apoptosis Inducing Factor (AIF)

3.4.1 Lebende Pneumokokken induzieren eine AIF-spezifische DNS-Degradation in zerebralen Endothelzellen

Das Protein AIF spielt beim alternativen programmierten Zelltod eine wichtige Rolle, da es unabhängig von Caspasen apoptotische Veränderungen in Zellen auslösen kann. Wesentliche Merkmale sind dabei die Kondensation des Zellkernes, die periphere Anordnung des Chromatins und die Spaltung der DNS in 50 kbp große Fragmente [large scale fragmentation] (Strasser et al., 2000; Susin et al,. 1999). Nachdem bereits in der Elektronenmikroskopie die für AIF typische Morphologie der Kerne der Endothelzellen beobachtet worden war, konnte in einem weiteren Experiment die spezifische Degradation der DNS in 50 kbp-Fragmente nachgewiesen werden (Abbildung 19).

Abbildung 19: Nachweis einer large scale fragmentation in 50-kbp-Fragmente. Endothelzellen wurden mit S. pneumoniae (R6, 107 cfu/ml) oder PBS (Kontrolle) inkubiert. Anschließend erfolgte eine Auftrennung der DNS mit Hilfe einer Pulsfeldgelelektrophorese. Ko=Kontrolle, M=Marker, kbp=Kilobasenpaare.


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Zerebrale Endothelzellen wurden hierzu 3, 5, 7 und 9 h mit S. pneumoniae in einer Konzentration von 107 cfu/ml inkubiert und eine Pulsfeldgelelektrophorese, die eine Auftrennung auch größerer DNS-Fragmente zuläßt, durchgeführt.

3.4.2 Beim endothelialen Zelltod durch lebende Pneumokokken kommt es zur Freisetzung von AIF aus den Mitochondrien in das Zytosol

In einem weiteren experimentellen Schritt sollte gezeigt werden, daß AIF von den Mitochondrien in das Zytosol transloziert wird.

Um dies zu untersuchen, wurde eine Fraktionierung der Bestandteile der zerebralen Endothelzellen in eine mitochondriale und eine zytosolische Komponente durchgeführt und AIF in einem Western Blot mit einem spezifischen Anti-AIF-Antikörper nachgewiesen.

In diesem in Abbildung 20 dargestellten Western Blot ist eine Abnahme von AIF in der mitochondrialen Fraktion und eine Zunahme im zytosolischen Kompartiment zu sehen, die etwa 3 h nach Inkubation mit S. pneumoniae beginnt und sich nach 5 h verstärkt.

Dies zeigt, daß AIF aus den Mitochondrien in das Zytosol freigesetzt wird und daß die Kinetik der Freisetzung mit der des beobachteten programmierten Zelltodes in zerebralen Endothelzellen übereinstimmt.

Abbildung 20: Translokation von AIF aus den Mitochondrien in das Zytosol. Die Endothelzellen wurden mit S. pneumoniae (Stamm R6, 107 cfu/ml) oder PBS (Kontrolle) inkubiert und eine zytosolische und mitochondriale Fraktion hergestellt. Anschließend wurde ein Western Blot mit einem spezifischen Anti-AIF-Antikörper durchgeführt. Ko = Kontrolle, kDa = Kilodalton


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3.5  Untersuchung der Rolle Pneumokokken-spezifischer Eigenschaften

3.5.1 Kapsel- und Adhäsionseigenschaften der Pneumokokken haben keinen Einfluß auf den programmierten Zelltod zerebraler Endothelzellen

Nach einer näheren Beschreibung und Untersuchung der Prozesse auf Seiten der Endothelzelle, sollte nun die Bedeutung verschiedener Eigenschaften von S. pneumoniae näher beleuchtet werden.

Hierzu wurde als erstes der Einfluß der Kapsel, einem wesentlichen Virulenzfaktor von Pneumokokken untersucht. Mit Hilfe der Acridinorange-Ethidiumbromid-Methode wurde die endotheliale Zelltodesrate durch den bekapselten Laborstamm D39 mit der seines unbekapselten jedoch sonst identischen Derivat R6 verglichen, wobei sich beide Pneumokokkenstämme im Verlauf der Inkubation der zerebralen Endothelzellen in vergleichbarer Weise vermehrten.

Abbildung 21 zeigt die Zelltod-Kinetik im Vergleich. Es traten keine signifikanten Unterschiede im prozentualen Anteil des programmierten Zelltodes auf, was darauf hinweist, daß die Kapsel keine entscheidende Rolle bei der Induktion des endothelialen Zelltodes spielt.

Abbildung 21: Kinetik des Zelltodes durch R6 (unbekapselt) und D39 (bekapselt). Zerebrale Endothelzellen wurden mit R6 (107 cfu/ml), D39 (107 cfu/ml) oder PBS (Kontrolle) inkubiert. Acridinorange-Ethidiumbromid-Methode. n = 9 bei 3 unabhängigen Experimenten.


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Ähnliche Resultate wurden beim Vergleich des Stammes R6 mit seinem Derivat CbpA- erhoben. Durch eine Mutation fehlt dem Pneumokokkenstamm CbpA- das Choline-binding protein A, ein Protein, das für die Bindung und Adhäsion von S. pneumoniae an Wirtszellen wichtig ist. Durch dieses Experiment sollte untersucht werden, ob die Adhäsion von S. pneumoniae beim Pneumokokken-induzierten Zelltod zerebraler Endothelzellen eine entscheidende Bedeutung hat. Es zeigte sich, daß das Fehlen des CbpA und damit das Binden der Pneumokokken an die Endothelzellen keinen Einfluß auf die Rate des endothelialen Zelltodes hatte (Abbildung 22).

Abbildung 22: Rate des Zelltodes durch R6 (unbekapselter Pneumokokkenstamm) und CbpA- (Derivat von R6 mit fehlendem Choline-binding protein A). Zerebrale Endothelzellen wurden mit R6 (107 cfu/ml), CbpA- (107 cfu/ml) oder PBS (Kontrolle) für 12 h inkubiert. Acridinorange-Ethidiumbromid-Methode. n = 9 bei 3 unabhängigen Experimenten.

3.5.2 H2O2 und Pneumolysin sind gemeinsam für den endothelialen Zelltod verantwortlich

Nachdem durch die oben beschriebenen Experimente ein Zusammenhang zwischen endothelialem Zelltod und bakteriellen Adhäsions- und Kapseleigenschaften unwahrscheinlich war, stellte sich die Frage, ob andere Faktoren, die z.B. nach der Lyse von Pneumokokken freigesetzt werden, für den endothelialen Zelltod verantwortlich sein könnten.

Es ist bekannt, daß S. pneumoniae mindestens zwei solcher Faktoren, Wasserstoffperoxid und das Poren-formende Toxin Pneumolysin, produziert, von denen bereits in Tierexperimenten eine Toxizität für Alveolar-Epithelzellen nachgewiesen werden konnte (Duane et al., 1993; Hirst et al., 2000).


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Um zunächst den Einfluß von Pneumolysin auf die Zelltodesrate zu untersuchen, wurde zur Inkubation ein von D 39 abstammender Pneumokokkenstamm verwandt, dem durch Mutation die Fähigkeit zur Produktion von Pneumolysin fehlt (PlnA-) und die endotheliale Zelltodrate mit der durch D 39 verglichen. Der zytotoxische Einfluß von Wasserstoffperoxid wurde durch die Zugabe des Enzyms Katalase näher untersucht, das durch die Katalysierung der Reaktion von H2O2 zu H2O und O2 zu einer Eliminierung von Wasserstoffperoxid führt. Durch die gleichzeitige Eliminierung von Pneumolysin (durch Verwendung des Stammes PlnA-) und H2O2 (durch Zugabe von Katalase) sollte zudem ein möglicher synergistischer Effekt der beiden Toxine nachgewiesen werden. Zerebrale Endothelzellen wurden hierzu mit D39 bzw. dem Pneumolysin-defizienten Stamm PlnA- in einer Konzentration von je 107 cfu/ml für 12 h inkubiert und in je 2 Untergruppen geteilt, von denen die eine zusätzlich mit Katalase (1250 U/ml) und die andere mit gleicher Menge PBS versetzt wurde. Anschließend wurden sie mit Ethidiumbromid und Acridinorange gefärbt und die Zelltodesrate der Endothelzellen quantifiziert. Als weiterer Zelltod-Nachweis wurde eine Anfärbung der apoptotischen Zellkerne mittels TUNEL durchgeführt. Es zeigte sich, daß die alleinige Blockierung einer der beiden Toxine nicht zu einer Inhibition des S. pneumoniae-induzierten Zelltodes führte. Bei einer gemeinsamen Blockierung von Pneumolysin und Wasserstoffperoxid konnte dagegen eine signifikanten Reduktion des Zelltodes erreicht werden (Abbildung 23 und 24).

Abbildung 23: Die gemeinsame Blockierung von Pneumolysin und Wasserstoffperoxid führt zur Inhibierung des S. pneumoniae-induzierten Zelltodes. Inkubation der Zellen mit D39, PlnA- (je 107 cfu/ml) oder PBS mit oder ohne Katalase (1250 U/ml) für 12 h und Färbung mit TUNEL (A-E) sowie mit Acridinorange und Ethidiumbromid (F-J). Balken = 50 µm.


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Abbildung 24: Die gemeinsame Blockierung von Pneumolysin und Wasserstoffperoxid führt zur Inhibierung des Zelltodes. 12 h Inkubation der Zellen mit D39, dem Pneumolysin-defizienten Stamm PlnA- (je 107 cfu/ml) oder PBS (Kontrolle) mit oder ohne Katalase (1250 U/ml). Acridinorange-Ethidiumbromid-Färbung. n=9 bei 3 unabhängigen Experimenten. Statistische Signifikanz bei * für p<0,001 (ungepaarter t-Test).

Die Hypothese, daß Pneumolysin und H2O2 gemeinsam für den Tod zerebraler Endothelzellen durch Pneumokokken verantwortlich sein könnte, konnte durch weitere Versuche bestätigt werden, in denen die Zelltod-Induktion eines unveränderten Pneumokokkenstammes (D 39) mit der eines Stammes mit einer zweifachen Mutation (PlnA-/SpxB-) verglichen wurde.

Die Doppelmutante PlnA-/SpxB- besitzt neben einem veränderten Gen für Pneumolysin auch eine fehlerhafte Pyruvatoxidase, und ist dadurch nicht in der Lage ist, adäquate Mengen H2O2 zu bilden. Aus diesem Grund liegen die von der Doppelmutante gebildeten Wasserstoffperoxid-Mengen deutlich unter 5 % im Vergleich zum Wildtyp D 39 (Braun et al., 2002).

Im Zeitverlauf war bereits nach 6 h mit 58,8 ± 5,1 % beim Wildtyp D 39 und 6,9 ± 1,8% bei der Doppelmutante PlnA-/SpxB- eine signifikante Inhibition des Zelltodes festzustellen. Auch nach 12-stündiger Inkubation zeigte sich zwischen D 39 (81,3 ± 3,7 %) und PlnA-/SpxB- (23,3 ± 3,7 %) wegen der fehlenden Pneumolysin- und H2O2-Produktion ein signifikanter Unterschied (Abbildung 25).


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Abbildung 25: Der Pneumolysin- und H2O2-defiziente Stamm PlnA-/SpxB- führt zur Inhibierung des endothelialen Zelltodes. 12-stündige Inkubation der Zellen mit D 39, dem Pneumolysin- und H2O2-defizienten Stamm PlnA-/SpxB- (je 107 cfu/ml) oder PBS (Kontrolle). Acridinorange-Ethidiumbromid-Methode. n = 9 bei 3 unabhängigen Experimenten.

3.5.3 Purifiziertes Pneumolysin und H2O2 können jeweils einen Zelltod in zerebralen Endothelzellen auslösen

Um zu untersuchen, ob Pneumolysin und H2O2 auch unabhängig voneinander in der Lage sind Zelltod zu induzieren, wurden zerebrale Endothelzellen mit purifiziertem Pneumolysin (0,1 µg/ml) oder H2O2 (20-2000 µg/ml) inkubiert und deren Morphologie mit Hilfe der Acridinorange-Ethidiumbromid-Methode beurteilt und quantifiziert. Die Konzentrationen der beiden Toxine wurden so gewählt, daß sie etwa pathophysiologischen Bedingungen entsprechen (Houldsworth et al., 1994; Pericone et al., 2000). Es zeigte sich, daß zugefügtes H2O2 zu Veränderungen der Zellkerne, einschließlich der Kondensation der Kerne sowie der peripheren Anordnung des Chromatins, führte, die mit den Veränderungen durch lebende Pneumokokken vergleichbar war. Bei einer Konzentration von 2000 μM trat eine Rate des programmierten Zelltodes von 67,5 ± 2,87 % auf (s. Abbildung 26).


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Abbildung 26: Zelltod zerebraler Endothelzellen nach Inkubation mit H2O2 (20-2000 µM) für 12 h. Prozentuale Darstellung der lebenden Zellen (grau), nekrotischen Zellen (weiß) und Zellen mit typischer Morphologie für programmierten Zelltod (grau). Acridinorange-Ethidiumbromid-Methode. n = 9 bei 3 unabhängigen Experimenten

Auch durch Pneumolysin allein kam es zu einer Induktion eines programmierten Zelltodes in zerebralen Endothelzellen, die, wie in Abbildung 27 ersichtlich, der Kinetik des Zelltodes durch S. pneumoniae ähnelte.

Abbildung 27: Kinetik des Zelltodes zerebraler Endothelzellen nach Stimulation mit purifiziertem Pneumolysin (0,1 µg/ml). Quantifizierung mit der Acridinorange-Ethidiumbromid-Methode. n=6, bei drei voneinander unabhängigen Experimenten.


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3.5.4  Die Induktion des endothelialen Zelltodes durch purifiziertes Pneumolysin ist an dessen zytolytische Aktivität gebunden

Die Virulenz von Pneumolysin ist mit mindestens zwei wichtigen Eigenschaften des Toxins verbunden: mit seiner Fähigkeit, die Komplementkaskade zu aktivieren und seiner zytolytischen Aktivität, die durch die Bildung einer transmembranären Pore zustande kommt (Mitchell, 2000).

Um die jeweilige Rolle dieser beiden Eigenschaften bei der Induktion des endothelialen Zelltodes zu testen, wurde die Zelltodraten durch Pneumolysin (Pln wt) mit denen zweier durch Mutationen veränderter Pneumolysin-Proteine, denen entweder die Fähigkeit zur Komplementaktivierung (D385N; Pln Kompl-) oder die zytolytische Aktivität (W433F; Pln Lys-) fehlten, verglichen. Die Herstellung und Testung der Eigenschaften des rekombinanten Pneumolysins erfolgte nach Mitchell et al. (1997).

Die Abbildung zeigt, daß nach 12-stündiger Inkubation mit dem veränderten Pneumolysin Pln Kompl- eine vergleichbare Zelltodrate erreicht wurde wie beim unveränderten Pneumolysin (Pln wt), während das Zytolyse-defiziente Pneumolysin (Pln Lys-) nicht in der Lage war, einen signifikanten Zellschaden in zerebralen Endothelzellen zu induzieren.

Dies weist darauf hin, daß die Fähigkeit von Pneumolysin, eine Zell-Lyse zu induzieren, hauptsächlich für dessen Fähigkeit zur Zelltodinduktion in zerebralen Endothelzellen verantwortlich ist.

Abbildung 28: Vergleich der Rate des Zelltodes nach 12 h Inkubation mit unverändertem Pneumolysin (Pln wt), Zytolyse-defizientem (Pln Zyt-) und Komplement-defizientem Pneumolysin (Pln Kompl-). n = 9, bei drei unabhängigen Experimenten.


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09.03.2005