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4  DISKUSSION

Ziel der vorliegenden Arbeit war es, den Effekt lebender Pneumokokken auf die Viabilität und Morphologie zerebraler mikrovaskulärer Endothelzellen, dem zellulären Hauptbestandteil der Blut-Hirn-Schranke, in einem Zellkultur-Modell zu untersuchen.

Insbesondere ging es dabei um die Frage, ob S. pneumoniae einen programmierten Zelltod in Endothelzellen induzieren kann und welche Eigenschaften von S. pneumoniae dabei eine Rolle spielen.

Hierbei ergaben sich folgende Resultate:

Diese Ergebnisse sollen in den folgenden Abschnitten im Einzelnen diskutiert werden.


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4.1  Pneumokokken als Auslöser von programmiertem Zelltod

Die Induktion und Modulation von programmiertem Zelltod scheint eine wichtige Strategie von Bakterien bei der Pathogenese von Infektionen zu sein. Extrazelluläre Bakterien profitieren durch diesen Mechanismus, indem sie Wirtszellen und Immunzellen eliminieren, inflammatorische Prozesse modulieren und dadurch der effektiven Bekämpfung durch das Immunsystem entgehen (Zychlinsky und Sansonetti, 1997). Dabei benutzen die verschiedenen Erreger unterschiedliche Wege, um Apoptose auszulösen, z.B. über die direkte Aktivierung von Caspase 1 (Hersh et al., 1999), Caspase 3 (Gao et al., 1999), die Inhibierung von NFκB (Ruckdeschel et al., 1998) und die Signaltransduktion über Fas- oder Toll-Like-Rezeptoren (Baran et al., 2001; Aliprantis et al., 1999). Auf der anderen Seite ist es auch aus Sicht des Immunsystems sinnvoll, daß Zellen, die mit intrazellulären Erregern infiziert sind, durch Apoptose sterben und eliminiert werden. Da diese intrazellulären Bakterien vom Überleben der Wirtszellen abhängen, wird so eine weitere Ausbreitung eingeschränkt (Hotchkiss et al., 2002).

Auch S. pneumoniae kann Apoptose auslösen. Untersuchungen an Tiermodellen zeigten, daß die Apoptose von Neuronen im Gyrus dentatus ein entscheidender Schädigungsmechanismus bei der Pneumokokkenmeningitis ist (Zysk et al., 1996; Braun et al., 1999). Damit übereinstimmend führte im Tiermodell die Gabe des Caspaseninhibitors zVAD-fmk zu einer Verringerung des neuronalen Zelltodes um etwa 50 % und zu einer signifikanten Reduktion der Liquor-Zellzahl (Braun et al., 1999). Diese neuronale Apoptose scheint zu einem großen Teil durch wirtseigene Entzündungsmediatoren (TNFα und IL-1β) ausgelöst zu werden. Jedoch wurde zusätzlich aufgrund der selektiven Vulnerabilität der Neuronen des Gyrus dentatus und ihrer Nähe zum Ventrikelsystem als dem Replikationsort der Bakterien spekuliert, daß auch direkte toxische Effekte von S. pneumoniae von Bedeutung sein könnten (Braun et al., 1999).

Einschränkend muß zu dieser Theorie über eine direkte Schädigung der Neuronen durch S. pneumoniae allerdings festgestellt werden, daß sich die Bakterien im Subarachnoidalraum vermehren und erst in der Endphase der bakteriellen Meningitis in das Hirnparenchym eindringen. Dies bedeutet, daß es erst sehr spät zu einem direkten Kontakt zwischen Neuronen und Pneumokokken im Gyrus dentatus kommt.

Im Gegensatz zu einem möglichen späten Kontakt mit Neuronen kommen lebende Pneumokokken bereits in einem viel früheren Stadium mit den Zellen der Blut-Hirn-Schranke in direkten Kontakt (Leib und Täuber, 1999), ohne daß es einer intraparenchymatösen Invasion bedarf. Daher dürften direkte toxische Effekte von S. pneumoniae auf zerebrale Endothelzellen [Seite 61↓]und der dadurch ausgelöste Zelltod von Endothelzellen von tatsächlicher biologischer Bedeutung für die Schädigung der Blut-Hirn-Schranke und von klinischer Relevanz sein.

In der vorliegenden Arbeit konnte gezeigt werden, daß lebende Pneumokokken in einer klinisch relevanten Konzentration von 107 cfu/ml über eine Induktion von programmiertem Zelltod rasch zu einer Destruktion von zellulären Bestandteilen der Blut-Hirn-Schranke führten.

Für diesen Nachweis wurde ein in-vitro-Zellkultursystem mit primären mikrovaskulären Endothelzellen aus zerebralen Kapillaren von Ratten verwendet. Dieses Zellkulturmodell der Blut-Hirn-Schranke ist deshalb für die durchgeführten Untersuchungen geeignet, da die Zellen einen konfluenten Monolayer ausbilden und bestimmte Transporteigenschaften besitzen, die mit denen der Blut-Hirn-Schranke in vivo vergleichbar sind (Audus et al., 1996). Zudem hat das Zellkulturmodell einem in-vivo-Modell gegenüber entscheidende Vorteile. Unabhängig von zusätzlichen Einflüssen, z.B. der wirtseigenen Immunantwort eines tierexperimentellen Modells, können die direkten Effekte von Pneumokokken auf zelluläre Bestandteile der Blut-Hirn-Schranke untersucht und genauer charakterisiert werden. Hinzu kommt, daß der Nachweis des apoptotischen Zelltodes von Endothelzellen in vivo nur sehr schwierig zu führen ist, da sich Endothelzellen nach Abschluß des Zelltodes von der Basalmembran ablösen und mit dem Blutstrom weggeschwemmt oder durch Makrophagen phagozytiert werden (Hotchkiss et al., 2002).

Aus diesen Gründen war es trotz der technisch anspruchsvollen und zeitaufwendigen Präparation der Endothelzellen aus 3 Wochen alten Ratten von Vorteil, primäre zerebrale Endothelzellen als Modell zur Untersuchung der Interaktion von Pneumokokken und der Blut-Hirn-Schranke zu verwenden.

4.2 Nachweis des programmierten Zelltodes

Die Detektion der Apoptose erfolgte durch unterschiedliche Methoden.

Die erste, auf einem Nachweis von DNS-Strangbrüchen basierende TUNEL-Methode gehört zu den am meisten verwendeten Apoptoseassays. Zu den Vorteilen dieser Methode gehört die vergleichsweise einfache Durchführbarkeit und die große Sensitivität. Sie kann sowohl bei adhärenten Zellen (wie den Endothelzellen) als auch bei nicht-ahärenten Zellen angewendet werden (Sgonc und Gruber, 1998). Nachteilig ist die eingeschränkte Spezifität. Es sind Fälle beschrieben worden, in denen unbehandelte und eigentlich vitale Zellen abhängig vom verwendeten Protokoll eine falsch-positive Reaktion zeigten (Stähelin et al., 1998). Dies trat jedoch erst ab einer Inkubationszeit mit Proteinase K, einem Inkubationsschritt der TUNEL-Methode, von über 15 min auf. In dieser Arbeit wurde ein Protokoll mit einer nur 8-minütigen [Seite 62↓]Inkubation mit Proteinase K verwendet, so daß eine falsch-positive Färbung von vitalen Zellen unwahrscheinlich ist.

Desweiteren ist gezeigt worden, daß auch nekrotische Zellen, bei denen eine massive DNS-Degradation auftritt, falsch-positiv angefärbt werden können (Mirakian et al., 2002). Um dies im Fall des untersuchten Zelltodes auszuschließen, wurden die Endothelzellen nach Infektion mit Pneumokokken zusätzlich mit zwei weiteren Methoden evaluiert, die auf dem Nachweis von charakteristischen morphologischen Merkmalen der Zelle bei Apoptose basieren. Diese gehören zum Goldstandard unter den Detektionsmethoden des programmierten Zelltodes (Smolewski et al., 2003).

Durch eine Färbung mit den fluoreszierenden DNS-Farbstoffen Acridinorange und Ethidiumbromid wurde die Morphologie von zerebralen Endothelzellen fluoreszenzmikroskopisch untersucht. Die Verwendung zweier Farbstoffe, von denen der eine durch intakte Zellmembranen diffundieren kann (Acridinorange) und der andere ausgeschlossen wird (Ethidiumbromid), ist deshalb von Vorteil, da zusätzlich die Aussage getroffen werden kann, ob die Zellmembran intakt oder durchlässig ist, und damit, ob es sich um ein frühes oder spätes Stadium des Zelltodes handelt. Dadurch ist eine Differenzierung zwischen lebenden Zellen und Zellen mit apoptotischer oder nekrotischer Morphologie leichter möglich (Braun et al., 2001).

Zusätzlich wurden elektronenmikroskopische Aufnahmen angefertigt, in denen durch die noch stärkere Vergrößerung auch subzelluläre Merkmale wie die Anordnung des Chromatins im Zellkern gut dargestellt werden konnten.

Durch diese beiden Methoden konnte nachgewiesen werden, daß es in Pneumokokken-behandelten Zellen zu Veränderungen in der Zellmorphologie kommt: zu einem Schrumpfen der gesamten Zelle, einer Kondensation des Zellkernes und zu einer peripheren Anordnung des Chromatins im Zellkern. Zusätzlich zeigte sich eine Blasenbildung (Blebbing) der Kernmembran. Erst spät im Zuge des endothelialen Zelltodes war eine Permeabilisierung der Zellmembran und damit Rotfärbung der Zellen durch den nicht-diffusiblen Kernfarbstoff Ethidiumbromid festzustellen.

Diese morphologischen Merkmale sind untypisch für den nekrotischen Zelltod, da bei Nekrose der Zellkern in der Regel nicht kondensiert und schon früh eine Permeabilisierung der Zellmembran eintritt. Vielmehr sind wichtige morphologische Kriterien der Apoptose erfüllt.

Auffällig ist, daß es, im Gegensatz zu den mit Staurosporin inkubierten Zellen, nicht zu einer kompletten Fragmentierung des Kernes, einer vollständigen Kondensation des Chromatins oder zur Bildung von apoptotischen Körperchen kam. Mit dieser nur partiellen Kondensation des [Seite 63↓]Chromatins entspricht das Aussehen der Zellkerne dem Stadium I der apoptotischen Chromatinkondensation, das in einer frühen Phase der Apoptose auftritt und zeitlich mit einer Translokation von AIF in den Kern assoziiert ist (Daugas et al., 2000).

Stadium II ist als Endstadium der nukleären Apoptose durch eine kompaktere Kondensation des Chromatins ohne (IIa) oder mit (IIb) Bildung apoptotischer Körperchen gekennzeichnet (Loeffler et al., 2001b; Daugas et al., 2000) und vom Vorhandensein von aktiven Caspasen und einer Aktivierung der Caspase activated DNase (CAD) abhängig. Die Zugabe von Caspasen-Inhibitoren in in-vitro-Experimenten führt zu einem Arrest einer Staurosporin-induzierten nukleären Apoptose im Stadium I (Daugas et al., 2000).

Da beim Zelltod durch S. pneumoniae lediglich Stadium I, nicht jedoch Stadium II nachzuweisen ist, kann spekuliert werden, daß die Exekution der nukleären Apoptose nicht vollständig abläuft.

4.3 Fehlende Aktivierung der Caspasen

Caspasen spielen bei der Initiierung und Exekution der klassischen Apoptose eine wichtige Rolle. Zur näheren Charakterisierung des endothelialen Zelltodes durch S. pneumoniae sollte überprüft werden, ob und zu welchem Zeitpunkt hierbei Caspasen aktiviert werden.

Aus diesem Grund wurde zunächst ein Blockierungsversuch mit dem Breitspektrum-Caspase-Inhibitor zVAD-fmk durchgeführt, einem Caspase-Hemmer, der alle Mitglieder der Caspasefamilie irreversibel inhibiert und deshalb für den allgemeinen Nachweis der Beteiligung von Caspasen häufig verwandt wird.

Es zeigte sich, daß der Pneumokokken-induzierte Zelltod durch die Zugabe von zVAD-fmk nicht signifikant reduziert werden konnte. Da die Inkubation mit zVAD-fmk in den Staurosporin-behandelten Zellen zu einer fast vollständigen Hemmung der Apoptose führte, ist nicht eine mangelnde Aktivität von zVAD-fmk in unserem Assay, sondern eher eine fehlende Beteiligung der Caspasen anzunehmen.

Als nächster Schritt wurde eine direkte Messung der Caspasen-3, -8 und -9 durchgeführt. Diese drei Caspasen wurden ausgewählt, da sie mit der Caspase-8 aus dem extrinsischen Signalweg, der Caspase-9 aus dem intrinsischen Weg und der Caspase-3 als wichtigster Exekutor-Caspase die entscheidenden Caspasen darstellen (Nicholson, 2000). Die Messung der Caspaseaktivität erfolgte in Anlehnung an Braun et al. (2001) als Einzeitmessungen nach 60 min. Diese Vorgehensweise wurde gewählt, weil in diesem Zeitraum auch für höhere Caspasekonzentrationen eine nahezu lineare Korrelation zwischen Reaktionszeit und gemessener [Seite 64↓]Fluoreszenz (Emission) angenommen werden kann, wie aus Implementierungsversuchen in unserem Labor sowie bei Namura et al. (1998) zu erkennen war.

Die Caspaseaktivität der Pneumokokken-behandelten Proben war dabei nicht signifikant gegenüber der Negativkontrolle erhöht, was die Hypothese einer fehlenden Beteiligung zumindest dieser drei gemessenen Caspasen unterstützt.

Um einen weiteren Anhalt für die Richtigkeit dieser Hypothese zu erhalten, wurde in einem Western Blot untersucht, ob ein bestimmtes zelluläres Protein (α-Fodrin), das während der klassische Apoptose von aktivierten Caspasen in typische Untereinheiten gespalten wird, nach Exekution des endothelialen Zelltodes in dieser gespaltenen Form vorliegt. Auch hier konnte nur in der Positivkontrolle mit Staurosporin eine Spaltung von α-Fodrin als Zeichen von aktivierten Caspasen detektiert werden, während die Pneumokokken-behandelten Zellen nicht dieses für die Aktivierung von Caspasen typische Muster zeigten.

Aus den Ergebnissen dieser drei unterschiedlichen experimentellen Ansätze kann geschlußfolgert werden, daß Caspasen – zumindest die direkt gemessenen bzw. durch den Breitspektrum-Caspase-Inhibitor zVAD-fmk hemmbaren – für den Ablauf des Zelltodes von zerebralen Endothelzellen keine entscheidende Funktion haben.

Zusätzlich wird dies durch die Beobachtung gestützt, daß die Morphologie der Zellkerne der Endothelzellen nie über das nukleäre Apoptose-Stadium I hinausgeht, es also zu keiner Caspasen-abhängigen kompletten Fragmentation des Kernes oder Bildung apoptotischer Körperchen kommt. Dies ist deshalb von Bedeutung, da die Exekution der klassischen Apoptose per definitionem strikt an die Aktivierung von Caspasen gebunden ist.

In den letzten Jahren gibt es jedoch immer mehr Evidenz für einen programmierten Zelltod ohne Aktivierung von Caspasen (Leist und Jäättelä, 2001). Dieser Caspasen-unabhängige programmierte Zelltod, der auch bei dem hier untersuchten Phänomen vorzuliegen scheint, hebt sich klar von der klassischen Apoptose ab, teilt aber auch wichtige Merkmale mit ihr. So kann auch der Caspasen-unabhängige programmierte Zelltod durch Todesrezeptoren und durch mitochondriale Veränderungen ausgelöst werden. Zudem sind auch die Auswirkungen auf benachbarte Zellen (Elimination der Zellreste ohne Inflammation) mit denen der klassischen Apoptose vergleichbar.

Die Exekution des Zelltodes übernehmen dabei Proteasen, die nicht zur Familie der Caspasen gehören (Leist und Jäättelä, 2001). Zu den „Nicht-Caspase-Proteasen“ gehören z.B. Calpain, Cyscathepsine, Serinproteasen und Cathepsin D (Leist und Jäättelä, 2001). Diese können die klassischen Caspase-Substrate spalten und so die zellulären Effekte von Caspasen nachahmen (Johnson et al., 2000; Wang, 2000). So sind beispielsweise Cathepsin D im Camptothecin-[Seite 65↓]induzierten Zelltod von Leber-Karzinom-Zellen (Roberts et al., 1999), Cathepsin B in mit TNFα behandelten Fibrosarkomzellen (Foghsgaard et al., 2001) oder Calpain in Vitamin-D-behandelten Brustkrebszellen (Mathiasen et al., 1999) für die Exekution des Zelltodes hauptsächlich verantwortlich.

Auch beim hier untersuchten Pneumokokken-induzierten programmierten Zelltod ist eine Beteiligung von „Nicht-Caspase-Proteasen“ vorstellbar. Die Identifizierung der beteiligten Proteasen wird dabei weiteren Projekten vorbehalten sein.

4.4 Intrazelluläres Calcium und mitochondriales Membranpotential

Der Influx von extrazellulärem Calcium bzw. die Freisetzung von Calcium aus intrazellulären Depots in das Zytoplasma und in die Mitochondrien werden in verschiedenen Apoptosemodellen vor dem Auftreten von morphologischen Apoptosecharakteristika beobachtet (Rizzuto et al., 2003). Eine Erhöhung der mitochondrialen Calciumkonzentration führt zu einer Freisetzung von proapoptotischen Proteinen (z.B. Cytochrom c und AIF) und/oder zu einer Störung der mitochondrialen Atmungskette (Hajnoczky et al., 2003). Die hierdurch entstehenden Sauerstoffradikale bewirken eine Freisetzung von Calcium aus dem Endoplasmatischen Retikulum und eine weitere Erhöhung der Calciumkonzentration im Mitochondrium, was wiederum die Permeabilisierung der Mitochondrienmembran und den oxidativen Streß erneut steigert. Dieser Circulus vitiosus führt letztlich zum Tod der Zelle (Jacobson et al., 2002). Die genauen Mechanismen der Calcium-Homöostase in der Zelle bzw. den Zellorganellen im Zusammenhang mit dem Zelltod sind äußerst komplex reguliert. Dabei spielen auch die Mitglieder der Bcl-2-Familie, einer großen an der Regulation von Apoptose beteiligten Familie von Proteinen, eine Rolle. So führt beispielsweise eine Überexpression von bcl-2 zu einer Senkung der endoplasmatischen Calciumkonzentration und daraus folgend zu einer Änderung der Sensitivität gegenüber apoptotischen Stimuli (Rizzuto et al., 2003).

Im folgenden Teil der Arbeit sollte untersucht werden, ob es auch beim Pneumokokken-induzierten endothelialen Zelltod zu einer Erhöhung des intrazellulären freien Calciums kommt, das wiederum über eine Schädigung der Mitochondrien an der Destruktion der Zelle beteiligt sein könnte.

Hierzu wurden zerebrale Endothelzellen mit dem unbekapselten Pneumokokkenstamm R6 stimuliert und anschließend mit dem Calciumsensitiven Fluoreszenzfarbstoff Fluo-4 AM behandelt. Dieser Stoff bindet hochspezifisch an freies Calcium und ist durch seine Acetoxyacetylester-(AM)-Gruppe in der Lage, die Lipid-Doppelschicht der Zellmembran zu [Seite 66↓]überqueren. Im Zytoplasma der Zelle werden diese AM-Gruppen durch unspezifische Esterasen gespalten. Hierdurch kann Fluo-4 an freie Calcium-Ionen binden, was letztlich in einer etwa 100-fachen Erhöhung der Emission des Fluoreszenzfarbstoffes resultiert. Zusätzlich führt die Abspaltung der AM-Gruppe zu einer Abnahme der Lipophilität von Fluo-4, so daß der Calcium-Indikator nicht mehr aus der Zelle diffundieren kann. Dadurch kann eine Aussage über die relative Veränderungen des intrazellulären Calciumgehaltes getroffen werden. Zu beachten ist allerdings, daß verschiedene Faktoren, die von der eigentlichen intrazellulären Calciumkonzentration unabhängig sind, zu einer Beeinflussung des Fluoreszenzsignals führen können (Takahashi et al., 1999),

Solche beeinflussenden Faktoren sind beispielsweise die Autofluoreszenz des zellulären Monolayers insbesondere durch die Pyridin-enthaltenden Nukleotide oder eine inkomplette Hydrolysierung der Estergruppe mit daraus folgender unzureichender Bindung von Calcium-Ionen. Weiterhin ist eine unspezifische Bindung an intrazelluläre Proteine und Ionen z.B. Mangan vorstellbar, die mit zu geringen Emissionswerten einhergehen würden. Auch ein Übertreten des intrazellulär lokalisierten Farbstoffes in das extrazelluläre Medium wäre möglich. Dieses leakage würde ebenfalls zu erniedrigten Meßwerten führen. Aus diesen Gründen ist eine kritische Interpretation der Ergebnisse nötig.

Trotz dieser methodischen Einschränkungen, wurde die Färbung mit Fluo-4 AM für eine relative Aussage über die Veränderungen des intrazellulären Calciumgehaltes häufig für vergleichbare Fragestellungen verwendet (Braun et al., 2002; Takahashi et al., 1999).

Die Behandlung von zerebralen Endothelzellen mit lebenden Pneumokokken in einer Konzentration von 107 cfu/ml führte zu einer raschen und signifikanten Erhöhung des Fluoreszenzsignals. Innerhalb von 2,5 h kam es zu einer Verdopplung des gemessenen Ausgangswertes, nach einer weiteren Stunde zu einer Verdreifachung. Vergleicht man nun die Kinetik der intrazellulären Calciumkonzentration mit der Kinetik der morphologischen Veränderungen der Zellen, läßt sich feststellen, daß der Calciumanstieg früher auftritt. Übereinstimmend mit Untersuchungen in Neuronen, in denen unterschiedliche Agentien über eine intrazelluläre Erhöhung von Calcium zu Apoptose führen (Lipton und Nicotera, 1998) ist es demnach wahrscheinlich, daß die Veränderungen des Calciumgehaltes an der Regulation des endothelialen Zelltodes ursächlich beteiligt sind.

Um diese Annahme zu bestätigen, wurden die Endothelzellen mit dem intra- und extrazellulären Calciumchelator BAPTA-AM vorinkubiert und anschließend mit Pneumokokken behandelt. Hierbei konnte eine signifikante Reduktion der Zelltodrate auf etwa die Hälfte festgestellt [Seite 67↓]werden, was demonstriert, daß die Konzentrationszunahme des Calciums für den Pneumokokken-induzierten Zelltod zumindest teilweise von Bedeutung sein muß.

Die Zunahme der mitochondrialen Calciumkonzentration kann zu einer Schädigung des Mitochondriums und zu einer Öffnung der permeability transition pores in den Mitochondrien führen (Crompton, 1999). Diese Poren, die durch einen Komplex von mitochondrialen Proteinen zwischen innerer und äußerer Mitochondrienmembran entstehen, führen im Rahmen des intrinsischen Apoptoseweges zur Freisetzung von proapoptotischen Proteinen. Zudem geht die Öffnung mit einer Abnahme des mitochondrialen Membranpotentials ΔφM einher, da das Mitochondrium nicht mehr in der Lage ist, einen Protonengradienten über der inneren Mitochondrienmembran aufrechtzuerhalten (Zamzami et al., 1996).

Um der Frage nachzugehen, ob die Stimulation mit Pneumokokken zu einer frühen Abnahme von ΔφM als Ausdruck einer (Calcium-induzierten) Schädigung der Mitochondrien führt, wurden Pneumokokken-behandelte Endothelzellen mit dem Fluoreszenzfarbstoff Tetramethylrhodaminester (TMRE), einem Rhodamin-Farbstoff, inkubiert. Diese sind kationische, lipophile Stoffe, die selektiv Mitochondrien abhängig von ihrem negativen Membranpotential anfärben. Veränderungen des transmembranären Potentials führen zu einer Änderung der mitochondrialen Fähigkeit, diesen Farbstoff aufzunehmen bzw. zu speichern, was letztlich in einer meßbaren Abnahme des Fluoreszenzsignals resultiert.

Dies konnte bereits nach einer kurzen Zeit nach Inkubation mit S. pneumoniae festgestellt werden: nach etwa 3 h kam es nahezu zu einer Halbierung der TMRE-Fluoreszenz, was die Aussage über eine frühe Schädigung der Mitochondrien stützt.

Zusammenfassend läßt sich feststellen, daß es durch S. pneumoniae zu einem Einstrom von Calcium aus intrazellulären Depots und/oder aus dem extrazellulären Medium in das Zytoplasma kommt, was, wahrscheinlich über eine rasche mitochondriale Schädigung, ursächlich zum endothelialen Zelltodes beiträgt.

4.5 Beteiligung von Apoptosis Inducing Factor (AIF)

Nachdem der Nachweis einer frühen mitochondrialen Schädigung erbracht war, stellte sich die Frage, ob AIF, als ein zwischen der inneren und äußeren Mitochondrienmembran lokalisiertes Protein, im Rahmen dieser Schädigung freigesetzt wird. Dies ist insbesondere deshalb von Interesse, da AIF unabhängig von der Aktivierung von Caspasen zu programmiertem Zelltod führen kann und aus diesem Grund als wichtiger auslösender Faktor in Frage kommt.


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Wahrscheinlich war die Annahme einer Beteiligung von AIF auch deshalb, da bei den Pneumokokken-behandelten Endothelzellen eine charakteristische, durch eine periphere Kondensation des Chromatins gekennzeichnete Kernmorphologie zu beobachten war. Diese dem Apoptosestadium I entsprechende Kondensation des Zellkernes konnte in verschiedenen Arbeiten als AIF-spezifisches Phänomen identifiziert werden (Leist und Jäättelä, 2001; Susin et al., 1999; Dougas et al., 2000).

Durch welche Mechanismen bzw. Interaktionen AIF zu dieser nukleären Veränderung führt, ist noch unbekannt, da AIF selbst keine Nuklease-Aktivität aufweist (van Gurp et al., 2003). Bekannt ist jedoch, daß AIF mit der Endonuclease G interagiert, die Caspasen-unabhängig DNS degradieren kann (Hansen und Nagley, 2003).

Biochemisch geht die periphere AIF-induzierte Fragmentierung des Kernes mit einer Degradation der genomischen DNS in 50 kbp-große Fragmente einher (van Gurp et al., 2003).

Durch die Auftrennung der DNS von Pneumokokken-behandelten zerebralen Endothelzellen in einer Pulsfeldgelelektrophorese, mit der man insbesondere große DNS-Fragmente gut darstellen kann, konnte in dieser Arbeit dieses spezifische Degradationsmuster nachgewiesen werden. Diese auch als large scale fragmentation bezeichnete Spaltung stellte sich ab einer 5-stündigen Inkubation der Endothelzellen mit S. pneumoniae deutlich dar und nahm im Laufe einer weiteren 2-stündigen Inkubation zu. Damit stimmt diese Kinetik mit der Kinetik der morphologischen Veränderungen der Endothelzellen weitestgehend überein, die ebenfalls zwischen der dritten und sechsten Stunde nach Inkubation mit Pneumokokken auftreten und im weiteren Verlauf zunehmen.

Des weiteren sollte nachgewiesen werden, ob AIF im Rahmen des endothelialen Zelltodes aus den Mitochondrien in das Zytosol transloziert wird. Hierzu wurde eine Fraktionierung der Endothelzellen in ihre mitochondrialen und zytosolischen Untereinheiten durchgeführt und AIF mit einem spezifischen Antikörper in einem Western Blot nachgewiesen. In Abhängigkeit von der Inkubationszeit mit S. pneumoniae nahm AIF in der mitochondrialen Fraktion ab und in der zytosolischen Fraktion zu. Hieraus kann geschlußfolgert werden, daß AIF (ausgelöst durch eine Calcium-induzierte mitochondriale Schädigung) in das Zytosol gelangt und darauffolgend zu den apoptosetypischen Veränderungen des Zellkernes und der Zelle führt, wobei Calcium als ein Faktor für die Freisetzung von AIF bereits bekannt ist (Susin et al., 1999).

Geht man davon aus, daß neben AIF auch das ebenfalls im intermembranären Spalt lokalisierte proapoptotische Protein Cytochrom c in das Zytosol gelangt, stellt sich die Frage, warum es nicht zu einer Aktivierung von Caspasen und damit zum Ablauf einer klassischen Apoptose kommt. Im normalen Fall bildet Cytochrom c im Rahmen des intrinsischen, durch die Mitochondrien [Seite 69↓]regulierten Apoptoseweges mit Apaf-1, Procaspase 9 und dATP einen Komplex (Apoptosom), durch den eine Aktivierung der Capasen-Kaskade initiiert wird (Green, 2000).

Ausgehend von dieser Überlegung kann spekuliert werden, daß möglicherweise ein nicht vollständig funktionstüchtiges Apoptosom vorliegt, wodurch der Ablauf einer klassischen, intrinsisch ausgelösten Apoptose verhindert wird. Für die fehlende Funktionalität könnte es verschiedene Gründe geben.

Vorstellbar ist zum einen, daß es im Zuge des endothelialen Zelltodes und der frühen Schädigung der Mitochondrien zu einem Mangel an dATP kommt. Damit würde ein essentieller Bestandteil des Apoptosoms fehlen und seine mangelnde Funktionstüchtigkeit sowie fehlende Aktivierung der Caspase 9 und 3 erklären. Schon 1997 konnte gezeigt werden, daß bei gleichem auslösenden apoptotischen Stimulus der Energielevel in der Zelle entscheidet, ob der Zelltod mit oder ohne Aktivierung von Caspasen abläuft (Leist et al., 1997). Für diese Theorie spräche auch die Tatsache, daß die nukleären und zellulären Prozesse durch AIF nicht ATP-abhängig sind. Im Hinblick auf den endothelialen Zelltod hieße dies beispielsweise, daß es zwar durch AIF ATP-unabhängig zu einer nukleären Apoptosestadium I kommt, eine vollständige Exekution der klassischen Apoptose (mit einem nukleären Apoptosestadium II) durch Energiemangel jedoch nicht ablaufen kann.

Weiterhin wäre es auch möglich, daß eine Überaktivierung von intrazellulär vorhandenen Inhibitoren der Caspasen, z.B. den sogenannten IAPs (inhibitors of apoptosis proteins), eine Initiierung der Caspasen-Kaskade verhindert.

Bis zum jetzigen Zeitpunkt sind 8 verschiedene IAPs in der Säugetierzelle bekannt (LeBlanc, 2003). Sie können Caspasen durch zwei verschiedene Mechanismen hemmen: durch eine direkte Interaktion und durch eine Proteasom-vermittelte Degradation von Caspasen. Neben einer transskriptionalen Regulation der IAPs beispielsweise durch NFκB und MAP-Kinasen, werden sie durch verschiedene Faktoren (z.B. Smac/Diablo) negativ posttranslational reguliert, d.h. in ihrer Aktivität gehemmt (LeBlanc, 2003).

Würde man nun eine Funktion der IAPs im hier untersuchten Caspasen-unabhängigen endothelialen Zelltod annehmen, wäre es wegen der raschen Kinetik des Zelltodes von besonderem Interesse nachzuweisen, ob posttranslational negativ regulierende Proteine hieran beteiligt sind und ob eventuell direkte Virulenzfaktoren von S. pneumoniae dabei eine Rolle spielen.

Diese Fragestellungen sind zukünftigen Studien vorbehalten.


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4.6  Kapsel- und Adhärenzeigenschaften von S. pneumoniae

Neben den ablaufenden Mechanismen auf Seiten der Endothelzelle sind in einem weiteren Teil der Arbeit Eigenschaften von S. pneumoniae untersucht worden, die zur Induktion des Zelltodes beitragen könnten.

Hierzu wurde als erster Schritt der Einfluß der Kapsel- und Adhärenzeigenschaften von S. pneumoniae auf die Zelltodrate näher untersucht.

Der Vergleich zwischen einem bekapselten (D39) und einem unbekapselten Pneumokokkenstamm (R6) bei sonst identischen Eigenschaften zeigte keinen Unterschied in Kinetik und Ausmaß des endothelialen Zelltodes. Dies weist darauf hin, daß die Kapsel von S. pneumoniae keinen entscheidenden Einfluß auf die hier untersuchten Prozesse hat.

Ein ähnliches Ergebnis erbrachte der Vergleich zwischen dem unbekapselten Wildtyp-Stamm (R6) und einer Pneumokokken-Mutante (CbpA-), bei der das Gen für das Oberflächenprotein Choline-binding protein A (CbpA) ausgeschaltet ist. Durch CbpA wird die Bindung und Adhärenz von S. pneumoniae an Endothelzellen erleichtert. Dieses Protein trägt neben dem in der Bakterienzellwand lokalisierten Phosphorylcholin durch seine Interaktion mit einem endothelialen Rezeptor (PAF-Rezeptor) hauptsächlich zum Übertritt von S. pneumoniae über endotheliale Barrieren und damit zur Invasivität des Erregers bei (Ring et al., 1998). Wegen der Bedeutung von CbpA für die bakterielle Invasion sollte untersucht werden, ob CbpA zu einer Modulation des Zelltodes, etwa durch eine stärkere Adhärenz der Pneumokokken an die Endothelzellen, führt. Dies konnte im Vergleich zwischen Wildtyp- und dem CbpA-defizienten Pneumokokkenstamm nicht bestätigt werden.

4.7 Rolle von Wasserstoffperoxid und Pneumolysin

Durch die Verwendung von Pneumokokkenmutanten konnten im letzten Abschnitt dieser Arbeit die beiden Faktoren von S. pneumoniae identifiziert werden, die für den endothelialen Zelltod verantwortlich sind: Wasserstoffperoxid und Pneumolysin. Diese beiden Toxine wirken dabei synergistisch, sind aber auch jeweils unabhängig voneinander in der Lage, einen Zelltod in Endothelzellen auszulösen. Wird nur eines dieser beiden Toxine (durch Knockout-Mutation oder Zugabe des Wasserstoffperoxid-abbauenden Enzyms Katalase) gehemmt, stellt man eine ähnlich hohe Zelltodrate fest, wie dies ohne inhibierende Behandlung der Fall ist.

Eine gleichzeitige Hemmung beider Faktoren führt zu einer nahezu vollständigen Aufhebung der zytotoxischen Potenz von S. pneumoniae. Hinsichtlich der wahrscheinlichen pathogenetischen [Seite 71↓]Bedeutung für die Integrität der Blut-Hirn-Schranke ist dieses Ergebnis deshalb von Bedeutung, weil diese beiden Toxine gemeinsames Ziel einer potentiellen Entwicklung von Therapeutika sein könnten bzw. sollten.

Wasserstoffperoxid, das in großen Mengen von S. pneumoniae gebildet wird (Duane et al., 1993) kann leicht in eukaryonte Zellen diffundieren und dort eine oxidative Schädigung anrichten. Zusätzlich kann es auch von der Wirtszelle selbst bei gestörter mitochondrialer Funktion produziert werden. Um zu untersuchen, ob das bakterielle und/oder das intrinsisch in der Endothelzelle entstehende H2O2 für die Zytotoxizität verantwortlich sind, wurde einerseits eine Pneumokokkenmutante (PlnA-/SpxB-) verwendet, der neben Pneumolysin auch das Enzym zur Bildung von H2O2 fehlt. Andererseits konnte durch Zugabe des H2O2-abbauenden Enzyms Katalase zur Pneumolysin-defizienten Pneumokokkenmutante (PlnA-) untersucht werden, ob auch eine intrinsische Bildung von H2O2 beteiligt sein könnte. Da die Ausschaltung der bakteriellen Produktion von H2O2 zu einer signifikanten Reduktion des endothelialen Zelltodes führte, kann man davon ausgehen, daß diese die hauptsächliche Quelle für die Bildung des H2O2 darstellt. Jedoch kann auch eine intrinsische Produktion von H2O2 angenommen werden, da die Behandlung mit Katalase zu einer leicht höheren Hemmung der Zelltodesrate führte.

Es ist bekannt, daß Wasserstoffperoxid über eine Schädigung von Membranen und eine Störung der ATP-Produktion zu Apoptose führen kann (Cochrane, 1991). Vor kurzem wurden zwei Publikationen veröffentlicht, in denen in Neuronen nach Exposition von H2O2 ein Caspasen-unabhängiger Zelltod mit einer Translokation von AIF, einer peripheren Kondensation des Chromatins und einer large scale fragmentation nachgewiesen werden konnte (Zhang et al., 2002; Fonfria et al., 2002). Diese Ergebnisse stimmen mit den hier angeführten Untersuchungen überein. Einen weiteren Hinweis für die Beteiligung von H2O2 bei der Pneumokokkenmeningitis lieferte eine andere, ältere Arbeit: in einem Meningitismodell in Ratten, die mit Pneumokokken infiziert wurden, führte die gleichzeitige Behandlung mit Katalase nach 6 Stunden zu einer signifikanten Reduktion des regionalen zerebralen Blutflusses und des Hirnödems sowie zu einem Rückgang des intrakraniellen Druckes (Pfister et al., 1992).

Pneumolysin, das zweite an der Zelltodinduktion beteiligte Virulenzmerkmal, ist ein Toxin, das viele Funktionen einnimmt: es kann Zytolyse, die Aktivierung des Komplementsystems und die Produktion von NO und Zytokinen induzieren (Mitchell et al., 1997; Braun et al, 1999; Paton, 1996). Spezifische Domänen des Pneumolysins sind unabhängig voneinander für die proinflammatorische und zytolytische (Poren-bildende) Aktivität verantwortlich (Mitchell et al., 1997). Verändertes Pneumolysin, das durch Mutation in der jeweiligen Domäne entstanden ist, wurde verwendet, um zu untersuchen, welche Eigenschaften von Pneumolysin zur Zytotoxizität [Seite 72↓]beitragen. Ähnlich wie H2O2 ist Pneumolysin in der Lage, im endothelialen Zellkulturmodell einen programmierten Zelltod auszulösen. Hierzu benötigt es die Fähigkeit zur Bildung von transmembranären Poren, wie im Experiment mit dem Zytolyse-defizienten Pneumolysin-Protein nachgewiesen werden konnte. Im Gegensatz dazu hat die komplementaktivierende Komponente von Pneumolysin auf den endothelialen Zelltod keinen Einfluß.

Folgende Hypothese kann aufgestellt werden: über die durch Pneumolysin entstandenen Poren, die etwa einen Durchmesser von 35-45 nm haben (Gilbert et al. 1999), kommt es zu einem Influx von extrazellulärem Calcium, dem nachgewiesenen raschen Anstieg des intrazellulären Calciums und nachfolgend über eine mitochondriale Schädigung und die Freisetzung von AIF zum endothelialen Zelltod.

Weniger wahrscheinlich ist eine von Pneumolysin ausgelöste Apoptose mit einer Signaltransduktion über Toll-like-(TLR)-Rezeptoren. TLR-Rezeptoren können verschiedenste bakterielle Moleküle erkennen, die als Pathogen-associated molecular patterns (PAMPs) zusammengefasst werden. Zu ihnen gehören neben den Lipopolysacchariden (LPS) auch Lipoproteine sowie Peptidoglykane und Lipoteichonsäuren. Die Aktivierung dieser TLR-Rezeptoren führt nicht nur zu einer Produktion von proinflammatorischen Zytokinen (Medzhitov und Janeway, 1997), sondern kann auch über eine Rekrutierung des Adaptermoleküls Fas associated death domain (FADD), d.h. über den extrinsischen Weg eine klassische Apoptose hervorrufen (Aliprantis et al., 2000). Zwar konnte nachgewiesen werden, daß Pneumolysin über den TLR-4-Rezeptor zur Bildung von verschiedenen Zytokinen führt (Malley et al., 2003), jedoch spricht die verzögerte, nach etwa 18 h eintretende proinflammatorische Antwort des Pneumolysins sowie die im TLR-System beobachtete Unabhängigkeit von der zytolytischen Aktivität des Pneumolysins gegen eine Induktion der endothelialen Apoptose über TLR-Rezeptoren. Zudem ist auch der frühe Abfall des mitochondrialen Membranpotentials eher für einen intrinsisch (über eine mitochondriale Schädigung) als einen extrinsisch (durch Rezeptoren) ausgelösten Zelltod typisch.

Pneumolysin ist verwandt mit Hämolysinen anderer bakterieller Erreger der Meningitis. Von diesen Hämolysinen, z.B. dem Lysteriolysin von Listeria monocytogenes und dem β-Hämolysin der Gruppe-B-Streptokokken, ist bereits nachgewiesen worden, daß sie Apoptose induzieren können (Guzman et al., 1996; Fettucciari et al., 2000). Es wäre daher von besonderem Interesse zu untersuchen, ob diese Hämolysin-Familie über einen ähnlichen Mechanismus, wie den hier beschriebenen, d.h. Caspasen-unabhängig und AIF-abhängig, Apoptose verursachen kann.

Dafür spricht, daß es beim Zelltod von Makrophagen durch das β-Hämolysin von Gruppe-B-Streptokokken, ähnlich wie bei den hier untersuchten Mechanismen, nicht zu einer Aktivierung [Seite 73↓]von Caspase-1 und -3 kommt. Zudem kann auch der Zelltod der Makrophagen durch Calcium-Chelatoren verringert werden, so daß auch in diesem Fall ein rascher Calcium-Influx als hauptsächlicher Auslöser vermutet wurde (Fettucciari et al., 2000).

4.8 Ausblick

Nachdem gezeigt werden konnte, daß lebende Pneumokokken über die Freisetzung von H2O2 und Pneumolysin unabhängig von der Aktivierung von Caspasen einen programmierten Zelltod in primären zerebralen Endothelzellen verursachen, sollten nun in weiteren Projekten die Mechanismen dieses Zellschadens näher charakterisiert werden. Besonderes Interesse gilt dabei den potentiellen bei der Exekution beteiligten Nicht-Caspase-Proteasen, da deren Identifizierung einen wesentlichen Beitrag zur Erforschung von bakteriellen Wirkungsmechanismen und zur Entwicklung von Inhibitoren, analog etwa den sich in klinischer Erprobung befindenden Caspasen-Inhibitoren, leisten könnte.

Desweiteren stellt sich die Frage, aus welchem Grund eine Aktivierung von Caspasen trotz Freisetzung proapoptotischer Proteine ausbleibt. Neben einem kritischen Energiehaushalt der Zelle könnten auch bakterielle Eigenschaften etwa über eine Regulierung der Caspasen-hemmenden Familie der IAPs eine Rolle spielen.

Auch erscheint eine weitere Erforschung der Mechanismen, die durch AIF in Gang gesetzt werden, wichtig. Ziel der Untersuchungen könnten hierbei die Regulation der Translokation von AIF in den Zellkern sowie die Interaktion mit weiteren Faktoren, z.B. Endonukleasen, sein.

In Zukunft könnte eine nähere Charakterisierung der S. pneumoniae-induzierten Destruktion zerebraler mikrovaskulärer Endothelzellen zum besseren Verständnis der Blut-Hirn-Schranken-Störung bei bakterieller Meningitis und damit zur Entwicklung adjuvanter Therapiemöglichkeiten beitragen.


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09.03.2005